Клиническое значение фактора роста эндотелия сосудов (ФРЭС) при раке молочной железы тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.00.14, кандидат медицинских наук Алиева, Севиндж Камил кызы

• Алиева, Севиндж Камил кызы
• кандидат медицинских наук
• 2003

Оглавление диссертации кандидат медицинских наук Алиева, Севиндж Камил кызы

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Общие представления об ангиогенезе и механизмах его регуляции.

1.2. Роль ФРЭС в регуляции ангиогенеза при раке молочной железы.

1.3. Клиническое значение определения ФРЭС при раке молочной железы.

1.4. ФРЭС-зависимый ангиогенез как мишень противоопухолевой терапии при раке молочной железы.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Характеристика больных.

2.2. Получение и обработка тканей.

2.3. Получение сыворотки крови.

2.4. Определение свободного фактора роста эндотелия сосудов в цитозолях опухолей и сыворотке крови.

2.5. Иммуноферментное определение содержания общего ФРЭС в сыворотке крови.

2.6. Определение рецепторов стероидных гормонов.

2.7. Статистический анализ данных.

Глава 3. Результаты исследования и их обсуждение

3.1. Содержание свободного и общего ФРЭС в сыворотке крови больных раком молочной железы и здоровых доноров.

3.2. Сравнение содержания свободного и общего ФРЭС в сыворотке крови больных раком молочной железы до и после удаления первичной опухоли.

3.3. Взаимосвязь содержания общего и свободного ФРЭС в сыворотке крови больных РМЖ с клинико-морфологическими особенностями заболевания.

3.4. Сравнение содержания свободного ФРЭС в злокачественных опухолях, фиброаденомах и гистологически неизмененных тканях молочной железы.

3.5. Взаимосвязь содержания свободного ФРЭС в цитозолях опухолей больных РМЖ с клинико-морфологическими особенностями заболевания.

3.6. Соотношение концентраций ФРЭС в сыворотке крови и опухолях больных РМЖ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Клиническое значение фактора роста эндотелия сосудов (ФРЭС) при раке молочной железы»

Актуальность проблемы. Рак молочной железы - одно из самых распространенных онкологических заболеваний у женщин. Статистические данные последних лет свидетельствуют о неуклонном росте заболеваемости и смертности от рака молочной железы, несмотря на значительный прогресс в лечении заболевания, достигнутый благодаря увеличению чувствительности диагностических процедур и совершенствованию хирургических и лекарственных методов лечения (Н.Н. Трапезников и Е.М.Аксель, 2001) .

В связи с этим не теряет своей актуальности разработка новых подходов к общему прогнозу заболевания и выбору наиболее адекватных схем лечения для каждой больной. Большое внимание в этой области уделяется различным молекулярным и клеточным маркерам, характеризующим фундаментальные биологические свойства опухоли (Роекеш е1 а1., 1991; Н.Е.Кушлинский и Е.С.Герштейн, 2001; Е.С.Герштейн и Н.Е.Кушлинский, 2002). Они могут быть полезны, по крайней мере, в трех ситуациях: во-первых, для выявления пациентов с очень хорошим прогнозом, для которых осложнения и стоимость адъювантного лечения не будут оправданы имеющимся риском рецидива; во-вторых, для выявления группы больных с очень плохим прогнозом, которым требуется более агрессивное адъювантное лечение, и, в-третьих, для определения чувствительности или резистентности больных к конкретным видам терапии. Кроме того, на основании исследования молекулярнобиологических особенностей опухоли может быть создана новая стратегия лечения, непосредственно влияющая на определенные молекулы и процессы. Знание специфических биологических характеристик опухоли может помочь и в усовершенствовании существующих схем терапии, и в развитии новых подходов к лечению.

В последние годы большое внимание уделяется проблеме неоангиогенеза в злокачественных опухолях. Уже не вызывает сомнения тот факт, что опухоль не может развиваться и расти без образования в ней разветвленной сети сосудов, обеспечивающих снабжение клеток кислородом и питательными веществами (Le Querrec et al, 1993; Salven et al, 1997). Изучение молекулярных механизмов ангиогенеза позволило перейти от микроскопической оценки плотности сосудов в опухолевой ткани к исследованию конкретных молекул, участвующих в регуляции образования и роста новых сосудов в опухолевой ткани. Ведущая роль среди таких регуляторов, безусловно, принадлежит фактору роста эндотелия сосудов (ФРЭС) (Ferrara et al, 1995; Donovan et al, 1997). Доказано, что ФРЭС играет, в частности, ключевую роль в неоваскуляризации рака молочной железы (Toi et al, 1996; Borgstrom, 1999; Brown et al, 1999).

Результаты ряда ретроспективных клинических исследований, опубликованные в самое последнее время, свидетельствуют о том, что экспрессия ФРЭС при раке молочной железы имеет, по-видимому, существенное значение для прогноза заболевания (Harris et al, 1996; Eppenberger et al, 1998; Locopo et al, 1998; Gasparini, 2000; Linderholm et al,

2000), а также влияет на чувствительность опухолей к гормональному и лекарственному лечению (Gasparini et al, 1999; Adams et al, 2000). Кроме того, в настоящее время активно создаются и исследуются новые препараты с антиангиогенными свойствами (Klauber et al, 1997; Asano et al, 1999; Eisen et al, 2000), и оценка активности ФРЭС-зависимого ангиогенеза может стать основой для их целенаправленного применения.

В литературе, тем не менее, не существует до настоящего времени единого мнения о преимуществах тех или иных методов или субстратов (опухоль, кровь) для клинически значимого определения ФРЭС при раке молочной железы (Toi et al, 1996; Yamamoto et al, 1996; Kraft et al, 1999; Callagy et al, 2000). Все это и определило цель и задачи настоящего исследования.

Цель работы: оценить клинические перспективы исследования содержания фактора роста эндотелия сосудов (ФРЭС) в опухолях и сыворотке крови больных раком молочной железы.

Задачи исследования:

1. Иммуноферментными методами определить концентрацию свободного и общего ФРЭС в цитозолях опухолей и сыворотке крови больных раком молочной железы и оценить взаимосвязь между этими показателями.

2. Проследить динамику изменений содержания ФРЭС в сыворотке крови больных РМЖ после удаления первичной опухоли.

4. Проанализировать взаимосвязь частоты и уровня экспрессии ФРЭС в опухолях и его концентрации в сыворотке крови больных РМЖ с возрастом и менопаузным статусом больных, стадией заболевания и отдельными показателями системы ТЫМ, морфологическими и рецепторными характеристиками опухоли.

5. Выделить биохимический показатель, наиболее адекватно отражающий состояние процессов ангиогенеза при раке молочной железы.

Научная новизна: Впервые параллельно определено содержание свободного и общего ФРЭС в сыворотке крови до и после операции, а также свободного ФРЭС в опухолях и гистологически неизмененных тканях больных раком молочной железы и в фиброаденомах. В результате этого исследования впервые показано, что только содержание свободного ФРЭС увеличено в сыворотке крови больных РМЖ и взаимосвязано с уровнем экспрессии ФРЭС в опухолевой ткани, тем не менее после удаления первичной опухоли содержание свободного ФРЭС в сыворотке крови не нормализуется. Количественным биохимическим методом продемонстрировано значительное увеличение продукции ФРЭС в РМЖ по сравнению с окружающей тканью молочной железы и с доброкачественными опухолями. В результате изучения взаимосвязи между этими показателями и основными клинико-морфологическими

Практическая значимость работы: Результаты проведенного исследования свидетельствуют о том, что количественное иммуноферментное определение содержания свободного ФРЭС в цитозолях опухолей больных РМЖ достаточно адекватно отражает активность процессов неоангиогенеза в этой ткани. Данный показатель является перспективным тканевым биологическим маркером прогноза заболевания и чувствительности опухолей молочной железы к антиангиогенной терапии.

Основные положения, выносимые на защиту: Концентрация свободного ФРЭС в цитозолях опухолей как наиболее адекватный количественный показатель активности неоангиогенеза при РМЖ.

Заключение диссертации по теме «Онкология», Алиева, Севиндж Камил кызы

ВЫВОДЫ

1. Содержание свободного ФРЭС в сыворотке крови 81% больных раком молочной железы превышает пороговый уровень для здоровых женщин, составляющий 6,98 пг/мл. Уровень общего ФРЭС в сыворотке крови больных РМЖ и здоровых женщин практически одинаков и на три порядка выше, чем уровень свободного ФРЭС.

2. Уровень свободного ФРЭС в сыворотке крови больных РМЖ слабо, но достоверно коррелирует с его концентрацией в цитозолях опухолей (Я = 0,32; р<0,05), но после удаления опухоли снижается лишь у половины больных; при этом направление и степень изменений концентрации свободного ФРЭС в сыворотке крови не зависят от его исходного уровня в крови и в опухолевой ткани.

3. Значимых взаимосвязей сывороточных концентраций свободного и общего ФРЭС со стадией заболевания, гистологическим строением и рецепторным статусом РМЖ не обнаружено, однако уровень свободного ФРЭС в сыворотке крови достоверно увеличивался с возрастом (Я= 0,35; р= 0,015).

4. Концентрация свободного ФРЭС в цитозолях опухолей больных РМЖ была достоверно выше, чем в окружающих гистологически неизмененных тканях молочной железы, при этом увеличение экспрессии ФРЭС у 61% составило от 30 до 2430% (медиана - 370%). Концентрация свободного ФРЭС в фиброаденомах была практически такой же, как в неизмененной ткани молочной железы.

5. Концентрация свободного ФРЭС в цитозолях опухолей положительно коррелировала со стадией заболевания у больных РМЖ без отдаленных метастазов, а также с показателем размера опухоли (Т), но достоверно не зависела от степени поражения лимфатических узлов (Ы) и наличия отдаленных метастазов.

6. Концентрация свободного ФРЭС в цитозолях опухолей больных РМЖ была достоверно повышена у больных старше 55 лет и у всех больных, находящихся в постменопаузе, но не зависела от рецепторного статуса и гистологического строения РМЖ.

7. Наиболее адекватным количественным биохимическим показателем активности внутриопухолевого ангиогенеза при раке молочной железы является концентрация свободного ФРЭС в цитозоле опухоли.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Изучение неоангиогенеза (образования новых капиллярных отростков из уже существующих крупных сосудов) в злокачественных опухолях является одним из перспективных направлений современной онкологии, так как только разветвленная сеть сосудов может обеспечить необходимое для роста опухоли снабжение ее клеток кислородом и питательными веществами. Изучение молекулярных механизмов ангиогенеза, интенсивно проводившееся в последнее десятилетие, привело к обнаружению большой группы регуляторных ангиогенных и антиангиогенных факторов, динамический баланс которых обеспечивает формирование и распространение новых сосудов внутри опухоли.

Ключевым положительным регулятором ангиогенеза является фактор роста эндотелия сосудов (ФРЭС или УЕОР), гомодимерный белок с молекулярной массой 46-48 кЭа. Биологическая доступность ФРЭС во многом определяется размером молекулы и регулируется на генетическом и эпигеномном уровне, а также зависит от того, находится ли этот фактор в свободном или связанном состоянии. Единого мнения о том, с какими конкретно белками или структурами связан ФРЭС, не существует, однако, известно, что одной из форм существования ФРЭС в крови является его депонирование в тромбоцитах. С другой стороны, для проявления биологической активности ФРЭС и его успешного взаимодействия со специфическими рецепторами, необходимо комплексирование этого белка с гепарино-подобными соединениями.

Проблема ФРЭС-зависимого ангиогенеза при раке молочной железы является чрезвычайно актуальной в двух аспектах: во-первых, тканевой и сывороточный уровень ФРЭС, по-видимому, может служить значимым биологическим маркером прогноза заболевания; во-вторых, определение уровня ФРЭС необходимо для целенаправленного назначения антиангиогенной терапии и мониторинга за ее эффективностью.

Как было представлено в обзоре литературы, исследованию клинического значения ФРЭС при раке молочной железы посвящено очень большое число публикаций и большинство из них свидетельствует о перспективности использования этого показателя. Тем не менее, вопрос о том, какой из методов и субстратов (опухоль, сыворотка или плазма крови) для определения ФРЭС является наиболее адекватным и, в то же время, удобным для практического применения у больных РМЖ, пока остается открытым, что и определяет необходимость проведения дальнейших исследований.

В нашем распоряжении было два вида стандартных наборов фирмы Cytimmune Science Inc (США): прямая иммуноферментная тест-система «сэндвичевого» типа «CytElisa™ Human VEGF» для определения свободного ФРЭС и система для конкурентного иммуноферментного анализа «Accucyte® Human VEGF» для определения общего ФРЭС, что позволило нам провести сравнительное исследование содержания свободного и общего ФРЭС в сыворотке крови и цитозолях опухолей и гистологически неизмененных тканей молочной железы больных РМЖ.

В результате этого исследования удалось выявить ряд закономерностей и особенностей, имеющих принципиальное значение для использования этих показателей в клинической практике для оценки активности неоангиогенеза при данном заболевании.

Так, обнаружено, что в крови 81% больных РМЖ повышен уровень свободного ФРЭС по сравнению со здоровыми донорами, тогда как уровень общего (свободного и связанного с различными белками) ФРЭС практически не отличается от нормы. Таким образом, можно было предположить, что сывороточный уровень свободного ФРЭС при РМЖ отражает активацию процессов неоангиогенеза в опухолевой ткани. В пользу этого предположения свидетельствовало и наличие слабой, но достоверной положительной корреляционной взаимосвязи между уровнями свободного ФРЭС в сыворотке крови и цитозолях опухолей больных РМЖ, которой не наблюдалось для общего ФРЭС.

Тем не менее, ряд наших наблюдений дечает это предположение не столь однозначным. Оказалось, в частности, что при повторном исследовании сывороточного уровня ФРЭС через 2-14 дней после удаления первичной опухоли, этот показатель снижался лишь у половины больных, а у части больных он даже существенно увеличивался (возможно, за счет активации процессов ангиогенеза при заживлении послеоперационной раны). При этом степень и направление послеоперационных изменений сывороточной концентрации ФРЭС не зависели от его исходного уровня в сыворотке крови и в опухоли. Кроме того, мы не обнаружили ожидаемой положительной взаимосвязи между концентрацией ФРЭС в сыворотке крови и общей клинической стадией РМЖ или отдельными показателями распространенности процесса по системе ТЫМ. Более того, наблюдалось парадоксальное достоверное увеличение сывороточного показателя ФРЭС при первой стадии заболевания.

Таким образом, изучение содержания ФРЭС в сыворотке крови больных РМЖ показало, что только уровень свободного фактора роста в большей или меньшей степени отражает его продукцию в опухолевой ткани, но даже этот показатель, по-видимому, складывается из различных составляющих и не в полной мере характеризует активность неоангиогенеза в ткани РМЖ.

Более однозначные и обнадеживающие результаты получены при изучении содержания свободного ФРЭС в цитозолях опухолей больных РМЖ.

Во-первых, было показано, что у 61% больных РМЖ содержание ФРЭС в опухоли повышено более чем на 30% (в среднем в 4-5 раз) по сравнению с окружающей гистологически неизмененной тканью молочной железы. В небольшой группе обследованных нами больных фиброаденомой молочной железы внутриопухолевый уровень ФРЭС был также значительно ниже, чем в злокачественных опухолях и практически не отличался от нормальной молочной железы. Таким образом, нами подтверждено положение о том, что высокое тканевое содержание свободного ФРЭС характерно именно для злокачественных опухолей.

Во-вторых, нам удалось показать, что концентрация ФРЭС в первичной опухоли достоверно возрастает с увеличением стадии заболевания (до появления отдаленных метастазов) и наиболее четко коррелирует с размером первичной опухоли. Это наблюдение согласуется с представлениями о том, что значение и активность неоангиогенеза особенно возрастают в больших опухолях, где наиболее велика потребность в кислороде и питательных веществах для предотвращения некроза.

Таким образом, количественное определение содержания свободного ФРЭС в цитозолях опухолей больных РМЖ достаточно адекватно отражает активность процессов неоангиогенеза в этой ткани и является перспективным направлением в области разработки и использования новых биологических маркеров прогноза заболевания и чувствительности опухолей к антиангиогенной терапии. Дальнейшее наблюдение за обследованными больными позволит проверить правильность этого заключения и выработать количественные критерии для внедрения данного показателя в клиническую практику.

Г ~ .

90

Список литературы диссертационного исследования кандидат медицинских наук Алиева, Севиндж Камил кызы, 2003 год

1. Герштейн Е.С., Кушлинский Н.Е. Тканевые маркеры как факторы прогноза при раке молочной железы. Практическая онкология, 2002, т.З, №1, с.38-44.

2. Кушлинский Н.Е., Герштейн Е.С. Современные возможности молекулярно-биохимических методов оценки биологического «поведения» рака молочной железы. Вестник Российской академии медицинских наук. 2001. - №9. - с. 65-70.

3. Платонов А.Е. Статистический анализ в медицине и биологии: задачи, терминология, логика, компьютерные методы. Издательство РАМН. -М. 2000.

4. Рецепторы стероидных гормонов в опухолях человека. Под ред. J1.C. Бассалык. - М.: "Медицина". - 1987. - 223 с.

5. Трапезников Н.Н., Аксель Е.М. Статистика злокачественных новообразований в России и странах СНГ (состояние онкологической помощи, заболеваемость и смертность). М. - 2001.

6. Asano, M., Yukita, A., Suzuki, H. Wide spectrum of antitumor activity of a neutralizing monoclonal antibody to human vascular endothelial growth factor. Jpn J Cancer Res, V 90, N 1, P 93-100, 1999.

7. Bhujwalla, Z.M., Artemov, D., Natarajan, K., Ackerstaff, E., Solaiyappan, M. Vascular differences detected by MRI for metastatic versus nonmetastatic breast and prostate cancer xenografts. Neoplasia, V 3, N 2, P 143-153,2001.

8. DeJong, J.S., vanDiest, P.J., vanderValk, P., Baak, J.P. Expression of growth factors, growth factor receptors and apoptosis related proteins in invasive breast cancer: relation to apoptotic rate. Breast Cancer Res Treat, V 66, N3,P 201-208, 2001.

9. Donovan, D. Harmey, J.H. Toomey, D. Osborne, D.H. Redmond, H.P. Bouchier-Hayes, D.J. TGF beta-1 regulation of VEGF production by breast cancer cells see comments. Ann Surg Oncol,V 4, N 8, P 621-627, 1997.

10. Edel, M.J. Analysis of the TEL protein during tumour angiogenesis. Anticancer Res, V 19, N 4B, P 2945-2951, 1999.

11. Erlichman, C., Adjei, A.A., Alberts, S.R., Sloan, J.A., Goldberg, R.M., Pitot, H.C., Rubin,J., Atherton, P.J., Klee G.G., Humphrey, R. Phase I study of the matrix metalloproteinase inhibitor, BAY 12-9566. Ann Oncol, V 12, N 3,P 389-395, 2001.

12. Ferrara, N. The role of vascular endothelial growth factor in pathological angiogenesis. Breast Cancer Res Treat, V 36, N 2, P 127-37, 1995

13. Foekens J.A., Peters H.A., Portengen H., et al. Cell biological prognostic factors in breast cancer: a review. J Clin Immunoassay, V 14, P 184-196, 1991.

14. Fortier, A.H., Nelson, B.J., Grella, D.K., Holaday, J.W. Antiangiogenic activity of prostate-specific antigen. J Natl Cancer Inst, V 91, N 19, P 16351640, 1999.

15. Gasparini, G. Clinical significance of determination of surrogate markers of angiogenesis in breast cancer. Crit Rev Oncol Hematol, V 37, N 2, P 97-114, 2001.

16. Gasparini, G. Prognostic value of vascular endothelial growth factor in breast cancer. Oncologist, V 5 Suppl 1, P 37-44, 2000.

17. Greb, R.R., Maier, I., Wallwiener, D., Kiesel, L. Vascular endothelial growth factor A (VEGF-A) mRNA expression levels decrease after menopause in normal breast tissue but not in breast cancer lesions. Br J Cancer, V 81, N 2, P 225-231, 1999.

18. Harris, A.L. Anti-angiogenesis therapy and strategies for integrating it with adjuvant therapy. Recent Results Cancer Res, V 152, P 341-352,1998.

19. Hyder, S.M., Murthy, L., Stancel, G.M. Progestin regulation of vascular endothelial growth factor in human breast cancer cells. Cancer Res, V 58, N 3,P 392-395, 1998.

20. Hyder, S.M., Nawaz, Z., Chiappetta, C., Stancel, G.M. Identification of functional estrogen response elements in the gene coding for the potent angiogenic factor vascular endothelial growth factor. Cancer Res, V 60, N 12, P 3183-3190, 2000.

21. Hyder, S.M., Stancel, G.M. Regulation of VEGF in the reproductive tract by sex-steroid hormones. Histol Histopathol, V 15, N 1, P 325-334,2000.

22. Klauber, N., Parangi, S., Flynn, E., Hamel, E., D'Amato, R.J. Inhibition of angiogenesis and breast cancer in mice by the microtubule inhibitors 2-methoxyestradiol and taxol. Cancer Res, V 57, N 1, P 81-86,1997.

23. Kranz, A., Mattfeldt, T., Waltenberger, J. Molecular mediators of tumor angiogenesis: enhanced expression and activation of vascular endothelial growth factor receptor KDR in primary breast cancer. Int J Cancer, V 84, N 3,P 293-298,1999.

24. Kurebayashi, J. Otsuki, T. Kunisue, H. Mikami, Y. Tanaka, K. Yamamoto, S. Sonoo, H. Expression of vascular endothelial growth factor (VEGF) family members in breast cancer. Jpn J Cancer Res, V 90, N 9, P 977-981, 1999.

25. Kurebayashi, J., Kunisue, H., Yamamoto, S., Kurosumi, M., Otsuki, T., Sonoo, H. Paradoxical hormone responses of KPL-1 breast cancer cells in vivo: a significant role of angiogenesis in tumor growth. Oncology, V 59, N 2, P 158-165, 2000.

26. Kurizaki, T., Toi, M., Tominaga, T. Relationship between matrix metalloproteinase expression and tumor angiogenesis in human breast carcinoma. Oncol Rep, V 5, N 3, P 673-677, 1998.

27. Lau, D.H., Xue, L., Young, L.J., Burke, P.A., Cheung, A.T. Paclitaxel (Taxol): an inhibitor of angiogenesis in a highly vascularized transgenic breast cancer. Cancer Biother Radiopharm, V 14, N 1, P 31-36, 1999.

28. Le Querrec, A., Duval, D., Tobelem, G. Tumour angiogenesis. Baillieres Clin Haematol, V 6, N 3, P 711-730, 1993.

29. Lee, A.H., Dublin, E.A., Bobrow, L.G., Poulsom, R. Invasive lobular and invasive ductal carcinoma of the breast show distinct patterns of vascular endothelial growth factor expression and angiogenesis. J Pathol, V 185, N 4, P 394-3401,1998.

30. Leek, R.D., Hunt, N.C., Landers, R.J., Lewis, C.E., Royds, J.A., Harris, A.L. Macrophage infiltration is associated with VEGF and EGFR expression in breast cancer. J Pathol, V 190, N 4, P 430-436, 2000.

31. Lewin, M., Bredow, S., Sergeyev, N., Marecos, E., Bogdanov, A. Jr, Weissleder, R. In vivo assessment of vascular endothelial growth factor-induced angiogenesis. Int J Cancer, V 83, N 6, P 798-802,1999.

32. Linderholm, B., Lindh, B., Tavelin, B., Grankvist, K., Henriksson, R. p53 and vascular-endothelial-growth-factor (VEGF) expression predicts outcome in 833 patients with primary breast carcinoma. Int J Cancer, V 89, N 1, P 5162, 2000.

33. Linderholm, B., Tavelin, B., Grankvist, K., Henriksson, R. Does vascular endothelial growth factor (VEGF) predict local relapse and survival in radiotherapy-treated node-negative breast cancer? Br J Cancer, V 81, N 4, P 727-732, 1999.

34. Locopo, N., Fanelli, M., Gasparini, G. Clinical significance of angiogenic factors in breast cancer. Breast Cancer Res Treat,V 52, N 1-3, P 159-173, 1998.

35. Mignatti, P., Rifkin, D.B. Plasminogen activators and matrix metalloproteinases in angiogenesis. Enzyme Protein, V 49, P 117-137,1996.

36. Nozaki, S., Sledge, G.W. Jr, Nakshatri, H. Cancer cell-derived interleukin 1 alpha contributes to autocrine and paracrine induction of pro-metastatic genes in breast cancer. Biochem Biophys Res Commun, V 275, N 1, P 60-62, 2000.

37. Ohhashi, T. Lymph0dynamic factors governing Emphatic spread of carcinoma cells., Nippon Geka Gakka, Zasshi, V 102, N 6, P 435-439 2001

38. Pidgeon, O.P., Barr, M.P., Harmey, J.H., Foley, D.A., Bouchier Hayes DJ. Vascular endothelial growth factor (VEGF) upregula.es BCL-2 and inhibits apoptosis in human and murine mammary adenocarcinoma cells. Br J Cancer, V 85, N 2, P 273-278,2001.

39. Pintucci, G., Bikfalvi, A., Klein, S., Rifldn, D.B. Angiogenesis and the fibrinolytic system. Semin Thromb Hemost, V 22, N 6, P 517-524,1996.

40. Salven, P. Perhoniemi, V. Tykka, H. Maenpaa, H. Joensuu, H. Serum VEGF levels in women with a benign breast tumor or breast cancer. Breast Cancer Res Treat V 53, N 2, P 161-166, 1999.

41. Salven, P., Manpaa, H., Orpana, A., Alitalo, K., Joensuu, H. Serum vascular endothelial growth factor is often elevated in disseminated cancer. Clin Cancer Res, V 3, N 5, P 647-651, 1997.

42. Sato, Y. Transcription factor ETS-1 as a molecular target for angiogenesis inhibition. Hum Cell, V 11, N 4, P 207-214, 1998.

43. Skobe, M., Hawighorst, T., Jackson, D.G., Prevo, R., Janes, L., Velasco, P., Riccardi, L, Alitalo, K, Claffey, K, Detmar, M. Induction of tumor lymphangiogenesis by VEGF-C promotes breast cancer metastasis. Nat Med, V 7, N 2, P 192-198, 2001.

44. Speirs, V., Atkin, S.L. Production of VEGF and expression of the VEGF receptors Flt-1 and KDR in primary cultures of epithelial and stromal cells derived from breast tumours. Br J Cancer, V 80, N 5-6, P 898-903,1999.

45. Toi, M., Hoshina, S., Takayanagi, T., Tominaga, T. Association of vascular endothelial growth factor expression with tumor angiogenesis and with early relapse in primary breast cancer. Jpn J Cancer Res, V 85, N 10, P 1045-1049, 1994.

46. Toi, M., Inada, K., Suzuki, H., Tominaga, T. Tumor angiogenesis in breast cancer: its importance as a prognostic indicator and the association with vascular endothelial growth factor expression. Breast Cancer Res Treat, V 36, N 2, P 193-204, 1995b.

47. Toi, M., Kondo, S., Suzuki, H., Yamamoto, Y., Inada, K., Imazawa, T., Taniguchi, T., Tominaga, T. Quantitative analysis of vascular endothelial growth factor in primary breast cancer. Cancer, V 77, N 6, P 1101-1106, 1996a.

48. Toi, M., Yamamoto, Y., Taniguchi, T., Saji, S., Hayashi, K., Tominaga, T. Regulation of endothelial growth factor expressions in breast cancer. Gan To Kagaku Ryoho, V 23 Suppl 1, P 75-79,1996b.

49. Valtola, R., Salven, P., Heikkila, P., Taipale, J., Joensuu, H., Rehn, M., Pihlajaniemi, T., Weich, H., deWaal, R., Alitalo, K. VEGFR-3 and its ligand VEGF-C are associated with angiogenesis in breast cancer. Am J Pathol, V 154, N 5, P 1381-1390, 1999.

50. Vandenbunder, B., Wernert, N., Queva, C., Desbiens, X., Stehelin, D. Does the transcription factor c-etsl take part in the regulation of angiogenesis and tumor invasion? Folia Biol (Praha), V 40, N 5, P 301-313, 1994.

51. Wang, G., Dong, Z., Xu, G., Yang, Z., Shou, C., Wang, N., Liu, T. The effect of antibody against vascular endothelial growth factor on tumor growth and metastasis. J Cancer Res Clin Oncol, V 124, N 11, P 615-620,1998.

52. Wang, G., Yang, Z., Shou, C. The effect of antibody against vascular endothelial growth factor (VEGF) on tumor metastasis. Chung Hua Chung Liu Tsa Chih, V 19, N 6, P 407-409, 1997.

53. Xie, B., Tam, N.N., Tsao, S.W., Wong, Y.C. Co-expression of vascular endothelial growth factor (VEGF) and its receptors (flk-1 and flt-1) in hormone-induced mammary cancer in the Noble rat. Br J Cancer, V 81, N 8, P 1335-1343, 1999.

54. Yoshiji, H., Gomez, D.E., Shibuya, M., Thorgeirsson, U.P. Expression of vascular endothelial growth factor, its receptor, and other angiogenic factors in human breast cancer. Cancer Res, V 56, N 9, P 2013-2016,1996.

55. Zebrowski, B.K., Yano, S., Liu, W., Shaheen, R.M., Hicklin, D.J., Putnam, J.B. Jr, Ellis, L.M. Vascular endothelial growth factor levels and induction of permeability in malignant pleural effusions. Clin Cancer Res, V 5, N 11, P 3364-3368,1999.

56. Ziehe, M., Donnini, S., Morbidelli, L., Parenti, A., Gasparini, G., Ledda, F. Linomide blocks angiogenesis by breast carcinoma vascular endothelial growth factor transfectants. Br J Cancer, V 77, N 7, P 1123-1129, 1998.