Характеристика ядрышкового антигена клеток человека, выявляемого новым моноклональным антителом тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.00.29, кандидат биологических наук Григорьев, Андрей Александрович

• Григорьев, Андрей Александрович
• кандидат биологических наук
• 2008

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Григорьев, Андрей Александрович

Список используемых сокращений:.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Структура и функции ядрышка.

1.2. Реакции клетки и ядрышка на стрессовые воздействия.

ГЛАВА II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Клетки.

2.2. Антитела.

2.3. Воздействие ингибиторов.

2.4. Методы исследования.

2.4.1. Реакция непрямой иммунофлуоресценции.

2.4.2. Выявление фрагментации ДНК методом TUNEL.

2.4.3. Мечение клеток BrdU.

2.4.4. Выявление аргентофильных белков.

2.4.5. Выявление микрофиламентов.

2.4.6. Обработка РНКазой А и пепсином.

2.4.7. Иммуноблотинг.

ГЛАВА III. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ.

3.1. Основная характеристика антигена, выявляемого новым моноклональным антителом A3.

3.1.1. Оптимизация условий выявления A3 антигена.

3.1.2. Определение видовой специфичности МКА A3.

3.1.3. Локализация антигена A3 в интерфазных и митотических клетках.

3.1.4. Особенности распределения антигена A3 в ядрышках клеток различных культур.

3.2. Реакция A3 антигена на действие ингибиторов белкового синтеза.

3.2.1. Влияние ингибитора белкового синтеза - анизомицина на локализацию A антигена в клетках различного тканевого происхождения.

3.2.2. Влияние различных ингибиторов белкового синтеза на локализацию A антигена в клетках HeLa.

3.2.3. Реакция клеток на ингибирование белкового синтеза в зависимости от стадии клеточного цикла.

3.2.4. Выявление Ag-белков после действия анизомицина.

3.2.5. Выявление фрагментации хроматина методом TUNEL.

3.2.6. Структура актинового цитоскелета в клетках HeLa, обработанных анизомицином.

3.2.7. Колокализация A3 с другими ядрышковыми белками после инкубации с анизомицином.

3.3. Выявление аномальной локализации A3 антигена при длительном культивировании клеток HeLa.

ГЛАВА IV. ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ

ВЫВОДЫ:.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Характеристика ядрышкового антигена клеток человека, выявляемого новым моноклональным антителом»

АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ

Ядрышко эукариотической клетки является динамической структурой, в которой происходят транскрипция рибосомных генов (рДНК), процессинг рРНК и сборка прерибосомных субъединиц. Показано также, что эта органелла принимает участие как в процессах пролиферации, так и в процессах клеточного старения и апоптоза. Известно, что структурное состояние ядрышка зависит от уровня метаболизма и способности клеток к пролиферации. Поэтому морфология ядрышек, а также его отдельных компонентов в митозе (ядрышковых организаторов) часто принимаются во внимание в медицинской практике для уточнения прогноза течения заболевания и выбора адекватного курса лечения. Хорошо известно, что состояние ядрышка изменяется в ответ на стрессовые воздействия или после обработки токсическими веществами, подавляющими, например, синтез рРНК или влияющих на уровень фосфорилирования ключевых ядрышковых белков. Однако в современной литературе содержатся лишь отдельные сведения о реакции ядрышка на действие ингибиторов белкового синтеза, включая те из них, которые вызывают гибель клеток путем апоптоза.

Согласно последним данным масс-спектрометрического анализа ядрышка, в его составе присутствует около 700 белков, которые в зависимости от аминокислотного состава или функциональной значимости могут быть объединены в несколько основных групп. Одна из таких групп включает белки, которые принимают участие в регуляции транскрипции рибосомных генов и входят в состав комплекса транскрипционного аппарата РНК полимеразы I -комплекса, осуществляющего транскрипцию рДНК. Общим свойством белков этой группы является их прочная связь с рибосомными генами, которая сохраняется не только в активных ядрышках в интерфазе, но и во время митоза, когда транскрипция рДНК прекращается. Известно, что некоторые из этих белков изменяют локализацию в ответ на действие химических агентов или физических факторов. Определение чувствительности белков ядрышка к действию стрессовых агентов, таких как ингибиторы транскрипции рибосомных генов и синтеза белка, лежит в основе изучения механизмов их действия на нормальные и опухолевые клетки человека.

Одним из подходов к изучению ядрышка и его белковых компонентов является иммуноцитохимическое выявление белков ядрышка, в основе которого лежит использование моноклональных антител (МКА). В лабораторных условиях антитела обычно получают путем иммунизации животных антигенами разного происхождения или клеточными структурами с дальнейшим применением методов гибридомной биотехнологии. Этим путем были получены МКА к ядерным белкам В23/нуклеофозмину, Ki-67, PCNA (proliferating cell nuclear antigen) и др.

Способность антител специфически узнавать антигены применяется при изучении свойств и функций белков. Однако панель антител к ядрышковым белкам, обладающих высокой иммунореактивностью, видовой специфичностью и пригодных для проведения медико-биологических исследований, в настоящее время является достаточно ограниченной. В связи с этим, целенаправленное получение новых МКА к ядерным антигенам человека и их идентификация представляет несомненный как научный, так и практический интерес.

Целью работы явилось изучение иммуноцитохимических особенностей ядрышкового антигена, выявляемого новым моноклональным антителом A3, в клетках человека с различным уровнем пролиферации, а также реакции A3 антигена на обработку клеток ингибиторами белкового синтеза.

Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:

1.0тработать оптимальные условия иммуноцитохимического окрашивания ядрышкового антигена новым моноклональным антителом, названным «МКА A3».

2.0пределить видовую и тканевую специфичность МКА A3, а также описать локализацию A3 антигена в разных типах клеток человека и на основных стадиях клеточного цикла.

3.Изучить локализацию антигена A3 при активации лимфоцитов периферической крови здоровых доноров к пролиферации с помощью стимуляции фитогемагглютинином (ФГА).

4.Изучить влияние ингибиторов синтеза белка (анизомицина, пуромицина и циклогексимида) на локализацию A3 антигена.

5.Исследовать колокализацию A3 антигена с известными белками ядрышка клеток человека до и после действия на клетки ингибиторов белкового синтеза. б.Определить взаимосвязь между изменениями в локализации A3 антигена и гибелью клеток, вызываемую подавлением синтеза белка.

НОВИЗНА

С помощью нового моноклонального антитела, секретируемого мышиной гибридомой A3, выявлен антиген, располагающийся в ядрышках клеток человека, обладающий четкой видовой специфичностью, названный "A3 антиген", и имеющий основные свойства, характерные для компонентов комплекса РНК полимеразы I.

Дана характеристика и выявлены особенности A3 антигена. Показано, что в пролиферирующих клетках человека в отличие от покоящихся A3 антиген выявляется в виде многочисленных дискретных фокусов, расположенных исключительно в зоне ядрышка. Количество фокусов A3 антигена уменьшается при ингибировании транскрипции рДНК. Отличительной особенностью A3 антигена является его высокая лабильность, которая проявляется в его миграции из ядрышка в нуклеоплазму под действием ингибиторов белкового синтеза. Обнаружено, что изменения в локализации A3 антигена предшествуют массовой гибели клеток путем апоптоза, что позволяет рассматривать этот феномен-как-маркер-ранних-стадий-апоптотической-гибели-клетокчеловекав------культуре.

Обнаружено, что при длительном культивировании (в течение 4-6 месяцев) человеческих клеток HeLa наблюдается спонтанная «миграция» A3 антигена из ядрышка в нуклеоплазму, что сопровождается повышением чувствительности культуры к внешним воздействиям.

НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ

Выявлен ядрышковый антиген белковой природы, названный A3 антиген, обладающий не только видовой специфичностью, но и способностью изменять локализацию под действием ингибиторов белкового синтеза, что дополняет фундаментальные представления о свойствах белков ядрышка.

Разработан метод объективной визуальной оценки общего состояния культур клеток человека, определяемого по локализации A3 антигена. Показано, что появление клеток с атипичной - внеядрышковой - локализацией A3 антигена указывает на "старение" клеток и их повышенную чувствительность к внешним воздействиям.

Видовая специфичность МКА A3 может оказаться полезной для выявления возможной контаминации культур клеток человека клетками другой видовой принадлежности.

Высокая реактивность в иммуноцитохимических реакциях позволяет использовать МКА A3 в качестве положительного контроля в клинико-лабораторных исследованиях при тестировании различных антител.

Изменения в локализации A3 антигена, наблюдаемые при ингибировании синтеза белка, позволяют использовать этот феномен при изучении механизмов действия новых антибиотиков и цитостатических препаратов, а также оценке их способности ингибировать синтез белка в опухолевых клетках человека in vitro.

ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ:

1. Антиген, выявляемый МКА A3, является ядрышковым белком, относящимся к комплексу РНК полимеразы I.

2. Обработка клеток ингибиторами белкового синтеза (анизомицином, пуромицином или циклогексимидом) приводит к миграции A3 антигена из ядрышка в нуклеоплазму, где он локализуется в виде дискретных фокусов.

3. Изменения в локализации A3 антигена относятся к ранним маркерам апоптотической гибели клеток человека в культуре.

4. Длительное культивирование клеток HeLa приводит к спонтанной релокализации A3 антигена из ядрышка в нуклеоплазму.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ Основные положения диссертации были представлены в виде постерных докладов на конференции Annual BIOCITY Symposium CELL STRESS, (Turcu, Финляндия) в августе 2006 , а также на VI съезде аллергологов и иммунологов СНГ (Москва) в сентябре 2006 г. Диссертационная работа апробирована 24 декабря 2007 на заседании проблемной комиссии «Гемопоэз, молекулярная биология, биотехнология, иммуногематология; гемобластозы и депрессии кроветворения» ГУ ГНЦ РАМН.

Работа выполнена в лаборатории клинической иммунологии Гематологического научного центра РАМН (зав. лаб. - проф., д.м.н. Т.И. Булычева) и в лаборатории структурной биохимии Института биоорганической химии им. академиков М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН (зав.лаб.-проф., д.б.н. О.В.Зацепина)

Заключение диссертации по теме «Гематология и переливание крови», Григорьев, Андрей Александрович

ВЫВОДЫ:

1. Антиген, выявляемый новым моноклональным антителом A3, и названный, соответственно, A3 антиген, является видоспецифичным и локализуется в ядрышках клеток человека вне зависимости от их тканевого или линейного происхождения; A3 антиген чувствителен к обработке пепсином и нечувствителен к обработке РНКазой А, что свидетельствует о его белковой природе.

2. Использованный для определения природы A3 антигена метод колокализации с уже известными ядрышковыми белками позволяет высказать предположение о принадлежности A3 антигена к компонентам транскрипционного комплекса РНК полимеразы I и его сходстве со специфическим кофактором — белком UBF.

3. Особенностью A3 антигена является его миграция из ядрышка в нуклеоплазму в ответ на действие ингибиторов белкового синтеза, а также спонтанная релокализация в нуклеоплазму при длительном культивировании клеток HeLa, свидетельствующая о снижении их жизнестойкости и повышении чувствительности к внешним воздействиям.

4. Изменения в локализации АЗ-антигена предшествуют гибели клеток путем апоптоза, что позволяет считать его ранним маркером апоптотической гибели клеток.

5. Изучение локализации A3 антигена с помощью иммуноцитохимических методов может использоваться для оценки состояния клеточных культур, изучения эффективности действия потенциальных ингибиторов белкового синтеза и при подборе химиотерапевтических препаратов in vitro.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Григорьев, Андрей Александрович, 2008 год

1. Булычева Т.И., Дергунова Н.Н., Артеменко Е.Г. и др. Анализ пролиферативной активности клеток с помощью новых моноклональных антител к ядрышковому белку В23/нуклеофозмину. Цитология. 2000. 42 (10): 944-954.

2. Гурченков В.В., Ползиков М.А., Магоулас К. и др. Свойства и функции нового белка ядрышка Surf-б в клетках мыши ЗТЗ. Биоорганическая Химия. 2005; 31 (6) : 578-585.

3. Домнина JI.B., Иванова О.Ю., Черняк Б.В и др. Влияние ингибиторов цитоскелетных структур на развитие апоптоза, индуцированного фактором некроза опухолей. Биохимия, 2002; 67 (7): 890-900.

4. Жарская О.О., Зацепина О.В. Динамика и механизмы реорганизации ядрышка в митозе. Цитология. 2007; 49 (5) : 355-369.

5. Мухарьямова К.Ш., Дудник О.А., Сперанский А.И. и др. Сравнительная локализация основных белков ядрышка фибрилларина и В23 в делящихся клетках млекопитающих. Биологические Мембраны. 1998; 15 (6) : 657669.

6. Плетюшкина О.Ю., Фетисова. Е.К., Лямзаев.К.Г. и др. Пероксид водорода, образуемый внутри митохондрий, участвует в передаче апоптозного сигнала от клетки к клетке. Биохимия. 2006; 71 (1): 75-84.

7. Смирнова. О.Ю, Мишина.В.А, Зацепина. О.В Цитоплазматические эффекты воздействия ингибитора синтеза белка эметина на клетки и ядрышки культуры HeLa. Цитология. 2003 45(12): 1179-1187

8. Abayasiriwardana KS, Barbone D, Kim KU, et al. Malignant mesothelioma cells are rapidly sensitized to TRAIL-induced apoptosis by low-dose anisomycin viaBim. Mol Cancer Ther. 6(10):2766-2776.

9. Amamoto R.T., Nogi Y., Dodd J.A. et al. RRN3 gene of Saccharomyces cerevisiae encodes an essential RNA polymerase I transcription factor which interacts with the polymerase independently of DNA template. EMBO J. 1996; 15:3964-3973

10. Anand, N., Murthy, S., Amann, G., et al. Protein elongation factor EEF1A2 is a putative oncogene in ovarian cancer. Nat. Genet. 2002; 31: 301-305.

11. Andersen J.S., Lam Y.W., Leung A.K. et al. Nucleolar proteome dynamics. Nature. 2005; 433 (7021) : 77-83.

12. Andersen JS, Lyon CE, Fox AH et al. Directed proteomic analysis of the human nucleolus. Curr Biol. 2002 Jan 8; 12(1): 1-11.

13. Aprikian P., Moorefield В., and Reeder R.H. New model for the yeast RNA polymerase I transcription cycle. Mol. Cell. Biol. 2001; 21: 4847^1855.

14. Biggiogera M, Fakan S, Kaufmann SH et al. Simultaneous immunoelectron microscopic visualization of protein B23 and C23 distribution in the HeLa cell nucleolus. J Histochem Cytochem. 1989 , 37(9):1371-1374.

15. Bohmann K, Ferreira JA, Lamond Al. Mutational analysis of p80 coilin indicates a functional interaction between coiled bodies and the nucleolus. J Cell Biol. 1995 ;131(4):817-831.

16. Borer RA, Lehner CF, Eppenberger HM et al. Major nucleolar proteins shuttle between nucleus and cytoplasm. Cell. 1989, 56(3):379-390.

17. Budde A, Grummt I. p53 represses ribosomal gene transcription. Oncogene. 1999;18(4):1119-1124.

18. Caizergues-Ferrer M, Mariottini P, Curie С et al. Nucleolin from Xenopus laevis: cDNA cloning and expression during development. Genes Dev. 1989, 3(3):324-333.

19. Cavanaugh A.H., Hirschler-Laszkiewicz I., Hu Q. et al. Rrn3 phosphorylation is a regulatory checkpoint for ribosome biogenesis. J. Biol. Chem. 2002; 277: 27423-27432.

20. Cavanaugh AH, Hempel WM, Taylor LJ et al. Activity of RNA polymerase I transcription factor UBF blocked by Rb gene product. Nature. 1995;374(6518):177-180.

21. Chan PK, Aldrich M, Busch H. Alterations in immunolocalization of the phosphoprotein B23 in HeLa cells during serum starvation. Exp Cell Res. 1985 , 161(1):101-110.

22. Chen YR, Wang X, Templeton D et al. The role of c-Jun N-terminal kinase (JNK) in apoptosis induced by ultraviolet С and gamma radiation. Duration of JNK activation may determine cell death and proliferation. J Biol Chem. 1996 ;271(50):31929-31936.

23. Clos J, Normann A, Ohrlein A et al. The core promoter of mouse rDNA consists of two functionally distinct domains. Nucleic Acids Res. 1986, 14(19):7581-7595.

24. Colombo E, Marine JC, Danovi D et al. Nucleophosmin regulates the stability and transcriptional activity of p53. Nat Cell Biol. 2002; 4(7):529-533.

25. Comai L, Tanese N, Tjian R. The TATA-binding protein and associated factors are integral components of the RNA polymerase I transcription factor, SL1. Cell. 1992 ,68(5):965-976.

26. Conconi A, Widmer RM, Koller T et al. Two different chromatin structures coexist in ribosomal RNA genes throughout the cell cycle. Cell. 1989 ;57(5):753-761.

27. Coso OA, Chiariello M, Yu JC, Teramoto H et al. The small GTP-binding proteins Racl and Cdc42 regulate the activity of the JNK/SAPK signaling pathway. Cell. 1995; 81(7):1137 1146.

28. Cutler SR, Ehrhardt DW, Griffitts JS et al. Random GFP::cDNA fusions enable visualization of subcellular structures in cells of Arabidopsis at a high frequency. Proc Natl Acad Sci USA. 2000 , 97(7):3718-3723.

29. David-Pfeuty Т., Nouvian-Dooghe Y., Sirri V. et al. Common and reversible regulation of wild-type p53 function and of ribosomal biogenesis by protein kinases inhuman cells. Oncogene ;2001. 20 (42) : 5951-5963.

30. БёгуаМ В, Hibi M, Wu IH et al. JNK1: a protein kinase stimulated by UV light and Ha-Ras that binds and phosphorylates the c-Jun activation domain. Cell. 1994;76(6): 1025-1037.

31. Derijard B, Raingeaud J, Barrett T et al. Independent human MAP-kinase signal transduction pathways defined by MEK and MKK isoforms. Science. 1995;267(5198):682-685.

32. Devary Y, Gottlieb RA, Smeal T et al. The mammalian ultraviolet response is triggered by activation of Src tyrosine kinases. Cell. 1992;71(7):1081-1091.

33. Dousset T, Wang C, Verheggen C. et al. Initiation of nucleolar assembly is independent of RNA polymerase I transcription. Mol Biol Cell. 2000 Aug;l 1(8):2705-2717.

34. Dumbar TS, Gentry GA, Olson MO. Interaction of nucleolar phosphoprotein B23 with nucleic acids. Biochemistry. 1989 , 28(24):9495-9501.

35. Dundr M, Misteli Т. Functional architecture in the cell nucleus. Biochem J. 2001, 356(Pt 2):297-310.

36. Eberhard D, Tora L, Egly JM et al. A TBP-containing multiprotein complex (TIF-IB) mediates transcription specificity of murine RNA polymerase I. Nucleic Acids Res. 1993 , 21(18):4180-4186.

37. Erard MS, Belenguer P, Caizergues-Ferrer M et al A major nucleolar protein, nucleolin, induces chromatin decondensation by binding to histone HI. Eur J Biochem. 1988 , 175(3):525-530.

38. Escande-Geraud ML, Azum MC, Tichadou JL et al. Correlation between rDNA transcription and distribution of a 100 kD nucleolar protein in CHO cells. Exp Cell Res. 1985 ,161(2):353-363.

39. Fath S., Milkereit P., Peyroche G. et al. Differential roles of phosphorylation in the formation of transcriptional active RNA polymerase I. Proc. Natl. Acad. Sci. 2001; 98: 14334-14339.

40. Feuerstein N, Mond JJ, Kinchington PR et al. Evidence for DNA binding activity of numatrin (B23), a cell cycle-regulated nuclear matrix protein. Biochim Biophys Acta. 1990,1087 (2):127-136.

41. Ford E, Voit R, Liszt G et al. Mammalian Sir2 homolog SIRT7 is an activator of RNA polymerase I transcription. Genes Dev. 2006; 20(9):1075-1780.

42. French SL, Osheim YN, Cioci F et al. In exponentially growing Saccharomyces cerevisiae cells, rRNA synthesis is determined by the summed RNA polymerase I loading rate rather than by the number of active genes. Mol Cell Biol. 2003 ;23(5):1558-1568.

43. Gerbi SA. The evolution of eukaryotic ribosomal DNA. Biosystems. 1986;19(4):247-258.

44. Gerdes J., Schwab U., Lemke H. et al. Production of a mouse monoclonal antibody reactive with a human nuclear antigen associated with cell proliferation. Int. J. Cancer. 1983; 31 (1) : 13-20.

45. Goessens G. Nucleolar structure. Int Rev Cytol. 1984, 87:107-158.

46. Gokal PK, Cavanaugh AH, Thompson EA Jr. The effects of cycloheximide upon transcription of rRNA, 5 S RNA, and tRNA genes. J Biol Chem. 1986;261 (6):253 6-2541.

47. Goodpasture C, Bloom SE. Visualization of nucleolar organizer regions im mammalian chromosomes using silver staining. Chromosoma. 1975 ;53(1):37-50.

48. Griffiths, G.D., Leek, M.D. and Gee, D.J. The toxic plant proteins ricin and abrin induce apoptotic changes in mammalian lymphoid tissues and intestine. J. Pathol. 1987; 151:221-229.

49. Grummt I. Prog Nucleic Acid Res Mol Biol. 1999;62:109-154. Regulation of mammalian ribosomal gene transcription by RNA polymerase I. Prog Nucleic Acid Res Mol Biol. 1999;62:109-154.

50. Haas S, Kaina B. c-Fos is involved in the cellular defence against the genotoxic effect of UV radiation. Carcinogenesis. 1995;16(5):985-991.

51. Hanada K, Song CZ, Yamamoto К et al. RNA polymerase I associated factor 53 binds to the nucleolar transcription factor UBF and functions in specific rDNA transcription. EMBO J. 1996 ,15(9):2217-2226.

52. Heix J, Grummt I. Species specificity of transcription by RNA polymerase I. Curr Opin Genet Dev. 1995, 5(5):652-656

53. Heix J, Vente A, Voit R. et al. Mitotic silencing of human rRNA synthesis: inactivation of the promoter selectivity factor SL1 by cdc2/cyclin B-mediated phosphorylation. EMBO J. 1998 ,17(24):7373-7381.

54. Hernandez-Verdun D, Hubert J, Bourgeois CA et al. Ultrastructurallocalization of Ag-NOR stained proteins in the nucleolus during the cell cycleand in other nucleolar structures. Chromosoma. 1980;79(3):349-362.

55. Hernandez-Verdun D, Roussel P, Gebrane-Younes J. Emerging concepts of nucleolar assembly. J Cell Sci. 2002, 115 (Pt 11):2265-70.

56. Hernandez-Verdun D. Structural organization of the nucleolus in mammalian cells. Methods Achiev Exp Pathol. 1986;12:26-62.

57. Hernandez-Verdun D. The nucleolus: a model for the organization of nuclear functions. Histochem Cell Biol. 2006, 126(2): 135-148.

58. Herrera JE, Savkur R, Olson MO. The ribonuclease activity of nucleolar protein B23. :Nucleic Acids Res. 1995 ; 23(19):3974-3979.

59. Hershey, J.W.B. and Miyamoto S. Translational control of cancer. In Translational control of gene expression (eds. N. Sonenberg et al.), pp. 637654. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. 2000

60. Hirschler-Laszkiewicz I., Cavanaugh A., Hu Q. et al,. The role of acetylation in rDNA transcription. Nucleic Acids Res. 2001; 29(20): 4114-4124.

61. Holcik, M.N., Sonenberg, N., and Korneluk, R.G. Internal ribosome initiation of translation and the control of cell death. Trends Genet 2000; 16: 469^73.

62. Horky M, Kotala V, Anton M et al. Nucleolus and apoptosis. Ann N Y Acad Sci. 2002;973:258-264.

63. Hubbell HR. Silver staining as an indicator of active ribosomal genes. Stain Technol. 1985 ;60(5):285-294.

64. Iborra FJ, Jackson DA, Cook PR. The case for nuclear translation. J Cell Sci. 2004 , 117(Pt 24) :5713-5720.

65. Isaac C, Yang Y, Meier UT. Noppl40 functions as a molecular link between the nucleolus and the coiled bodies. J Cell Biol. 1998 , 142(2):319-329

66. Jacob ST. Regulation of ribosomal gene transcription. Biochem J. 1995;306 ( Pt3):617-626.

67. Jantzen HM, Admon A, Bell SP et al. Nucleolar transcription factor hUBF contains a DNA-binding motif with homology to HMG proteins. Nature. 1990, 344 (6269):830-836.

68. Jimenez-Garcia LF, Segura-Valdez ML, Ochs RL et al. Nucleologenesis: U3 snRNA-containing prenucleolar bodies move to sites of active pre-rRNA transcription after mitosis. Mol Biol Cell. 1994 ;5(9):955-966.

69. Kageyama A, Kusano I, Tamura T et al. Comparison of the apoptosis-inducing abilities of various protein synthesis inhibitors in U937 cells. Biosci Biotechnol Biochem. 2002 ; 66(4):835-859.

70. Kantarjian HM, Talpaz M, Santini V et al. Homoharringtonine: history, current research, and future direction. Cancer. 2001 ; 92(6):1591-1605.

71. Keppler-Hafkemeyer A, Brinkmann U, Pastan I. Role of caspases in immunotoxin-induced apoptosis of cancer cells. Biochemistry. 1998 ;37(48): 16934-16942.

72. Kermekchiev M, Workman JL, Pikaard CS. Nucleosome binding by the polymerase I transactivator upstream binding factor displaces linker histone HI. Mol Cell Biol. 1997 , 17(10):5833-5842.

73. Klein J. and Grummt I. Cell cycle-dependent regulation of БУМА polymerase I transcription: The nucleolar transcription factor UBF is inactive in mitosis and early Gl. Proc. Natl. Acad. Sci. 1999, 96: 6095-6101.

74. Koberna K, MaHnsky J, Pliss A et al. Ribosomal genes in focus: new transcripts label the dense fibrillar components and form clusters indicative of "Christmas trees" in situ. J Cell Biol. 2002 ,157(5):743-748

75. Koroleva OA, Tomlinson ML, Leader D et al. High-throughput protein localization in Arabidopsis using Agrobacterium-mediated transient expression of GFP-ORF fusions. Plant J. 2005 , 41(1):162-174.

76. Kruhlak MJ, Lever MA, Fischle W. et al. Reduced mobility of the alternate splicing factor (ASF) through the nucleoplasm and steady state speckle compartments. J Cell Biol. 2000 ,150(1):41-51.

77. Laemmli UK. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 1970 ;227(5259):680-685.

78. Lafarga M, Berciano MT, Andres MA. Protein-synthesis inhibition induces perichromatin granule accumulation and intranuclear rodlet formation in osmotically stimulated supraoptic neurons. Anat Embryol (Berl). 1993 ;187(4):363-369.

79. Lamond Al, Earnshaw WC. Structure and function in the nucleus. Science. 1998, 280(5363): 547-553.

80. Lapeyre B, Mariottini P, Mathieu С et al. Molecular cloning of Xenopus fibrillarin, a conserved U3 small nuclear ribonucleoprotein recognized by antisera from humans with autoimmune disease. Mol Cell Biol. 1990; 10(l):430-434.

81. Learned RM, Cordes S, Tjian R. Purification and characterization of a transcription factor that confers promoter specificity to human RNA polymerase I. Mol Cell Biol. 1985, 5(6):1358-1369

82. Lee KH, Nishimura S, Matsunaga S et al. Inhibition of protein synthesis and activation of stress-activated protein kinases by onnamide A and theopederin B, antitumor marine natural products. Cancer Sci. 2005;96(6):357-364.

83. Leung AK, Gerlich D, Miller G et al. Quantitative kinetic analysis of nucleolar breakdown and reassembly during mitosis in live human cells. J Cell Biol. 2004, 166(6):787-800.

84. Lewis JD, Tollervey D. Like attracts like: getting RNA processing together in the nucleus. Science. 2000 , 288(5470):1385-1389

85. Lin A, Minden A, Martinetto H et al. Identification of a dual specificity kinase that activates the Jun kinases and p38-Mpk2. Science. 1995;268(5208):286-290.

86. Lischwe MA, Ochs RL, Reddy R et al. Purification and partial characterization of a nucleolar scleroderma antigen (Mr = 34,000; pi, 8.5) rich in NG,NG-dimethylarginine. J Biol Chem. 1985 ; 260(26):14304-14310.

87. Marilley M, Pasero P. Common DNA structural features exhibited by eukaryotic ribosomal gene promoters. Nucleic Acids Res. 1996, 24(12):2204-2211.

88. Marilley M, Radebaugh CA, Geiss GK et al. DNA structural variation affects complex formation and promoter melting in ribosomal RNA transcription. Mol Genet Genomics. 2002, 267(6):781-791.

89. Mayer C, Bierhoff H, Grummt I. et al. The nucleolus as a stress sensor: JNK2 inactivates the transcription factor TIF-IA and down-regulates rRNA synthesis. Genes Dev. 2005;19(8):933-941.

90. Mayer C, Zhao J, Yuan X et al. mTOR-dependent activation of the transcription factor TIF-IA links rRNA synthesis to nutrient availability. Genes Dev. 2004 ;18(4):423-434.

91. Mazzola JL, Sirover MA. Alteration of intracellular structure and function of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase: a common phenotype of neurodegenerative disorders? Neurotoxicology. 2002 , 23(4-5):603-609.

92. Meier UT, Blobel G. NAP57, a mammalian nucleolar protein with a putative homolog in yeast and bacteria. J Cell Biol. 1994; 127(6 Pt 1):1505- 1514.

93. Meier UT, Blobel G. Noppl40 shuttles on tracks between nucleolus and cytoplasm. Cell. 1992 ;70(1):127-138.

94. Milkereit P. and Tschochner H. A specialized form of RNA polymerase I, essential for initiation and growth-dependent regulation of rRNA synthesis, is disrupted during transcription. EMBO J. 1998; 17: 3692-3703.

95. Miller G., Panov K.I., Friedrich J.K. et al. hRRN3 is essential in the SL1-mediated recruitment of RNA polymerase I to RNA gene promoters. EMBO J. 2001; 20: 1373-1382.

96. Miller OJ, Miller DA, Dev VG et al. Expression of human and suppression of mouse nucleolus organizer activity in mouse-human somatic cell hybrids. Proc

97. Natl Acad Sci USA.1976 ;73(12):4531-4535.

98. Misteli T, Spector DL. The cellular organization of gene expression. Curr Opin Cell Biol. 1998, 10(3):323-331

99. Misteli Т. Protein dynamics: implications for nuclear architecture and gene expression. Science. 2001 ; 291(5505):843-847.

100. Morcillo G, De la Torre C, Gimenez-Martfn G. Nucleolar transcription during plant mitosis. In situ assay for RNA polymerase activity. Exp Cell Res. 1976 ;102(2):311-316.

101. Muth V., Nadaud S., Grummt I. et al. Acetylation of TAFI68, a subunit of TIF-IB/SL1, activates RNA polymerase I transcription. EMBO J. 2001 20: 1353-1362

102. Narayanan S, Surendranath K, Bora N, Surolia A, Karande AA Ribosome inactivating proteins and apoptosis. FEBS Lett. 2005;579(6): 1324-1331.

103. Noaillac-Depeyre J, Dupont MA, Tichadou JL et al. The effect of adenosine analogue (DRB) on a major nucleolar phosphoprotein nucleolin. Biol Cell. 1989; 67(l):27-35.

104. Ochs R.L., Lischwe M.A., Spohn W.H. et al. Fibrillarin: a new protein of the nucleolus identified by autoimmune sera. Biol Cell. 1985; 54 (2) : 123-133.

105. Olson MO. Sensing cellular stress: another new function for the nucleolus? Sci STKE. 2004;2004 (224): pelO.

106. O'Mahony DJ, Smith SD, Xie W et al. Analysis of the phosphorylation, DNA-binding and dimerization properties of the RNA polymerase I transcription factors UBF1 and UBF2. Nucleic Acids Res. 1992 ;20(6): 1301-1308.

107. Ottenheijm HC, van den Broek LA. The development of sparsomycin as an anti-tumour drug. Anticancer Drug Des. 1988 ; 2(4):333-337.

108. Pendle AF, Clark GP, Boon R. et al. Proteomic analysis of the Arabidopsis nucleolus suggests novel nucleolar functions. Mol Biol Cell. 2005,16(1): 260269

109. Pestov DG, Strezoska Z, Lau LF. Evidence of p53-dependent cross-talk between ribosome biogenesis and the cell cycle: effects of nucleolar protein Bopl on G(l)/S transition. Mol Cell Biol. 2001 ;21(13):4246-4255.

110. Peyroche G., Milkereit P., Bischler N. et al. The recruitment of RNA polymerase I on rDNA is mediated by the interaction of the A43 subunit with

111. Rrn3. EMBO J. 2000; 19: 573-5482.

112. Phair RD, Misteli T. High mobility of proteins in the mammalian cell nucleus.

113. Nature. 2000,404(6778):604-609

114. Platani M, Goldberg I, Swedlow JR et al. In vivo analysis of Cajal body movement, separation, and joining in live human cells. J Cell Biol. 2000 , 151(7):1561-74.

115. Raska I, Andrade LE, Ochs RL et al. Immunological and ultrastructural studies of the nuclear coiled body with autoimmune antibodies. Exp Cell Res. 1991 ;195(l):27-37.

116. Raska I. Oldies but goldies: searching for Christmas trees within the nucleolar architecture. Trends Cell Biol. 2003 , 13(10):517-525.

117. Reeder RH. Regulation of RNA polymerase I transcription in yeast and vertebrates. Prog Nucleic Acid Res Mol Biol. 1999;62:293-327.

118. Reichow SL, Hamma T, Ferre-D'Amare AR, Varani G. 2007. Nucleic Acids1. Res. 35(5):1452-1464.

119. Reimer G, Pollard KM, Penning CA et al. Monoclonal autoantibody from a (New Zealand black x New Zealand white) F1 mouse and some human scleroderma sera target an Mr 34,000 nucleolar protein of the U3 RNP particle.

120. Arthritis Rheum. 1987 ;30(7):793-800.

121. Rinehart KL. Antitumor compounds from tunicates. Med Res Rev. 200020(l):l-27.

122. Roussel P, A"Hre C, Comai L et al. The rDNA transcription machinery is assembled during mitosis in active NORs and absent in inactive NORs. J Cell Biol. 1996 ;133(2):235-246.

123. Roussel P, Hernandez-Verdun D. Identification of Ag-NOR proteins, markers of proliferation related to ribosomal gene activity. Exp Cell Res. 1994 ; 214(2):465-472.

124. Roussel P, Sirri V, Hernandez-Verdun D. Quantification of Ag-NOR proteins using Ag-NOR staining on western blots. J Histochem Cytochem. 1994;42(11):1513-1517.

125. Roussel P., Andre C., Masson C., Geraud G., Hernandez-Verdun D. Localization of the RNA polymerase I transcription factor hUBF during the cell cycle. J. Cell. Sci. 1993 104 (2) : 327-337.

126. Rubbi CP, Milner J. Disruption of the nucleolus mediates stabilization of p53 in response to DNA damage and other stresses. EMBO J. 2003; 22(22):6068-6077.

127. Rubbi CP, Milner J. p53~guardian of a genome's guardian? Cell Cycle. 2003; 2(1):20-21.

128. Ruggero, D. and Pandolfi, P.P. Does the ribosome translate cancer? Nat. Rev. 2003; 3: 179-192.

129. Riiller S, Stahl C, Kohler G et al. Sensitization of tumor cells to ribotoxic stress-induced apoptotic cell death: a new therapeutic strategy. Clin Cancer Res. 1999;5(10):2714-2725.

130. Russell J, Zomerdijk JC. RNA-polymerase-I-directed rDNA transcription, life and works. Trends Biochem Sci. 2005;30 (2):87-96.

131. Sanchez I, Hughes RT, Mayer В J et al. Role of SAPK/ERK kinase-1 in the stress-activated pathway regulating transcription factor c-Jun. Nature. 1994;372(6508):794-798.

132. Savino T.M., Bastos R., Jansen E. et al. The nucleolar antigen Nop52, the human homologue of the yeast ribosomal RNA processing RRP1, is recruited at late stages of nucleologenesis. J Cell Sci. 1999; 112 (12): 1889-1900.

133. Savkur RS, Olson MO. Preferential cleavage in pre-ribosomal RNA byprotein B23 endoribonuclease. Nucleic Acids Res. 1998; 26(19):4508-4515.

134. Schnapp A, Pfleiderer C, Rosenbauer H et al. A growth-dependent transcription initiation factor (TIF-IA) interacting with RNA polymerase I regulates mouse ribosomal RNA synthesis. EMBO J. 1990 ;9(9):2857- 2863.

135. Schreiber M, Baumann B, Cotten M et al. Fos is an essential component of the mammalian UV response. EMBO J. 1995;14(21):5338-5349.

136. Scott M., Boisvert F.M., Vieyra D. et al. UV induces nucleolar translocation of ING1 through two distinct nucleolar targeting sequences. Nucleic Acids Res. 2001; 29 (10) : 2052-2058.

137. Seither P, Zatsepina O, Hoffmann M et al. Constitutive and strong association of PAF53 with RNA polymerase I. Chromosoma. 1997 ,106(4):216-225.

138. Seither P., Iben S., Thiry M. et al. PAF67, a novel protein that is associated with the initiation-competent form of RNA polymerase I. Biol. Chem. 2001; 382: 1163- 1170.

139. Shav-Tal Y., Blechman J., Darzacq X. et al. Dynamic sorting of nuclear components into distinct nucleolar caps during transcriptional inhibition. Mol. Biol. Cell. 2005;16 (5) : 2395-2413.

140. Simpson JC, Wellenreuther R, Poustka A et al. Systematic subcellular localization of novel proteins identified by large-scale cDNA sequencing. EMBO Rep. 2000 ; l(3):287-292.

141. Sirri V., Roussel P., and Hernandez-Verdun, D. In vivo release of mitotic silencing of ribosomal gene transcription does not give rise to precursor ribosomal RNA processing. J. Cell Biol. 2000; 148: 259-270.

142. Srivastava M,'Fleming PJ, Pollard HB et al. Cloning and sequencing of the human nucleolin cDNA. FEBS Lett. 1989 , 250(1):99-105.

143. Stoykova AS, Dabeva MD, Dimova RN et al. Ribosome biogenesis and nucleolar ultrastructure in neuronal and oligodendroglial rat brain cells. J Neurochem. 1985 , 45(6): 1667-1676.

144. Tower J. and Sollner-Webb В. Transcription of mouse rDNA is regulated by an activated subform of RNA polymerase I. Cell 1987; 50: 873-883.

145. Туе K, Steitz JA. U3, U8 and U13 comprise a new class of mammalian snRNPs localized in the cell nucleolus. EMBO J. 1989 ;8(10):3113-3119.

146. Van Dam H, Wilhelm D, Herr I et al. ATF-2 is preferentially activated by stress-activated protein kinases to mediate c-jun induction in response to genotoxic agents. EMBO J. 1995; 14(8): 1798-1811.

147. Voit R, Schafer K, Grummt I. Mechanism of repression of RNA polymerase I transcription by the retinoblastoma protein. Mol Cell Biol. 1997;17(8):4230-4237.

148. Voit R, Schnapp A, Kuhn A et al. The nucleolar transcription factor mUBF is phosphorylated by casein kinase II in the C-terminal hyperacidic tail which is essential for transactivation. EMBO J. 1992 ;11(6):2211-2218.

149. Voit R., Hoffmann M., and Grummt I. Phosphorylation by Gl-specific cdk-cyclin complexes activates the nucleolar transcription factor UBF. EMBO J. 1999;18: 1891-1899.

150. Wang D, Baumann A, Szebeni A et al. The nucleic acid binding activity of nucleolar protein B23.1 resides in its carboxyl-terminal end. J Biol Chem. 1994 , 269(49):30994-30998.

151. Waskiewicz AJ, Cooper JA. Mitogen and stress response pathways: MAP kinase cascades and phosphatase regulation in mammals and yeast. Curr Opin Cell Biol. 1995;7(6):798-805.

152. Watkins, S.J. and Norbury, C.J. Translation initiation and its deregulation during tumorigenesis. Br. J. Cancer 2002; 86: 1023-1027.

153. Wojciechowski J., Horky M., Gueorguieva M., et al. Rapid onset of nucleolar disintegration preceding cell cycle arrest in roscovitine-induced apoptosis of human MCF-7 breast cancer cells. Int. J. Cancer. 2003; 106 (4) : 486-495.

154. Wu HL, Hsu CY, Liu WH, et al. Berberine-induced apoptosis of human leukemia HL-60 cells is associated with down-regulation of nucleophosmin/B23 and telomerase activity. Int J Cancer. 1999;81(6):923-929.

155. Yan M, Dai T, Deak JC, et al. Activation of stress-activated protein kinase by MEKK1 phosphorylation of its activator SEK1. Nature. 1994;372(6508):798-800.

156. Yang GH, Jarvis BB, Chung YJ et al. Apoptosis induction by the satratoxins and other trichothecene mycotoxins: relationship to ERK, p38 МАРК, and SAPK/JNK activation. Toxicol Appl Pharmacol. 2000;164(2):149-160.

157. Yuan X, Zhou Y, Casanova E et al. Genetic inactivation of the transcription factor TIF-IA leads to nucleolar disruption, cell cycle arrest, and p53-mediated apoptosis. Mol Cell. 2005 ;19(l):77-87.

158. Yuan X., Zhao J., Zentgraf H. et al. Multiple interactions between RNA polymerase I, TIF-IA and TAFI subunits regulate preinitiation complex assembly at the ribosomal gene promoter. EMBO Rep. 2002; 3: 1082-1087.

159. Yung BY, Busch H, Chan PK. Translocation of nucleolar phosphoprotein B23 (37 kDa/pI 5.1) induced by selective inhibitors of ribosome synthesis. Biochim Biophys Acta. 1985; 826(4): 167-173.

160. Zatsepina O.V., Todorov I.T., Philipova R.N. et al. Cell cycle-dependent translocations of a major nucleolar phosphoprotein, B23, and some characteristics of its variants. Eur. J. Cell Biol. 1997; 73 (1) : 58-70.168.169.170.171.172.

161. Zinck R, Cahill MA, Kracht M et al. Protein synthesis inhibitors reveal differential regulation of mitogen-activated protein kinase and stress-activated protein kinase pathways that converge on Elk-1. Mol Cell Biol. 1995; 15(9):4930-4938.