Активность и стабильность β-галактозидаз тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 02.00.15, кандидат химических наук Пилипенко, Ольга Станиславовна

• Пилипенко, Ольга Станиславовна
• кандидат химических наук
• 2006

Оглавление диссертации кандидат химических наук Пилипенко, Ольга Станиславовна

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Глава I. Источники, структура и механизм действия Р-галактозидаз.

1.1. Классификация р-галактозидаз.

1.2. Р-Галактозидазы растений.

1.3. Р-Галактозидазы млекопитающих и человека.

1.4. Р-Галактозидазы микроорганизмов.

1.4.1. Бактериальные Р-галактозидазы.

1.4.2. Грибные и дрожжевые Р-галактозидазы.

1.4.3. Третичная структура р-галактозидаз.

1.5. Механизм каталитического действия Р-галактозидаз.

1.5.1. Каталитическая активность Р-галактозидаз.

1.5.2. Механизм каталитического действия Р-галактозидаз.

1.5.3. Активаторы и ингибиторы Р-галактозидаз.

Глава II. Биокатализаторы на основе Р-галактозидазы.

2.1. Практическое использование р-галактозидаз.

2.2. Адсорбция и другие физические методы иммобилизации

Р-галактозидаз.

2.3. Химические методы иммобилизаци р-галактозидаз ковалентное связывание).

2.4. Свойства и применение иммобилизованных р-галактозидаз.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

Глава III. Объекты и методы исследования.

3.1. Характеристика ферментов и использованпых химических реактивов.

3.1.1. Ферменты.

3.1.2. Химические реактивы.

3.1.3. Буферные растворы.

3.2. Определение ферментативной активности р-галактозидазы.

3.3. Методика изучения термоинактивации фермента.

3.3.1. Термоинактивация ß-галактозидазы в растворе.

3.3.2. Термоинактивация ß-галактозидазы в адсорбционных слоях.

3.4. Адсорбционная иммобилизация ß-галактозидазы.

3.4.1. Адсорбционная иммобилизация ß-галактозидазы на силикагеле.

3.4.2. Получение совместных адсорбционных слоев фермента и полисахаридов.

3.5. Количественное определение белка методом Брэдфорда.

3.6. Оценка погрешностей в определении экспериментальных величин.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

Глава IV. Механизм реакции гидролиза гликозидной связи субстрата в активном центре ß-галактозидазы из Escherichia coli в рамках теории цепей перераспределения связей.

4.1. Механизм реакции.

4.2. Влияние метанола на гидролиз орто- и пара-нитрофенил-ß-галактопиранозидов ß-галактозидазой из Escherichia coli.

4.3. Структурный анализ аминокислотных последовательностей

-галактозидаз из различных источников.

Глава V. Термоинактивация ß-галактозидаз из различных источников.,.

5.1. Ассоциативно-диссоциативные процессы в растворах

-галактозидаз.

5.1.1. Диссоциация и удельная активность олигомеров ß-галактозидаз.

5.1.2. ß-Галактозидаза животного происхождения из печени быка.

5.1.3. ß-Галактозидаза бактериального происхождения из Escherichia coli.

5.1.4. ß-Галактозидаза дрожжевого происхождения из

Kluyveromyces fragilis.

5.1.5. Удельные активности олигомерных форм ß-галактозидаз.

5.2. Термоинактавация ß-галактозидаз различного происхождения.

5.2.1. Кинетические механизмы термоинактивации.

5.2.2 Диссоциативная термоинактивация ß-галактозидаз.

5.2.3. Индукционный период на кривых термоинактивации

-галактозидаз.

5.3. Влияние различных факторов на стабильность ß-галактозидаз.

5.3.1. Активность и стабильность ß-галактозидаз.

5.3.2. Влияние температуры на стабильность ß-галактозидаз.

5.3.3. Влияние катионов магния на стабильность ß-галактозидазы из Escherichia coli.

5.4. Термоинактивация и параметры стабильности олигомерных ферментов.

5.5. Некоторые особенности термоипактивации ß-галактозидазы животного происхождения из печени быка.

Глава VI. Адсорбционные слои ß-галактозидазы из Pénicillium canescens на силикагеле и их стабилизация полисахаридами.

6.1. Адсорбционная иммобилизация ß-галактозидазы.

6.1.1. Адсорбция ß-галактозидазы Pénicillium canescens на силикагеле.

6.1.2. Каталитические свойства адсорбционных слоев ß-галактозидазы.

6.1.3. Кинетика адсорбции ß-галактозидазы на силикагеле.

6.2. Совместные адсорбционные слои ß-галактозидазы и полисахаридов на поверхности силикагеля.

6.2.1 Каталитические свойства совместных адсорбционных слоев

-галактозидазы и полисахаридов.

6.2.2. Термостабильность адсорбционных слоев ß-галактозидазы.

ВЫВОДЫ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Активность и стабильность β-галактозидаз»

З-Галактозидаза - фермент, участвующий в углеводном обмене растений, микроорганизмов, животных и человека. Одна из функций р-галактозидазы в организме млекопитающих - гидролиз молочного сахара (лактозы) на два легко усваиваемых моносахарида (глюкозу и галактозу). Поскольку значительная часть населения Земли из-за недостатка р-галактозидазы не способна усваивать молочные продукты, этот фермент широко используется при производстве молочных продуктов с пониженным содержанием лактозы для детского и диетического питания. Ферментные препараты, содержащие (3-галактозидазу, используются в качестве пищевой добавки для людей с лактазной недостаточностью, они применяются для получения глюкозо-галактозного сиропа, который используется в качестве заменителя сахара в хлебопечении и кондитерской промышленности.

Р-Галактозидаза помимо гидролазной проявляет также трансферазную активность и катализирует реакции трансгалактозилирования с образованием олигосахаридов различного состава. В последние годы активно обсуждается перспектива промышленного применения р-галактозидазы для производства лактулозы и других бифидогенных олигосахаридов, входящих в состав лечебно-профилактических продуктов питания.

Р-Галактозидазы находят применение в медицине при лечении и диагностике некоторых заболеваний, при решении экологических проблем, связанных с загрязнением окружающей среды отходами молочной промышленности, они могут быть использованы в лабораторном органическом синтезе.

В настоящее время из различных источников выделены сотни отличающихся строением и свойствами Р-галактозидаз, достаточно хорошо изучена лишь незначительная часть этих ферментов. В связи с перспективами широкого промышленного использования Р-галактозидаз актуальна проблема получения высокоактивных и стабильных катализаторов на основе иммобилизованных Р-галактозидаз. Получение таких катализаторов невозможно без систематического сравнительного исследования активности и стабильности р-галактозидаз из различных источников.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение диссертации по теме «Катализ», Пилипенко, Ольга Станиславовна

выводы

Проанализированы общие закономерности механизма каталитического действия ß-галактозидаз; рассмотрены механизмы их термоинактивации и влияние различных факторов на активность и стабильность ß-галактозидаз из различных источников (бактерии Escherihia coli, грибы Pénicillium canescens, дрожжи Kluyveromyces fragilis, печень быка).

1. Предложен кислотно-основной механизм гидролиза гликозидной связи и выделены цепи перераспределения связей (ЦПС) па стадии возникновения и распада промежуточного соединения (галактозил-фермента) и образования конечного продукта реакции с использованием данных PC А о пространственном строении активного центра ß-галактозидазы из E.coli.

2. Сравнение аминокислотных последовательностей пяти ß-галакгозидаз из различных источников показало, что характерные для активного центра фермента из Escherichia coli фрагменты аминокислотной последовательности сохраняются в первичных структурах четырех других ß-галактозидаз.

3. Показано, что в растворах ß-галактозидаз происходят обратимые процессы ассоциации-диссоциации олигомерпых молекул. Впервые определены активности различных олигомерпых ассоциатов и рассчитаны соответствующие константы равновесия диссоциации.

4. Установлено, что термоинактивация ß-галакгозидаз в растворе в зависимости от природы фермента и условий эксперимента происходит по различным кинетическим механизмам. Рассчитаны соответствующие кинетические параметры и определено число промежуточных стадий процесса, не сопровождающихся потерей каталитической активности. Определены энергии активации на стадиях диссоциации и денатурации фермента.

5. Для ß-галактозидаз впервые определены параметры, характеризующие стабильность ферментов: температуры исчезновения индукционного периода на кинетических кривых термоинактивации, число промежуточных стадий процесса без потери активности, длительность индукционного периода при заданной температуре, условия смены кинетического режима инакт ивации.

Получены активные и стабильные катализаторы, представляющие собой совместные адсорбционные слои |3-галактозидазы из грибов Pénicillium canescens и полисахаридов (амилоза или гепарин) на поверхности силикагеля. Показано, что присутствие полисахаридов активирует и стабилизирует фермент.

Список литературы диссертационного исследования кандидат химических наук Пилипенко, Ольга Станиславовна, 2006 год

1. Henrissat B.11 Biochem.J. 1991. V.280. P. 309-316. /A classification ofglycosyl hydrolases based on amino acid sequense similarities

2. Henrissat B., Bairoch A. //Biochcm. J. 1996 V.316. P.695-696 / Updating the sequence-based classification of glycosyl hydrolases.

3. Triantafillidou D., Georgatsos J.G. //J. Protein Chemistry. 2001, v.20, n.7, p.551-662 / Barley beta-galactosidase: strustructure, function, heterogeneity and gene origin

4. Haider J., Bhaduri A. //J.Natr.Biochem. 1997. 8, 7. 378-384 /Glycosidases from tea-leaf (Camellia sinensis) and characterization of P-galactosidase

5. Lee D.H., Kang S.G., Byun J.K. //Mol.Cells,2003,15,1,68-74 /Purification and characterization of a P-galactosidase from peach (Primus persica)

6. Li S.-C., Han J.-W., Chen K.-C., Chen C.-S. //Phytochemistry 2001. V. 57. P. 349-359 /Purification and characterization of isofonns of P-galactosidases in mung beam seedlings

7. Leparou S., Padrines M., Placier G., Colas B. //Biochim. Et Biophys. Acta. 1997. V. 1336. N.3 P. 522-532 /Characterization of a strictly specific acid beta-galactosidase from Achatina achatina

8. Jimenez-Barbero J., Canada F.J., Fernandez P., Martin-Lomas M. //Carbohydrate Research, 1995, 271, 1, 31-42 /Substrate specificity of small-intestinal lactase: study of the steric effects. Hydrogen bonds involved in enzyme-substrate interaction

9. Kobayashi T„ Shinnoh N„ Goto I., Kuroiwa Y. //J.Biol.Chem.260 (1985) 14982-14987 /Hydrolysis of galactosylceramide is catalyzed by two genetically distinct acid beta-galactosidases

10. Alpers D.H. //. Biol. Chem. 244 (1969), 1238-1246 /Separation and isolation of rat and human intestinal beta-galactosidases

11. Asp N.G. //Biochem. J. 121 (1971). 299-308 /Human small-intestinal-galactosidases. Separation and characterization of three forms of an acid-galactosidase.

12. Norden A.G.W., O'Brien J.S. //Arch. Biochem. Biophys. 159 (1973) 383-392 /Ganglioside GMrbeta-gaIactosidase: studies in human liver and brain.

13. Ho M.W., Cheetham P. Robinson D. '/Biochem. J. 136 (1973), 351-359 /Hydrolysis of GMrganglioside by human liver beta-galactosidase isoenzymes.

14. Norden A.G.W., O'Brien J.S. //Biochem. Biophys. Res. Commun. 56 (1974), 7969-7976 /Binding of human liver bcta-galactosidases to plant lectins insolubilized on agarose.

15. Cheetham P.S.J., Dance N.E. //Biochem. J. 157 (1976), 189-195 /The separation and characterization of the methylumbelliferyl bcta-galactosidase of human liver

16. Frost R.G., Holmes E.W., Norden A.G.W., O'Brien J.S. //Biochem. J., 1978, 175, 181-188 /Characterization of purified human liver acid beta-galactosidases A2 and A3

17. Lo J.-T., Mukerji K., Awasthi Y.C., llanada E., Suzuki K., Srivastaya S.K. //J. Biol. Chem. 254 (1979), 6710-6715 /Purification and properties of sphingolipid beta-galactosidase from human placenta

18. Li Y.-T., Li S.-C. //Adv. Carbohydr. Chem. Biochcm. 40 (1982), 235-286 /Biosynthesis and catabolism of glycosphingolipids

19. Holmes E.W., O'Brien J.S. //Biochemistry, 18 (1979), 6, 952-958 /Purifications and properties of acid beta-galactosidase from feline liver

20. Hiraivva M., Uda Y. //Jpn.J.Exp.Med.,1988,58,3,129-138 /GM1 ganglioside 0-Galactosidase from bovine liver

21. Gatt S. //Biochim. Biophys. Acta. 137 (1967), 192-195 /Enzymatic hydrolysis of sphingolipids. V.Hydrolysis of monosialoganglioside and hexosilceramides by rat brain beta-galactosidase.

22. Fraser N.L., Mahuran O., Freeman S.J., Callahan J.W. //Can. JvBiochem. Cell. Biol. 61 (1983), 313-322 /Improved purification of beta-galactosidase from rabbit brain: two separable fractions share kinetic and structural properties.

23. Hiraivva M., Uda Y. // J. Biochem. 100 (1986), 707-715 /Purification and properties of GM1 ganglioside beta-galactosidase from bovine brain

24. Yamamoto Y., Fujie M. Nishimura K.//.I.Biochem., 1982,92,1,13-21/The interrelation between high- and low-molccular-wcight forms of GM1 P-galactosidase purified from porcine spleen

25. Ostrovvska H., Krukowska K., Kalinowska J., Orlovvska M., Lengievvicz I. //Cell.Mol.Biol.Lett.,2003,8,1,19-24 /Lysosomal high molecular weight multienzyme complex

26. Verheijen F.W., Brossmer R. Galjaard II. //Biochcm. Biophys. Res. Commun., 1982, 108, 868-875 /Purification of acid beta-galactosidase and acid neuraminidase from bovine testis: evidence for an enzyme complex

27. Hiraiwa M., Nishizavva M., Uda Y., Nakajima T., Miyatake T. //Biochem. Biophys. Res. Commun., 1989, 163, 1498-1504 /Molecular cloning of a full-length cDNA for human alpha-N-acetylgalactosaminidase (alpha-galactosidase b)

28. Van der Spoel A., Bonten E., D'Azzo A. //J.Biol.Chcm., 275, 14, 10035-10040 /Processing of lysosomal p-galactosidase. The C-terminal precursor fragment is an essential domain of the mature enzyme

29. Callahan J.W., D'agroza R.M., Hubbes M. Shankaran R., Novak A. //Trans. Am. Soc. Neurochem., 1990, 21, 127 /Characteristics of the beta-galactosidase-carboxypeptidase complex and free forms of beta-galactosidase.

30. Norden A.G.W., Tennant L.L., O'Brien J.S. //J. Biol. Chem., 1974, 249, p. 79697976 /GMiGanglioside P-galactosidase A. Purification and studies of the enzyme from human liver

31. Hiraiwa M., Saitoh M., Narutoshi A. Shiraishi T. Odani S., Uda Y., Ono T., O'Brien J.S. //Biochim. Biophys. Acta, 1997, 1341, 189-199 /Protective protein in the bovine lysosomal p-galactosidase complex

32. Taguchi S., Kouyama H., Yago N.//J.Biochem„ 1981, 89, 2, 483-492 /Reversible aggregation and stability of lysosomal P-galactosidase from porcine adrenal cortex

33. Skudlarek M.D., Tulsiani D.R., Orgebin-Crist M.C. //Biochem.J., 1992, 286 (Pt 3): 907-914 /Rat epidymal luminal fluid acid beta-D-galactosidase optimally hydrolyses glycoprotein substrate at neutral pi I

34. Lodish H.F. //J. Biol. Chem., 1988, 263, 2107-2110 /Transport of secretory and membrane glycoproteins from the rough endoplasmic reticulum to the Golgi. A rate-limiting step in protein maturation and secretion35