Характеристика продуктов генов кластера утилизации ламинарина Thermotoga neapolitana тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.03, кандидат биологических наук Волков, Илья Юрьевич

• Волков, Илья Юрьевич
• кандидат биологических наук
• 1999

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Волков, Илья Юрьевич

Список сокращений.

ВВЕДЕНИЕ.-.'.'■■

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. ' Бактерии рода ТПегтогода и их гликозилгидролазный комплекс ферментов.■.

1.2. Структура кластера утилизации ламинарина бактерии Thermotoga пеароИ1апа.

1.3. 0(1, 3)-глюканы, Р(1,3-1,4)-глюканы и их распространенность в природе.

1.4. 0(1,3)- и 0(1,3; 1,4)-глюканазы, . р-глюкозидазы, их биохимические и субстратные характеристики.

1.5. Систематика гликозилгидролаз на основе гомологии аминокислотных последовательностей.

1.6. Основные механизмы каталитического действия и характерные особенности пространственного строения гликозил-гидролаз.

1.7. Доменная структура некоторых 3~глюканаз и (З-глюкозидаз.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Бактериальные штаммы и плазмиды.

2.2. Химические реактивы и субстраты.:.

2.3. ПААГ-электрофорез белков и методы получения зимограмм.

2.4. Изоэлектрофокусирование и определение р1.

2.5. Определение концентрации белка.,.

2.6. Методы определения восстанавливающих Сахаров й глюкозы.

2.7. Методы определения ферментативной активности

0-глюканаз и (3-глюкозидаз.

2.8. Определение термостабршьности ферментов.

- з

2.9. Анализ продуктов гидролиза лихенана и ламинарина.

2.10. Изучение адсорбции на нерастворимых субстратах.

2.11. Определение константы Михаэлиса.

2.12. Изучение ретардации LamA при прохождении денатурирующего гель-электрофореза в ПААГ в присутствии растворимых субстратов.

2.13. Ультрафильтрация.

2.14. Определение локализации ферментов в E.coll.

2.15. Разрушение клеток ультразвуком.

2.16. Очистка рекомбинантных ферментов:.

2.16.1. Очистка р-глюкозидазы BglB.

2.16.2. Очистка р-(1, 3)-глюканазы LamA.

2.16.3. Очистка делеционных производных LamA.

2.17. Анализ аминокислотной последовательности LamA.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Анализ аминокислотной последовательности BglB.

3.2. Очистка BglB.

3.3. Характеристики BglB.

3.4. Анализ доменной структуры LamA и функций доменов.

3.5. Очистка LamA.

3.6. Строение делеционных производных LamA.

3.7. Очистка делеционных производных LamA.'.

3.8. Свойства LamA и ее делеционных производных.

3.9. Адсорбционные свойства делеционных производных LamA.82

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Характеристика продуктов генов кластера утилизации ламинарина Thermotoga neapolitana»

В последнее десятилетие появилось большое количество публикаций, посвященных исследованию ферментов, гидролизующих полисахариды - гликозилгидролаз. В связи с широкой распространенностью растений, богатых полисахаридами, гликозилгидро-лазы занимают важное ме.сто в биохимических исследованиях, направленных на решение задач биотехнологии, связанных с получением глюкозы из возобновляемых источников сырья.

Особенный интерес в последнее время проявляется в отношении .термостабильных ферментов. Это обусловлено их объективными преимуществами по сравнению с мезофильными аналогами: высокой стабильностью, меньшей вероятностью микробного заражения культуральной жидкости в процессе ферментации, высокой удельной активностью, снижением вязкости растворов как исходных веществ, так и продуктов гидролиза при высоких температурах.

Известно, что экстремально-термофильные эубактерии рода Thermotoga продуцируют высокостабильные ферменты, гидролизу-ющие полисахариды, которые присутствуют в геотермальных источниках - местах обитания этих бактерий. Гены некоторых из этих ферментов клонированы в E.coli [43, 61, 95, 196].

Нами были клонированы гены, -кодирующие эндо-ß-d,3)-глю-каназу (ламинариназу) LamA и ß-глюкозидазу BglB Thermotoga neapolitana [208]. Экстремальная стабильность этих ферментов позволяет использовать их в качестве удобной модели для исследования проблемы термостабильности белковых молекул. Изучение проблемы тепловой денатурации и механизмов термостабильности белковых молекул должно привести к значительному прогрессу в белковой инженерии и созданию биотехнологически совершенных ферментов. В свою очередь, понимание механизмов термостабильности белков тесно связано с пониманием принципов сворачивания (фолдинга) полипептидной цепи, а также сил, стабилизирующих белковые молекулы при высокой температуре.

Другим важным направлением современных исследований является изучение феномена мультидоменности некоторых гликозил-гидролаз. Изучение функциональных свойств различных классов доменов, принципов их организации и междоменных взаимодействий позволит конструировать мультидоменные белки с широким спектром заданных свойств.

LamA и BglB могут быть совместно использованы для переработки ламинарина, являющегося основным углеводным компонентом некоторых бурых водорослей, до глюкозы. LamA может найти применение в научных исследованиях для получения протопластов грибов и дрожжей, а также для гидролиза р(1-3,1-4)-глю-канов в пивоварении.

Целью настоящей работы было исследование функций и структуры термостабильных ферментов ламинариназы LamA и {Ьглюкозидазы BglB, участвующих в гидролизе ламинарина.

В ходе работы решались следующие задачи:

- разработка способа очистки рекомбинантной (5-(1,3)-глюка-назы LamA, а также ее делеционных производных.

- разработка способа очистки рекомбинантной р-глюкозидазы

BgiB.

- изучение физико-химических и ферментативных свойств указанных белков.

- исследование доменной структуры LamA и функциональных свойств ее доменов.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Бактерии рода Thermotoga и их глюканогидролазный комплекс.

Thermotoga - анаэробная грам-отрицательная спорообразую-щая экстремально-термофильная эубактерия, растущая при температурах 55-90 С с оптимумом около 80 С. Культуры этих бактерий были выделены из геотермальных источников морского дна [95]. По результатам секвенирования 16S рРНК она ближе всего к эубактериям, хотя близкого родства ни с одной из известных групп не ■ было найдено. В целом рост бактерии наблюдался в диапазоне pH от 5.5 до 9.О с оптимумом в районе pH 6.5. Подобный диапазон концентрации солей составляет от 0.25% до 3.75% с оптимумом около 2.7%. Thermotoga maritima способна утилизировать глюкозу, рибозу, ксилозу, галактозу, сахарозу, мальтозу, крахмал, гликоген, дрожжевой экстракт, а также цельный . клеточный экстракт эу- и археобактерий. Основными продуктами ферментации были С02, Н2. L(+)- лактат и уксусная к-та [95].

Целлюлазы и ксиланазы Thermotoga присутствуют в культу-ральной жидкости в виде отдельных ферментов (без образования комплексов типа целлюлосом Clostridium thermocellum, Rumino-coccus albus, Вас tero ides succinogenes и других [56]).

Для представителей рода Thermotogales было доказано наличие разнообразных сахаролитических ферментативных активностей, в частности, целлюлаз, р-ксиланаз, ламинариназы, p-D-ксилозидаз, (5-глюкозидаз, a-D-глюкуронидазы, a-L-араби-нозидазы и а-амилазы [43, 114, 158, 36].

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Волков, Илья Юрьевич

ВЫВОДЫ.

1. Разработаны схемы препаративного выделения из клеток E.coli и очистки до гомогенности рекомбинантных белков BglB и LamA, а также делеционных производных LamA.

2. Изучены физико-химические и ферментативные свойства BglB и LamA. Данные субстратной специфичности и анализ основных продуктов гидролиза показали, что LamA является эн-до-р-(1,3)-глюканазой (ламинариназой), a BglB - р-глюкозида-зой, специфичной к р-(1,3)—связям. При совместном действии BglB и LamA достигается полная конверсия растворимого 0-'(1, 3)-глюкана до глюкозы.

3. Проведено сравнительное изучение аминокислотных последовательностей LamA и BglB. BglB относится к семейству 3 гликозилгидролаз, а каталитический домен LamA - к семейству 16. LamA состоит из трех доменов. Методом делеционного анализа исследованы функции отдельных доменов и показано, что N- и С- концевой домены являются субстрат - связывающими доменами, специфичными в отношении р-(1, 3)-глюканов.

4. N- и С- концевой домены гомологичны друг другу и значительно отличаются от всех известных на сегодня субстрат -связывающих доменов, специфичных в отношении 0-(1,3)-глюка-нов, и представляют собой новый тип структуры таких субс-трат-связывающих доменов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Нами разработаны схемы препаративного выделения из клеток E.coli и очистки до гомогенности рекомбинантных белков BglB и LamA, а также делеционных производных LamA. Исследование субстратной специфичности и продуктов гидролиза показало, что LamA является ß(1,3)-глюканазой (ламинариназой), а BglB - ß(l, 3)-глюкозидазой (ламинарибиазой). Подробно изучены физико-химические и ферментативные свойства этих белков. Температурный оптимум активности LamA - 95°С, BglB - 90°С. pH оптимумы составили соответственно 6.2 и 5.5. Оба фермента высокостабильны и обладают высокой активностью. LamA является наиболее термостабильной из известных ламинариназ. Нами показано, что совместное использование LamA (специфичного к высокополимерным субстратам) и BglB (способного переводить в глюкозу продукты гидролиза ламинарина LamA) может быть использовано для переработки растворимых ß(l,3)-глюканов до глюкозы.

В результате анализа аминокислотной последовательности выявлены размеры доменов LamA и их предполагаемые границы. LamA обладает сигнальным пептидом из 17 а.к.о. Все делецион-ные производные LamA (Lig2, Lig4, Lig7, Lig8) обладают ß-(l, 3)-глюканазной активностью, что подтверждает предположение о том, что каталитический домен расположен в середине последовательности (аминокислотные остатки 200 - 480).

Нами были исследованы адсорбционные свойства делеционных производных LamA. При этом делеционные производные Lig2, Lig4, Lig7 адсорбировались на ß(l,3)-глюкан клеточной стенки дрожжей, а Lig8 не проявляла таких свойств. Таким образом, N- и С- концевые домены LamA являются субстрат-связывающими доменами (ССД), специфичными в отношении |5-(1,3)-глюканов. На рис. 28 указаны функциональная роль и границы доменов ЬатА. Поскольку не наблюдалось никакой значимой гомологии аминокислотной последовательности некаталитических доменов ЬатА с известными к настоящему моменту ССД, специфичными к р-(1,3)-глюканам, изученные нами ССД ЬатА следует считать новым типом ССД, специфичных в отношении таких субстратов.

18

200

480

646

LamA Lig2 Lig4 Lig7 Lig8 лидерныи пептид каталитический домен субстрат-связывающие домены повторяющиеся последовательности в составе ССД

Рис. ZS. Доменная структура LamA.

Согласно существующим представлениям, термостабильность белков не связана с какой-то специальной пространственной структурой, а обусловлена энергетическим выигрышем, связанным с повышением плотности укладки и жесткости полипептидной цепи, а также с усилением внутримолекулярных взаимодействий, стабилизирующих структуру белковой молекулы [20, 21, 39, 58, 62, 82, 99, 100, 108, 126, 146]. Предполагается, что представители семейства 16 гликозилгидролаз обладают одинаковой

- 89 пространственной структурой. Однако, эти ферменты значительно различаются по термостабильности (температурные оптимумы от 55 до 95°С).

Изученные нами физико-химические свойства ЬашА, в частности, влияние детергентов и этанола на стабильность, данные по зависимости пробега и количества белковых полос от времени инкубации в денатурирующем буфере при электрофорезе в ПААГ, уменьшение подвижности белковой зоны при проведении электрофореза с растворимыми субстратами в геле, свидетельствуют в пользу предположения о высокой жесткости и предельной стойкости к разворачиванию белковой глобулы ЬашА.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Волков, Илья Юрьевич, 1999 год

1. Келети Т. (1990) Основы ферментативной кинетики. М.:Мир, 1990.

2. Лопатин С. А., Варламов В.П., Даванков В.А. (1990) Лигандо-обменная хроматография белков и ферментов. Биоорганическая химия, т. 16, п.6, с.725-750.

3. Лопатин С.А., Варламов В.П. (1995) Новые тенденции в металло-хелат аффинной хроматографии белков. Прикладная биохимия и микробиология, т.31, п.3, с.259-266.

4. Мосолова Т.П., Калюжный С.В., Великодворская Г. А. (1993) Очистка и некоторые свойства эндоглюканазы С. thermocellum, образуемой рекомбинантным штаммом Escherichia coli. Биохимия, т. 58, вып.8, с.1213-1220.

5. Номенклатура ферментов. Москва, 1979.

6. Петушкова Е.В. (1972) Введение в кинетику ферментативных реакций. М. : Изд-во МГУ, 1972.

7. Синицын А.П., Черноглазов В.М., Гусаков A.B. (1993) Итоги науки и техники. Сер. биотехнология, т. 25. М.: ВИНИТИ, 59-66.

8. Сова В. В., Светашева Т. Г., Елякова Л. А. (1996) Изучение-(l,3)-глюканаз картофеля возможных участников защиты растений от патогенов. Биохимия, т.61, вып.3, с.514-524.

9. И.Сундукова Е. В., Елякова Л. А. (1990) Выделение, очистка и некоторые свойства эндо-р-1,3- и эндо-р-1,6- глюканаз из гребешка приморского. Всесоюзный симпозиум химия белков 21-26 мая 1990-- 92 г. в Тбилиси. Пущино, 1990.

10. Сундукова Е.В., Светашева Т.Г., Сова В.В., Елякова Л.А.(1990)

11. Действие различных реагентов на активность эндо-р-1,3- и эндо--($-1,6- глюканаз из гребешка приморского. Всесоюзный симпозиум химия белков 21-26 мая 1990 г. в Тбилиси. Пущино, 1990.

12. Тарчевский И.А., Марченко Г.Н. Биосинтез и структура целлюлозы. М: Наука, 1985, стр.11,24, 27,33.

13. Усов А.И., Чижов А.0. (1993) Новые данные о структуре ламина-рана из Chorda fHum (L.) и резервных глюканов из некоторых других бурых водорослей. Известия Академии Наук. Сер. химическая. 1993, п.9, с.1660-1664.

14. Халмурадов А.Г., Саттарова Р.С., Коннова Э.В. (1996) Выделение р-(1,3)-глюканазы из гриба Verticillum dahliae и некоторые ее свойства. Биохимия, т.61, вып.4, с.643-647.

15. Элберсгейм П., Дарвилл А.Г. (1985) Олигосахарины. В мире науки, 1985, п. И, с. 16-23.

16. Alt N., Creuzet N. and Cattaneo J. (1979) Characterization and properties of thermostable (3-glucosidase from Clostridium thermocellum. Biochem. Blophys. Res. Commun., v.90, pp.537-546.

17. Akiyama T., Kaku H., Shibuya N. (1996) Purification andproperties of a basic endo-1,3-beta-glucanase from rice (Oryza sativa L.). Plant Cell Physiol., 37(5):702-705.

18. Akiyama T., Shibuya N., Hrmova M., FincherG.B. (1997) Purification and characterization of a (1-3)-beta-D-glucan endohydrolase from rice (Oryza sativa) bran. Carbohydr. Res., V.297(4), pp.365-374.

19. Amelunxen R., Murdock A. (1978) Mechanisms of thermophily. CRC critical reviews in microbiology, dec.1978, pp.343-393.

20. Argos P., Rossmann M. G., Grau U.M., Zuber H., Frank G. and

21. Tratschin J.D. (1979) Thermal stability and protein structure. Biochemistry, v. 18, n. 25, pp. 5698-5703.

22. Aspinall G.0.(1980). Chemistry of cell wall polisaccharides. In: The biochemistry of plants.v.3. Acad. Press, NY,473-500 .

23. Bachman E.S. & McClay D.(1996) Molecular cloning of the firstmetazoan 0(1,3)-glucanase from eggs of the sea urchin Stron-gylocetrotus purpuratus. Proc. of Nat. Academy of Sciences USA, V. 93, pp. 6808-6813.

24. Bacon J.S.D., Farmer V.C., Jones D. and Taylor I.F. (1969)

25. The glucan components of the cell wall of baker's yeast (Saccharomyces cerevisiae) considered in relation to its ultrastructure. Biochemical Journal, v.114, pp.557-567

26. Bacon J.S.D., Gordon A.H., Jones D., Taylor I.F. & Webley D.M.1970) The separation of ($(1, 3)-glucanases prodused by Cytop-haga jonsonii and their role in lysis of yeast cell walls. Biochemical J., v.120, pp.67-78.

27. Bateman D.F. (1978) In: Biochemical aspects of plant-parasite relationships. Annual Proc. Phytochemical Society. Academic Press, London, 1978, pp.79-103.

28. Bauer M.W., Halio S.B., Kelly R.M. (1996) Proteases and glycosylhydrolases from hyperthermophilic microorganisms. Advances in Protein Chemistry, v.48, pp.271-310.

29. Bayer E.A., Chanzy H., Lamed R., Shoham Y. (1998) Cellulose, cellulases and cellulosomes. Current Opinion in Structural Biology, v.8, pp.548-557.

30. Beddell C.R., Blake C.C.F., Oatley S. J. (1975) An X-ray studyof the structure and binding properties of iodine- inactivated lysozyme. J. Mol. Biol., v. 97, p. 643.

31. Beerhues L., Kombrink E. (1994) Primary structure and expression of mRNAs encoding basic chitinase and 1,3-beta-glucanase in potato. Plant Mol. Biol., v.24(2), p.353-367.

32. Begiun P. (1983) Detection of cellulase activity in polyacry-lamide gels using Congo Red stained agar replicas. Anal. Biochemistry, v.133, pp.333-336.

33. Beguin P. (1990) Molecular biology of cellulose degradation. Annu. Rev. Microbiol., v.44, pp.219-248.

34. Beguin P., Millet J., Chauvaux S., Salamitou S.,Tokatlidis K., Navas J., Fuj'ino T., Lemaire M., Raynaud 0., Daniel M.-K. and Aubert J.-P. (1992) in: Biochemistry of plant polysaccharides, Biochemical Society Transactions, v. 20, pp. 42-46.

35. Black G.W., RixonJ.E., Clarke J. H., Hazlewood G. P., Theodorou

36. M.K., Morris P., Gilbert H.J. (1996) Evidence that linker sequences and cellulose-binding domains enhance the activity of hemicellulases against complex substrates. Biochem. J., v.319, pp.515-520.

37. Borriss R., Zemek J. (1980). Zentralbl. Bakteriol. Parasitenkd. Infektionskr. Hyg., Abt. II, 135, 696-703.

38. Boriss R.(1981) Purification and characterization of an extracellular f5-glucanase from Bacillus IMET B376. Zeitschrift fur Allgemeine Microbiologie, 21/1, pp.7-17.

39. Boriss R., Olsen 0., Thomsen K.K., von Wettstein D. (1989) Hybrid bacillus endo-(l-3, l-4)-|3-glucanases: construction of recombinant genes and molecular properties of the gene products. Carlsberg Res. Commun. vol. 54, p.41-54.

40. Borriss R., Buettner K., Maentsaelae P. (1990) Structure of thebeta-1, 3-1,4-glucanase gene of Bacillus macerans: homologies to other beta-glucanases. Mol. Gen. Genet., v.222(2-3), pp.278-283.

41. Bradford M.M. (1976) A rapid sensitive method for the actionof microgram quantities of protein utilizing the principle of protein dye binding. Anal. Biochem. v.72, pp.248-254

42. Breedveld M.W. and Miller K.J. (1994) Cyclic 0-glucans of members of the family Rhizobiaceae. Microbiological Reviews, v. 58, pp.145-161.

43. Bronnenmeier K., Kern A., Liebl W. and Staudenbauer W.(1995) Purification of Thermotoga maritima enzymes for the degradation of cellulotic.materials. Applied and Enviromental Microbiology, v.61,n.4, 1399-1407.

44. Brookhaven Protein Data Bank, access codes 1GBG, 1MAC.

45. Brookhaven Protein Data Bank, access code 1UL0.

46. Brookhaven Protein Data Bank, access code 1GHS, 1GHR.

47. Buliga G.S., Brant D.A. (1986) The sequence statistics and solution conformation of a barley (1-3, l-4)-f$-D-glucan. Carbohydrate Research, v.157, pp.139-156.

48. Chang M.M., CulleyD.E., Hadwiger L. A. (1993) Nucleotidesequence of a pea (Pisum sativum L.) beta-1, 3-glucanase gene. Plant Physiol., v.101(3), pp.1121-1122.

49. Chen L., Sadek M., Stone B.A., Brownlee R.T., Fincher G.B., Hoj P.B. (1995) Stereochemical course of glucan hydrolysis by barley (1-3)- and (1-3,l-4)-beta-glucanases. Biochim. Biophys. Acta, v. 1253, n. 1, pp. 112-116.

50. Chye M.L., Cheung K. Y. (1995) Beta-1,3-Glucanase is highlyexpressed in laticifers of Hevea brasiliensis. Plant Mol. Biol. V.29(2), pp.397-402.

51. Clarke A.J. (1987) Essential tryptophan residues in the function of cellulase from Schizophyllum commune. Biochem. Biophis.Acta v. 912, pp. 424-431.

52. Connely I.e., Coughlan M.P. (1991) Isolation and characterization of two endo-^-glucanases from solid-state cultures of the anaerobic fungus Penicillium capsulatum. Enzyme Microb. Technol.,v.13, 462-469.

53. Copa-Patino J.L., Reyes F., Perez-Leblic M.I. (1989) Purification and properties of a 1,3-beta-glucanase from Penicillium oxalicum autolysates. FEMS Microbiol. Lett. 53(3):285-291.

54. Coughlan M.P., Ljundahl L.G. (1988) Comparative biochemistry of fungal and bacterial cellulotic enzyme systems. FEMS Symp. 43, Acad. Press, pp.11-30.

55. Coutinho J.B. ,Gilkes N. R., Warren R. A., Kilburn D.G., Miller R.-J1992) The binding of Cellulomonas fimi endoglucanase C (CenC) to cellulose and sephadex is mediated by the N-terminal repeats. Mol'. Microbiol., v. 6, p. 1243.

56. Cutler R.L., Yellowlees D. (1979) Purification and characterisation of two endo-(l linked to 3)-beta-D-glucanases from Telescopium telescopium. Carbohydr. Res. 75:221-229.

57. Dill K.A. (1985) Theory for the folding and stability of globular proteins. Biochemistry, v.24, pp.1501-1509.

58. Doi K. & Doi A. (1986) Cloning and expression in E.coli of the gene for an Arthobacter 0-1,3-glucanase. J. of Bacteriology, v.168, n.3 , pp.1272-1276.

59. Edington B.V., Lamb C.J., Dixon R.A. (1991) cDNA cloning andcharacterization of a putative 1,3-beta-D-glucanase transcript induced by fungal elicitor in bean cell suspension cultures. Plant Mol. Biol., V.16(l), pp.81-94.

60. Erfle J.D. & Teather R.M. (1991) Isolation and properties of a p-i,3-D-glucanase from Ruminococcus flavefacience. Applied and Environmental Microbiology, v.57, n.1, pp.122-129

61. Ferrer P., Halkier T., Hedegaard L., Savva D., Diers I. and

62. Fleet G.H. and Phaff H.J. (1974) Lysis of yeast cell walls:glucanases from Bacillus circulans WL12. J. Bacteriology, v.119, pp.207-219

63. Flint H.J., Martin J., McPherson C.A., Daniel A. S. and Zhang

64. J.-X. (1993) A bifunctional enzyme, with separate xylanase and p(1,3-1,4)-glucanase domains, encoded by the xynD . gene of Ruminococcus flavefaciens. J. Bacteriol., 175, 2943-2951.

65. Fontaine T., Hartland R., Beauvais A., Diaquin M., Latge J. (1997) Purification and characterization of endo-1,3-betaglucanase from Aspergillus fumigatus. Eur.J. Biochem. 243:315-321.

66. Gheysen G., Inze D., Soetaert P., Van Montagu M., Castresana C. (1990) Sequence of a Nicotiana plumbaginifolia beta(l,3)-glucanase gene encoding a vacuolar isoform. Nucleic Acids Res. v.18(22), pp.6685.

67. Gilbert H.J. and Hazlewood G.P.(1993) Bacterial cellulases and xylanases. J. of General Microbiology 139, 187-194.

68. Gilkes N. R., Warren R.A.J., Miller R.C. and KilburnD.G.1988) Precise excision of the cellulose binding domains from two Cellulomonas fimi cellulases by a homologous protease andthe effect on catalysis. J. Biol. Chem., v. 263, pp.10401--10407.

69. Gilkes N. R., Kilburn D.G., Miller R. C. and Warren R.A.J.1989) Structural and functional analysis of bacterial cellulase by proteolysis. J. Biol. Chem., 264, 17802-17808.

70. Gilkes N.R., Henrissat B., KilburnD.G., Miller R.C. and Warren R.A.J. (1991) Domains in microbial 0-1,4-glycanases: sequence conversation, function and enzyme families. Microbiol. Rev., 55, 303-315.

71. Golovchenko N.P., Kataeva I.A. and Akimenko V.K. (1992)

72. Elucidation of the role of hydrophobic interactions in the adsorption of endo-1,4-p-glucanases on polysaccharides. Enzyme Mirrob. Biotechnol., v.14, 327-330.

73. Gosalbes M.J., Perez-Gonzales J.A., Gonzales R. & Navarro A. (1991) Two p-glucanase genes are clustered in Bacillus poly-mixa: molecular cloning, expression, and sequence analysis of genes encoding a xylanase and endo-p(1,3;1,4)-glucanase.

74. J. of Bacteriology, v. 173, n. 23, pp. 7705-7710.

75. Grabnitz F., Rucknagel K.P., Seis M., Staudenbauer W.L. (1989) Nucleotide sequence of the Clostridium thermocellum bglB gene encodind thermostable ¡3-glucosidase B: homology to fungal |3-glucosidases. Mol Gen Genetics, v. 217, pp. 70-76.

76. Gueguen Y., Voorhorst W.G., van der Oost J., de Vos W.M. .(1997). Molecular and biochemical characterization, of an endo-beta-1,3- glucanase of the hyperthermophilic archaeon Pyrococcus furiosus. J. Biol. Chem., v.272(50), p.31258-64.

77. Hahn M., Piotukh K., Boriss R. and Heinemann U. (1994) Nativelike in vivo folding of a circularly permuted jellyroll protein shown by crystal structure analysis. Proceedings of the Nat. Academy of Sciences USA, v.91, pp. 10417-10421.

78. Hahn M., Pons J., Planas A., Querol E., Heinemann U. (1995a) Crystal structure of Bacillus licheniformis 1,3-1,4-beta-D-glucan-4-glucanohydrolase at 1.8 A resolution. FEBS Lett., V.374(2), pp.221-224.

79. Hahn M., Keitel T., Heinemann U. (1995b) Crystal and molecular structure at 0.16-nm resolution of the hybrid Bacillus endo--1, 3-1, 4-beta-D-glucan 4-glucanohydrolase H(A16-M).

80. Eur. J. Biochem., v.232(3), pp.849-858.

81. Henrissat B. (1991) A classification of glycosyl hydrolases based on amino acid sequence similarities. Biochemical J., v.280, pp.309-316.

82. Henrissat B. and Bairoch A. (1993) New families in the classification of glycosil hydrolases based on amino acid similarities. Biochem. J., v.293, pp.781-788.

83. Hien N.H., Fleet G.H. (1983) Separation and characterization of six (1 leads .to 3)-beta-glucanases from Saccharomyces cerevisiae. J.Bacteriol., v.156(3), pp.1204-1213.

84. Hirayama T., Horie S., Nagayama H., Matsuda K. (1978) Studies on cellulases of a phytopathogenic fungus, Pyricularia oryzae cavara. II. Purification and properties of a beta-glucosidase.- 101

85. J. Biochem. (Tokyo), v.84(1), pp.27-37.

86. Hoj P.B., Hartman D.J., Morrice N. A., Doan D.N., Fincher G.B.1989) Purification of (1—>3)-beta-glucan endohydrolase isoenzyme II from germinated barley and determination of its primary structure from a cDNA clone. Plant Mol. Biol., v. 13(1), v.31-42.

87. Hofemeister J., Kurtz A., Borris R., Knowles J. (1986) The p-glucanase gene from Bacillus amyloliquefacience shows ew-tensive homology with that of Bacillus subtilis. Gene, v.49, pp.177-187.

88. Horitsu H., Satake T., Tomoyeda M. (1973) Agricultural Biological Chemistry, 37, 1007-1012 (1973).

89. Huber R. and Bennett W. (1983) Functional significance of flexibility in proteins. Biopolimers, v.22, pp.261-279.

90. Huber R., Langworthy Th.A., Konig H., Thomm M., Woese C., Sleytr U., Stetter K. (1986) Thermotoga maritima sp.nov. represents a new genus of unique extremely thermothilic eubacteria growing up to 90 C. Arch.Microbiol. 144:324-333 .

91. Instructions: DIAFLO ultrafilters type YM. Amicon scientificsystems division, publ. No.I-188C.

92. Isakov V.V., Sova V.V., Denisenko V. A., Sakharovsky V. G.,

93. Elyakova L.A., Dzizenko A.K. (1972) A study of the action of laminarinases from Spisula sachalinensis by the use of nuclear magnetic resonance. Biochim. Biophys. Acta, v.268(1), pp.184-186.

94. Jaenicke R. and Zavodszky P. (1990) Proteins under extreme physical conditions. FEBS Letters, v. 268, pp. 344-349.

95. Jaenicke R. (1991) Protein stability and molecular adaptation to extreme conditions. Eur. J. Biochem., 202, 715-728.

96. Jeffcoat R., Kirkwood S. (1987) Implication of histidine at the active site of exo-beta-(l-3)-D-glucanase from Basidiomycete sp. QM 806. J. Biol. Chem. 262(3): 1088-1091.

97. Johnson P.E., Joshi M.D. Tomme P., Kilburn D.G. and Mcintosh L.P. (1996) Structure of the N-terminal cellulose-binding domain of Cellulomonas fimi CenC determined by Nuclear Magnetic Resonance spectroscopy. Biochemistry, v.35, pp.14381.

98. Juy M., AmitA.G., Alzari P.M., PoljakR.J., Claeyssens M., Beguin P. and Aubert J.-P. (1992) Three dimentional structure of a thermostable bacterial cellulase. Nature, 357, 89-91.

99. Keitel Th., Granzin J., Simon 0., Boriss R., Thomsen K.K., Wessner H., Hohne W., Heinemann U. (1991) Crystallization of the hybrid bacillus (1-3,l-4)-p-glucanase H(A16-M). J. Mol. Biol., V.218, 703-704.

100. Keitel Th.,Simon 0., Boriss R., Heinemann U. (1993) Molecular- 103 and active site structure of a Bacillus (1, 3-1,4)-p-glucana-se. Proc. Natl. Academy Sci. USA, v.90, n.11, pp.5287-5291.

101. Kelly R.M. & Brown S.H. (1993) Enzymes from high-temperature microorganisms. Current opinion in Biotechnology, 4, 188-192.

102. Knowles J., TeeriT.T., Lehtovaara P., PenttilaM., Saloheimo M. (1988) The use of gene technology to investigate fungal cellulolytic enzymes. Biochemistry and Genetics of Cellulose Degradation. FEMSSymp., pp.153-169. London: Academic.

103. Kohchi C. and Toh-e A. (1985) Nucleotide sequence of Candida pelliculosa p-glucosidase gene. Nucl. Acids Research, v.13, n.17, pp.6273-6282.

104. Krah M., Misselwitz R., Politz 0., Thomsen K.K., Welfle H.

105. Borriss R. (1998) The laminarinase from thermophilic eubac-terium Rhodothermus marinus conformation, stability, and identification of active site carboxylic residues by site-directed mutagenesis. Eur. J. Biochem. v.257(1), pp.101-111.

106. Laemmli U.K. (1970) Cleavage of structural priteins during the assambly of the head bacteriophage T4. Nature, v.227, pp. 680-685.

107. Lepagnol-Descamps V., Richard C., Lahaye M., Potin P., Yvin J.C., Kloareg B. (1998) Purification and determination of the action pattern of Haliotis tuberculata laminarinase. Carbohydr. Res., v.310(4), pp.283-289.

108. Liebl W., Stemplinger I., Ruile P. (1997) Properties and gene structure of the Thermotoga maritima alpha-amylase AmyA, a putative lipoprotein of a hyperthermophilic bacterium.

109. J. Bacteriol. v.179(3),pp.941-948.

110. Linthorst H.J., Melchers L.S., Mayer A., van Roekel J.S., Cornelissen B.J., Bol J.F. (1990) Analysis of gene families encoding acidic and basic beta-1, 3-glucanases of tobacco.

111. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, v.87(22), pp.8756-8760.

112. Lloberas J., Querol E., Bernues J. (1988) Purification and characterization of endo-0-1,3-1,4-glucanase activity from Bacillus licheniformis. Appl. Microbiol. Biotechnol.29:32-38.

113. Lloberas J., Perez-Pons J.A., Querol E. (1991) Molecular cloning, expression and nucleotide sequence of the endo-0--1,3-1,4-D-glucanase gene from Bacillus licheniformis. European J. of Biochem. v. 197, pp. 337-343.

114. Love D., Streiff M. and Bergquist P.L. (1986) Molecular cloning of a 0-glucosidase gene from an extremely thermophilic anaerobe in E.coli and B.subtilis. Proceedings Seventh Australian Biotechnology Conference, pp.207-210.

115. Love D.R., Fisher R., Bergquist P.L. (1988) Sequence structure and expression of a cloned 0-glucosidase gene from an extreme thermophile. Mol Gen Genetics, v.213, n.1, pp.84-92.

116. Mackenzie L.F., Brooke G.S., Cutfield J.F., Sullivan P.A., Withers S.G. (1997) Identification of Glu-330 as catalytic nucleophile of Candida albicans exo-beta-(l, 3)-glucanase. J. Biol. Chem.1997 FEB 7;272(6):3161-3167.

117. MacLeod A.M., LindhorstT., Withers S.G. and Warren A.J. (1994) The acid/base catalyst in the exoglucanase/xylanase from Cellulomonas fimi is glutamic acid 127: evidence from detailed kinetic studies of mutants. Biochemistry, 33, 6371-6376.

118. Maoris B.J. (1984) Production and characterization of cellula-se and 0-glucosidase from a mutant of Alternarla alternata. Applied and Enviromental Microbiology, v.47, pp.560-565.

119. Maniatis T., Fritsch E.F., Sambrook J. (1982) Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor, N. Y.

120. Manners D.J., Wilson G.(1973) Studies on beta-glucanases. Some- 105 properties of a bacterial endo-beta-(l leads to 3)-glucanase system. Biochem. J., v.135(1), pp.11-18.

121. Matsuzawa T., Tsunetomo, Amano, Yoshihiko, Kubo, Mitsuru, Kanda, Takahisa. (1996) Mode of action of exo-(l, 3)-fl-gluca-nase from Trichoderma pseudokonigii TM37 on various (l,3)-p-glucans. Seibutsu Kogaku Kaishi v.74(4), pp.261-267.

122. Matthews B.W., Nicholson H., BecktelW.J. (1987) Enhanced protein thermostability from site-directed mutations that decrease the entropy of unfolding. Proc. of National Academy of Sciences USA, v.84, pp. 6663-6667.

123. McFadden G.I., Ahluwalia B., Clarke A.E. and Fincher G.B. (1988) Expression sites and developmental regulation of genes encoding (1-3,l-4)-p-glucanases in germinating barley. Planta, v.173, pp.500-508.

124. McHale A. and Coughlan M.P. (1981) The cellulolytic system of Talaromyces emersonii. Purification and characterization of the cellular and intracellular p-glucosidases. Biochimica et Biophysica Acta, v.662, pp.152-159.

125. Meinke A., Braun C., Gilkes N.R., Kilburn D.G., Miller R.C. and Warren R.A. (1991) Unusual sequence organization in CenB, an inverting endoglucanase from Cellulomonas fimi. J.Bacteriology, v.171, pp.308-314.

126. Miller G.L. (1959) Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugars. Analytical chemistry, v.31, pp.426-428.

127. Miller G.L., Blum R., Glenon W.E. and Burton A.L. (1960) Me-asurment of carboxymethylcellulase activity. Anal. Biochem., 2, 127-132.

128. Mini-PROTEAN II Electrophoresis Cell. Instruction Manual. Cat.No.165-2940.- 106

129. Miyazaki T., Yadomae T., Yamada H., Oikawa N. (1977) An endo-(l leads to 3)-beta-D-glucanase from Mucor hiemalis. Carbohydr. Res. 55:65-72.

130. Moore, A.E., Stone, B.A. (1972) A -1,3-glucan hydrolase from Niootiana glutinosa. I. Extraction, purification and physical properties. Biochim Biophys Acta., v.258(1), pp.238-247.

131. Moore A.E., Stone B.A. (1972) A beta-I,3-glucan hydrolase from Nicotiana glutinosa. II. Specificity, action pattern and inhibitor studies. Biochim. Biophys. Acta, v.258(1), pp.248-264.

132. Mrsa V., Klebl F., Tanner W. (1993) Purification and characterization of the Saccharomyces cerevisiae BGL2 gene product, a cell wall endo-beta-1,3-glucanase. J. Bacteriol. 175(7):2102-2106.

133. Murphy N.D., McConnell D.J. and Cantwell B.A. (1984) The DNA sequence of the gene and genetic control sites for the excreted B. subtilis enzyme p-glucanase. Nucleic Acids Res., v.12, pp. 5355-5367.

134. Nogi Y., Horikoshi K. (1990) A thermostable alkaline 1,3-p-glucanase produced by alkalophilic Bacillus sp. AG-430. Appl. Microbiol. Biotechnol. 32, 704-707.

135. Noronha E.F., Ulhoa C.J. (1996) Purification and characterization of an endo-beta-1,3-glucanase from Trichoderma harzianum. Can. J. Microbiol. 42(10):1039-1044.

136. Olsen 0., Borrlss R., Simon 0., Thomsen K.K. (1991) Hybrid Bacillus (1-3,l-4)-ß-glucanases: engineering thermostable enzymes by construction of hybrid genes. Mol. Gen. Genet., 255, 117-185.

137. Olsen 0., Thomsen K.K., Weber J., Duus J.O., Svendsen I.,

138. Phillips D.C. (1966)The three-dimensional structure of enzyme molecule. Scientific American, 215(5), 78-90.

139. Pölitz 0., Simon 0., Olsen 0. and Boriss R. (1993) Determinants for the enhanced thermostability of hybrid (1-3,1-4)--ß-glucanases. Eur.J.Biochem., v.216, pp.829-834.

140. Rao M., Deshpande V.V., Gaikwad S., Mishra C. (1991) Lamina-rinase from Penicillium funiculosum and its role in release of beta-glucosidase. Biotechnol. Appl. Biochem., v. 13, n. 2,pp.277-285.

141. Rapp P. (1992) Formation, separation and characterization of three beta-1,3-glucanases from Sclerotium glucanicum. Biochim. Biophys. Acta 1117(1):7-14.

142. Raven P.H., Evert R.F., Eichorn S.E. "Biology of plants".1. Worth Publishers, 1986.

143. Raynal A., Gerbaud C., Francingues M.C., Guerineau M. (1987) Sequence and transcription of the (S-glucosidase gene of Kluy-veromyces fragills cloned in Saccharomyces cerevisiae. Current Genetics, v.12, n.3, pp. 175-184.

144. Read S.M., Currie G., Bacic A. (1996) Analysis of the structural heterogeneity of laminarin by electrospray-ionisation-mass spectrometry. Carbohydr. Res. 281(2):187-201.

145. Reichelt B.Y., Fleet G.H. (1981) Isolation, properties, function, and regulation of endo-(l leads to 3)-beta-glucana-ses in Schizosaccharomyces pombe. J.Bacteriol., v.147(3), pp.1085-1094.

146. Righetti P.G. Isoelectric focusing: theory, methodology and applications. Elsevier Biomedical Press, Amsterdam, 1983.

147. Rombouts F.M., Phaff H.J. (1976) Lysis of yeast cell walls. Lytic beta-(l leads to 3)-glucanases from Bacillus circulans WL-12. Eur. J. Biochem., v.63(1), pp.121-130.

148. Rouvinen J., Bergfors T., Teeri T., Knowles J.K.C., Jones T.A. (1990) Three-dimensional structure of cellobiohydrolase II from Trichoderma reesei. Science, v.249, pp. 380-386.

149. Structure of the Clostridium thermocellum gene licB and the encoded beta-1,3-1,4-glucanase. A catalytic region homologous- 110 to Bacillus lichenases joined to the reiterated domain of clostridial cellulases. Eur. J. Biochem. 204, 13-19.

150. Schwarz W.H., Schimming S. & Staudenbauer W.L. (1988). Isolation of a Clostridium thermocellum gene encoding a thermostable beta-1,3-glucanase (laminarinase). Biotechnology Lett. v.10, pp.225-230.

151. Shen S.-H., Chretien P., Bastien L. & Slilaty S.N. (1991)

152. Primary sequence of the glucanase gene from Oerskovia xanthi-neolytica. J. of Biol. Chemistry, v.266, n.2, pp.1058-1063.

153. Skory C.D., Freer S.N., Bothast R.J. (1996) Properties of an intracellular beta-glucosidase purified from the cellobiose-fermenting yeast Candida wickerhamii. Appl. Microbiol. Biotechnol.,v.46(4), pp.353-359.

154. Sova V.V., Elyakova L.A., Vaskovsky V.E. (1970) Purification and some properties of beta-1,3-glucan glucanohydrolase from the crystalline style of bivalvia, Spisula sachalinensis. Biochim. Biophys. Acta, v.212(1), pp.111-115.

155. Sperisen C., Ryals J., Meins F. (1991) Comparison of cloned genes provides evidence for intergenomic exchange of DNA in the evolution of a tobacco glucan endo-1, 3-beta-glucosidase gene family. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, v.88(5), pp.1820-1824.

156. Tamura H., Tanaka S., Oda T., Uemura Y., Aketagawa J., Hashimoto Y. (1996) Purification and characterization of a (1-3)-beta-D-glucan-binding protein from horseshoe crab (Tachyleus tridentatus) amoebocytes. Carbohydr. Res.295:103-116.

157. Tanaka H. and Paff H.J. (1965) Enzymatic hydrolysis of yeast cell walls. I. Isolation of wall-decomposing organisms and separation and purification of lytic enzymes. J.Bacteriol., v.89, pp.1570-1580.

158. Tanaka H., Ogasawara N., Nakajima T. and Tamari K. (1970) Cell walls of Piricularia oryzae. I. Selective enzymolysis of Piricularia oryzae cell walls by wall-lytic enzymes of Bacillus circulans WL-12. J. General Applied Microbiology, v.16, pp.39-60.

159. Thimmapuram J. and Korban S.S. (1996) Characterization andinduction of a peach 0-1,3-glucanase gene. 1996 Meeting of Ann. Soc. of Plant Physiologists, poster 526; supplement to Plant Physiol, v.lll, n.2.

160. Tingle M.A., Halvorson H.0. (1971) A comparison of 0-glucanase- 112 and p-glucosidase In Saccharomyces lactls. Biochim. Biophys. Acta, v.250(1), pp.165-171.

161. Tomme P., Warren R.A.J, and Gilkes N.R. (1995). Cellulose Hydrolysis by Bacteria and Fungi. Advances in Microbial Physiology, 37, 1-81.

162. Totsuka A., Usui T. (1986) Agricultural Biological Chemistry, 50, 543-550.

163. Tull D. & Withers S.G. (1994) Mechanisms of cellulases and xylanases: a detailed kinetic study of the exo-p-1,4-gluca-nase from Cellulomonas fimi. Biochemistry, v.33, pp.6363--6370.

164. Turkiewicz M., Kalinowska H., Galas E. (1991) An endo-(l-3)--beta-glucanase and a collagenol.ytic serine proteinase from Euphausia superba Dana (Antarctic krill). Acta Biochim. Pol., v.38(1), pp.79-85.

165. Uknes S., Mauch-Mani B., Moyer M., Potter S., Williams S., Dincher S., Chandler D., Slusarenko A., Ward E., Ryals J. (1992) Acquired resistance in Arabidopsis. Plant Cell., v. 4(6), pp.645-656.

166. Umezurike G.M. (1979) The p-glucosidase from Botryodiplodia theobromae. Mechanism of enzyme-catalysed reactions. Biochemical Journal, v.179, pp.503-507.

167. Van K.T.T., Toubart P., Cousson A., Darvill A.G., Gollln D.J., Chelf P. and Albersheim (1985) Manipulation of the morphoge-netic pathways of tobacco explaints by oligosaccharins.- 113

168. Nature, v.314, n.6012, pp. 615-617.

169. Varghese J.N., Garrett T.P., C.olman P.M. , Chen L., Hoj P.B., Fincher G.B. (1994) Three-dimensional structures of two plant beta-glucan endohydrolases with distinct substrate specificities. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, v.91, n.7, pp.2785-2789.

170. Villa T.G., Notario V., Villanueva J.R. (1979) Occurrence ofan endo-1,3-beta-glucanase in culture fluids of the yeast Candida utilis. Purification and characterization of the enzyme activity. Biochem. J., v.177(1), pp.107-114.

171. Vogelsang R., Barz W. (1993) Purification, characterizationand differential hormonal regulation of a beta-1,3-glucanase and two chitinases from chickpea (Cicer arietinum L.). Planta 189(1):60-69.

172. Watanabe T., Suzuki K., Oyanagi W., Ohnishi K. and Tanaka H. (1990) Gene cloning chitinase A1 from Bacillus circulans WL-12 revealed its evolutionary relationship to Serratia chitinase and to the-typeIII homology units of fibronectin.

173. J. Biol. Chemistry, v.265, pp.15659-15665.

174. Watanabe T., Kasahara N., Aida K. and Tanaka H. (1992) Three N-terminal domains of 0-1, 3-glucanase A1 are involved in binding to insoluble 0-1,3-glucan. J. of Bacteriology, v. 174, n. 1, pp. 186-190.

175. Winterhalter C. and Liebl W. (1995) Two extremely thermo- . stable xylanases of the hyperthermophilic bacterium Thermo-toga maritima MSB8. Appl. Environ. Microbiol., 61,1810-1815.- 114

176. Winters A., Gallagher J., Barron N., Rollan A., McHale A.P. (1996) Molecular cloning and expression of a Micromonospora chalcae beta-glucosidase encoding gene in Escherichia coli. Biotechnol. Lett., v.18(12), pp.1387-1390.

177. Wood T.M. and McRae S.I. (1982) Purification and some properties of the extracellular p-D-glucosidase of the cellulolytic fungus Trichoderma konigii. J. of General Microbiology, V.128, pp.2973-2982.

178. Wood T.M. and Bhat K.M.(1988) Methods for measuring cellulase activities. Methods Enzymology v.160, pp.87-112.

179. Woodward J.R. & Fincher G.B. (1982) Purification and chemical properties of two 1,3;1,4-p-glucan endohydrolases from germinating barley. Eur. J. of Biochemistry, v.121, pp. 663669.

180. Wu S., Kriz A.L., Widholm J.M. (1994) Nucleotide sequence of a maize cDNA for a class II, acidic beta-1, 3-glucanase. Plant Physiol., v.106(4), pp.1709-1710.

181. Xu P., Wang J., Fincher G.B. (1992) Evolution and differential expression of the (l->3)-beta-glucan endohydrolase-encoding gene family in barley, Hordeum vulgare. Gene, v.120(2), pp.157-165.

182. Yahata N., Watanabe T., Nakamura Y., Yamamoto Y., Kamimiya S., Tanaka H. (1990) Structure of the gene encoding (5-1,3-gluca-nase A1 of Bacillus circulans WL-12. Gene, v.86, pp.113-117.

183. Zverlov V.V., Fuchs K.P., Schwarz W.H., Velikodvorskaya G.A. (1994) Purification and cellulosomal localization of Clostridium thermocellum mixed linkage (5-glucanase LicB1,3-1,4-0-D-glucanase). Biotechnol. Letters, v.16, pp.29-31

184. Zverlov V.V., Volkov I.Y., Velikodvorskaya T.V. and Schwarz W (1997) Thermotoga neapolitana bglB gene, upstream of lamA encodes a highly thermostable 0-glucosidase that is a lamina-ribiase. Microbiology, v.143, 3537-3542.