Синтез сорбентов с заданными свойствами и создание на их основе биопрепаратов иммобилизованных ферментов тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.23, кандидат биологических наук Анисенко, Ольга Викторовна

• Анисенко, Ольга Викторовна
• кандидат биологических наук
• 2005

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Анисенко, Ольга Викторовна

введение

1. анализ состояния вопроса

1.1. Особенности носителей используемых для иммобилизации биологически активных веществ.

1.1.1. Органические полимерные носители

1.1.2. Носители на основе дисперсных кремнеземов

1.2. Модифицирование поверхности твердых носителей макромолекулами биополимеров •

1.2.1. Основные фракции казеина, характеристика, химический состав

1.2.2. Структурообразование в водных растворах казеина

1.3. Методы иммобилизации ферментов

1.4. Применение иммобилизованных препаратов.

2. материалы и методы исследований

2.1.Характеристика реагентов, используемых для получения композиционных сорбентов

2.2.Методы определения структуры сорбентов

2.3.Метод определения сорбционной емкости сорбентов

2.4. Метод определения содержания глюкозы

2.5. Метод определения содержания белка

2.6. Ферментные препараты и методы их исследований

2.6.1. Метод выделения уреазы из бобов сои

2.6.2. Метод определения активности уреазы.

2.6.3. Метод определения активности В-галактозидазы

2.7. Методы математической и статистической обработки 48 3 .СИНТЕЗ КОМПОЗИЦИОННЫХ БИОСОРБЕНТОВ

3.1 .Получение композиционных биосорбентов

3.2. Способы получения биосорбентов

3.3. Исследование структурных характеристик биосорбента

3.4. Исследование сорбционной емкости биосорбента по иону железа (III) 68 4. СИНТЕЗ И ИССЛЕДОВАНИЕ ИММОБИЛИЗОВАННЫХ

ПРЕПАРАТОВ УРЕАЗЫ Ир- ГАЛАКТОЗИДАЗЫ

4.1. Получение препарата иммобилизованной уреазы

4.2.Получение и свойства препарата иммобилизованной

Р - галактозидазы

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Синтез сорбентов с заданными свойствами и создание на их основе биопрепаратов иммобилизованных ферментов»

Актуальность темы

Основные направления современной биотехнологии предусматривают разработку сорбционных материалов и дальнейшее их применение в различных областях медицины, сельского хозяйства, а также конструирование высокоэффективных препаратов иммобилизованных ферментов, в качестве регенерируемых и специфических катализаторов.

Среди различных методов синтеза носителей для иммобилизации ферментов перспективно направление биотехнологии по получению композиционных сорбентов, основанное на химической сборке структурных единиц органической и неорганической природы (Weyl W., 1951; Leboda R., 1978; Бры-калов А.В., 1996; Ефременко В.И., 1996). Данные носители отличают стандартностью состава, исключают неспецифическую сорбцию и подверженность микробиологической атаке. В настоящее время предлагается огромный выбор биокатализаторов, которые могут быть использованы в биотехнологии и медицине в качестве энтеросорбентов, а также для селективного извлечения катионов и анионов из водных (или жидких) сред. Однако далеко не все из них отвечают вышеперечисленным требованиям. Развитие данного направления требует продолжения экспериментов с целью разработки более безопасных и экономичных препаратов.

Не менее важной остается проблема разработки высокоэффективных препаратов иммобилизованных ферментов, нашедших применение в самых различных сферах деятельности человека (Березин И.В.,1976; Варфоломеев С.Д., 1999; Вудворд Д., 1988; Тривен М., 1983).

В области медицины актуальной остается проблема разработки биопрепаратов по обнаружению мочевины в крови человека, с целью ранней диагностики ряда заболеваний (анемии, болезни сердца, рак и др.), сопровождающихся гиперуремией, т.е. увеличением содержания мочевины в крови.

Одной из насущных проблем сельского хозяйства является обеспеченность растений минеральным азотом, запасы которого в непосредственно доступной растениям форме весьма ограниченны и удовлетворяются исключительно за счет участия почвенной уреазы в разложении мочевины и нитрифицирующих бактерий. Одним из путей повышения азотного плодородия почв может быть дополнительное внесение вместе с минеральным удобрением препарата иммобилизованного фермента, обладающего пролонгированным действием.

В пищевой промышленности одной из актуальных остается проблема создания безлактозных и низколактозных пищевых продуктов. Установлено, что около 10% населения страдают галактоземией, т.е. непереносимостью молочных продуктов. Данная энзимопатия обусловлена отсутствием в организме фермента Р - галактозидазы, участвующего в каталитическом расщеплении дисахарида лактозы на моносахара галактозу и глюкозу, что приводит к различным нарушениям со стороны желудочно-кишечного тракта (Рахимов К.Р., 1991). Для успешной профилактики и лечения этого заболевания необходимо исключить поступление лактозы в организм с пищей и наиболее эффективными методами получения таких продуктов являются энзиматиче-ские.

Настоящая работа выполнялась в соответствии с планом научных исследований Южного Научного Центра РАН по теме «Построение моделей высокоэффективных сорбентов биологического и медицинского назначения с заданными свойствами и функциями на основе соиммобилизованных материалов» (тема № 00-04-04 научной программы фундаментальных исследований РАН).

Цель работы и задачи исследования.

Целью настоящей работы является разработка композиционных сорбентов с заданными свойствами и создание биопрепаратов на основе иммобилизованных ферментов.

Для выполнения поставленной цели решались следующие задачи:

1) разработать технологию композиционных сорбентов на основе материалов органической и неорганической природы и исследовать их состав и физико-химические свойства;

2) исследовать влияние модификатора поверхности - казеина - на сорбционную емкость сорбентов;

3) разработать методы иммобилизации ферментов с максимумом сохранения активности и стабильности;

4) исследовать влияние физико-химических параметров (рН, температура, кратность использования) на активность иммобилизованных ферментов.

Научная новизна и теоретическая значимость работы.

Впервые разработана технология получения композиционного биосорбента методом формирования пористой структуры кремнеземной матрицы в присутствии белкового комплекса казеина. Впервые представлены данные о влиянии концентрации модифицирующего агента казеина на структурные характеристики и сорбционную емкость биосорбента. Установлено, что увеличение массовой доли казеина уменьшает удельную поверхность в среднем в три раза, образуя высокоразвитую поверхность сорбционной матрицы, и увеличивает сорбционную емкость.

На основе разработанных биосорбентов были получены иммобилизованные препараты ферментов и исследованы их физико-химические параметры. Выбран оптимальный режим работы биопрепаратов. Для препарата иммобилизованной уреазы на кремнеземном носителе оптимальным является рН 5,4-6,0, температура 20-50°С. Для препарата иммобилизованной уреазы на МКЦ оптимум рН 7,0 температура 20-30°С. Полученные ферментные препараты характеризуются высокой активностью до 135%, длительном сроком хранения без уменьшения активности и многократностью использования.

Практическая ценность работы.

Получены и исследованы композиционные материалы, обладающие высокой сорбционной емкостью. Проведены испытания по использованию биосорбентов для экспресс-диагностики возбудителя туляремии, при этом чувствительность иммуноферментного (ИФА) и иммунофлуоресцентного (КИ-ФА) методов в 2 раза превышала чувствительность общепринятых методов, интенсивность окрашивания опытных проб в 10 раз превышала контрольные, что подтверждено актом Ставропольского научно-исследовательского противочумного института. Разработан и утвержден пакет нормативно-технической документации на препарат "Биосорбент" (ТУ 9229-01402080718-02), получено положительное решение на выдачу патента «Способ получения биосорбентов» (№2002105544 от 7 марта 2002г.) по заявке и «Способ получения сорбента» (№ 2004115003 18 мая 2004г). В рамках VII Международного выставки - салона «Высокие технологии. Инновации и инвестиции» г. Санкт-Петербург 2002 г. по проекту «Сорбционные материалы в промышленности» оргкомитетом присуждена золотая медаль.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

1) технология получения композиционных биосорбентов с заданными свойствами на основе кремнеземной матрицы, гетерогенезированной белковым комплексом казеина. Исследование структурных характеристик;

2) результаты исследования влияния модификатора поверхности - казеина - на сорбционную емкость сорбентов;

3) разработка твердофазных каталитически активных препаратов иммобилизованной уреазы;

4) технология получения препарата иммобилизованной (3- галактозидазы.

Апробация работы.

Материалы диссертации доложены на научно-практических конференциях: XIV международной научно-технической конференции «Реактив -2003» (Москва, 2003), 7-ой Пущинской школе-конференции «Биология -наука 21 века» (Пущино, 2003), II Всероссийской, научно-технической конференции, «Современные достижения биотехнологии» (Ставрополь, 2002), Всероссийской научной конференции, "Катализ и сорбция биотехнологии, химии, химических технологиях и экологии" (Тверь, 2003), XVI Международной научно-технической конференции. "Химические реактивы, реагенты и процессы малотоннажной химии" (Уфа, 2003), VII Международной выставке - салоне «Высокие технологии. Инновации и инвестиции» (Санкт-Петербург, 2002).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 12 научных работ. Структура и объем диссертации.

Диссертация состоит из ведения, обзора литературы, 3 глав теоретических и экспериментальных исследований, заключения, выводов, списка литературы, включающего 117 работ отечественных авторов и 55 работ зарубежных авторов. Работа изложена на 129 страницах машинописного текста, иллюстрирована 8 таблицами и 30 рисунками.

Заключение диссертации по теме «Биотехнология», Анисенко, Ольга Викторовна

выводы

1. Разработана технология получения сорбентов на основе пирогенной двуокиси кремния аэросила (А-175, А-380) и микрокристаллической целлюлозы, поверхность которых гетерогенезирована белковым комплексом. Теоретически обоснована и практически доказана возможность использования белкового комплекса казеина для синтеза высокоэффективных биосорбентов.

2. Изучено влияние массовой доли казеина на формирование структуры биосорбентов. Дан анализ структурным характеристикам (удельной поверхности, радиусу и объему пор) разработанных сорбционных материалов. Установлено, что увеличение массовой доли казеина уменьшает удельную поверхность в среднем в три раза, тем самым, увеличивая объем мезопор.

3. С целью изучения сорбционной емкости сорбента был проведен анализ влияния массовой доли каЗеина на величину удельной адсорбции иона железа (III). Увеличение массовой доли казеина способствовало увеличению адсорбции, что связано с наличием центров связывания, образованных радикалами аминокислот, входящих в состав молекул казеинового комплекса. Максимальная адсорбция по иону железа (III) для сорбентов на МКЦ наблюдалась при концентрации казеина от 5 до 10 мае. %.

4. Оптимизирован процесс влияния удельной поверхности и радиуса пор на адсорбцию иона железа (III) из раствора на поверхность кремнеземного биосорбента. Экспериментально доказано, что максимальная адсорбция наблюдалась при удельной поверхности от 80 до 100 м /г и радиусе пор от 20 до 40 нм

5. На основе разработанных сорбентов были получены твердофазные каталитически активные препараты иммобилизованной уреазы с удельной активностью 25-58 мкмоль/мг фермента. Установлено, что на активность иммобилизованного фермента влияют структурные и физико-химические параметры. Препараты иммобилизованной уреазы на неорганических носителях сохраняли от 55% до 135% активности, в то время как препараты на органических носителях - 43% по сравнению со свободным ферментом.

6. Установлены оптимальные режимы использования иммобилизованных препаратов уреазы. Температура 20° - 40° С, рН 5,0 - 6,0, концентрация субстрата 4-5%. Препараты стабильны при хранении в течение 9 месяцев.

7. Получены твердофазные каталитически активные препараты иммобилизованной р - галактозидазы с активностью 11,9 мкмоль/мг на МКЦ и 19,8 мкмоль/мг на кремнеземном носителе, что составило 34 % и 56% соответственно.

8. Установлены оптимальные режимы использования иммобилизованных препаратов Р - галактозидазы. Температура 30° - 60°С, рН - 5,8. Препараты стабильны при хранении в течение 2 месяцев.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В соответствии с целью и поставленными задачами проведенных исследований по одному из основных направлений биотехнологии - разработке новых композиционных сорбционных материалов - удалось разработать матрицы, которые обладают рядом преимуществ: развитой удельной поверхностью, термостабильностью, механической устойчивостью, малым изменением объема гранул при изменении рН или ионной силы, наличием функциональных групп, пригодных для селективной химической модификации.

Разработана технология получения композиционных биосорбентов, на основе пирогенной двуокиси кремния аэросила и микрокристаллической целлюлозы (МКЦ) путем гетерогенизации поверхности природным высокомолекулярным соединением белковой природы - казеином. Технологический процесс синтеза биосорбентов включал следующие стадии: получение гидрогеля на основе аэросила и казеина, переход гидрогеля в ксерогель, механическое измельчение и фракционирование, прокаливание сорбента при 1000° С.

Нами было установлено влияние модификатора поверхности - казеина на структурные характеристики и сорбционную емкость биосорбента.

Выявлено, что удельная поверхность биосорбентов на основе аэросила -380 и казеина уменьшается с увеличением содержания казеина в композите. Кроме того, величины удельной поверхности уменьшаются при переходе размеров гранул от 22 - 63 мкм к 223 - 268 мкм. Соответственно меняются и радиусы мезопор сорбентов, так как пористая структура формируется посредством сшивания белковых молекул, находящихся на поверхности, с образованием крупнопористых частиц сорбента. Также при синтезе данных сорбционных материалов в качестве растворителя казеина был использован раствор щелочи (гидроксид натрия), присутствие которого способствует агрегации мицелл в крупные частицы, что в свою очередь значительно увеличивает объем мезопор.

Развитая поверхность и присутствие большого числа активных функциональных групп, входящих в состав казеинового комплекса, иммобилизованного на аэросиле и микрокристаллической целлюлозе, позволила использовать сорбенты в качестве матриц для иммобилизации ферментов.

Иммобилизация ферментов (уреазы, Р-галактозидазы) на сорбентах методом физической адсорбции показала перспективность использования иммобилизованных препаратов с целью повышения стабильности ферментов и увеличения кратности использования. Разработанные методы иммобилизации позволяют получить препараты иммобилизованной уреазы, имеющие удельную активность в пределах 130% и иммобилизованной Р-галактозидазы - 56%.

Нами установлена зависимость между концентрацией казеина на носителе и удельной активности иммобилизованного фермента. Обнаружено, что с увеличением содержания казеина на носителе увеличивается и сорбционная емкость по ферменту. Однако, при этом наблюдается падение удельной активности фермента уреазы от 135% для АК-3% до 55% для АК-15%. Для МКЦК активность фермента по сравнению со свободным снизилась до 47%. Подобное уменьшение активности фермента при иммобилизации происходит главным образом за счет экранирования активных центров и белок-белковых взаимодействиях, приводящих к ингибированию фермента.

Изучено влияние различных физико-химических параметров: рН раствора, температура, концентрация субстрата на активность ферментов.

Определены оптимальные технологические режимы использования иммобилизованных ферментов. Установлено, что максимальная активность иммобилизованной уреазы наблюдается при рН 6,0 и температуре 10-50°С. Для иммобилизованной р-галактозидазы оптимальным режимом является температура - 30-60°С, продолжительность ферментативной реакции - 15 минут, рН - 5,8, концентрация раствора субстрата (лактозы) - 4,5%.

Главными достоинствами данных ферментных препаратов, по сравнению с известными, является высокая каталитическая активность, термостабильность, возможность многократного использования.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Анисенко, Ольга Викторовна, 2005 год

1. Алексеева Н.Ю., Аристова В.П., Патратий А.П. Состав и свойства молока как сырья для молочной промышленности: Справочник. - М.: Аг-ропромиздат, 1986. - С.238.

2. Алесковский В.Б. Стехиометрия и синтез твердых соединений. -Л.: Наука, 1976.- 139 с.

3. Анисенко О.В., Кунижев С.М., Денисова Е.В., Воробьева О.В. Разработка биосорбентов на основе 0-казеина и аэросила // 6-я Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология-наука XXI века».— Тула, 2002. Tl. - С.211.

4. Анисенко О.В., Степавенко О.В., Щербатенко А.В. Способы иммобилизации уреазы на неорганических носителях // «Биология — наука XXI века» 8-я международная Пущинская школа-конференция молодых ученых. 17-21 мая 2004 -Пущино, 2004. С.249.

5. Ахрем А.А., Свиридонов О.В., Стельченок О.А. Способ иммобилизации протосубтилина // АС №810815,C12N11/00-1981.

6. Бебрис Н.К., Киселев А.В., Никитин Ю.С. Получение чистого макропористого кремнезема аэросила адсорбента для газовой хроматографии// Коллоидный журнал? 1967. - Т.29. - №3. - С. 326 - 332.

7. Безбородов A.M., Куликова А.К. Фундаментальные науки — народному хозяйству. — М.: Наука, 1990. С.253-255.

8. Березин И.В., Мартынек К.М. Введение в прикладную энзимоло-гию.-М.: МГУ, 1982. С.26-100.

9. Березин И.В., Клесов Л.А. Практический курс химии ферментативной кинетики. -М.: МГУ, 1976. С.15-17.

10. Бернхард С. Структура и функции ферментов- М.: Мир, 1971.-С.95-109.

11. Брей В.В. Теоретическая и экспериментальная химия. — 1982. -Т.18. №1. - С. 122- 125.

12. Бробст К.М. Методы исследования углеводов. -М.: Мир, 1975. -348 с.

13. Брухман Э.Э. Прикладная биохимия. М.: Легкая и пищевая промышленность, 1981.-294 с.

14. Брыляков В.М., Хасанханова М.Н., Шаповалов О.И. Способ получения микрокристаллической целлюлозы // SV 1479455.С08В 15/02. -1974.

15. Варфоломеев С.Д., Гуревич К.Г. Биокинетика: практический курс. -М.: Гранд, 1999. 715 с.

16. Варфоломеев С.Д., Калюжный С.В. Биотехнология. Кинетические основы микробиологических процессов. М.: Высшая школа, 1990. — 304с.

17. Волькенштейн М.В. Структура и стабильность биологических макромолекул. М.: Мир, 1973. — 85 с.

18. Воробьева О.В., Анисенко О.В. Сорбенты на основе белкового комплекса казеина. I. Структурные характеристики сорбентов // Вестник Ставропольского государственного университета. 2003. - Вып. 34. — С.111-115.

19. Гайда А.В., Староверов С.М. Модифицированные кремнеземные носители в биотехнологии // Журнал Всес. хим. общества им. Д.И. Менделеева. 1989. - Т.34. - №3. С.350-361.

20. Гаринова М.И., Лепиянин Г. В., Антонова Л. Ф., Хавкин Ю.А. Способ получения иммобилизованных белков //SV 1500670,C12N11/00. — 1989.

21. Герман А.Б., Неклюдов А.Д. Получение и свойства иммобилизованной аминоацилазы Streptoverticilium olivoreticuli // Прикладная биохимия и микробиология. -2001. -Т. 37. № 1. - С. 63-66.

22. Глегг Р.Е., Танг Л.Дж., Бруэр Р.Дж.Д. Фракционирование .- Целлюлоза и ее производные. Под ред. Н.Байклза, Л.Сегала. М.: Мир, 1974. -Т.1. - С.382-412.

23. Горбатова К.К. Биохимия молока. М.: Пищевая пром-ть, 1980. -354 с.

24. Грачева И.М. Технология ферментных препаратов. М.: Пищевая пром-ть, 1975. - 390 с.

25. Грег С., Синг JI. Адсорбция, удельная поверхность, пористость. -М.: Мир,1985. — 360 с.

26. Давиденко Т.И. Трасформация азотсодержащих соединений с использованием биокатализаторов. Атореф. дисс. доктора хим. наук. Фи~ зико-химический институт им. А.В. Богатского АН Украины. Одесса, 1989.

27. Давидова Е.Г., Рачинская В.В. Сорбция белков на ионообменных целюлозах // Прикладная биохимия и микробиология. -1977.- Т.З. №3. -С.341-345.

28. Дихтярев С.И., Киселев А.В., Курганов Б.И. и др. Способ получения уреазы, иммобилизованной на неорганических носителях // АС 925183. C12N11/14.-1982.

29. Дубинин М.М. Физико-химические основы сорбционной техники. -М.: Госхимтехиздат, 1932. 381с.

30. Дьяченко П.Ф. Исследование белков молока. Труды ВНИМИ.-1959.- Вып. 19.-С.28-32.

31. Евтюгин Г.А., Будников Г.К., Никольская Е.Б. Биосенсоры для определения ингибиторов ферментов в окружающей среде // Успехи химии. 1999. - Т.68 (12). - С.1142-1160.

32. Еремин А.Н. Соиммобилизация супероксиддисмутазы, каталазы и пероксидазы // Прикладная биохимия и микробиология-2001. -Т. 37. -№ 1.С. 53-62.

33. Ефременко В.И. Магносорбенты в микробиологических исследованиях. Ставрополь, 1996. - 130 с.

34. Захарова И .Я., Буглова Т.Т., Тихомирова А.С. Ферменты, трансформирующие галактозу. Киев: Наукова думка, 1988. - С. 220.

35. Золотов Ю.А. Аналитическая химия. В 2-х т. М.: Химия, 1999.-280с.

36. Измайлова В.Н., Ребиндер П А. Структурообразование в белковых системах. М.: Наука, 1974. - С.68.

37. Иммергут Э.Х. Целлюлоза. М.: Лесная промышленность, 1967. -С.114-117.

38. Каравайко Г.И., Галицкая Н.Б., Авакян З.А. Способ получения твердых биосорбентов для извлечения металлов // RV 2045574.С12N11/08. 1995.

39. Карнаухов А.П. Глобулярная модель пористых тел корпускулярного строения // Кинетика и катализ. 1971. -Т.12. -№4. - С.1025 - 1033.

40. Кельцев Н.В. Основы адсорбционной техники. М.: Химия, 1984.-С.280.

41. Кестнер А.И. К рН-зависимости реакции с иммобилизованными ферментами // Получение и применение иммобилизованных ферментов vlll-Таллин, 1976. Вып. 465. - С. 19-25.

42. Киселев А.В., Лукьянович В.М., Никитин Ю.С. Влияние температуры гидротермальной обработки на изменение структуры пор и скелета модельного силикагеля // Коллоидный журнал. 1969. -Т. 31. -№3. - С.388-393.

43. Киселев А.В., Никитин Ю.С., Оганесян Э.Б. Влияние продолжительности гидротермальной обработки на изменение пор и скелета промышленного силикагеля // Коллоидный журнал. -1969. -Т. 31.- №5.-С.525-531.

44. Клячко Гурвич А.А. Методы определения удельной поверхности. -М.: Изд-во АН СССР, 1961. - № 10. - 185 с.

45. Колотуша Т.Т., Полонская И.Н., Белякова JI.A. и др. Способ получения носителей для иммобилизации органических соединений // АС №1153975.В 01120/10. 1985.

46. Кольцов С.И. Синтез твердых веществ методом молекулярного наслаивания. Автореферат дис. докт. хим. наук. Ленинград, 1971.т48. Кольцов С.И., Алесковский В.Б. Силикагель, его строение и физико-химические свойства. Л.: Госхимиздат, 1953.-96 с.

47. Коршак В.В., Штильман М.И. Полимеры в процессах иммобилизации и модификации природных соединений. М.: Наука, 1984. - 264 с.

48. Кочетков Н.К., Бочков А.Ф., Дмитриев Б.А. и др. Химия углеводов. М.: Химия. - 1967. - 350с.

49. Кошелев С.А., Давиденко Т.Н., Кирш Ю.Э., Пашкин И.И., Кузькина И.Ф. Иммобилизация уреазы в поли-Ы-винилкапролактам // Прикладная биохимия и микробиология. -1994. Т.ЗО, №3. -С.349-353.

50. Куликова А.К., Гомартели М.М., Церетели А.К., Безбородов A.M., Квеситадзе Г.И., Билай Т.И. // Прикладная биохимия и микробиология 1989.- Т.25. - № 6. - С.734-746.

51. Куликова А.К., Летунова Е.В. // Прикл. биохимия и микробиология.- 1970. Т.20.- № 1. - С.133-137.

52. Кулис Ю.Ю. Аналитические системы на основе иммобилизованных ферментов Вильнюс, 1981. - С.4-7.

53. Кулис Ю.Ю., Песлякене М.В. Способ иммобилизации алкоголь-оксидазы.//SU 1615179- 1990.

54. Куличинский Ю.Л., Малашенко Т.А., Фирсова В.И. Способ получения белкового сорбента// SU 1680715,С08 Hl/00, B01J20/30, С08 15/20/-1991.

55. Краткий справочник физико-химических величин. Ленинград, 1967.- 140 с. .

56. Крусир Г.В., Кравченко И.В., Черно Н.К, Давиденко Т.И., Севастьянова Е.В. Иммобилизация ферментов на пищевых волокнах // Прикладная биохимия и микробиология. 1994. - Т.ЗО. - №6. - С. 849 - 856.

57. Кунижев С.М., Денисова Е.В., Аполохова С.Ф., Воробьева О.В., Анисенко О.В. // Заявка 2002105544 (РФ) Способ получения сорбентов. Положительное решение от 7 марта 2002. 7 с.

58. Кунижев С.М., Денисова Е.В. Информационный листок «Биофильтры нового поколения». Ставрополь: Изд-во СГУ, 2001. 2 с.

59. Кунижев С.М., Воробьева О.В., Денисова Е.В., Анисенко О.В. Разработка способа получения универсальной матрицы для энтеросорбен-тов //Материалы 1-го Международного Конгресса «Биотехнология состояние и перспективы». - Москва, 2002. - С. 75.

60. Кухтин А.В., Еремеев H.JI., Беляева JI.A., Казанская Н.Ф. Взаимосвязь между состоянием термочувствительной матрицы и активностью иммобилизованной в ней уреазы // Биохимия.-1997.- Т.62. Вып. 4. -С.437-443.

61. Лазарев А.Н. Колебательные спектры и строение силикатов. Л.: Наука, 1968.-С.218.

62. Ласкорин В.Н. Сорбенты на основе силикагеля в радиохимии. -М.: Атомиздат, 1977. 303с.

63. Лисичкин Г.В., Кудрявцева Т.Ф., Сердан А.А. Модификационные кремнеземы в сорбции, катализе хроматографии. М.: Химия, 1986. -С.246.

64. Лисичкин Г. Д. Достижения и перспективы химического модифицирования поверхности минеральных веществ // Журн. Всесоюзн. хим. об-ва. им. Д.И. Менделеева. 1989. - Т. 34. - №3. - С. 291 - 297.

65. Лишевская М.О., Вирник А.Д., Роговин З.А. Введение новых функциональных групп в макромолекулу модифицированной целлюлозы, содержащей ароматические аминогруппы. Москва, 1963. - 165с.

66. Любченко П.Н. Клйническая лабораторная диагностика. Москва, 1994. С.6-7.

67. Макаров К.А., Зытнер Я.Д. Синтенз биополимерных материалов и препаратов методами электрохимической (со)полимеризации и (со)иммобилизации. Применение новых биополимерных материалов в медицине Ленинград, 1979. - 230 с.

68. Макаров.К.А., Кабардин С.А. Иммобилизованные биопрепараты в медицине. -М.: Медицина, 1980. 125 с.

69. Макушин Е.М., Тур Л.Т. Способ получения сорбента // АС 615089 С 08 В 15/00.- 1978.

70. Манченко Л.В. Аэросил, его свойства, применение и технические условия. Львов, 1965.-С.183.

71. Матюшин Ю.Н., Корчатова Л.И., Сопин В.Ф. Исследование влияния условий высушивания целлюлозы на теплоту ее сгорания. I Всесоюзная конференция по синтезу целлюлозы и его регуляции.: Тез.докл. -Казан, 1980.-С 36.

72. Медянцева Э.П., Вертлив М.Г., Будников Г.К. Ионы металлов как эффекторы ферментов // Успехи химии. 1998. - Т.67(3). - С.247-253.

73. Мешкова Н.П., Северин С.Е. Практикум по биохимии. М.: Изд-воМГУ, 1979.-430 с.

74. Неймарк Н.Е. Синтетические минеральные адсорбенты и носители катализаторов. Киев: Наукова Думка, 1982. - С. 15-19.

75. Неймарк Н.Е., Шайнфайн Р.Ю., Кругликова Н.С. К вопросу о формировании пористой структуры силикагеля // Коллоидный журнал. -1964. Т.26. - №4. с. 595 - 599.

76. Пак В.Н. Строение поверхностных комплексов, полученных в результате взаимодействия VOCI3 с силикагелем и аэросилом.// Журн. физ. хим. 1976. - Т.50. - №6. - С. 1404-1410.

77. Пак В.Н Оптические спектры кремнеземов в области 200-400 нм //Журн. физ. -хим. -1975. -Т.49. №11.-С.2938-2939.

78. Плюгачева Е.И., Метелица Д.И. Иммобилизация уреазы из соевых бобов // Прикладная биохимия и микробиология. 1994. -Т.30. -№6.-С. 842-847.

79. Постнов В.Н., Макаров к.А., Кольцов С.И., Алесковский В.Б. Свойства неорганических матриц для твердофазного синтеза пептидов. -Докл. АН СССР, 1977. №3. - С.599-600.

80. Постнова A.M., Пак В.И., Кольцов С.И. Исследование протонной кислотности титаносодержащих силикагелей, полученных методом молекулярного наслоения // Журн. физ. хим. 1981.- Т.35. - С. 2140-2142.

81. Пугачевич П.П., Бегляров А.В., Лавыгин А.И. Поверхностные явления в полимерах. М.: Химия, 1982. - 198 с.

82. Пучкаев А.В. и др. Влияние природы поверхностно-активных веществ на стабильность уреазы // Биохимия.-1997. Т.62. -Вып.9.- С.1171-1181.

83. Пучкаев А.В., Метелица Д.И. Стабильность уреазы в водных растворах и обращенных мицеллах аэрозоля ОТ в октане // Биохимия. 1996. -Т.61.- Вып.5. - С. 826-834.

84. Пучкаев А.В., Метелица Д.И. Влияние степени гидратации обращенных мицелл аэрозоля ОТ и концентрации солюбилизированной уреазы на её стабильность // Биохимия.- 1996.- Т.61. Вып.10. - С. 18741882.

85. Пушкарь В.Г., Ефременко В.И., Климова И.М., Гавенский С.Д. Приготовление и применение магнитных сорбентов для изучения антигенов микроорганизмов // ЖМЭИ. 1985. - №12. - С.ЗО - 34.

86. Раскин М.Н., Егоров А.Е., Васильева Г.Г., Кательникова Н.Е., Петропавловский Г.А. Способ получения МКЦ // АС № (11) 751808 30.07.80. Бюл. №28.

87. Рахимов К.Р. Механизм усвоения лактозы в онтогенезе человека и животных. Ташкент, 1991. -С. 381.

88. Ребриев А.В., Ивашкевич С.П., Стародуб Н,Ф., Керча С.Ф., Маслюк А.Ф. Электрохимический сенсор на основе фотополимерных мембран для определения мочевины // Укр. биохим. ж. -2001. Вып. 73. - №1.-С .133-141.

89. Роговин З.А., Шорыгина Н.Н. Химия целлюлозы и ее спутников. М.: Госхимиздат, 1953.- .678с.

90. Рогожин С.В., Варламов В.П., Вальковский Д.Г. Получение модифицированных кремнеземов для присоединения биологически активных соединений // Изв. АН СССР .- 1975. №8. - С.1718-1720.

91. Русанов А.И. Применение термодинамически искривленной поверхности к описанию адсорбционных процессов. В кн.: Адсорбция и пористость. - М.: Наука, 1973. - С. 173-181.

92. Самошина И.М., Лотменцова Е.Ю., Борисова В.И., Нахапетян Л.А. // Прикл. биохимия и микробиология. 1985. - Т.21.- № 6. - С.745-752

93. Степанова З.Н., Грищенко С.И., Стручак С.В., и др. Способ получения сорбента для аффинной хроматографии //SV 1578137.С08В15/00,ВО1120/24.20/30. 1990.

94. Тагер А.А. Физикохимия полимеров. 3-е изд. М.: Химия, 1978. -544 с.

95. Танабэ К. Твердые кислоты и основания. М.: Мир, 1973. - 250с.

96. Тарасевич Ю.И., Смирнова В.А., Монахова Л.И. Адсорбция альбумина на глинистых материалах // Коллоид, журн. -1975.-Т.37. №5.-С.912-917.

97. Тарчевский И.А., Марченко Г.Н. Биосинтез и структура целлюлозы. М.: Наука, 1985. - 279 с.

98. Тетин А. Химия и физика молока. М.: Пищевая промышленность, 1979.-624 с.

99. Тертых В.А., Павлов В.В., Ткаченко К.И., Чуйко А.А. О размещении структурных гидроксильных групп на поверхности аэросила // Теор. и эксперим. химия.-1975. Т.П.- №3.-С. 415-420.

100. Тривен М. Иммобилизованные ферменты.- М.: Мир, 1983. -208 с.

101. Улезло И.В., Церетели А.К., Портная И.Б., Безбородов A.M. Р-галактозидаза супертермофильной бактерии Thermoanaerobium sp. 2905 и ее иммобилизация // Прикладная биохимия и микробиология. -2001. —Т. 37.-№ 1.-С. 48-52.

102. Фениксова Р.В. Гидролитические ферменты микроорганизмов и их применение в народном хозяйстве. М.: Наука, 1972. — 20 с.

103. Храмцов А.Г. Молочный сахар. М.: Пищепромиздат, 1987. -280 с.

104. ЦеретелиА.К., Куликова А.К., Шиян С.Д., Тихомирова А.С.// Прикл. биохимия и микробиология. 1980. - Т.12.-№ 6. -С. 902-908.

105. Цизин Г.И., Формановский А.А., Михура И.В. Аминокарбок-сильное производное целлюлозы в качестве сорбента для концентрирования тяжелых металлов и способ его получения// SV 1702659.С08В 15/06,ВО 1120/26. 1993.

106. Черкасов А.Н., Пасечник В.А. Мембраны и сорбенты в биотехнологии. Л.: Химия, 1991. - 240с.

107. Чернавина И.А. Физиология и биохимия микроэлементов. М.: Высшая школа, 1970. - С.309-401.

108. Чертов В.М., Джамбаева Д.Б., Неймарк И.Е. Влияние условий гидротермальной обработки гидрогеля кремниевой кислоты на структуру и свойства ксерогеля // Коллоидный журнал. -1965. -№27. Вып.2. -С.499-502.

109. Чуйко А.А, Тертых В.А., Казаков К.П., Павлов В.В. Исследование процессов хемосорбции четыреххлористого титана на поверхности кремнезема.// Сб-к Адсорбция и адсорбенты. -1980.- №8. -С.39-43.

110. Шуваев В.А., Харитонов В.Д., Кунижев С.М. Способ определений объема пустот в порошкообразных молочных продуктах // А.С. № 807176.- 1981.

111. Щербухин В.Д., Кондырева А.В., Миронова А.И., Грюнер B.C. // Прикл. биохимия и микробиология. -1970. -Т. 6. № 4. - С. 467 - 470.

112. Янкаускайте Д.П., Дикчювене А. А., Паулюконис А.Б. Способ модификации полисахаридов // АС 732278. С 08В15/06. 1980.

113. Aguado Jose, Romero M.Dolores, Rodriguez Lourdes, Calles Jose A. Thermal deakttivation of free immobilized P-glucosidas from Penicillium fu-niculosum // Biotechnol.Prog.-1995 -11, №1.-P.104-106.

114. Akasaki.,Susuki M., Funakochi J., Jamashina J. //J. Biochem. 1976. V.80.- № 6 P. 1195-1200.

115. Alexsander G. В., Heston W. M., Yler R.K. The solubility of amorphous silica in water // J. Phys. Chem. 1954. - № 6. P. 453 - 455.

116. Arnon D.I. Ferredoxin and photosynthesis // Science, 1965. P. 149.

117. Bachofen R., Buchanan B.B., Arnon D.I. Ferredoxin as a reductant in pyruvate synthesis by a bacterial extract. Proc. Nat. Acad. Sci. U.S. - 1964. -P. 51,690.

118. Bates W.K., Hedman S.C., Woodward D.O.// J. Bacteriol. -1967.-V. 93. -№ 5. P. 1631-1637.

119. Ben Bassat A., Zeikus J.G. // Arch. Microbiol. -1981. V. 128.- №2.-P. 365-369.

120. Borgium G.B., Sternberg M.Z.// J. Food Sci. -1972. V. 37- .№ з.„ P. 619-623.

121. Borman Stu, Enzymes immobilized in polymeric microcapsule arrays, Chem. and Eng. News. 1994. - 72, -№ 22. - C. 17.

122. Broughton R.L., Leung R., Lamberti F.V., Zimmermann J. Clinical applications of heparinase , Artif. Cells, Blood Substitut. and Immobilizat. Bio-technol. 1994. - 22, №5. - P.340.

123. Brown J. C., Tiffin L.O., Specht A.W., Resnicky J.W. Stability and concentration of metal chelates factors in iron chlorosis of plants // Agron. J. -1961.-P. 778-779.

124. Cojocaru D.C., Artenie V.G., Tanase Elvira.Immobilization of amy-loglucosidase on solid supports through covalent finding // An. Sti. Univ.Sec-1993. 39. - P.161-164.

125. De Коек P.C., Morrison R.J. The metabolism of chlorotic leawes// Amino acids. Biochem. J. 1958. - P.344-367.

126. Dickson R.C., Dickson L.R., Markin J.S. // J. Bakteriol. 1979.-V.139.- № 1. - P.52-61.

127. Chen Zun, Kong Wei, Zhou Hui, Li Wei, Shen Jia-Cong. Исследование по иммобилизации глюкоамилазы на привитой крахмальной подложке// Shengwu huaxue zazhi. Chin. Biochem. j.- 1995.- 11.- №2. -P.150-154.

128. Chonde Y., Paul M Acrylate based adsorbent rtsin for the immobilization of enzymes //Pat. 4897352.USA C12 Bll/08. 1990.

129. Furusaki S., Nozava Т., Nomuras S. Membrane enzyme reactor with simultaneous separation using electrophoresis //Bioprocess Eng.-1990. -V5 № 2.-P.73-78.

130. Gardaer D.L., Emmerling D.S. Biomedical applications of immobilized Enzimes and Proteins // Ed. T.M.S. Chang. N.Y. Plenum Press.- 1977.- P. 163-167.

131. Gastello F., Moreno B. // J. Dairy Sci. 1983. - V.66.- № 8.- P. 16161621.

132. Greenberg S.A., Sinelair D. The polimerisation of silicic Acid. // J. Phys. Chem. 1955. - № 5. P. 435 - 440.

133. Hlling PJ.,Dunnill P. Improved nonporous magnetie supports fog immobilized enzumes //Biotechnol and bioeng. -1979.-V.21.- №3. P.393-416.

134. Huang Fang Cheng, Ju Yi-Hsu. Improved activity of a lipase by vacuum drying on to a hydrophobic microporous support //Biotechnol.Techn.-1994.-V.8.- № 11 P. 827-830.

135. Hughes, R.C. Mac-2: A versatile galactose-binding protein of mammalian tissues // Glycobiology. 1994. - V.4. - P.5-12.

136. Huzjak D., Huzjak Jasna, Krizanik J. The stability of p galaktosi-dase (Aspegillus oryzae) immobilized on Eupergit С.// Pregramb.-tehnol. I bio-tehnol. rew. - 1994. - V.32 - № 4. - P. 177 - 179.

137. Ichijo Hisao, Najasawa Iunichi Yamauchi Aizo. Immobilization ot biocatalysis with poly (vinyl alcohol) supports // J. Biotechnol. 1990. - V.14.-№2. - P. 169- 178.

138. Kumar, V., Ramakrishnan, S., Teerit, Т., Knowles, J.K.S., Hartley, B.S. Saccharomyces cerevisiae cells secreting and Aspergillus niger (3126galactosidase grow on whey permeate //Biotechnology. 1992. - №10.- P.82-85.

139. Kunigev, S.M., Denisova, E.V., Shuvaev, V.A. Study of requirements of an enzymatic hydrolysis of lactose // Proceeding of UNESCO medikal center «Unona», -Essentuki. 2001. - V.5. - P. 198-200.

140. Leboda R. Discussion modification mechanism of texture and structure of Silica gels with alcogols // Pol. J. Chem. 1978. - № 7/8. - P. 1479 -1486.

141. Mathur N.K., Narang C.K., Williams R.E. Polymers as aids in organic chemistry //New York: Academic Press, 1980.

142. Mayerhold M., Rechnitz. G. Methods Enzymol.- 1980. -P. 439-443.

143. Marx-Figini M., Schulz G.V. Die Viskosimetrische Molekularge-wichts bestimung von Cellulosen und Cellulosennitraten unter Standartbedigun-gen. Makromol. Chem., 1962. - Bd.54. - S. 102-118.

144. Pappenheimer, J.R., Reiss, K.Z. Adsorption of nutrients by solvent drag // J. Membr. Biol. 1987. - V.100. - P. 432-436.

145. Paulson K.N., Kurtz L.T. Michaelis contant of soil urease // Soil. Sci. Soc. Amer. Proc. 1970,- V.34 - № 1. - P. 70-72.

146. Pettet N.M. Soil urease activity, stability and kinetic properties // Soil. Biol. Biochem. 1976. -V.9. - № 6. -P. 479-484.

147. Pavi, D.E., Robinson, M.P. Handbook of enzyme biotechnology I I Nutr. Metabol. 1976. - V.20. - P.351-363.

148. J.Porath, P.Flodin. Nature, 1959. P. 183

149. Rhoads W.A., Wallace A. Possible involvement of dark fixation of C02 in lime-induced chlorosis// Soli Sci. 89, 5 - 1960. - P.56.

150. Ridha S.H.,Crauford R., Tamine.A.I. The quality of Cheddar cheose prodused from lactose hydrolysed milk //Dairy Ind. Int.- 1983.- V. 48.- №.12.-P. 17,20-22.

151. Roig M.G., Slade A., Kennedy J.F., Tayler D.W., Garaito M.G. Investigations of stabilies, pH, and temperature profiles and kinetic parameters of glucoamylase immobilized on plastic supports // Appl.Biochem and Biotech-nol.A.-1995.-V.50.-№1 -P.ll-33.

152. Sammer J.B. Enzymes. 1951. - P. 1-2, 873.

153. Sing K.S. W., Madelew J.D. The Surface properties of silica gels // J. Appl. Chem. 1953. - № 3. - P. 12-15.

154. Schafhauser D.Y., Storey K.B. Immobilization of glucose isomerase onto granular chicken bone//Appl. Biochem. and Biotechnol. 1992. - V.32. -P. 79-87.

155. Shan Yamini, Shan Dushyant, Patel R. В., Trivedi В. M. Immobilisation of urease in calcium alginate gels// Res and Ind 1995 -V.40 -№1. - P.23-27.

156. Sheffield Deborah J., Harry Tim R., Smith Arnold J., Rogers Lyndon J. Immobilisation of bromoperoxidase from Corallina officinalis Biotechnol. Techn. 1994. - V.8- № 8. - P. 579-582.

157. Til H.P., Feron, V.J., Immel, H.R. Chronic (89-week) feeding study with hydroxypropyl distarch phosphate, starch acetate, lactose and sodium alginate in mice // Food Chem. Toxicol. 1986. - V.24. - P.825-834.

158. Tripurari S., Indu B.P., Deb S. Pore structure of silikagel // J. Appl. Chem. and Biotechnol. 1978.- № 9. - P. 633 - 677.

159. Verstracten L.M. Inferaction between urease activity and soil charac-teries-tics // Agrochimica. 1978. - V.22 - № 56. - P. 455-464.

160. Virto Maria D., Agud Isabel, Montero Sol, Blanco Alilua. Kinetic properties of soluble and immobilized Candida rugoza lipase //Appl. Biochem and Biotechnol. -1995. -V.50.- №2 P.127-136.

161. Weyl W., Hausser E. Bildung und Strruktur von Silicagelen // Kol-loid. Z. 1951. - № 11. - S. 72-76.

162. Widmer F., Leuba J. // Eur. J. Biochem. 1979- V. 100. -.№2.-P.559-567.

163. Wright Wayne W/, Baez Juan Carlos, Vanderkooi Jane M. // (Mixed trehalose/sucrose glasses used for protein incorparation as studied by infrareg and optical spectroscopy // J. Biochem. 2002.- V.307.- №1.- P. 167-172.

164. Xu.Chen Lizi jiaowan yu xifu// Ion Exch. and Absorp. 1993. -V. 9. -№6.-P. 381-485.

165. Аэросил 380 Увеличение х 40

166. Аэросил + 5% масс, казеина Увеличение х 80

167. Микрокристаллическая целлюлоза (МКЦ) Увеличение х 40

168. Микрокристаллическая целлюлоза + 5%мас. казеин Увеличение х 40

169. Мною, нижеподписавшимся, зав. лабораторией агрохимиспытаний к.б.н. Азимовым А.К. в течение июня июля текущего года были проведены испытания иммобилизованных препаратов уреазы.

170. Полученные в ходе испытания иммобилизованных препаратов уреазы результаты отражены в приведенной ниже таблице.

171. Носитель Иммобилизация Уд. активность мкмоль/мг фермента Сохранение активности,%мг/г сорбента %иммобилиза ции 1. АК-3% 1,91 44 58,78 1351. АК-5% 1,70 37 29,60 801. АК-15% 1,13 25 23,53 581. МКЦК 4,1 82 17,43 431. Заключение.

172. Препараты иммобилизованной уреазы имеют удельную активность 17-58 мкмоль/мг фермента, стабильны в интервале температур 20-60°С, сохраняют высокую активность 4-5-кратном использовании.

173. Зав. лабораторией агрохимиспытанийк.б.н. Азимов А.К.1. УТВЕРЖДАЮ1. Директор Ставропольского1. И.Ефремснко1. АКТ

174. Чувствительность ИФА я КИФА в 2 раза превосходила общелрн-нятые методы, при этом значение величины интенсивности окрашивания опытных проб над контрольными (отрицательными) было не менее, чем л 10 раз.

175. Таким образом» полученные данные свидетельствуют о возможности использования модифицированной кремнеземной матрицы на основе аэросила с р-казеином для конструирования диагностических препаратов.

176. Зам. директора по производству МИБП, доктор медицинских наук, профессор

177. Ст. н.с., кандидат биологических наук НПО по выпуску МИБП

178. Ст. н.с., кандидат- биологических наук НПО по выпуску МИБП1. ЕВ. Жданова1. ДатапоЩШИО '28 ФЕВ 2002 ФИПСОТЛ*?0

179. ЗАЯВЛЕНИЕ о выдаче патента Российской Федерации на изобретение0ФЭШ34369

180. В Российское агентство1 по патентам и товарным знав 121853, Москва, Еережковекаа hiO„30, кЛ Федеральный институт промышленной собствсьшиггь

181. Представляя указанные ниже документы, прошу (просим) выдать патент Российской Федерации на имя

182. Ставропольский государственный университет71. Заявитель(н)

183. Ставропольский государственный университет1. Код организациипоОКПО (если он установлен)02080718 *1. Код страны по станд.»,'