Хромосомная организация геномов растений с хромосомами малых размеров или малоинформативным рисунком дифференциального окрашивания тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.03, доктор биологических наук Муравенко, Ольга Викторовна

• Муравенко, Ольга Викторовна
• доктор биологических наук
• 2010

Оглавление диссертации доктор биологических наук Муравенко, Ольга Викторовна

Актуальность проблемы.

Цитогенетика растений менее чем за столетие прошла путь от описания числа и морфологии хромосом в геноме и кариотипе вида (в понимании Г. Винклера, Л.Н. Делоне и Г.А. Левитского) до молекулярного кариотипирования (идентификации хромосом с помощью физического картирования на них различных ДНК-зондов методами флуоресцентной гибридизации in situ). Важнейшим этапом в развитии цитогенетики растений стало внедрение в 70-е годы прошлого столетия в широкую практику Т. Касперсоном, К. Воза и другими учеными методов диффренциального окрашивания хромосом (бэндинга). Метод С-бэндинга, основанный на выявлении участков конститутивного гетерохроматина, на долгие годы занял ведущее место в исследованиях хромосом растений, что связано с чрезвычайной обогащенностью их геномов повторяющимися последовательностями ДНК. В 70-80-х г.г. прошлого века были изучены рисунки С-бэндинга хромосом у многих видов возделываемых и дикорастущих растений. Следующий этап в развитии цитогенетики растений, приведший к серьезному расширению ее возможностей, связан с разработкой и началом широкого использования в 80-90-х годах прошлого столетия флуоресцентной гибридизации in situ (FISH). В качестве маркерных ДНК-зондов начали применять участки генов рибосомных РНК и другие ДНК-последовательности. В результате за прошедшие десятилетия был накоплен огромный багаж знаний, касающихся особенностей хромосомной организации геномов растений, получены важнейшие сведения об их изменчивости, происхождении и эволюции, что послужило базисом для разработки цитогенетических основ селекции. Стал возможен многопараметрический сравнительный анализ кариотипов в природных популяциях, а также у сортов и линий культурных растений и их гибридов. Цитогенетический мониторинг селекционных образцов, исследование селекционной истории и контроль чистоты сортов прочно вошли в практику селекции. В это же время возник широкий спектр методов молекулярного анализа генома, который внедрился в генетические исследования многих культурных видов растений и их дикорастущих сородичей, а также в селекционную практику. Объединение цитогенетического и молекулярного подходов открыло новые перспективы для изучения геномов растений. В частности, физическое картирование последовательностей ДНК на хромосомах является необходимым этапом при тотальном секвенировании крупных эукариотических геномов.

Однако большинство из перечисленных выше исследований были выполнены на объектах, метафазные хромосомы которых имеют размеры не менее 5 мкм (большинство злаков, лилейные, многие бобовые). Это связано с тем, что изучение рисунка дифференциального окрашивания небольших хромосом (длиной 1-4 мкм) часто представляет значительные трудности вследствие недостаточной разрешающей способности светооптического микроскопа. Кроме того, геномы мелкохромосомных растений, как правило, имеют небольшие размеры (на один-два порядка меньше, чем геномы злаков или лилейных) и содержат сравнительно мало повторяющихся последовательностей ДНК различных классов, а, следовательно, и конститутивного гетерохроматина. Это обуславливает бедность рисунков С-бэндинга мелких хромосом, что еще в большей степени затрудняет их распознавание. В связи с этим, для изучения кариотипов растений, имеющих небольшие хромосомы, возникла необходимость разработки новых подходов, повышающих разрешение методов хромосомного анализа, а также поиск дополнительных хромосомных маркеров. Важность решения этой задачи связана с тем, что кариотипы значительного числа хозяйственно-ценных культур: технических, масличных, овощных и т.п. представлены хромосомами малых размеров. Для большинства таких растений задача соотнесения молекулярной, генетической и цитологической классификаций хромосом остается весьма актуальной. Особое место среди таких растений занимает лен — культура, имеющая для нашей страны не только большое хозяйственное, но и стратегическое значение. Именно поэтому исследование хромосомной организации генома этого ценного растения и его дикорастущих сородичей представляет собой задачу первостепенной важности.

Цель работы.

Разработка новых и усовершенствование существующих методов молекулярно-цитогенетического исследования для повышения разрешающей способности анализа геномов растений с хромосомами малых размеров или малоинформативным рисунком дифференциального окрашивания. Изучение кариотипов таких растений (низших и высших) с целью идентификации индивидуальных хромосом, выявления структурных перестроек, изучения внутривидового хромосомного полиморфизма, а также сравнения геномов родственных видов для уточнения их таксономического статуса и филогенетических взаимосвязей.

Основные задачи исследования:

1. Разработка комплекса методов, повышающих разрешающую способность анализа хромосомной организации геномов растений с хромосомами малых размеров или малоинформативным рисунком С-бэндинга на модельных объектах (человек, ячмень, пшеница) и объектах исследования (ромашка, лен, горох).

2. Поиск дополнительных молекулярных и цитогенетических маркеров для Р[8Н-картирования хромосом и геномов растений с хромосомами малых размеров или малоинформативным рисунком С-бэндинга:

• применение универсальных маркеров - генов рибосомных РНК и теломерной последовательности ДНК,

• маркеры из тотальной геномной ДНК,

• оптимизация методов выявления флуорохромного бэндинга на хромосомах растений после процедуры FISH.

3. Повышение информативности хромосомного анализа с помощью последовательного или одновременного сочетания нескольких методов выявления на хромосомах различных молекулярных и цитогенетических маркеров, а также применения специализированных компьютерных технологий и методов геномного анализа.

4. Исследование с помощью разработанных подходов кариотипов растений с хромосомами малых размеров или с неинформативным рисунком дифференциального окрашивания с целью точной идентификации их хромосом, выявления структурных перестроек, определения родственных взаимоотношений, уточнения таксономического статуса и филогенетических взаимосвязей изученных видов. Особое внимание предполагается уделить растениям, имеющим хозяйственную ценность (хлопчатник, лен, горох, ромашка) или используемым в качестве модельных объектов.

Научная новизна.

Экспериментальная часть работы представляет собой исследование приоритетного характера, так как основные результаты получены впервые и/или на объектах, не исследовавшихся ранее.

На модельном объекте - ячмене разработана модификация метода, позволяющая выявлять рисунок ранней репликации хромосом у растений. Показано, что у растений, также как и у животных, наблюдается высокая консервативность последовательности репликации районов хромосом в родственных геномах. Подобно млекопитающим, у растений выявляется сходство рисунков ранней репликации и G-подобного окрашивания хромосом после обработки трипсином.

Разработана методика получения препаратов митотических метафазных хромосом низкой степени конденсации с помощью предобработки делящихся клеток интеркалятором ДНК 9-аминоакридином. Установлено, что для достоверного анализа хромосомного полиморфизма по С-блокам длина недоконденсированных хромосом не должна более чем в три раза превышать средний размер этих же хромосом, получаемых без использования интеркалятора. Методика существенно расширяет возможности анализа хромосом человека и растений, особенно мелкохромосомных видов, а также видов с неинформативным рисунком С-окраски хромосом.

Обнаружено, что окрашивание недоконденсированных хромосом растений ацетоорсеином позволяет выявлять высокоразрешающий G/R-подобный рисунок дифференциального окрашивания (OR-бэндинг), содержащий значительно большее число сегментов по сравнению с С-окраской. Установлено, что OR-бэндинг хромосомо- и видоспецифичен и хорошо воспроизводим. С помощью последовательного OR-C/DAPI-окрашивания хромосом льна и гороха впервые продемонстрировано, что ацетоорсеином не окрашиваются прицентромерные, крупные интеркалярные и теломерные гетерохроматические районы хромосом.

Показано, что локализация с помощью FISH на хромосомах генов рибосомных РНК позволяет использовать их в качестве эффективных дополнительных молекулярно-цитогенетических маркеров для идентификации мелких хромосом и хромосомных перестроек в геномах растений.

Продемонстрирована перспективность использования для растений подходов, разработанных с целью исследования генома человека. Показана принципиальная возможность получения Notl-библиотек из небольших геномов мелкохромосомных растений и их использования для изучения этих геномов и поиска молекулярных маркеров хромосом.

У мелкохромосомных растений использование собственной геномной ДНК в качестве зонда для FISH позволяет выявлять на хромосомах рисунки гибридизации, сходные с С-бэндингом.

Установлено, что применение двух новых АТ-специфичных флуоресцентных соединений - димерных бис-бензимидазолов - позволяет выявлять более контрастные рисунки дифференциального окрашивания гю сравнению со стандартно используемыми флуорохромами DAPI и Hoechst 33258. Это не только расширяет возможности точной идентификации хромосом и хромосомных перестроек, но и FISH-картирования на них различных зондов.

По рисункам ранней репликации впервые идентифицированы хромосомы в диплоидном Aj геноме дикорастущего хлопчатника Gossipium herbaceum var. africanum и аллотетраплоидном (AD)2j геноме тонковолокнистого хлопчатника G. barbadense, а также проведено разделение хромосом (AD)2 генома на Аь и Db субгеномы. Обнаружено сходство рисунков ранней репликации хромосом в родственных геномах.

С применением 9-АМА впервые проведено морфометрическое исследование хромосом одноклеточных красных водорослей и показано, что число хромосом может быть использовано для уточнения таксономии класса Cyanidiophyceae (Rhodophyta).

По рисунку С-бэндинга повышенного разрешения (после 9-АМА предобработки) проведена идентификация хромосом в кариотипах ромашки аптечной и двух родственных видов ромашек. Установлено, что Matricaria inodora является автотетраплоидом, субгеномы которого сходны с геномом М maritima, а М. chamomilla имеет родственный геном.

По рисункам C/DAPI-бэндинга идентифицированы все хромосомы гороха, включая морфологически неразличимые при равномерном окрашивании 1 и 2 пары гомологов. Это позволило провести исследование внутривидового полиморфизма гетерохроматических районов хромосом, а также обнаружить двойную транслокацию с одновременной перицентрической инверсией у линии гороха с перестроенным кариотипом.

Сравнительное исследование геномов двухромосомных злаков из родов Zingeria и Colpodium по молекулярно-цитогенетическим маркерам хромосом и последовательностям внутренних транскрибируемых спейсеров генов 45 S pPHK (ITS1 и ITS2) позволило установить, что эти два близких рода имеют монофилетическое происхождение.

Впервые с помощью комплекса высокоразрешающих модификаций методов C/DAPI-бэндинга и одновременного FISH-картирования на хромосомах генов 26S и 5S рРНК изучены геномы возделываемого вида льна (Linum usitatissimum L.) и 25 дикорастущих видов из 6 секций рода Linum L., произрастающих в Евразии и Африке. Установлены хромосомные числа у L. squamulosnm Rudolphi (2n = 18), L. komarovii Juz. (2n = 18), L. (hracicum Degen, и L. czernjajevii Klokov; уточнены хромосомные числа у L. decumbens Desf ( 2n = 16), L. narbonense L. (2n = 28), L. stelleroides Planch (2n = 18), L. pallescens Bunge (2n = 18). Впервые в кариотипах видов секции Syllinum обнаружены В-хромосомы и изучена их структура и установлено, что число А-хромосом у этих видов равно 28.

По сходству кариотипов, все изученные виды льнов разделились на 8 групп, что совпало с распределением этих видов на кластеры по данным RAPD-анализа. Результаты молекулярно-цитогенетического анализа подтвердили обособленность секции Adenolinum от секции Linum, выявили геномное сходство видов секций Adenolinum и Stellerolinum, а также показали обособленное положение видов L. narbonense L. и L. nodiflorum L. от других видов льна. Проведенный анализ позволил уточнить таксономический статус некоторых видов секций Linopsis, Syllinum, Linum и Adenolinum. Проведена реконструкция возможных филогенетических взаимосвязей культурного и дикорастущих видов льна.

Теоретическая и практическая ценность работы.

Впервые на основании использования цитологических маркеров проведена полная идентификация хромосом у двух видов хлопчатников. Предложенная нами классификация хромосом хлопчатников, остается единственной, и по сей день используется всеми авторами, изучающими геномы возделываемых видов хлопчатников и их дикорастущих сородичей.

Выявлены новые кариологические характеристики видов, входящих в состав родов Galdieria, Cianidium, Gossypium, Matricaria, Zingeria, Calpodium, Linum, позволяющие уточнить их таксономический статус и происхождение.

Полученные результаты могут быть применены для ускорения селекционного процесса, направленного на получение новых высокопродуктивных и устойчивых сортов льна, гороха и ромашки аптечной. Результаты также могут быть использованы в геномных исследованиях льнов секции Syllinum, которые являются продуцентами биологически активных соединений, применяемых в фармакологии в качестве противоопухолевых препаратов.

Применение интеркалятора ДНК 9-АМА и новых флуоресцентных красителей (димерных бис-бензимидазолов) не только расширяет возможности исследования хромосомной организации геномов ценных сельскохозяйственных культур, но и может существенно повысить точность цитогенетического анализа и картирования хромосом человека, что особенно важно для проведения сложной перинатальной цитогенетической диагностики плода.

Сведения, полученные о геномах видов рода Ыпит, заложили цитогенетические основы для объединения генетической и цитологической классификаций хромосом и тотального секвенирования генома L. usitatissimum L.

Результаты исследования могут быть также использованы в курсах лекций и лабораторных работах по цитогенетике в средних и высших учебных заведениях.

Апробация работы.

Результаты, полученные в данной работе, представлены на следующих научных конференциях: VI International Barley Genetic Symposium, 1991; 17 International Congress of Genetics, 1993; II Российский симпозиум "Новые методы биотехнологии растений", 1993; 26 Annual Meeting of American

1998) и XI (1999) Конференции-"Геном человека"; V International Oat Conference & VII International Barley Symposium, 1997; XI(1997), ХЩ1999), XV(2005) Всероссийские совещания "Структура и функции клеточного ядра"; XIX(1998), ХХ(2000), XXIV (2008) International Congress ISAC, II (1997), III (1999), IV (2001) VII(2007) и VIII(2009) Международные симпозиумы "Новые и нетрадиционные растения и перспективы их практического использования"; XIII International Genome Sequencing and Analysis Conference, 2001; Международный симпозиум "Молекулярные механизмы генетических процессов и биотехнология", 2001; International Polyploidy Conference, 2003; 111(2004) и V(2009) Съезды ВОГиС; IV International Conference BGRS, 2004; Международная конференция "Молекулярная и прикладная генетика", 2005; Международная научная конференция "Современные проблемы генетики", 2005; V Международное совещание по кариологии, кариосистематике и молекулярной систематике растений, 2005; Human Genome Meeting, 2001 и 2006; 11th World Congress on Advances in Oncology and 9th International Symposium on Molecular Medicine, 2006; Международная конференция "Генетика в России и мире", 2006; 16th International Chromosome Conference (ICC), 2007; Международная конференция "Генетические ресурсы культурных растений в XXI веке: состояние, проблемы, перспективы", 2007; II Научно-практическая конференция "Современные тенденции в селекции и семеноводстве овощных культур. Традиции и перспективы", 2008; II съезд Общества клеточной биологии совместно с юбилейной конференцией, посвященной 50-летию ЦИН РАН, 2007; Симпозиум памяти Г.А. Левитского "Хромосомы и эволюция", С-Петербург 2008; VI(2008), V(2009) Международной научной конференции "Факторы экспериментальной эволюции организмов"; International Conference "Chromosome, 2009".

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 52 статьи (среди которых три обзора) в международных и отечественных рецензируемых научных журналах, раздел в книге, 19 статей в сборниках и около 60 тезисов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Семена ячменя для исследования получены из коллекции Лаборатории генетики растений ИОГен РАН, ромашек - из коллекции ВИЛАР РАСХН, гороха - из коллекции кафедры генетики МГУ и из коллекции ВНИИСХМ, цингерии, кальподиума и катабразеллы - из Лаборатории кариосистематики БИН РАН, хлопчатников - из коллекции Иолотанской опытной станции ВИР РАСХН, льнов - из коллекций ВНИИЛ РАСХН, ИГиЦ HAH Беларусии, Института ботаники HAH Украины и Генного банка Института генетики растений и исследования возделываемых растений г. Гетерслебена (Institute of Plant Genetics and Crop Plant Research, Gatersleben, Germany).

Для исследования хромосом растений бьши разработаны методы выявления рисунков ранней репликации хромосом и искусственной задержки конденсации митотических хромосом, а также модифицированы методики OR-, С-, DAPI-, СМА- и Ag-ЯОР-дифференциального окрашивания хромосом. G-подобное окрашивание хромосом после обработки трипсином проводилось согласно уже известной методике [Friebe et al., 1996]. Геномная ДНК выделялась стандартным СТАБ-методом [Murray, Tompson, 1980]. Клонирование фрагментов 26S и 5S рДНК, выделенных с помощью ПЦР из генома Linum austriacum L., проводилось в клетках Escherichia coli (XL 10-Gold Ultracompetent Cells, Stratagene) с использованием вектора pTZ57R (Fermentas, St.Leon-Rot, Germany) согласно протоколу производителя. Для получения геномных Notl библиотек и их анализа, определения количества ДНК в расчете на 1С, проведения высокоразрешающего RAPD-PCR-анализа в полиакриламидном геле, анализа последовательностей внутренних транскрибируемых спейсеров ITS1 и ITS2 генов 45 S рРНК применены методики, разработанные ранее [Бойко и др., 1985; Kashuba et al., 1999; Родионов и др., 2005; Зеленина и др., 2006]. Для поиска гомологии сиквенсов клонированных последовательностей с имеющимися в базах данных использованы NCBI Blast и Arabidopsis thaliana WU-BLAST2. Для гибридизации на хромосомах геномной ДНК, клонированных геномных фрагментов, генов рибосомных РНК и синтезированной меченной флуорохромом олигонуклеотидной теломерной последовательности арабидопсиса (СССТААА)3-Сб-СуЗ (БиоЧип, ИМБ РАН) специально были разработаны различные модификации метода FISH. Исследование проводили с помощью систем цитогенетического анализа (микроскоп, CCD-камера), а также специализированных программ хромосомного анализа ImageJ 1.42 (National Institutes of Health, USA), ВидеоТестКарио 1.5 и 3.0 (ВидеоТест, Сантк-Петербург, РФ).

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

Глава 1. Подходы к идентификации мелких хромосом в геномах растений.

Знание любого генома неполно без исследования его хромосомной организации. У растений такая работа обычно начинается с изучения числа и морфологии метафазных хромосом в митозе с последующей идентификацией гомологичных пар. Существует несколько возможностей решения задач идентификации и исследования хромосом в кариотипах растений. Как правило, для каждого конкретного кариотипа необходимо подбирать наиболее эффективные методы анализа и последовательность их применения. Кроме того, нужны способы, позволяющие быстро и с наименьшими потерями информации провести регистрацию изображений хромосом и их объективное исследование. Это легко разрешимо в век компьютерных технологий, которые позволяют быстро получить цифровое изображение хромосом, выявить максимальное число хромосомных маркеров и провести анализ хромосом в интерактивном режиме, т.е. создать объектспецифичный алгоритм изучения хромосом.

При исследовании мелких хромосом со сходной морфологией гарантированный результат можно получить только при комплексном применении всех вышеперечисленных подходов. Именно такой эффективный подход к изучению кариотипов растений с небольшими хромосомами представлен ниже. Подход включает комплекс высокоразрешающих молекулярно-цитогенетических методов исследования, позволяющих получать достаточное число маркеров для распознавания и сравнительного изучения мелких хромосом или хромосом с малоинформативным рисунком С-бэндинга.

1.1. Рисунок ранней репликации хромосом растений.

Поиск новых методов, позволяющих получать рисунок дифференциального окрашивания высокого разрешения, был начат нами с методики выявления репликативного бэндинга, основанной на асинхронности репликации ДНК хромосом в течение S-фазы. В основе этого метода лежит включение в процессе репликации ДНК аналогов оснований с последующей их детекцией. В результате, на хромосомах млекопитающих выявляется высокоразрешающий так назваемый "репликативный" бэндинг. У млекопитающих процесс синтеза ДНК имеет двухфазный характер, поэтому в хромосомах можно выявлять рисунки, соответственно, ранней и поздней репликации. У человека рисунок ранней репликации сходен с G-, а поздней -с R- и С-бэндингом при использовании так называемого FPG (Fluorochrom Plus Giemsa) метода выявления репликативного бэндинга [Захаров и др., 1982]. Применительно к хромосомам растений мы адаптировали вариант метода выявления рисунков ранней репликации хромосом - BrdU-Hoechst-Giemsa-бэндинг. Он основан на встраивании бромдезоксиуридина (BrdU) в

ДНК в начале S-периода ее синтеза и последующим разрушением участков ДНК со встроенным аналогом с помощью облучения ультрафиолетовым светом [Захаров и др., 1982]. При этом участки хромосом, реплицирующиеся в середине и конце S-фазы, выделяются как темно окрашенные (Giemsa-положительные) сегменты (бэнды). В этом варианте методики используется обработка BrdU в высокой концентрации, что блокирует большинство делящихся клеток корневой меристемы в начале S-фазы. После снятия BrdU-блока, в первом митотическом делении на хромосомах выявляется рисунок ранней репликации.

Для отработки методики в качестве модельного объекта было выбрано крупнохромосомное растение - ячмень (Ногde um vulgare L.), хромосомы которого имеют длину 6-12 мкм. У этого модельного объекта нам удалось получить рисунок ранней репликации, который был специфичен для каждой из 7 гомологичных групп хромосом (Рис. 1).

Рис. 1. Кариограмма хромосом Н. vulgare. В каждой гомологичной группе (номера

1-7) хромосомы расположены по типам окрашивания слева направо:

- рисунок поздней репликации хромосом (по данным Vom et al., 1997);

- рисунок ранней репликации хромосом;

- рисунок G-подобной окраски (окрашивание раствором Giemsa после обработки трипсином);

- рисунок С-окраски хромосом.

Ранее считалось, что у растений асинхронность репликация ДНК в течение S-периода выражена в меньшей степени, чем у млекопитающих [Cortes et al., 1980; Kakeda, Yamagata, 1991]. Однако, как показали наши исследования, асинхронность репликации ДНК в течение S-периода у растений может проявляться достаточно отчетливо. При этом на хромосомах ячменя, как и на хромосомах человека [Захаров и др., 1982], рисунок поздней репликации хромосом в целом совпадает с рисунком С-окраски [Lte« ¡?/ al, 1997], а рисунок ранней репликации хромосом - с рисунком G-подобного дифференциального окрашивания, выявляемого на хромосомах после обработки трипсином (Рис. 1). Этот факт еще раз подтверждает единство основных принципов хромосомной организации геномов высших эукариот.

Большое число сегментов, которые выявил на хромосомах ячменя метод репликативного бэндинга, побудило нас попытаться использовать этот подход для изучения мелких хромосом растений с целью идентификации этих хромосом по рисункам ранней репликации (См. раздел 2.1).

1.2. Исследование недоконденсированных хромосом.

Другой подход, который используют при изучении кариотипов растений с малыми размерами метафазных хромосом - это их анализ в прометафазе или профазе, когда отчетливо виден рисунок дифференциальной конденсации хромосом, который можно применять для их идентификации. Однако, этот метод не получил широкого распространения, поскольку получение большого количества прометафазных и профазных хромосом связано с рядом методических сложностей [Fukui, Mukai, 1988].

Более широкие перспективы имеет подход, основанный на искусственном торможении процесса конденсации хромосом за счет встраивания молекул интеркаляторов между парами оснований молекулы ДНК. К числу ДНК-интеркаляторов, задерживающих конденсацию хромосом, относятся такие широко применяемые флуоресцентные красители, как этидий (ЭБ) или акридиновый оранжевый (АО) [Зеленин, 1967; Zelenin, 1999]. Введение интеркаляторов в делящиеся клетки приводит к увеличению продолжительности профазы и метафазы и накоплению в этой стадии большого числа клеток с недоконденсированными или искусственно "удлиненными" хромосомами. На таких хромосомах разрешающая способность любого дифференциального окрашивания повышается.

С целью замедления конденсации хромосом растений мы использовали предобработку делящихся клеток ДНК-интеркалятором 9-аминоакридином (9-АМА). При выборе этого агента мы исходили из простоты его структуры (отсутствии множественных боковых групп), а также низкой константы связывания 9-АМА с ДНК. Эти особенности 9-АМА гарантируют его легкое удаление из хромосом при фиксации и последующих обработках, а, следовательно, использование 9-АМА не препятствует применению в дальнейшем различных методик дифференциального окрашивания хромосом.

1.2.1. Метод задержки конденсации митотических хромосом с помощью 9-АМА.

Отработку метода задержки конденсации хромосом с помощью 9-АМА проводили на хромосомах человека, поскольку степень их конденсации легко оценивать по числу G-бэндов на гаплоидный набор, и на хромосомах ромашки аптечной (Matricaria chamomilla L.), степень конденсации которых оценивали по числу OR-бэндов. Для сравнения использовали обработку этидием, которую часто применяют для задержки конденсации хромосом человека и животных и получения рисунка дифференциального окрашивания более высокого разрешения. Было исследовано влияние 9-АМА и этидия в различных концентрациях (от 0,1 до 10,0 мкг/мл) на задержку конденсации хромосом. Установлено, что для получения сходных эффектов задержки конденсации хромосом требуется существенно более низкая концентрация 9-АМА, чем этидия.

Добавление в культуру лимфоцитов крови человека 9-АМА до конечной концентрации 0,5-1,0 мкг/мл или этидия - до 1,0-5,0 мкг/мл за час перед фиксацией давало возможность получать значительное число метафаз с длинными хромосомами и с небольшим числом хромосомных наложений на препаратах. В этих условиях средняя длина хромосом увеличивалась на 7090% по сравнению с хромосомами, не обработанными 9-АМА. При одинаковой степени разрешения рисунков G-бэндинга их контрастность, после обработки 9-АМА, оказалась заметно выше, чем после обработки этидием. Этот факт позволяет полагать, что использование предобработки 9-АМА весьма перспективно для повышения степени разрешения различных типов дифференциального окрашивания хромосом человека при проведении высокоточного цитогенетического анализа.

Для ромашки аптечной оптимальные условия предобработок интеркаляторами, приводящих к достаточному удлинению хромосом и выявлению четкого OR-бэндинга на всех хромосомах, были определены как 4-10 мкг/мл для этидия и 0,5-2,0 мкг/мл для 9-АМА за 12 часов до фиксации при температуре +26°С. Уменьшение концентрации и времени обработки интеркаляторами приводило к снижению эффекта задержки конденсации хромосом. Увеличение концентраций 9-АМА и этидия и/или длительности обработки этими реагентами приводило к значительному увеличению длины хромосом и числа хромосомных наложений, а также к снижению числа метафазных пластинок на препаратах.

Таким образом, был разработан протокол получения препаратов с большим числом "удлиненных" метафазных хромосом, основанный на использовании 9-АМА. Установлено, что обработка 0.5-1.0 мкг/мл 9-АМА в течение часа до фиксации клеток приводит к существенному возрастанию разрешающей способности G-окрашивания хромосом человека с 400 до 850 G-бэндов на гаплоидный набор. Для ромашки оптимальные условия обработки составляли 0.5-1.0 мкг/мл 9-АМА и в течение 12-24 часов до фиксации корневых меристем. При таких условиях 9-АМА не подавляет митотическую активность клеток меристемы, а длина хромосом достаточна для получения высокоразрешающего OR-бэндинга (250-260 бэндов на гаплоидный набор).

Обнаружено, что 9-АМА в качестве интеркалирующего агента имеет ряд существенных преимуществ по сравнению с этидием:

• достижение более сильного деконденсирующего эффекта при более низких концентрациях агента;

• легко отмывается фиксатором и поэтому не флуоресцирует на хромосомных препаратах и не мешает последующему применению различных методов флуоресцентного дифференцильного окрашивания и FISH;

• на хромосомах выявляется более четкий и контрастный рисунок бэндинга.

С учетом всех достоинств в дальнейшей работе для задержки конденсации митотических хромосом с целью повышения разрешающей способности хромосомного анализа мы применяли только 9-АМА.

1.2.2. Повышение разрешающей способности дифференциального окрашивания хромосом.

Методика задержки конденсации митотических хромосом была апробирована для повышения разрешающей способности OR- и С-бэндинга хромосом разных размеров у высших растений (лен, ромашка, горох, цингерия). Кроме того, использование 9-АМА впервые дало возможность" визуализировать и исследовать с помощью светового микроскопа хромосомы одного из самых примитивных низших растений - красных одноклеточных водорослей. Установлено, что для всех исследованных объектов оптимальной является одна и та же концентрация 9-АМА - 0,5-1 мкг/мл. Все изложенное позволяет рекомендовать использование этого интеркалятора для получения высокоразрешающего дифференциального окрашивания как хромосом растений, так и человека и животных.

1.2.2.1. Определение оптимальных для исследования интервалов длин недоконденсированных хромосом, полученных после предобработки 9

Использование 9-АМА впервые позволило идентифицировать мелкие хромосомы льна посевного (Linum asitatissimum L.) по рисункам С-окраски повышенного разрешения. При проведении этой работы, мы столкнулись с тем, что применение 9-АМА значительно увеличивает вариабельность метафаз по степени конденсации хромосом на препаратах, что особенно заметно для мелких хромосом (Рис. 2).

Рис. 2. С-дифференциальное окрашивание хромосом льна (X. usltatissimum L.): а -метафазная и б - прометафазная пластинки.

Это побудило нас осуществить исследование достоверности оценки размеров и положения С-бэндов на "удлиненных" хромосомах. Сравнение вариабельности рисунка С-окраски в зависимости от степени конденсации хромосом было проведено на примере хромосомы 4 льна крупноцветкового (Linum grandiflorum Desf.), содержащей относительно небольшое число С-бэндов. Препараты хромосом льна были приготовлены в двух вариантах: по стандартной методике с использованием колхицина и по предложенной нами методике с использованием 9-АМА (1мкг/мл на 12 часов перед фиксацией).

Рис. 3. Идиограмма С- дифференциально окрашенных хромосом: а - ячменя и б - льна.

Для сравнения была взята хромосома 4 ячменя (Hordeum vulgare L.) (Рис. 3). Ячмень был выбран потому, что для этого объекта был предварительно проведен качественный и количественный анализ полиморфизма С-блоков хромосом, и на основе полученных сведений были разработаны основные принципы хромосомной паспортизации по рисункам С-окраски.

Оказалось, что, несмотря на значительно больший разброс длин хромосомы 4 льна (2,3-7,1 мкм), после обработки 9-АМА по сравнению с необработанными (1,5-2,8 мкм) (Рис. 4), основной рисунок С-окраски мало изменяется. При длине хромосомы от 2,3 до 5,5 мкм обнаружено постоянство размеров и вариабельности крупных гетерохроматических блоков; не меняется также положение на хромосомных плечах небольших интеркалярных С-бэндов. Это позволяет проводить оценку полиморфизма С-блоков в хромосоме 4 льна, подобно тому, как это делается и у ячменя.

Рис. 4. Функция распределения длин хромосом ячменя (1), льна после обработки 9-АМА (2), льна без обработки 9-АМА (3).

Таким образом, было установлено, что на препаратах, приготовленных с применением 9-АМА, необходимо выбирать для исследования определенный интервал длин хромосом, который не должен превышать трёх средних размеров тех же метафазных хромосом, полученных без применения интеркалятора. В этом интервале длин можно достоверно оценивать хромосомный полиморфизм как по наличию-отсутствию С-бэндов, так и по их размерам. В указанном интервале длин на мелкохромосомных объектах можно проводить сравнительные исследования рисунков С-окраски и составлять хромосомные паспорта, аналогично тому, как это делается на крупнохромосомных объектах. Рекомендации, приведенные в этом разделе, учитывались нами при изучении полиморфизма по С-блокам разных сортов посевного льна (долгунцовые, масличные и межеумки) и в последующих исследованиях хромосом растений с использованием 9-АМА.

1.2.2.2. Сравнительное исследование рисунков ОН- и С-бэндинга.

Проведенное нами исследование рисунков (Ж-бэндинга хромосом ромашки, гороха и цингерии позволило определить некоторые общие особенности этого типа окрашивания. Установлено, что рисунок (Ж-окраски выявляется на недоконденсированных прометафазных хромосомах. Рисунок (Ж-окрашивания воспроизводим, хромосомо- и видоспецифичен, несмотря на то, что число выявляемых на хромосомах растений СЖ-бэндов зависит от степени конденсации хромосом, подобно тому как это имеет место при Сили Я-окрашивании хромосом животных.

При окрашивании хромосом растений ацетоорсеином было обнаружено, что, в отличие от окрашивания по С-методу, прицентромерные гетерохроматические районы хромосом обычно окрашиваются очень слабо. Для детального сравнения двух различных методов окрашивания была проведена последовательная обработка хромосом льна крупноцветкового (Ыпит grandiflorum Повії) ацетоорсеином и АТ-специфичным флуоресцентным красителем БАРІ. Как известно, на хромосомах растений, в том числе у льнов, БАР1-позитивные районы обычно совпадают с С-бэндами

Рис. 5. Хромосомы Ь. ¡>гап<Щ1огит\ а - СЖ-бэндинг, б - последующее окрашивание ОАР1, в - компьютерное совмещение ОАР1- и СЖ-бэндинга, г -С-бэндинг.

В результате последовательного (Ж- и ВАР1-окрашивания хромосом льна и последующего компьютерного наложения изображений выявлено, что ацетоорсеин слабо окрашивает не только околоцентромерные, но и теломерные гетерохроматические районы. Кроме того, было обнаружено, что большинство крупных блоков интеркалярного гетерохроматина также не окрашивается ацетоорсеином (Рис. 5 и см. разделы 2.3 - 2.5).

Таким образом, было установлено, что рисунок СЖ-бэндинга, хотя и зависит от степени компактизации хромосом, не является простым отражением рисунка дифференциальной конденсации. Вероятно,

Рис. 5). интенсивность окрашивания ацетоорсеином зависит не только от плотности упаковки отдельных районов хромосом, но и от особенностей структурной организации этих районов.

1.3. Молекулярно-цитогенетические маркеры для картирования хромосом и геномов с помощью флуоресцентной гибридизации in situ.

В период активной интеграции молекулярной биологии и цитогенетики значительно упростилась идентификация отдельных хромосом или геномов. Стало возможным проводить молекулярное кариотипирование с помощью метода FISH, позволяющего локализовать на хромосомах молекулярные маркерные зонды - хромосомоспецифичные или геномоспецифичные последовательности ДНК, т.е. осуществлять физическое картирование хромосом. У растений в качестве маркерных зондов обычно используются различные повторяющиеся последовательности.

1.3.1. Теломерные повторы.

Известно, что хромосомные слияния, имеющие место при реорганизации кариотипов растений в процессе видообразования, могут приводить к изменению числа и морфологии хромосом в родственных геномах. В некоторых случаях на месте слияния хромосом остаются теломерные повторы, обычно локализованные на концах хромосом. Наличие таких интерстициальных сайтов теломерных повторов может свидетельствовать о произошедших хромосомных перестройках и, в ряде случаев, дает возможность исследовать особенности реорганизации кариотипов в процессе видообразования. Кроме того, локализация таких дополнительных мест расположения теломерных повторов на хромосомах может служить в качестве дополнительных маркеров при распознавании трудно идентифицируемых хромосом (Рис. 6).

Рис. 6. FISH с зондом теломерного повтора (AAATGGG) (красный) на хромосомах: a -Pisum sativum (интерстициальные сайты гибридизации отсутствуют); б -Linum hirsutum (в двух хромосомах выявлены интерстициальные сайты гибридизации). Хромосомы окрашены DAPI (синий).

Использование теломерного повтора в качестве дополнительного молекулярно-цитогенетического маркера достаточно перспективно для изучения мелких хромосом и уточнения точек хромосомных разрывов в генетических коллекциях растений с перестроенными кариотипами, а также при исследовании особенностей структурной организации B-хромосом (См. разделы 2.4 и 2.6).

1.3.2. Гены рибосомных РНК.

Наиболее часто в качестве эффективных хромосомных маркеров используют рисунки локализации последовательностей генов 45S и 5S рРНК. Как известно, ДНК-последовательности рибосомных генов высоко консервативны и обладают очень низкой видовой специфичностью. Это позволяет последовательности генов рибосомных РНК, выделенные из генома какого-либо одного вида, применять в качестве зондов для исследования их хромосомной локализации с помощью FISH как у близких, так и у филогенетически далеких видов. В нашей работе была продемонстрирована возможность использования последовательности 18S-28S рДНК, выделенной из генома человека (клон 22F9 из библиотеки LA-13NC01), для гибридизации с хромосомами ячменя (Рис.7а). Также, показана возможность использования зондов 18S-26S и 5S рДНК (клоны рТа71 и рТа794 соответственно), полученных из генома мягкой пшеницы [Gerlach, Bedbrook, 1979], для гибридизации с хромосомами человека и примитивных фотосинтезирующих эукариот - красных одноклеточных водорослей (Рис. 7в и 76). зондами генов vulgare

Расположение локусов рибосомных генов на хромосомах считают синапоморфным признаком, несмотря на редкие исключения из этого правила, связанные с особенностями геномов некоторых видов. Изучение хромосомной локализации генов 45 S и 5S рРНК, наряду со сравнительными исследованиями последовательностей межгенных спейсеров (ITS), успешно используется для определения филогенетических взаимосвязей родственных видов растений (См. раздел 2.5).

1.3.3. Геномная гибридизация.

Высокое содержание различных классов повторяющихся последовательностей в геномах растений привело к разработке метода геномной гибридизации in situ (GISH), который открыл тайны происхождения многих аллополиплоидных видов, в частности злаков маркеры, очень ценна, особенно для хромосом с трудно выявляемым и бедным рисунком С-бэндинга.

1.3.4. Геномные библиотеки - источник зондов для FISH.

Картирование уникальных генов и различных анонимных последовательностей ДНК на хромосомах человека было начато задолго до начала тотального секвенирования его генома и во многом послужило основой для его успешного проведения. С целью исследования генома человека были разработаны различные методики получения ВАС-, YAC-библиотек геномных ДНК-последовательностей, позволившие секвенировать отдельные фрагменты генома и собирать из них фрагменты генома большего размера. Был разработан метод создания Notl-библиотек, специфичных для одной хромосомы и для генома в целом. Поскольку Notl сайты ассоциированы с генами, то исследование последовательностей ДНК из этих библиотек позволило обнаружить и картировать множество генов на хромосомах человека. Можно привести пример гена Harakiri (Рис. 10), вовлеченного в процесс апоптоза клеток.

Рис. 10. Локализация на 12 хромосоме человека (12ql3.1) гена Harakiri (красный). Хромосомы окрашены DAPI (синий).

Кроме того, использование клонов ДНК из Notl-библиотек позволило уточнить последовательность расположения генов в некоторых районах хромосомы 3 человека и выявить новые предполагаемые гены-супрессоры опухолевого роста. Сконструированные на основе Notl клонов ДНК микрочипы позволили создать новую технологию сравнительного анализа геномной ДНК, выделенной из нормальных и опухолевых клеток, дающую возможность выявлять генетические и эпигенетические изменения в геномах клеток на разных стадиях канцерогенеза. Интенсивные исследования генома человека также положили начало развитию молекулярной цитогенетики растений. Методики, разработанные для изучения хромосом человека и животных, были модифицированы и широко применяются для исследования хромосомной организации геномов растений. Интенсивные исследования структуры геномов растений (в первую очередь арабидопсиса) обнаружили, что участки генов растений, также как и животных, обогащены CpG-последовательностями, содержат Notl сайты рестрикции, метилирование которых и у растений является одним из способов эпигенетической регуляции [Matsuyama et cd., 2003]. Нами были проведены пилотные эксперименты по получению геномных Notl библиотек из Triticum aestivum L., L. usitatissimum и L. austriacum, используя методику создания Notl - связующих библиотек человека. Из генома пшеницы (около 7 млрд. п.н.) не было получено ни одного клона. В то же время с первой попытки из геномов льнов (около 650 млн. п.н. для L. usitstissimum) получен 41 клон геномных фрагментов. В результате сравнения сиквенсов этих последовательностей с имеющимися в базах данных (NCBI Blast и Arabidopsis thaliana WU-BLAST2) для 22 ДНК клонов не было обнаружено гомологий. Среди остальных выявлены гомологии с фрагментами хлоропластных и ядерных генов, а также с ДНК-последовательностью ретротранспозонного элемента, гомология с сиквенсом которого приведена на рис. 11.

СЬк 32 L. «Мши (capт орюішї-їі

AT4G06656 .1 I S^nbols : | gypsy-like retrate änsposon. fanüy (Ath .la; has a З.Зє-294 P-iralue blast match to ВВ:СЙА57397 Athila ORF 1 (Aialjlrtopsls tnallanaj | cura;3841924-3830389 REVEUSE Length =

Plus Strand HSPs :

Scare = 360 (60.1 bits), Expect = 2.5e-10, P = 2.5e

Identities = 190/312 (60%), Positives = 190/312 ібОй), Strand = Plus / Plus

Query:

Sbjct : "inn?

31 Є1ТПСЛМ1вЛвІІ-ТЄССЛАСГСАІТЄвв--АСІіССІЛАТСвАТТШЧСАТСАСІІАС

IIIIII I I I II II II III I II II I II I II Hill

4951 BlTTf CGAGAGT CTACT (ÄGiAAGAAT GGGGr ХАййСАСДйЛ GTÀGCKA-C - ТС -С ТТЙ.С

Query :

Sbj et :

88 CaCCrAtÄT6CftTBCGGCCfteGflGBG&ÄGTGiUl6ftftTCTreftGCTCAAGlBCATTrTTTT 147 II I III II I II II I II I I I I I II I I I I II I II I I 50 0 В CA 1CCACAGÄCAAGTGGCCAGG IGGAAA- ТС Г CIAACAGBGA GATAAAATCAAT TC TftGA

Query :

SD] et :

148 AAAACCüüTCG-TB.XCiUiTCTCTOAüC-KACreGTGiATCüCGCTCGATaGTCTETT-T 203 I III III I III II I II I II III I I II II II II I III I

3067 GiUWÄCTGTCGGGATCft—С-CAGGAGAftftTГ GGTCTGTAAAGCТСЄДСCAT SC-БТТАТ

Query :

Sfrjct :

204 GG GCC GATG&AA TT GCG7T C1A.IÄC ÎC СТАТ Г GGCAO TT CT CAT TT T CG&GT АС TT IñT G lili I II II II I II II I II I III II I I II III I I II III I

512 3 GG GCATACAGSA CAGCT IT CAA (ЙС 1С CCATI GGTAilAACC С CGTT ТДА1СТ ТС ТГ ЇДТ G

Query:

Sbîct :

264 GCAACTCTTTTCATTTTIATST CAT GC TT ÖIGAATAAGGCÄTAT ÎGTAAGGG 6T G4AGCA

I I I II I II I II III I I III I I I III I II I I I IIIIII

5183 GCAAiTCCTPTCACTTACCTeTTCAACTSGftGIACAAGGC-TAT-GTCGGCAeTSiAÄCT

Query : 324 CCTAAATATGGA

I II II I II Sbjct : 5241 TT TAÄATTTCGA

Рис. 11. Гомология клона 32 из генома Ь. инкайаншит (сорт Оршанский 2) дурау-ПОДОбнОМу семейству реТротраиСПОЗОНОВ (АЬЫ1а). частности, именно таким образом была проведена полная идентификация б :

§ ю и і: трудно распознаваемых хромосом у Linum flavum L. (Рис. 14).

Рис. 14, Кариотип L.flafum после совмещения различных методов окрашивания хромосом: DAPI (синий) и СМА (зеленый), а также FISH с зондами теломерного повтора (AAATGGG) (красный). 1-14 - хромосомные группы, В - добавочные или В-хромосомы.

Следует отметить, что любое исследование тонкой структуры мелких митотических хромосом с помощью светооптического микроскопа практически невозможно без современных компьютерных технологий. При анализе хромосом небольших размеров и/или малоинформативным рисунком бэндинга особое значение приобретает оптимизация методов получения оцифрованных изображений хромосом и их последующей компьютерной обработки. Новые возможности по улучшению разрешения самых мелких деталей рисунка дифференциального окрашивания хромосом открывают методы деконволюции изображений. Современные методы деконволюции позволяют эффективно устранять размытие изображения (вследствие оптических аберраций и шумов регистрирующей системы) с помощью применения сложного математического аппарата для моделирования процессов формирования изображения и оценки качества восстанавливаемого изображения. В конечном итоге существенно повышается разрешающая способность оптической системы (Рис.15).

Рис.15. Локализация теломерного повтора (AAATGGG) (красный) на хромосомах льна (L.usitalissimum) методом FISH. Хромосомы окрашены DAPI (синий), а - метафазная пластинка до деконволюции; б - та же метафазная пластинка после деконволюции; в - улучшение качества изображения с помощью деконволюции позволило распознать гомологи и составить кариограмму.

Анализ кариотипов мелкохромосомных растений значительно облегчают специализированные программы хромосомного анализа, работающие в интерактивном режиме. Примером такой программы, созданной фирмой ВидеоТест совместно со специалистами по хромосомному анализу, и в том числе при нашем активном участии, могут служить программы ВидеоТестКарио 1.5 и 2.0 (ВидеоТест, Санкт-Петербург).

Разработка программы ВидеоТестКарио 1.5 была направлена на создание объективного помощника при разностороннем изучении структуры хромосом (Рис. 16). С помощью этой программы анализ изображений хромосом ведется в интерактивном режиме. Взаимодействие исследователя с различными модулями программы позволяет направленно улучшать изображения хромосом, проводить их измерения, определять центромерные индексы, а также положение и размеры бэндов, что особенно ценно при малом числе маркеров хромосом.

Рис. 16. Интерфейс программы хромосомного анализа ВидеоТестКарио 1.5.

Идиограммы строятся в соответствии с интенсивностью окрашивания хромосомы по длине, что позволяет составлять объективные количественные идиограммы. По усредненным данным двух гомологов строится идиограмма хромосом генома изучаемого растения. Полученные результаты измерений хромосом в метафазной пластинке вносятся в таблицу, которая может быть преобразована в формат программы Microsoft Office Excel. Это позволяет накапливать результаты измерений по нужному числу хромосомных пластинок и далее использовать их для математической обработки, что очень важно при изучении полиморфизма хромосом, создании баз данных, а также при проведении сравнительных исследований. Коммерческие специализированные программы хромосомного анализа других производителей не предоставляют такой возможности, что существенно усложняет изучение хромосом разных видов растений.

Особенно эффективно сочетание комплексного подхода к изучению хромосомной организации геномов растений с различными молекулярными методами их исследования. Примерами плодотворности одновременного использования цитогенетических и молекулярных технологий (RAPD, ITS, определение количества ДНК в расчете на 1С) для изучения геномов растений могут служить сравнительные исследования различных видов красных микроводорослей, двухромосомных злаков и льнов, а также сортов и линий гороха, подробно описанные в следующей главе.

Глава 2. Хромосомная организация геномов у низших и высших видов растений с хромосомами малых размеров или неинформативным рисунком дифференциального окрашивания.

2.1. Сравнительные исследование геномов А| (Ї. кегЬасеит и (АБ)2 Є. ЬагЬа(1ете.

С помощью BrdU-Hoechst-Giemsa-метода выявления рисунков ранней репликации хромосом были изучены кариотипы дикорастущей разновидности диплоидного хлопчатника (гуза) Gossypium herbaceum L. var. africanum (Watt) Mauer (2n = 26) и возделываемого аллотетраплоидного вида тонковолокнистого хлопчатника G. barbadense L. (2п = 52). (! )!

Db !И \\ IIу! Ц ti М <1 « 'ti ** ™

Рис. 17. Кариограмма и идиограмма BrdU-Hoechst-Giemsa - окрашенных хромосом (а-т - обозначения хромосомных групп) хлопчатников: А1 - геном С. кегЬасеит; АЬ и ОЬ - субгеномы в составе генома (ЛО)2 С?. ЬагЬайете.

На прометафазных хромосомах хлопчатников длиной 1,8-5,5 мкм число выявленных Сіетза-позитивпьіх бэндов на хромосому варьировало от 2 до 9, Полученные рисунки ранней репликации хромосом были воспроизводимы и хромосомоспецифичны, что позволило идентифицировать все хромосомы в геноме А[ диплоида С. кегЬасеит и в геноме (АБ)г аллотетраплоида С. ЬагЬисІеше. При этом геном (АБ)г был разделен на субгеномы Аь и Оь по размеру хромосом и сходству ВгсШ-НоесІївЮіегша-бзндинга (Рис. 17). Сравнительное изучение рисунков ВгсШ-ІТоесЬзІ-Оіетяа-бшдинга хромосом в геномах хлопчатников выявило сходство распределения рано реплицирующихся районов по длине хромосом в Ai-геноме и в Аь- и Db-субгеномах.

Проведенное исследование показало, что у растений, так же как и у животных, рисунок репликации хромосом достаточно консервативен и может применяться для решения задач цитогенетики. Однако, несмотря на хорошее разрешение этого метода для анализа мелких хромосом растений, он имеет существенные недостатки, ограничивающие его применение. Метод довольно сложен в исполнении, требует длительной предобработки прорастающих корней раствором бромдезоксиуридина в высокой концентрации. При этом высокая митотическая активность корневой меристемы сохраняется только в условиях хорошей аэрации корней. Кроме того, использованный вариант BrdU-Hoechst-Giemsa-бэндинга не совместим с другими методами дифференциального окрашивания хромосом, а также с FISH, что очень важно при исследовании хромосомной организации геномов разных растений.

2.2. Микроводоросли класса Cyanidiophyceae (Rhodophyta).

До нашего исследования митотические хромосомы в клетках автоспор одноклеточных красных водорослей с помощью микроскопического исследования обнаружить не удавалось. Использование 9-АМА позволило визуализировать митотические хромосомы одноклеточных красных водорослей Galdieria maxima, G. partita, G. sulphuraria и Cianidium caldarium в процессе формирования автоспор. Для этого была разработана методика, позволяющая одновременно обрабатывать культивируемые клетки водорослей 9-АМА и пепсином с целью размягчения белкового компонента клеточных стенок. Такой подход позволяет после фиксации клеток и окрашивания ацетоорсеином получить хорошие давленые препараты недоконденсированных митотических хромосом и провести их морфометрическое исследование.

В автоспорах всех трех видов Galdieria было обнаружено по две хромосомы длиной 0,8-2,3 мкм, причем одна из хромосом была на треть больше другой (Рис. 18).

Рис. 18. Хромосомные пластинки (а) и их контрасти-рованное изображение (б):

1 - G. maxima,

2 - G. partita,

3 - G. sulphuraria,

4 -С. caldarium. Масштабная линейка - 3 мкм.

1 О О а б Ч* я б а б а б

Статистически значимые межвидовые различия размеров хромосом G. maxima, G. partita, G. sulphuraria могут быть использованы в качестве дополнительного признака при определении видовой принадлежности этих водорослей. Больше трудностей представлял подсчет числа хромосом в геноме С. саМагіит, поскольку размеры 5 видимых хромосом были от 0,4 до 0,7 мкм (Рис. 18). Иногда с трудом различались еще 2 точечных хромосомы, размеры которых были на грани разрешающей способности светового микроскопа.

На хромосомах всех изученных видов было трудно точно определить положение центромер. Возможно, что хромосомы этих водорослей относятся к голоцентрическому типу, характерному для некоторых зеленых водорослей. Полученные результаты позволяют использовать число хромосом в качестве таксономического признака для распознавания представителей родов Сіапісііит и ОаШіегіа.

Определение содержания ядерной ДНК, проведенное на профазных ядрах, окрашенных по Фельгену, показало, что представители семейства Суапісііасеае имеют самые маленькие из известных геномов у фотосинтезирующих эукариот - 1,5-2,25x10"2 пкг ДНК в расчете на 1С (Табл. I).

Таблица 1. Средние значения суммарной длины хромосом и количества ДНК в геномах красных микроводорослей.

Вид микроводоросли Суммарная длина хромосом, mkm±SE Содержание ДНК на 1С, пкг 10 2±SE

G. maxima 4.14±0.44 2.25+0.

G.partita 2.82±0.49 1.56±0.

G.sulphuraria 2.07±0.18 1.35±0.

С. caldarium 2.61±0.06 1.49±0.

SE - стандартная ошибка среднего значения,

Это хорошо объясняет как малые размеры хромосом, обнаружить которые при микроскопическом исследовании стало возможным только после применения 9-АМА, так и отсутствие дифференциального окрашивания хромосом у исследованных видов.

Таким образом, исследование хромосомной организации геномов четырех видов микроводорослей класса Cyanidiophyceae (Rhodophyta) позволило не только установить их хромосомные числа и уточнить их систематическое положение, но и подтвердить наличие зависимости хромосомной организации генома от его размера.

2.3. Ромашка аптечная и родственные виды.

Исследование рисунков OR- и С-бэндинга хромосом (Рис. 19, 20) у двух диплоидных (Азулена и Сибирская бизаболольная) и одного автотетраплоидного (Подмосковная) сортов ромашки аптечной Matricaria chamomilla L. показало, что четкий рисунок OR-бэндинга выявляется на хромосомах ромашки размером 5,3-10,2 мкм. Это почти в 1,5 раза превышает длину хромосом, необходимую для получения С-бэндинга высокого разрешения и в 2 раза - длину метафазных хромосом, получаемых без использования 9-АМА (2,8-5,9 мкм).

На каждой хромосоме ромашки аптечной выявляется от 12 до 22 СЖ-бэндов. При этом центромерные районы, а также области вторичных перетяжек не окрашиваются. Сравнительное изучение рисунков (Ж-окраски хромосом у разных сортов ромашки обнаружило межсортовую консервативность этого типа бэндинга.

Рис. 19. С- (а) и СЖ- (б) окрашенные хромосомы М. сііатотіїїа сорта Сибирская бизаболольная.

При изучении рисунков С-бэндинга в кариотипах тех же трех сортов ромашки аптечной выявлено, что они отличались большей контрастностью и наличием ряда дополнительных мелких интеркалярных С-блоков по сравнению с необработанными 9-АМА С-окрашенными хромосомами. По рисункам С-бэндинга проведена идентификация хромосом в кариотипах изученных сортов. Сорта различались в основном по размерам прицентромерных гетерохроматических районов, а также ряда небольших интеркалярных и теломерых С-бэндов на всех хромосомах, кроме 4 и 5. Хромосомы сорта Подмосковная в целом были более гетерохроматичны по сравнению с диплоидными сортами. Изучение рисунков С-бэндинга хромосом у этого сорта позволило подтвердить его автополиплоидное происхождение. Тем не менее, выявлены небольшие различия в рисунках С-окраски 2, 6 и 7 хромосом из разных субгеномов в кариотипе сорта Подмосковная. Геном ромашки аптечной был обозначен нами МС|, геном.

На основании оценки размеров хромосом, положения центромер и вторичных перетяжек было установлено соответствие результатов по идентификации хромосом, проведенной на основании рисунков СЖ- и С-окрашивания хромосом Мс)1 генома ромашки аптечной, и построены идиограммы (Рис. 20). а:; к;г ff ta f

Рис. 20. Идиограммы и кариограммы С-(слева) и (Ж- (справа) окрашенных хромосом (1-7 - обозначения гомологичных групп) МС|,-генома М. скатотШа Ь.

Исследование хромосом двух родственных видов ромашек: диплоидной М. maritima L. (2п = 18) и тетраплоидной М. inodora L. (2п = 36), позволило идентифицировать по рисункам С-окраски и морфологическим параметрам все пары гомологов в их кариотипах. Обнаружено, что геном М. inodora по морфологии хромосом и рисункам С-бэндинга можно разделить на два практически идентичных субгенома, что указывает на автополиплоидное происхождении этого вида. Сравнение хромосом М. maritima и М. inodora выявило, что они имеют очень близкие рисунки распределения гетерохроматических сегментов и сходную морфологию. Это позволило предположить, что геном М. inodora образовался в результате удвоения генома М. maritima , который был обозначен Мт. Это подтверждается и тем, что содержание ядерной ДНК в расчете на 1С у изученных видов имеет близкие значения: у диплоидного вида - 2.75 пкг, а у тетраплоидного вида -2,31 пкг [Garcia et al., 2005]. Сравнение хромосом Mm- и МсЬ-геномов выявило сходство морфологии хромосом и рисунков распределения позиций гетерохроматических районов по длине хромосом, что говорит об общности происхождения этих геномов. Однако в Мсь-геноме значительно большее количество гетерохроматина содержится в прицентромерных и интеркалярных районах хромосом, тогда как в Мт-геноме более четко были выражены тсломерные С-бэнды. Вероятно, дифференцировка этих геномов сопровождалась перераспределением повторяющихся последовательностей и их амплификацией в проксимальных районах хромосом Мсь-генома. Это соответствует и значительно большему содержанию ядерной ДНК у ромашки аптечной - 3,87 пкг в расчете на 1С [Garcia et al., 2005].

2.4. Горох посевной.

Применение 9-АМА позволило впервые изучить рисунки OR- и С-окраски хромосом 8 сортов гороха посевного (Pisum sativum L.), который имеет размеры хромосом, сходные с ромашкой. При С-окрашивании хромосом гороха выявляются небольшие прицентромерные и теломерные, а также мелкие интеркалярные С-бэнды. На основании оценки морфологии хромосом и рисунков С-бэндинга была проведена идентификация хромосом в геноме гороха в соответствии со стандартной цитогенетической номенклатурой Бликста (Рис. 21а) [Blixt, 1959].

• «. • i " *"

6 и if сел II щ

Рис. 21. Кариотипы P. sativum L.: С- (а) и OR- (б) дифференциальное окрашивание хромосом. Компьютерное совмещение последовательно окрашенных хромосом ацетоорсеином (красный) и DAPI (синий) (в). 1-7 - номера хромосом в соответствии со стандартной номенклатурой Бликста.

Рисунки С-бэндинга хромосом у сортов овощного, сахарного, кормового и зернового гороха различались по размерам прицентромерных и приспутничных гетерохроматических блоков, а также интеркалярных С-бэндов в коротких плечах 2, 3, 4 и 7 хромосом и в длинных плечах хромосом 1 и 5.

Четкий OR-бэндинг с большим числом темноокрашенных районов был выявлен на хромосомах тех же сортов гороха. По рисункам OR-окраски идентифицированы все хромосомы (Рис. 216). Также как и С-окрашенные хромосомы, они были расположены по размерам и центромерному индексу в соответствии с номенклатурой Бликста. Было проведено последовательное (Рис. 21 в) OR-, а затем C/DAPI-окрашивание (Рис. 21а и 22а) хромосом гороха, которое подтвердило правильность такого подхода при их идентификации. Межсортовых различий по рисункам OR-окраски не было выявлено.

При исследовании хромосом гороха было обнаружено, что на профазных и прометафазных хромосомах после предобработки 9-АМА и процедуры FISH выявляется Q-подобный DAPI-бэндинг. В зависимости от фазы митоза DAPI-бэндинг может быть различной степени разрешения. По мере компактизации хромосом Q-подобный DAPI-бэндинг переходит в С-подобный DAPI-бэндинг (C/DAPI-бэндинг) (Рис. 22а). flioli;

§kFWP' * ч Ip 1 - / щ 1 ^m іv Ii; і ■ feri sat

5 6 . =•■: 7 m 1 |?Г, Щ * *.<.,, І її' s w 4 / Ш*{'\ * ** 1 ІП 1 c - ]fJ" 1 ; u \ / Ы , - /fei |:7 ' : ^ gjE? ' Sä sat а І і І І ,, * *- і іїш 2 \ 7* * У* \ ** і Г І- ' . і і З пілг 2 г * % шаг ш*і 1' М-10 L-ІПЯ б

Рис. 22. Кариограммы и идиограммы ІМРІ-окрашенньїх (инвертированное изображение) хромосом гороха (1-7 - номера хромосом в соответствии со стандартной номенклатурой Бликста): а - разные степени разрешения ОАРІ-бэндинга (на профазных хромосомах суммарное число БАРІ-полос на гаплоидный набор хромосом гороха равно 344); б - точная локализация точек разрывов хромосом в транслокационных линиях гороха 1,-108 и М-10 по рисункам высокоразрешающего 1)АР1-окрашивания.

Это обстоятельство позволяет подобрать степень конденсации хромосом, при которой по рисунку DAPI-бэндинга возможно идентифицировать хромосомы и при необходимости локализовать на них точки хромосомных перестроек или ДНК-зонды. С помощью такого подхода была изучена структура кариотипов транслокационных линий L-108 и М-10 гороха. DAPI-бэндинг высокого разрешения позволил точно установить на профазных-прометафазных хромосомах точки разрыва хромосом при транслокациях (Рис. 226). Для линии L-108 выявлены точки разрывов в проксимальных районах коротких плеч хромосом 2 и 7. Для линии М-10 впервые установлено наличие двойной транслокации между длинными и короткими плечами хромосом 2 и 4.

Сравнительное исследование рисунков DAPI-бэндинга хромосом у всех восьми сортов и 2 родственных линий (с высоким симбиотическим потенциалом) гороха, выявленных после FISH картирования рибосомных генов и теломерного повтора, обнаружило невысокий уровень внутри- и межсортового полиморфизма, подобно С-окраске (Рис. 23).

У всех изученных образцов гороха 26S рДНК находится в районах вторичных перетяжек и на спутнике 4 хромосомы и в приспутничном районе 7 хромосомы. Сайты 5S рДНК располагались на 1, 3 и 5 хромосомах, причем высокоразрешающее DAPI-окрашивание дало возможность уточнить районы локализации 5S рДНК. Теломерные повторы выявлялись на концах всех хромосом (см. раздел 1.3.1, рис. 6) как в нормальных, так и в транслокационных кариотипах. Дополнительных сайтов гибридизации с рДНК и теломерными последовательностями не выявлено (Рис. 23).

Ag-ЯОР-окрашивание показало, что в изученных образцах гороха оба локуса 26S рДНК, расположенные на хромосомах 4 и 7, функционально активны. В линиях гороха, несущих транслокации по ЯОР-образующим хромосомам 4 и 7, изменений функциональной активности ЯОР в этих хромосомах не обнаружено.

Рис. 23. Хромосомы гороха сорта Frisson: а - С-бэндинг, б - FISH-картирование 45S (зеленый) и 5S (красный) рДНК, в -идиограмма хромосом с указанием расположения C/DAPI-бэндов (черный), 45S (зеленый) и 5S (красный) рДНК 1-7 -номера хромосом в соответствии со стандартной номенклатурой [Blixt, 1959; Fuchs et al, 1998].

Исследование геномного полиморфизма у изученных сортов и линий гороха методом КАРО-РСЯ-анализа в полиакриламидном геле с 3 информативными праймерами А06, А09 и А10 в выявило между ними различия по 45 полиморфным локусам. ЛАРО-спектры всех исследованных представителей сорта или линии делились на кластеры в четком соответствии с сортовой принадлежностью. В кластерах линии Sprint 2 и сорта Finale обнаружен геномный полиморфизм между изученными индивидуальными растениями. Полученные нами результаты подтверждают возможность применения RAPD-анализа для идентификации сортов гороха [Гостимсшй и др., 2005].

Таким образом, значительных кариотипических различий исследованных сортов и линий гороха выявлено не было. Тем не менее, даже небольшие специфические особенности их геномов могут служить основой для создания кариогеномного паспорта. Такой подход может быть особенно важен для сертификации определенного генотипа гороха посевного при создании новых сортов и проверке чистоты суперэлитного и элитного семенного материала.

2.5. Исследование Zingeria biebersteiniana и родственных видов.

2.5.1. Цингерия Биберштейна.

Наряду с исследованием мелкохромосомных видов нами были изучены дикорастущие злаки, с числом хромосом кратным 2 - Z. biebersteiniana (Claus) P. Smirn. (2n = 4) и Z. pisidica (Boiss.) Tutin (2n = 8), Colpodium versicolor (Stev.) Schmalh. (2n = 4) с целью изучения формирования и происхождения их уникальных двухромосомных геномов. Сложность исследования хромосом этих растений была связана с тем, что, несмотря на довольно крупные размеры хромосом (8-11 мкм), две пары хромосом цингерии не всегда легко идентифицируются по размерам и морфологии, особенно в случае отсутствия выраженных вторичных перетяжек, а рисунок С-бэндинга у них беден и поэтому малоинформативен. При С-окрашивании хромосом Zingeria biebersteiniana четко выявляются только крупные С-бэнды в прицентромерных районах хромосом, а интеркалярные и прителомерные С-бэнды имеют очень маленькие размеры и выявляются нерегулярно (Рис. 23а). Следует отметить, что по рисункам С-бэндинга идентификация хромосом цингерии не составляет труда, но сравнение хромосом близкородственных видов значительно затруднено ввиду плохой выраженности интеркалярных С-бэндов. Это обстоятельство выдвинуло на первый план задачу поиска дополнительных хромосомных маркеров, позволяющих детально исследовать структуру хромосом двухромосомных злаков.

Применение 9-АМА позволило выявить на недоконденсированных хромосомах длиной 11-15 мкм чёткий рисунок СЖ-бэндинга (Рис. 236).

Рис. 24. Кариограммы и идиограммы цингерии: а -С- бэндинг и б - (Ж- бэндинг. 1 и 2 - номера хромосом.

Д г )f

I-S і

По сравнению с С-окраской рисунок OR-бэндинга в хромосомах цингериии представлен большим числом интеркалярных бэндов. При этом С-позитивные прицентромерные районы хромосом, а также области вторичных перетяжек ацеторсеином не прокрашиваются.

2.5.2. Происхождение двухромосомных злаков Zinseria и Colpodium.

Для установления путей происхождения уникальных двухромосомных геномов злаков проведеноавнительное исследование хромосом в кариотипах Z.biebersteiniana (2п = 4), Z. pisidica (2п = 2х = 8), Colpodium versicolor (2n = 4) и Catabrosella variegata (syn.= Colpodium variegatum) (2n = 10). Метод С-дифференциального окрашивания выявляет на хромосомах этих видов малоинформативные рисунки, тем не менее, в кариотипах двух образцов Z. bibersteiniana из разных мест произрастания обнаружен межпопуляционный полиморфизм С-блоков хромосом. В частности, хромосомы растений,бранных вблизи лимана Пришиб в Волгоградской области,держат более крупные прителомерные и интеркалярные С-блоки поавнениюхромосомами растений, выросших в окрестностях Рахинка той же области.

Рис. 25. Кариограммы, идиограммы, метафазные пластинки С-окрашенных хромосом и FISH с зондами 45S (зеленый) и 5S (красный) рДНК. Zb -Z.bibershteniana, Zp - Z.pisidica и С - C.versicolor. Масштабные линейки по 5 мкм.

Сравнительный анализ геномов С. versicolor и Z. biebersteiniana показал, что они сходны по морфологии и характеру распределения интеркалярных С-блоков по одной из хромосом, тогда как по другой ядрышкообразующей) хромосоме различаются по центромерному индексу, положению вторичных перетяжек и рисунку С-окрашивания.

Установлено, что две пары хромосом из четырех в кариотипе Z. pisidica имеют значительное сходство с хромосомами Z. biebersteiniana. Однако, в отличие от Z. biebersteiniana, хромосомы Z. pisidica не содержат крупных прицентромерных С-блоков. Две другие хромосомы по рисункам С-окраски сходны с хромосомами С. versicolor. Однако размеры отдельных интеркалярных С-блоков у Z. pisidica значительно крупнее, чем таковые в хромосомах С. versicolor (Рис. 25). По-видимому, один из субгеномов Z. pisidica и геном Z. biebersteiniana имеют общее происхождение. Не исключено, что предковый геном С. versicolor принимал участие в формировании другого субгенома Z. pisidica.

У исследованных видов проведена хромосомная локализация генов 45S и 5S рРНК. Рисунки расположения генов 45S и 5S рРНК на хромосомах двух видов цингерий и у С. versicolor подтверждают предположение, что Z. pisidica является аллотетраплоидом, у которого один из субгеномов сходен с геномом Z. biebersteiniana (Рис. 24). Сравнение кариотипов Catabrosella variegata и описанных выше видов злаков не выявило черт сходства между ними.

Проведено сравнение последовательностей внутренних транскрибируемых спейсеров ITS1 и ITS2 генов 45 S рРНК в геномах изученных видов. Обнаружено, что геномы уникальных двухромосомных злаков (х = 2) - Z. biebersteiniana (2п = 4), Z. pisidica (2п = 2х = 8) и Colpodium versicolor (2n = 4), относимые ранее к разным трибам или подтрибам, представляют два близких рода, генетическое расстояние (p-di stance) между ITS которых составляет всего 1,2-4.4%. На молекулярно-филогенетическом древе виды Zingeria и Colpodium versicolor образуют единую кладу с Catabrosella araratica (2n = 42, х = 7).

Таким образом, установлено, что геномы Zingeria и Colpodium с наиболее низким из известных основным числом хромосом (х = 2) возникли не в разных филогенетических ветвях, а имеют монофилетическое происхождение.

2.6. Изучение геномов у видов рода Linum L.

Для определения родственных взаимоотношений и уточнения таксономического статуса, а также выявления филогенетических взаимосвязей видов рода Linum L. проведено изучение геномов возделываемого Linum usitatissimum L. и 25 дикорастущих видов из 6 секций [Юзепчук, 1949; Егорова, 1996], в основном произрастающих в Евразии.

2.6.1. Идентификация хромосом, геномы и кариогипы видов льна.

Род Linum - лен включает около 200 видов, которые разделяют на 5-9 секций [Юзепчук, 1949; Ockendon, Walters, 1968; Егорова, 1996]. Кариологическое изучение видов льна начато более полувека назад, и почти у 30 видов Нового и 50 видов Старого Света были определены хромосомные числа. Показано, что в кариотипах льновых число хромосом варьирует от до 84. Однако, у многих видов льна числа хромосом, определенные разными исследователями, различались. Даже в кариотипе наиболее хозяйственно важного возделываемого вида L. usitatissimum L. насчитывали два числа хромосом 2п = 30 и 2п = 32. Хромосомы у льнов имеют сходную морфологию (в основном это метацентрики), и их размеры колеблются от 1 мкм до 6 мкм [Ray, 1944; Болховских и др.,, 1969; Rogers и др., 1972; Chennaveeraiah, Joshi, 1983].

При изучении кариотипов видов из 6 секций рода Linum L. нами впервые установлены хромосомные числа у L. squamulosum Rudolphi (2n = 18), L. komarovii Juz. (2n = 18), L. thracicum Degen. (2n = 28+1-6B) и L. czernjajevii Klokov (2n = 28+1-6B); уточнены хромосомные числа у L. decumbens Desf. ( 2n = 16), L. narbonense L. (2n = 28), L. stelleroides Planch. (2n = 18), L. pallescens Bunge (2n = 18). На основании исследований кариотипов 22 долгунцовых и масличных сортов льна, а также межеумков было подтверждено, что число хромосом у L. usitatissimum - 2п = 30.

До настоящею исследования ни у одного вида льна по результатам монохромного окрашивания в кариотипе не были идентифицированы пары гомологов. В результате дифференциального окрашивания в хромосомах всех изученных видов были выявлены C/DAPI-бэнды, самые крупные из которых располагались преимущественно в прицентромерных районах, а средние и небольшие - в теломерных и интеркалярных районах хромосом. На хромосомах всех изученных видов были локализованы пробы 26S и 5S рДНК. В геномах большинства видов льнов обнаружены 1-2 основных локуса 26S рДНК, ко-локализованные с 5S рДНК, а также 1-3 отдельных локуса 5S рДНК. Исключение составили два вида секции Linopsis (syn.= Linastrum), в геномах которых 5 из 9 пар хромосом несут сайт 26S рДНК и одна - 5S рДНК. На основании изучения морфологии хромосом, рисунков C/DAPI-окрашивания и результатов FISH-анализа удалось провести полную идентификацию хромосом в кариотипах всех исследованных видов. В кариотипах видов секции Syllinum впервые были выявлены и охарактеризованы В-хромосомы.

2.6.2. В-хромосомы.

В кариотипах видов секции Syllinum: L.flavum L., L. capitatum Kit. ex Schultes, L. campanulatum L., L. thracicum Degen, L. tauricum Willd, L. elegans Sprun. ex Boiss., L. czerniajevii Klokov нами были обнаружены добавочные хромосомы (В-хромосомы), число которых варьировало в клетках корневой меристемы от 1 до 6, а у некоторых растений эти хромосомы отсутствовали вовсе.

Установлено, что В-хромосомы в кариотипах исследованных видов имеют сходную структуру. В подавляющем большинстве случаев они представляют собой субметацентрики длиной около 1 мкм, и являются самыми маленькими хромосомами в наборе. Они гетеропикнотичны, интенсивно окрашиваются DAPI и СМА (Рис. 26-III), содержат множественные сайты 5S и 26S рДНК (Рис. 26-IV), которые не проявляют функциональной активности (Рис. 26-П). В- хромосомы с такой морфологией мы назвали "основным морфологическим типом" (Рис. 26-1V). и рисунку DAPI-бэндинга B-хромосомы иногда бывает трудно отличить от самых мелких хромосом постоянного набора (A-хромосом), наличие генов рибосомных РНК в B-хромосомах позволяет надежно их идентифицировать. Исследование B-хромосом у видов секции Syllinum позволило точно установить число A-хромосом в их кариотипах (2п = 28).

2.6.3. Сравнительные молекулярно-цитогенетические исследования видов льна.

Все исследованные виды льнов были разделены на 8 групп на основании сходства их кариотипов. Виды, объединенные в одну группу, имели сходную структуру кариотипов, а межвидовые различия, выявленные по рисунку C/DAPI-окраски хромосом и расположению рибосомных генов, были представлены небольшим числом реципрокных хромосомных транслокаций или перицентрических инверсий. В то же время, кариотипы видов, входящих в разные группы, значительно отличались друг от друга как по размерам, числу хромосом и рисункам их дифференциального окрашивания, так и по числу и расположению на хромосомах рДНК локусов. Кариограммы и идиограммы одного из видов, принадлежащих к каждой группе представлены на рисунке 27.

Первую группу составили виды с 2п = 18 из секций Adenolinum и Stellerolinum. Хромосомы вида L. stelleroides Planch., который систематики выделяют в монотипную секцию Stellerolinum Juz. ex Probat. [Юзепчук, 1949], по рисунку C/DAPI-окраски и расположению рибосомных генов оказались схожими с видами из секции Adenolinum (L. austriacum subsp. austriacum L., L. austriacum subsp. euxinum Juz. (=L. squamulosum Rudolphi), L. leonii F.W. Schultz, L. perenne L., L. lewisii Pursh., L. komarovii Juz., L. altaicum Ledeb., L. mesostylum Juz., L. pallescens Bunge.). По-видимому, морфологические и анатомические отличия видов этих секций обусловлены различиями их геномов на молекулярном уровне, не детектируемыми цитогенетическими методами.

Секция Linum разделилась три группы видов с 2п = 30, 2п = 16 и 2п = 28. Следует отметить, что близкородственные 30-хромосомные виды L. usitatissimum L. и L. bienne Mill, отличаются от L. angustifolium Hunds, перицентрической инверсией хромосомы 3. Эти виды и виды L. grandiflorum Desf. и L. decumbence Desf. с 2n = 16 секции Linum, хотя и различаются плоидностью, но похожи по рисункам C/DAPI-окраски многих хромосом набора и расположению рибосомных генов. Высокое сходство рисунков C/DAPI-бэндинга наблюдается также между этими видами секции Linum и видами секций Adenolinum и Stellerolinum. При этом кариотипы последних, по нашим данным, отличаются от 16-хромосомных видов по наличию, по крайне мере, одной транслокации и дупликации по хромосоме 8. Таким образом, результаты хромосомного анализа подтверждают общность происхождения вышеуказанных видов секций Linum, Adenolinum и Stellerolinum.

BStti* S* S* ** 81 ¡« 6«

2n=18 секции Adenolimtm и SteUerolinum ifli#S*lit i* !' -i<--a»l e» i» s* в• e*ie

2n=30 секция Limim iílimiss «i ii 5« -••

2п=1б секция Linum {? *)

Illllillll IIHB li 1Я» шшливш

2n=28 секция Liman (?*) ¡I i! ü II =1 !t sil sil ii =i и

2п=28+(1-б)В секция SyHinum

I II Íl It -i i^isilli £« s*i e«8*e« 2п=2б секция SyHinum (Titbilinim) llie-íl-iliHí н

2n=l б секция Dasylinum

S^B = r И Sf В

2n=18 секция Linastrum (=syn.Linopsis)

Рис. 27. Кариограммы и идиограммы СЯ)АРІ -окрашенных хромосом с локализацией 26Я и 58 рДНК представителей различных секций рода Ьіпит Ь. * -Знаком (?) помечены спорные таксоны.

Вид Ь. пагЪопете Ь. резко отличался как по числу и размерам хромосом, так и по рисунку их С/БАРІ-окраски и расположению рибосомных генов от других видов секции Ыпит. Анализ хромосом по молекулярноцитогенетическим маркерам выявил тетраплоидную природу генома этого вида. По морфологии и размерам хромосомы L. narbonense скорее схожи с таковыми у L. hirsutum L. секции Dasylinum и видами секции Syllinum (2п = 28+В), что согласуется с мнением ботаников, считающих L. narbonense переходным видом, систематическое положение которого нуждается в уточнении [Светлова, 2007; Оптасюк, 2007].

Как уже говорилось выше, обнаружение в кариотипах видов L. JIavum, L. capitatum, L. campanulatum, L. thracicum, L. tauricum, L. elegans, L. czerniajevii секции Syllinum В-хромосом, позволило установить, что число хромосом в основном хромосомном наборе этих видов равно 28. Обнаружено, что основные А-хромосомные наборы всех этих видов сходны по размерам хромосом, рисунку C/DAPI бэндинга и локализации рДНК. У двух видов L. capitatum и L. czerniajevii выявлено по одной реципрокной транслокации хромосом.

Особняком от остальных видов секции Syllinum стоит 26-хромосомный вид L. nodiflorum L. Хромосомы этого вида имеют значительно меньшие размеры по сравнению с хромосомами других видов этой секции, В-хромосом у этого вида не обнаружено. Кроме того, L. nodiflorum отличается от других видов секции по расположению и количеству локусов генов рибосомных РНК. Следует, однако, отметить, что, несмотря на различия в размерах, хромосомы L. nodiflorum схожи с хромосомами других видов секции по рисунку C/DAPI-бэндинга. Последнее указывает на то, что L. nodiflorum имеет все же отдаленное родство с 28-хромосомными видами секции. Результаты молекулярно-цитогенетического анализа позволяют предположить, что в процессе формирования кариотипа L. nodiflorum имело место по крайней мере одно хромосомное слияние. Выявленные геномные отличия L. nodiflorum от других видов секции Syllinum хорошо согласуются с мнением некоторых систематиков о необходимости выделения этого вида в отдельную секцию Tubilinum [Светлова, 2006].

Две отдельные группы составляли виды секций Dasilinum и Linopsis. Кариотип L. hirsutum L. subsp hirsutum секции Dasylinum состоит из 16 хромосом, имеющих самые крупные размеры среди льновых. По рисункам C/DAPI-бэндинга и расположению рибосомных генов хромосомы этого вида схожи с отдельными хромосомами L. narbonense, L. nodiflorum и видов из секции Linopsis.

Кариотипы L. suffruticosum L. subsp. salsoloides (Lam.) Rouy. и L. tenuifolium L. секции Linopsis (syn. Linastrum) представлены 9 парами сходных по рисункам C/DAPI-бэндинга хромосом. Эти виды различаются по наличию транслокации между хромосомами, несущими гены рРНК и у L. tenuifolium на одной из 5 спутничных хромосом в разных плечах расположены сайты ко-локализованных 26S и 5S рДНК и отдельный сайт 5S рДНК. Таким образом, у этих видов представлены практически все морфологические типы хромосом, несущих гены рРНК, которые имеются у видов из других секций.

Параллельно с комплексным хромосомным анализом для этих же видов льна был проведен анализ геномного полиморфизма с помощью

Результаты RAPD-анализа хорошо согласуются с данными кариологического исследования. Обнаружено, что группы видов, имеющие сходную структуру кариотипа, имеют и низкий уровень межгеномной дивергенции и кластеризуются совместно. Так, виды секций Adenolinum и Stellerolinum попали в один кластер, a L nodiflorum кластеризуется отдельно от 28-хромосомных видов секции Syllinum. Отдельный кластер формирует вид секции Dasylinum. 30- и 16- хромосомные виды Linum и L. narbonense также формируют три отдельных кластера. Исключение составили виды секции Linopsis: L. suffruticosum subsp. salsoloides (Lam.) Rouy. и L. tenuifolium L. Для них выявлен высокий уровень межгеномной дивергенции, несмотря на то, что, по нашим данным, их кариотипы различаются по одной реципрокной транслокации. Систематика этих видов до сих пор не вполне ясна. У них была выявлена значительная межпопуляционная изменчивость по морфологическим признакам, и в то же время существует мнение, что L. suffruticosum и L. tenuifolium являются подвидами, а не самостоятельными видами [Nicholls, 1985].

2.6.4. Хромосомные числа видов рода Ыпит.

Предполагается, что лредковая форма рода Ыпит (Protolinum) могла иметь основное число хромосом равное 8 или 9. Эти числа встречаются у диплоидных видов рода, отнесенных к разным филогенетическим ветвям. Виды секций Adenolinum, Stellerolinum и Linopsis имеют п = 9, а виды секции Linum, Dasylinum и Cathartolinum имеют п = 8.

Protolinum п-х

Рис. 29. Гипотетическое эволюционное древо хромосомных чисел рода Ыпит Ь.

Ранее на основании анализа кариотипов при монохромном окрашивании хромосом было построено предполагаемое эволюционное древо рода Linum, в основание которого был помещен диплоидный вид с основным числом хромосом п = х = 9 [Chennaveeraiah and Joshi, 1983]. Если предположить, что исходным было число хромосом п = х = 8, то оказывается, что редукция хромосомных чисел имела место только у полиплоидных видов льна (п = 13, 14, 15), а диплоидные виды с п = 9, 10 могли возникнуть вследствие хромосомных дупликаций. На наш взгляд это наиболее простое объяснение изменчивости основного числа хромосом у льнов (Рис. 29).

Как показало проведенное нами кариологическое исследование, в процессе видообразования льновых происходила полиплоидизация, различные хромосомные перестройки, в частности, хромосомные слияния, а также могла иметь место полисомия и утрата хромосом полиплоидами, что и привело к существующему разнообразию хромосомных чисел у видов рода Linum. Поэтому в настоящий момент не представляется возможным достоверно установить, какое именно основное хромосомное число было исходным у льнов. Возможно, что это число было даже более низким, чем у ныне живущих диплоидных видов. В связи с этим следует упомянуть, что на основании недавно проведенного молекулярно-филогенетического исследования последовательностей внутренних нетранскибируемых спейсеров генов 45 S рРНК и нескольких генов генома хлоропластов, было высказано мнение, что род Linum не является монофилетическим [McDill et al, 2009]. Если это действительно так, то единого для рода Linum исходного хромосомного числа может и вовсе не существовать.

Таким образом, сравнительное молекулярно-кариологическое исследование видов рода Linum L. позволило подтвердить их филогенетические связи. В то же время обнаружено, что систематика рода не вполне совершенна, и хочется надеяться, что полученные нами результаты помогут уточнить таксономию рода Linum L.

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Муравенко, Ольга Викторовна

ВЫВОДЫ

1. Разработан комплекс цитогенетических методов (выявление рисунка ранней репликации хромосом растений, задержка конденсации митотических хромосом с помощью 9-АМА, OR-бэндинг, Q-подобный DAPI-бэндинг и применение новых флуоресцентных лигандов, созданных на базе красителя Hoecht, - DB(8) и DB(17), для получения высококонтрастного флуорохромного бэндинга), и повышающий разрешающую способность анализа хромосомной организации геномов растений с хромосомами малых размеров или малоинформативным рисунком дифференциального окрашивания.

2. Показано, что FISH-картирование универсальных молекулярных зондов (рДНК, теломерный повтор) не только облегчает идентификацию хромосом и выявление хромосомных перестроек в кариотипах растений с хромосомами малых размеров или малоинформативным рисунком Сбэндинга, но и дает возможность более точно устанавливать взаимотношения родственных геномов. Для растений с небольшими геномами и мелкими хромосомами FISH-картирование геномной ДНК или ее фрагментов из геномных библиотек перспективно для получения дополнительных маркеров, позволяющих проводить успешную идентификацию их хромосом.

3. Применение последовательно или одновременно нескольких молекулярно-цитогенетических методов в сочетании с оптимизацией программно-аппаратного комплекса получения и анализа изображений значительно расширяет возможности исследования хромосомной организации геномов растений с хромосомами малых размеров или малоинформативным рисунком дифференциального окрашивания.

4. По рисункам ранней репликации идентифицированы 13 пар гомологов в геноме Ai диплоидного хлопчатника G. herbaceum и 26 пар - в геноме (AD)2 аллотетраплоидного хлопчатника G. barbadense. Хромосомы генома (AD)2 были разделены на субгеномы Аь и Db. Сходство рисунков ранней репликации не только в Аргеноме и Аь-субгеноме, но и в Db-субгеноме свидетельствует о консервативности последовательности репликации ДНК в родственных геномах.

5. С применением 9-АМА впервые проведено морфометрическое исследование хромосом одноклеточных красных водорослей. Показано, что число хромосом может быть использовано для уточнения таксономии класса Cyanidiophyceae (Rhodophyta). Обнаружено, что изученные виды, относящиеся к наиболее примитивным эукариотам, обладают и практически самыми малыми геномами, что демонстрирует зависимость хромосомной организации генома от его размера.

6. Сравнительное исследование хромосом по рис) t кам С- и OR-бэндинга в кариотипах трех сортов ромашки аптечной (М chamomilla L.) показало, что они различались по полиморфизму С-блоков и не различались по рисункам OR-бэндинга. По сходству рисунков С-окраски хромосом обнаружено, что дикорастущий вид М. inodora является автотетраплоидом, субгеномы которого сходны с геномом М, maritima , обозначенного как Мт. Его сравнение с МсЬ-геномом ромашки аптечной выявило сходство морфологии хромосом и рисунков распределения позиций гетерохроматических районов по длине хромосом, что говорит об общности их происхождения.

7. По рисункам OR-бэндинга, C/DAPI-бэндинга, распределению на хромосомах рибосомных генов и теломерного повтора, а также их активности, проведено сравнительное исследование кариотипов 8 сортов и 4 линий гороха посевного. RAPD-анализ обнаружил деление их на кластеры в четком соответствии с сортовой принадлежностью. Продемонстрировано, что даже небольшие специфические особенности геномов сортов и линий гороха могут служить основой для их идентификации. С помощью высокоразрешающего DAPI-бэндинга проведено точное картирование разрывов в хромосомах транслокационных линий гороха М-10 и L-108.

8. Сравнительное исследование геномов двухромосомных видов злаков Zingeria и Colpodium по молекулярно-цитогенетическим маркерам хромосом и последовательностям внутренних транскрибируемых спейсеров генов 45S рРНК (ITS1 и ITS2) позволило установить, что эти два близких рода имеют монофилетическое происхождение.

9. По рисункам C/DAPI-бэндинга и расположению генов рРНК идентифицированы все хромосомы; составлены кариотипы и построены идиограммы хромосом для видов рода Linum L. У видов секции Syllinum впервые охарактеризованы B-хромосомы, что позволило уточнить число А-хромосом (2п=28) в их кариотипах.

10. 26 видов льнов из секций Linum Adenolinum, Stellerolinum, Dasylinum, Syllinum и Linopsis рода Linum разделились по результатам анализа кариотипов на 8 групп. Внутри этих групп виды различались по хромосомным перестройкам и плоидности. Результаты RAPD-анализа хорошо согласовались с данными кариологического исследования. Обнаружено, что группы видов льнов, обладающие сходной структурой кариотипа, имеют и низкий уровень межгеномной дивергенции и кластеризуются совместно.

11. Подтверждена таксономическая обособленность секций Adenolinum, Dasylinum, Linopsis и Tubilinum. Не обнаружено различий у видов секций Stellerolinum и Adenolinum. Виды секции Linum разделились на три геномных группы, что позволяет использовать кариотип как дополнительный таксономический признак при уточнении сложного систематического статуса этой секции.

12. Молекулярно-кариологическое исследование видов рода Linum L. позволило подтвердить их филогенетические связи. Обнаружено, что секции Linum, Adenolinum и Stellerolinum имеют общего предка. Изучение геномов различных видов льновых продолжается, однако уже сейчас можно утверждать, что полученные нами сведения об их кариотипах заложили цитогенетические основы для начала тотального секвенирования генома L. usitatissimum L.