Характеристика коротких бактериальных аргонавтов и их белков-партнеров тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, кандидат наук Каневская Анна Александровна

• Каневская Анна Александровна
• кандидат наук
• 2024

Оглавление диссертации кандидат наук Каневская Анна Александровна

Список используемых сокращений

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Аргонавты эукариот

1.2. Аргонавты прокариот

1.2.1. Структура длинных аргонавтов. Связывание гида в MID и PAZ-доменах

1.2.2. Длинные активные аргонавты подгруппы long-A

1.2.2.1. Механизм катализа

1.2.2.2. Защитная функция активных аргонавтов в клетках бактерий

1.2.2.3. Функции активных аргонавтов в репликации ДНК

1.2.2.4. Разнообразие активных аргонавтов

1.2.3. Длинные неактивные аргонавты подгруппы long-B

1.2.4. Длинные неактивные аргонавты подгруппы long-C

1.3. Короткие аргонавты прокариот

1.3.1. Клада S1B

1.3.2. Клада S2A

1.3.3. Клада S2B

1.3.4. Механизмы активации белков-партнеров коротких аргонавтов

1.4. Заключение

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Бактериальные штаммы

2.2. Плазмиды

2.3. Питательные среды и антибиотики

2.4. Получение и трансформация химически компетентных клеток

2.5. Методы работы с нуклеиновыми кислотами

2.5.1. Электрофорез в агарозном геле

2.5.2. Электрофорез в полиакриламидном геле

2.5.3. Выделение РНК из полиакриамидного геля

2.5.4. Выделение ДНК из агарозного геля

2.5.5. Переосаждение нуклеиновых кислот

2.5.6. Получение генетических конструкций

2.5.6.1. Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

2.5.6.2. Лигирование

2.5.6.3. Реакция Гибсона

2.5.7. Выделение плазмидной и геномной ДНК из клеток E. coli

2.5.8. Выделение тотальной РНК из клеток E. coli

2.5.9. Получение плазмид CmeSPARDA и вариантов NbaSPARDA

2.6. Методы работы с белками

2.6.1. Электрофорез белков в полиакриламидном геле по Лэммли

2.6.2. Экспрессия и очистка комплексов NbaSPARDA и CmeSPARDA

2.7. Методы исследования активности SPARDA in vitro

2.7.1. Изучение нуклеазной активности SPARDA

2.7.2. Изучение многораундовой кинетики расщепления субстратов комплексом NbaSPARDA

2.7.3. Определение молекулярной массы и олигомерного состояния SPARDA

2.7.4. Применение SPARDA в тест-системе

2.8. Методы исследования активности SPARDA in vivo

2.8.1. Исследование действия SPARDA на чужеродную плазмиду

2.8.2. Анализ деградации ДНК и РНК в клетках E. coli

2.8.3. Микроскопия клеток в присутствии чужеродной плазмиды

2.8.4. Изучение антифагового действия SPARDA

2.8.5. Изучение антифагового действия AmAgo и Agap-HEPN

2.8.6. Микроскопия клеток во время фаговой инфекции для AmAgo и Agap-HEPN

2.8.7. Выделение РНК, ассоциированных с NbaSPARDA и тотальной РНК из клеток E. coli

2.8.8. Получение и анализ библиотек коротких РНК и тотальной РНК

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Структура NbaAgo, CmeAgo и их белков-партнеров

3.2. Выделение комплексов NbaSPARDA и CmeSPARDA

3.3. Нуклеазная активность SPARDA

3.4. Роль DREN-домена в нуклеазной активности SPARDA

3.5. Роль MID-домена в активации SPARDA

3.6. Специфичность аргонавта к 5'-концу и длине гида

3.7. Оптимальные условия для нуклеазной активности SPARDA

3.8. Олигомерное состояние SPARDA при связывании гида и мишени

3.9. Использование SPARDA в тест-системе для детекции ДНК

3.10. Многораундовое расщепление субстратов комплексом NbaSPARDA

3.11. Активация SPARDA чужеродной плазмидой

3.12. Расщепление ДНК системой SPARDA в клетках бактерий

3.13. Влияние SPARDA на целостность бактериальных клеток

3.14. Анализ нуклеиновых кислот, ассоциированных с NbaSPARDA в клетках

3.15. Активация SPARDA при фаговой инфекции

3.16. Антифаговый эффект при кооперации ^^^ аргонавта AmAgo и нуклеазы Agap-HEPN

3.17. Заключение

ВЫВОДЫ

БЛАГОДАРНОСТИ

4. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ПРИЛОЖЕНИЕ

Список используемых сокращений

АДФ - аденозиндифосфат

АТФ - аденозинтрифосфат

БСА - бычий сывороточный альбумин

ДДТ - дитиотреитол

ДМСО - диметилсульфоксид

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

дцДНК - двуцепочечная ДНК

дцРНК - двуцепочечная РНК

мРНК - матричная РНК

нт - нуклеотид

оцДНК - одноцепочечная ДНК

оцРНК - одноцепочечная РНК

ПААГ - полиакриламидный гель

п.н. - пара нуклеотидов

ПЦР - полимеразная цепная реакция

РНК - рибонуклеиновая кислота

ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота

AaAgo - Аргонавт из Aquifex aeolicus

AfAgo - Аргонавт из Archaeoglobus fulgidus

BRAM - long-B pAgo-associated trans-membrane, длинный прокариотический аргонавт, ассоциированный с транс-мембранным белком BRAN - long-B pAgo-associated nuclease, длинный прокариотический аргонавт, ассоциированный с нуклеазой

BRAS - long-B pAgo-associated SIR2, длинный прокариотический аргонавт,

ассоциированный с SIR2-доменом

cADPR - cyclic ADP ribose, циклическая АДФ-рибоза

CbAgo - Аргонат из Clostridium butyricum

CcAgo - Аргонавт из Caballeronia cordobensis

CmeAgo - Аргонавт из Cupriavidus metallidurans

CRISPR - clustered regularly interspaced short palindromic repeats, короткие

регулярно расположенные палиндромные повторы

CrtAgo - Аргонавт из Crenotalea thermophila

Ddm - DNA defence module, модуль защиты ДНК

DREN - DNA/RNA effector nuclease, ДНК/РНК эффекторная нуклеаза

eAgo - эукариотические аргонавты

EmaAgo - Аргонавт из Exiguobacterium marinum

GsAgo - Аргонавт из Geobacter sulfurreducens

HEPES - 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновая кислота

KjAgo - Аргонавт из Kordia jejudonensis

KmaAgo - Аргонавт из Kurthia massiliensis

LB - среда Лурия-Бертани

LrAgo - Аргонавт из Limnothrix rosea

MapAgo - Аргонавт из Maribacter polysiphoniae

MjAgo - Аргонавт из Methanocaldococcus jannaschii

MOI - multiplicity of infection, множественность инфекции

MpAgo - Аргонавт из Marinitoga piezophiШ

NAD+ - никотинамидадениндинуклеотид

NbaAgo - Аргонавт из Novosphingopyxis baekryungensis

NgAgo - Аргонавт из Natronobacterium gregoryi

pAgo - прокариотические аргонавты

PIPES - пиперазин-Ы,№-бис(2-этансульфоновая кислота)

PfAgo - Аргонавт из Pyrococcus furiosus

PMSF - фенилметилсульфонил фторид

RsAgo - Аргонавт из Rhodobacter sphaeroides

SeAgo - Аргонавт из Synechococcus elongatus

SEC-MALS - size exclusion chromatography with multi-angle static light scattering, эксклюзионная хроматография с многоугловым рассеянием света SiAgo - Аргонавт из Sulfolobus islandicus

SPARDA - short prokaryotic Argonaute associated with DREN-APAZ, короткий

прокариотический аргонавт, ассоциированный с DREN-APAZ

SPARSA - short prokaryotic Argonaute associated with SIR2-APAZ, короткий

прокариотический аргонавт, ассоциированный с SIR2-APAZ

SPARTA - short prokaryotic Argonaute associated with TIR-APAZ, короткий

прокариотический аргонавт, ассоциированный с TIR-APAZ

TtAgo - Аргонавт из Thermus thermophilus

ВВЕДЕНИЕ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Характеристика коротких бактериальных аргонавтов и их белков-партнеров»

Актуальность

Белки-аргонавты относятся к программируемым эндонуклеазам: связывая гидовую молекулу, они способны разрезать комплементарную ей молекулу мишени. Эукариотические аргонавты являются центральным элементом системы РНК-интерференции. Их функции в клетках к настоящему моменту всесторонне исследованы: помимо различных путей сайленсинга генов, они играют важную роль в подавлении активности мобильных генетических элементов и в обеспечении противовирусного иммунитета.

У прокариот также есть механизмы, подавляющие экспрессию генов подобно РНК-интерференции (некоторые системы CRISPR-Cas), однако белки, которые в них задействованы, негомологичны эукариотическим белкам, участвующим в РНК-интерференции. В то же время, прокариотические аргонавты гораздо разнообразнее эукариотических, хотя они и были открыты позже. Способность аргонавтов прокариот использовать в качестве гидов и мишеней не только РНК, как эукариотические белки, но и ДНК, обуславливает их большее функциональное разнообразие. Еще одним существенным отличием аргонавтов прокариот от аргонавтов эукариот является вариабельность структуры. Тогда как эукариотические белки всегда включают четыре основных домена N, PAZ, MID и PIWI, аргонавты прокариот могут не иметь одного или двух доменов или содержать дополнительные домены. Физиологическая роль прокариотических аргонавтов была неизвестна долгое время и во многом не изучена и сейчас.

Исходя из строения прокариотических аргонавтов, можно выделить группы длинных и коротких аргонавтов. Длинные аргонавты состоят из клад активных аргонавтов и неактивных аргонавтов. Неактивные аргонавты содержат замены остатков активного центра домена PIWI и поэтому не способны разрезать мишени, однако в клетках они могут рекрутировать другие белки, в том числе с нуклеазной активностью. Длинные аргонавты каждой

подгруппы обладают своими интересными особенностями, но можно полагать, что их общая функция - обеспечение защиты клеток от чужеродных нуклеиновых кислот, таких как плазмиды или бактериофаги. Так как активные прокариотические аргонавты производят гид-зависимое разрезание мишени в строго определенном положении, они могут быть использованы как инструменты для генной инженерии. В отличие от CRISPR/Cas, аргонавтам не нужны специальные мотивы, и в качестве гида можно использовать не только РНК, но и ДНК, что расширяет возможности их применения в экспериментах in vitro.

Другая группа аргонавтов прокариот - короткие аргонавты, изучение которых находится на ранней стадии. Они составляют более половины всех прокариотических белков-аргонавтов. Их основная отличительная черта -наличие только MID и PIWI-доменов. Кроме того, они не имеют нуклеазной активности из-за замен каталитических остатков. Но в геномах они кодируются совместно с белками-партнерами, включающими домен APAZ и еще один или несколько доменов. Оказалось, что APAZ соответствует N-концевой части длинных аргонавтов, тогда как другой домен, по-видимому, является эффектором, выполняющим определенную функцию. Варианты эффекторных доменов могут быть совершенно разными, и их значительная часть остается неисследованной.

На данный момент изучено несколько белков-партнеров c НАДазной активностью, образующих комплексы с короткими аргонавтами. В этих комплексах белок-аргонавт связывает РНК-гид и распознает ДНК-мишень, тем самым активируя эффектор. При вторжении определенных плазмид или бактериофагов такие системы могут расщеплять клеточный NAD+, тем самым защищая клетки по механизму абортивной инфекции. Эта активность была использована для получения тест-системы для детекции ДНК, альтернативной системам на основе Cas-белков.

Одним из наиболее распространенных доменов в белках-партнерах коротких аргонавтов является домен с неизвестной функцией DUF4365,

который имеет отдаленную гомологию с нуклеазами и был нами назван DREN (DNA/RNA effector nuclease). Можно предполагать, что при связывании гидов и мишеней с данными аргонавтами, белки-партнеры будут проявлять коллатеральную нуклеазную активность. Таким образом, изучение коротких аргонавтов представляет интерес не только с точки зрения понимания механизмов иммунитета прокариотических организмов, но и с точки зрения их практического применения в качестве нуклеаз, активируемых при узнавании специфических мишеней, в биотехнологии и генетической инженерии. Данная работа в основном посвящена исследованию защитных систем, состоящих из коротких аргонавтов и белков-партнеров с эффекторным доменом DREN, которые были нами названы SPARDA (от short prokaryotic argonaute associated with DREN-APAZ).

Цели и задачи исследования

Целью данной работы являлась характеристика коротких бактериальных аргонавтов и их белков-партнеров, содержащих домен DREN, в экспериментах in vitro и in vivo. Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Получить очищенные препараты комплексов коротких аргонавтов с белками-партнерами, содержащими домен DREN.

2. Определить специфичность комплексов SPARDA к гидам и мишеням, а также наличие коллатеральной нуклеазной активности у белка-партнера при связывании гидов и мишеней аргонавтом.

3. Изучить активность комплексов SPARDA по отношению к различным коллатеральным субстратам и выяснить оптимальные условия для проявления коллатеральной активности.

4. Разработать систему детекции ДНК на основе коллатеральной активности комплексов SPARDA.

5. Исследовать активацию системы SPARDA в клетках E. coli в зависимости от чужеродной плазмидной ДНК. Проанализировать

специфичность связывания гидов комплексом SPARDA в клетках E. coli в присутствии чужеродной ДНК.

6. Изучить функциональную активность комплексов SPARDA при инфекции клеток E. coli различными бактериофагами.

7. Сравнить антифаговую активность системы SPARDA in vivo c активностью длинного активного аргонавта с аналогичной специфичностью к гиду и мишени.

Научная новизна и значимость работы

Диссертационная работа посвящена исследованию коротких аргонавтов, кодируемых совместно с прежде неизученными белками-партнерами, состоящими из доменов DUF4365 (DUF = domain of unknown function) и APAZ. Было установлено, что домен DUF4365 является активной нуклеазой, расщепляющей как ДНК, так и РНК-субстраты. Вследствие такой специфичности DUF4365 мы назвали его DREN (DNA/RNA effector nuclease). Впервые показано, что два коротких аргонавта CmeAgo и NbaAgo образуют стабильные комплексы с белками-партнерами DREN-APAZ, которые мы назвали SPARDA (short prokaryotic argonaute associated with DREN-APAZ). Продемонстрировано появление неспецифической коллатеральной активности комплексов только в случае связывания короткими аргонавтами РНК-гидов и распознавании комплементарных им ДНК-мишеней в присутствии магния и/или марганца. Определен спектр субстратной специфичности SPARDA и показано, что активированный комплекс способен расщеплять оцДНК, дцДНК (в том числе плазмидную ДНК), оцРНК и РНК-ДНК дуплекс. Кроме того, показано, что комплекс SPARDA может осуществлять несколько раундов катализа и со сравнимой эффективностью расщепляет избыток оцДНК и оцРНК in vitro. Установлено, что комплекс SPARDA активен в физологическом диапазоне температур (от 25 до 40 градусов Цельсия) и значений pH (от 7,5 до 8,5). Это удобно для

использования системы SPARDA в различных приложениях: в работе разработана тест-система для детекции ДНК на основе SPARDA, позволяющая с высокой чувствительностью обнаруживать целевую ДНК по увеличению флуоресцентного сигнала.

Впервые проведены исследования функциональной активности системы SPARDA у бактерий. Показано, что в клетках E. coli SPARDA активируется при вторжении чужеродной плазмиды, осуществляя деградацию геномной и плазмидной ДНК и вызывая гибель клеток. Таким образом происходит защита бактериальной популяции по механизму абортивной инфекции. Проанализирован спектр гидовых РНК, связанных с комплексом SPARDA в клетках E. mli в присутствии чужеродной плазмиды; показано, что гидовые РНК содержат 5'-концевой мотив AU и в основном соответствуют высоко транскрибируемым генам, в том числе, с плазмидной локализацией. Показано, что при инфекции бактериофагами лямбда (А) или P1 SPARDA обеспечивает защиту клеток путем предотвращения или замедления лизиса, по-видимому, подавляя репликацию фага. Подобный результат был показан и для длинного активного аргонавта AmAgo, который, как и SPARDA, имеет специфичность к РНК-гидам и ДНК-мишеням и кооперирует в клетках с нуклеазой Agap-HEPN.

Таким образом, SPARDA является новой системой защиты прокариот, которая активируется программируемым распознаванием ДНК -мишени и обладает уникальными свойствами, что позволяет использовать ее в практических приложениях.

Методология и методы исследования

В работе применялись разнообразные методы биохимии, молекулярной биологии и микробиологии. Посредством молекулярного клонирования и сайт-направленного мутагенеза были получены плазмиды, содержащие гены NbaAgo и DREN-APAZ, их варианты с аминокислотными заменами в активном

центре DREN-домена и гид-связывающем кармане MID-домена, а также гены CmeAgo и DREN-APAZ. Белки были экспрессированы в клетках E. coli и очищены с помощью никель-хелатной, гепариновой и анионобменной хроматографий, фракции были проанализированы методом электрофореза белков в полиакриламидном геле по Лэммли. Образование стабильного комплекса NbaAgo и DREN-APAZ было подтверждено методом многоуглового светорассеяния в сочетании с гель-фильтрацией. Исследование нуклеазной активности комплексов SPARDA проводилось в реакциях in vitro с разделением продуктов методами гель-электрофореза. Нуклеиновые кислоты, ассоциированные с комплексом SPARDA в клетках E. coli в присутствии чужеродной плазмиды, были выделены путем фенол-хлороформной экстракции и элюции из геля. Изучение влияния SPARDA, а также AmAgo и Agap-HEPN на чужеродную ДНК в клетках E. coli проводили с помощью анализа кривых роста клеточных культур, измерения количества жизнеспособных клеток и числа вирусных частиц, а также эффективности образования бляшек и микроскопии.

Положения, выносимые на защиту

1. SPARDA представляет собой иммунную систему прокариот, которая активируется при попадании чужеродной ДНК в клетки E. coli.

2. SPARDA является гетеродимерным комплексом, состоящим из короткого аргонавта и белка-партнера DREN-APAZ.

3. Белок-партнер DREN-APAZ является активной нуклеазой, коллатеральная активность которой высвобождается при связывании коротким аргонавтом РНК-гида и распознавании комплементарной ему ДНК-мишени.

4. SPARDA способна к многораундовому расщеплению ДНК и РНК субстратов с использованием магния или марганца при физиологических значениях температуры и pH.

5. В присутствии чужеродной плазмиды SPARDA деградирует ДНК в клетках E. coli, обеспечивая иммунитет бактериальной популяции по механизму абортивной инфекции.

6. SPARDA в клетках E. coli ассоциирована с короткими РНК-гидами, которые имеют строгое предпочтение к AU на 5'-конце и происходят из генов с высокими уровнями транскрипции.

7. При заражении клеток E. coli бактериофагами лямбда (А) и P1 SPARDA задерживает или предотвращает клеточный лизис.

8. Длинный активный аргонавт AmAgo, связывающий РНК-гиды и узнающий ДНК-мишени, также защищает клетки от бактериофагов А и P1, действуя совместно с нуклеазой Agap-HEPN, которая кодируется с ним в одном опероне.

Степень достоверности и апробация результатов работы

По результатам данной работы опубликованы 2 статьи в международных рецензируемых научных журналах. Результаты также были представлены на 2 конференциях (всероссийской и международной). Кроме того, был получен патент на разработанную в работе тест-систему для детекции ДНК.

Публикации в журналах:

1. Prostova M*., Kanevskaya A*., Panteleev V., Lisitskaya L., Perfilova-Tugaeva K., Sluchanko N.N., Esyunina D., Kulbachinskiy A. DNA-targeting short Argonautes complex with effector proteins for collateral nuclease activity and bacterial population immunity // Nat. Microbiology. - 2024. -9(5). - 1368-1381. * - равный вклад авторов

2. Agapov A., Panteleev V., Kropocheva E., Kanevskaya A., Esyunina D., Kulbachinskiy A. Prokaryotic Argonaute nuclease cooperates with co-encoded RNase to acquire guide RNAs and target invader DNA // Nucleic Acids Res. - 2024. - 52(10). - 5895-5911.

Патент:

Простова М.А., Каневская А.А., Есюнина Д.М., Кульбачинский А.В. Тест-система для детекции целевой ДНК или РНК с использованием короткого белка-аргонавта в комплексе с нуклеазой и флуоресцентного репортера // Патент России № 2821993, от 19.06.2023.

Тезисы конференций:

1. Каневская А.А., Пантелеев В.А., Лисицкая Л.А., Тугаева К.В., Случанко Н.Н., Есюнина Д.М., Кульбачинский А.В., Простова М.А. Короткий аргонавт активирует нуклеазу для защиты бактерий от чужеродной ДНК // Гены и клетки. - 2023. - Материалы Международного конгресса CRISPR-2023. - Т. 15. - C. 17.

2. Каневская А.А., Кульбачинский А.В. Комплекс короткого аргонавта и HNH-нуклеазы защищает бактерии от чужеродной ДНК, вызывая гибель клеток по механизму абортивной инфекции // Физико-химическая биология. - 2024. - Материалы V Всероссийской конференции «физико-химическая биология», приуроченной к 40-летию ИХБФМ СО РАН. - C. 21.

Личное участие автора в проведении исследовании

Все представленные в данной работе результаты были получены автором самостоятельно, либо при непосредственном участии автора. Автором были созданы плазмидные конструкции для экспрессии комплекса CmeSPARDA и мутантных вариантов комплекса NbaSPARDA в клетках E. coli. Автором лично выполнены все эксперименты in vitro, а также выделение комплексов CmeSPARDA, NbaSPARDA и мутантов NbaSPARDA. Совместно с Н.Н. Случанко были выполнены эксперименты по определению олигомерного состояния SPARDA (гель-фильтрация и SEC-MALS). Эксперименты с тест-системой были сделаны совместно с М.А. Простовой. Также автором были

самостоятельно выполнены эксперименты in vivo в случае чужеродных плазмид (в том числе анализ деградации ДНК и РНК), кроме микроскопии, которая была сделана при участии В.А. Пантелеева. Автором лично сделаны эксперименты по измерению эффективности образования бляшек и получены кривые при высокой множественности инфекции для CmeSPARDA и NbaSPARDA, остальные эксперименты с бактериофагами были выполнены совместно с В.А. Пантелеевым. Библиотеки коротких РНК и тотальной РНК были получены и проанализированы совместно с Л.А. Лисицкой и М.А. Простовой. Автор внес значительный вклад в обсуждение, интерпретацию результатов и подготовку публикаций.

Структура и объем работы

Диссертационная работа включает: список используемых сокращении, введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и обсуждение, выводы, список литературы и приложение. Работа изложена на 171 странице, содержит 41 рисунок, 2 таблицы. Список литературы включает 127 источников.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

В клетках эукариот и прокариот действует множество путей регуляции экспрессии генов как на уровне транскрипции, так и на посттранскрипционном уровне. К механизмам подавления экспрессии генов у эукариот относится процесс РНК-интерференции, в котором сайленсинг осуществляется с помощью малых РНК (Fire et al., 1998). В начале 21-го века было установлено, что ведущую роль в этом процессе играют белки-аргонавты. В дальнейшем белки-аргонавты были также обнаружены и у прокариот (Song et al., 2004; Yuan et al., 2005). Именно для прокариотических аргонавтов впервые удалось расшифровать трехмерные структуры, тогда как структуры эукариотических аргонавтов были получены значительно позже (Song et al., 2004; Schirle, MacRae, 2012).

На сегодня аргонавты эукариот изучены гораздо лучше, чем аргонавты прокариот, хотя последние гораздо более разнообразны. В последние годы начались активные исследования прокариотических аргонавтов. Было показано, что, в отличие от аргонавтов эукариот, они преимущественно узнают ДНК-мишени, а их основная функция - не регуляция экспрессии генов, а защита клеток от чужеродной ДНК. Лучше всего исследованы каталитически активные аргонавты, которые обладают нуклеазной активностью и осуществляют расщепление чужеродных генетических элементов в процессе ДНК-интерференции (Swarts et al., 2014a; Kuzmenko et al., 2020). В то же время, существуют большие группы аргонавтов, которые сами по себе не имеют нуклеазной активности. Наиболее разнообразной группой являются «короткие» аргонавты, у которых отсутствует часть доменов и которые, вероятно, участвуют в иммунной защите клеток совместно с дополнительными эффекторными белками.

Исследования всего разнообразия аргонавтов прокариот важны не только для понимания механизмов их работы и клеточных функций, но и для понимания того, как работают и эволюционируют эукариотические системы

иммунной защиты. В обзоре литературы кратко рассмотрены структура и функции белков-аргонавтов эукариот, а затем основное внимание уделено описанию разных групп аргонавтов прокариот.

1.1. Аргонавты эукариот

Аргонавты эукариот были открыты во время изучения генов, отвечающих за удлинение клеток у Arabidopsis thaliana, главного модельного организма в генетике растений. Свое название белки-аргонавты получили из-за мутанта A. thaliana по гену ago1. Его листья напоминали щупальца аргонавта - моллюска из отряда осьминогов, поэтому мутант был назван аргонавтом (argonaute), и впоследствии это стало названием всего семейства белков (Bohmert et al., 1998). Уже в ранних работах было обнаружено, что мутанты по генам, кодирующим белки семейства аргонавтов, демонстрируют устойчивость к подавлению экспрессии генов по механизму РНК-интерференции (Tabara et al., 1999; Catalanotto et al., 2000).

Эукариотические белки-аргонавты имеют достаточно консервативное строение. Они состоят их четырех основных доменов: PIWI (P-element induced wimpy testis), MID (среднего), PAZ (PIWI-Argonaute-Zwille) и N-концевого. Между PAZ-доменом и N-доменом расположен линкерный домен L1, а между MID и PIWI-доменами - домен L2 (Рис. 1.1). Активный центр находится в домене PIWI (Rivas et al., 2005; Elkayam et al., 2012).

1_175 226 347 450 573_859

N L1 PAZ 12 MID PIWI

Рисунок 1.1. Структура hAgo2 в комплексе с микроРНК -20а (Elkayam et al., 2012). Домены аргонавта показаны разными цветами в соответствии со схемой под структурой. Положение активного центра обозначено красным кругом. Светло-фиолетовым цветом показана микроРНК -20а, положение ее 5'конца (5'end) отмечено стрелкой.

Каталитический центр PIWI-домена включает в себя тетраду аминокислотных остатков DEDX, где X может быть H, K, D или N, в которой координируются два иона магния (Nakanishi et al., 2012). Строение активного центра аргонавтов (Рис. 1.2, слева) и механизм разрезания мишени весьма схожи с таковыми у РНКазы H (Рис. 1.2, справа) (Song et al., 2004). Стадии катализа будут рассмотрены ниже на примере прокариотических аргонавтов.

hAgo2 RNase H

Рисунок 1.2. Каталитические остатки PIWI-домена hAgo2 (PDB ID 4F3T) (слева; выделены синим, красным и пурпурным) и РНКазы H (PDB ID 3D0P) (справа; выделены синим и пурпурным) (модель PyMol) (Pallan, Egli, 2008). Оранжевым цветом показаны микроРНК -20а (слева) и дцДНК (справа).

Стоит добавить, что не все аргонавты эукариот обладают каталитической активностью, однако неактивные белки-аргонавты способны осуществлять регуляцию экспрессии генов иными способами, которые будут рассмотрены ниже.

Аргонавты эукариот можно разделить на две группы: AGO-белки и PIWI-белки. AGO-белки осуществляют сайленсинг генов, используя эндогенные miPHK (микроРНК) или siPHK (малые интерферирующие РНК), которые могут быть как экзогенными, так и эндогенными (Carthew, Sontheimer, 2009).

Для обоих типов siPHK в ходе процессинга длинные двуцепочечные РНК разрезаются под действием фермента Dicer, который принадлежит к семейству РНКазы III. Он состоит из двух доменов РНКазы III, хеликазного домена, домена PAZ, а также дополнительных доменов - dsRBD (double-stranded RNA-binding domain) и DUF283 (Su et al., 2022). После разрезания образуются фрагменты двунитевой РНК длиной около 25 нуклеотидов, содержащие на 5'-конце фосфат, а на 3'-конце гидроксил и два выступающих нуклеотида. Далее происходит формирование загрузочного комплекса RISC

(RNA-induced silencing complex), включающего в себя Dicer, TRBP (transactivation response RNA-binding protein) и белок-аргонавт (MacRae et al., 2008). Затем аргонавт взаимодействует с коротким РНК-дуплексом. Одна из цепей дуплекса становится «пассажирской» и элиминируется из комплекса, а вторая цепь становится гидовой и остается связанной с аргонавтом. При помощи Dicer и TRBP происходит ее загрузка в белок-аргонавт с образованием зрелого RISC-комплекса. В кармане MID-домена связывается 5'-конец гидовой РНК, а в PAZ-домене ее 3'-конец, и, таким образом, гидовая РНК защищается от деградации. Далее в области между доменами MID-PIWI и N-PAZ происходит связывание комплекса с мРНК-мишенью, благодаря комплементарным взаимодействиям с гидовой РНК, после чего мишень разрезается каталитическими остатками PIWI-домена аргонавта между 10 и 11 нуклеотидами гида (Рис. 1.3) (Hammond et al., 2000; Tomari, Zamore, 2005; Joshua-Tor, 2006; Tolia, Joshua-Tor, 2007; Kawamata, Tomari, 2010; Elkayam et al., 2012; Kuhn, Joshua-Tor, 2013; Rogers, Chen, 2013).

3'

PAZ —»v

Helix7 MID Ш^^Ё

Щ

Рисунок 1.3. Модель комплекса эукариотического аргонавта с гидом. Четыре основных домена аргонавта показаны разными цветами, гидовая РНК показана оранжевым цветом. Ее 5'-концевой нуклеотид связан в MID-домене, а 3'-конец расположен в PAZ-домене. Показаны два иона магния в активном центре PIWI-домена (пурпурным), которые координируются каталитической тетрадой DDEH (Kuhn, Joshua-Tor, 2013).

Важно отметить, что siРНК, как правило, полностью комплементарны мРНК-мишени (Tomari, Zamore, 2005). В качестве экзогенных siРНК могут выступать, например, продукты репликации РНК-вирусов, которые расщепляются Dicer с образованием коротких фрагментов vsiРНК (вирусных малых интерферирующих РНК), вследствие чего аргонавт может расщеплять комплементарную вирусную мРНК-мишень, тем самым обеспечивая противовирусную защиту (Boualem et al., 2016; Li, Wang, 2019). Для A. thaliana, инфицированных ДНК-вирусами, было показано образование множества vsiРНК, образующихся из вирусных транскриптов и процессируемых DCL3 (Dicer-like family) (Blevins et al., 2011). Эндогенные siРНК могут происходить в том числе из транспозонов, благодаря чему аргонавт может регулировать их экспрессию, посредством прямого расщепления РНК-мишени (у Drosophila melanogaster) или, например, ингибирования трансляции (у растений) (Kawamura et al., 2008; Ghildiyal et al., 2008; Lisch, 2012). Кроме того, у нематод и растений образование вторичных эндогенных siРНК инициируется РНК-зависимой РНК-полимеразой путем формирования из мРНК-мишени двуцепочечных транскриптов, которые становятся новыми субстратами для Dicer (Claycomb, 2014).

Процессинг miРНК начинается с синтеза РНК-полимеразой II длинных двуцепочечных pri-miРНК (первичная miРНК), содержащих одну или несколько шпилек, из которых в дальнейшем образуются miРНК. Затем под действием фермента Drosha происходит образование более коротких фрагментов pre-miРНК (предшественник miРНК). После этого, как и при процессинге siРНК, они разрезаются ферментом Dicer с образованием коротких двунитевых miРНК длиной около 22 нуклеотидов. Процесс образования miRISC-комплекса аналогичен такому же для siРНК - дуплекс miРНК связывается с белком-аргонавтом, одна из цепей становится пассажирской и удаляется из комплекса, а другая гидовой и загружается в

аргонавт при участии Dicer и РНК-связывающих белков (Bernstein et al., 2001; MacRae et al., 2008). Важным отличием miPHK от siPHK является неполная комплементарность miPHK мРНК-мишени, вследствие чего не происходит ее разрезания (Bartel, 2018). Однако было показано, что полностью комплементарная мРНК-мишень будет расщепляться комплексом miRISC (Hutvagner, Zamore, 2002). Таким образом, наличие каталитических остатков у аргонавта является необходимым, но не достаточным условием для расщепления мишени (Liu et al., 2004; Tolia, Joshua-Tor, 2007). Помимо комплементарности важное значение имеет строение гидовой РНК. Некоторые аргонавты проявляют нуклеазную активность только при связывании определенных малых РНК. Основным каталитически активным аргонавтом человека является белок hAgo2, а hAgo3 расщепляет мишень только при связывании в качестве гида микроРНК -20а (Park et al., 2017). При этом белки hAgol и hAgo4 из-за особенностей структуры лишены каталитической активности.

Еще одной особенностью как для siPHK, так и для miPHK при образовании RISC-комплекса является предпочтение разных AGO-белков к определенному 5'-концевому нуклеотиду. Например, у A. thaliana AGO1 связывает miPHK c урацилом на 5 '-конце, тогда как AGO2 связывает siPHK с аденином на 5'-конце. При этом в случае D. melanogaster у большей части коротких PHK на 5'-конце находится урацил (Tomari et al., 2007; Takeda et al., 2008; Montgomery et al., 2008). Для человеческого hAgo2 было показано предпочтительное связывание с гидами, у которых на 5'-конце находится урацил или аденин (Frank et al., 2010). Однако в другой работе сообщалось, что hAgo2 может связывать гиды с любым концевым нуклеотидом, и кинетика расщепления мишени сравнима для гидов с 5 '-G и 5'-A (Kalia et al., 2015).

Второй группой эукариотических белков-аргонавтов являются PIWI-белки, связывающие piPHK (PIWI-interacting PHK). Их главной функцией является подавление экспрессии транспозонов, являющихся важным

компонентом большинства геномов (Vagin et al., 2006; Zaratiegui et al., 2007). В отличие от siРНК и ш[РНК, в образовании piРНК не задействованы Dicer или Drosha. Их процессинг начинается с синтеза длинных одноцепочечных РНК, которые транскрибируются с piРНК-кластеров с помощью измененного комплекса РНК-полимеразы II (Brennecke et al., 2007; Andersen et al., 2017). Затем под действием эндонуклеазы Zucchini (Zuc) образуются фрагменты длиной около 30 нуклеотидов - это еще одно отличие от более коротких miРНК и siРНК. Далее происходит загрузка этих фрагментов в PIWI-белок, и затем их 3'-конец укорачивается и метилируется (Kawaoka et al., 2011). Кроме того, у некоторых организмов, например, дрозофилы, образование piРНК может происходить с помощью циклического процесса пинг-понг амплификации. Инициаторные piРНК благодаря комплементарным взаимодействиям вызывают расщепление аргонавтом предшественников piРНК, образуя pre-pre-piРНК (предшественники piРНК). Их 5'-конец загружается в аргонавт, а 3'-конец подвергается разрезанию нуклеазой Zucchini и метилированию. В результате образуются зрелые респондерные piРНК, которые вызывают расщепление предшественников piРНК с образованием новых инициаторных piРНК, завершая цикл (Aravin et al., 2008). Некоторые PIWI-белки также, как и AGO-белки, могут иметь противовирусную активность, но механизм этого на данный момент остается неизвестным (Santos et al., 2022).

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Каневская Анна Александровна, 2024 год

— <и

ЮЫА - __ _ — ё

30 I §_

дР!ЫА____ъ

Ъыа----------£

20 I &

о а. с

Рисунок 3.12. Влияние длины ДНК -мишени на активность NЪaSPARDA. А -последовательности ДНК -мишеней разной длины. Б - нуклеазная активность NЪaSPARDA с оцДНК (71 нт) для ДНК -мишеней разной длины. Продукты

реакций визуализированы с помощью SYBD Gold. Положение РНК -гида (gRNA), ДНК-мишени (tDNA), субстрата, а также продуктов расщепления, показано слева и справа от гелей.

Таким образом, были определены оптимальные условия для проявления активности NbaSPARDA. Комплекс использует ионы магния и марганца в качестве кофакторов (а также их комбинацию) при физиологических значениях температуры и pH. ДНК-мишени разной длины в одинаковой степени активируют SPARDA.

3.8. Олигомерное состояние SPARDA при связывании гида и мишени

Как уже обсуждалось выше, в свободном состоянии SPARDA представляет собой гетеродимерный комплекс (Рис. 3.13. А). Для исследования механизма активации комплекса in vitro и проверки его возможной олигомеризации при связывании нуклеиновых кислот была проведена гель-фильтрация после взаимодействия комплекса с гидом или с гидом и мишенью. Для этих экспериментов был синтезирован гид с флуорофором FAM на 3'-конце, чтобы детектировать его в процессе гель-фильтрации. Нужно отметить, что в отличие от метода SEC-MALS, описанного выше, в данном случае не проводили определения точной молекулярной массы комплекса, а сравнивали его положение на хроматографическом профиле с белковыми стандартами. Измеренная этим методом оценочная молекулярная масса комплекса, связавшего гид, лишь немного увеличивалась относительно комплекса в свободном состоянии (96 и 83 кДа, соответственно) (Рис. 3.13. А, Б). При связывании комплекса с гидом и мишенью появлялось два пика: один с такой же оценочной массой, как и при связывании гида, а второй в полтора раза больше (Рис. 3.13. В). Наличие гида в пике на рис. 3.13. Б и в пиках на рис. 3.13. В подтверждалось пиком флуорофора FAM при длине волны 500 нм (зеленая пунктирная линия). В то время как первый пик (с массой 96 кДа)

соответствует мономеру гетеродимерного комплекса SP.AR.DA, второй пик (с массой 150 кДа), вероятно, соответствует димеру гетеромерного комплекса.

Анализ содержимого фракций обоих пиков с помощью гель-электрофореза показал, что ДНК-мишень практически полностью находится в пике мономера, тогда как в пике димера обнаруживается в основном гид (Рис. 3.13. Д). Стоит добавить, что незначительный пик димера гетеромерного комплекса на хроматограмме свободного комплекса (Рис. 3.13. А), вероятно, соответствует небольшой фракции SP.AR.DA, связанной с короткими РНК из клеток (см. далее).

А

SPARDA WT SEC

В

о 0.00

- 280

260 83 kDa

SPARDA+gRNA+tDNA

£ 0.04

0.00

- 280 ! 96lkDa ----500

260 ■

150 kDa А ........À

0.005 ;

10 11 12 13 14 IS 16 17

10 11 12 13 14 15 16 17

Е 0.100

S 0.075

0.025

SPARDA + gRNA

- 280 96 kDa ----500

260 / / *, 1

0.04

0.02 1

0.01

Г

gRNA

■ 3' FAM

tDNA

20 nt gRNA tDNA 20 nt

10 11 12 13 14 15 16 17 18

Рисунок 3.13. Анализ олигомерного состояния NbaSPARDA с помощью гель-фильтрации. А - профиль гель-фильтрации свободного комплекса SPARDA. Б - профиль гель-фильтрации комплекса SPARDA после инкубации с РНК-гидом. В - профиль гель-фильтрации комплекса SPARDA после инкубации с РНК-гидом и ДНК-мишенью (длиной 20 нт). Профили поглощения при 260, 280 и 500 нм показаны оранжевым, синим и зеленым цветами, соответственно. Д - электрофорез в ПААГ фракций пиков из профиля В. Вверху геля подписаны мл (ml) профиля элюции. Показано положение гидовой РНК (gRNA) и ДНК-мишени (tDNA) длиной 20 нт.

Из полученных данных следует, что активным комплексом является именно мономер NbaSPARDA. Таким образом, в отличие от системы SPARTA, которая тетрамеризуется при активации (Koopal et al., 2022), SPARDA, аналогично SPARSA (Zaremba et al., 2022), не меняет своего олигомерного состояния при узнавании мишени.

3.9. Использование SPARDA в тест-системе для детекции ДНК

Так как расщепление субстрата осуществляется SPARDA при распознавании комплементарной гиду ДНК-мишени, мы решили использовать комплекс в тест-системе для обнаружения целевой ДНК. В качестве коллатерального субстрата была синтезирована короткая оцДНК (длиной 32 нуклеотида), содержащая на З'-конце флуорофор ROX, а на 5'-конце гаситель BHQ2. Когда флуорофор находится близко к гасителю, сигнал флуоресценции практически отсутствует. Однако, при связывании гида и мишени SPARDA начинает расщеплять субстрат, вследствие чего должно происходить отдаление флуорофора от гасителя и появление сигнала флуоресценции, который будет детектироваться во флуориметре (Рис. 3.14. А).

Было показано, что при внесении ДНК-мишени в реакционную смесь, содержащую флуоресцентный ДНК-субстрат и комплекс NbaSPARDA с РНК-гидом, соответствующим целевой ДНК, происходит постепенное увеличение сигнала флуоресценции (Рис. 3.14. Б). Очень значимым параметром тест-системы является ее чувствительность, которая зависит в том числе и от уровня фоновой активности. Было показано, что в случае SPARDA фоновая активность в отсутствие детектируемой ДНК достаточно низкая и в эксперименте без добавления ДНК-мишени не происходит увеличения сигнала. При проведении реакции с разными концентрациями ДНК-мишени было установлено, что чувствительность тест-системы составляет не менее 150 pM (Рис. 3.14. Б). Это сильно превышает чувствительность системы детекции, основанной на измерении НАДазной активности SPARTA, и

сопоставимо с чувствительностью систем на основе Cas12 и Cas13 (Рис. 3.14. В) (Gootenberg ^ а1., 2017; Коора1 et а1., 2022; Dmytrenko et а1., 2023).

Другим важным параметром тест-системы является ее специфичность. Было изучено влияние мисматчей, введенных в различные позиции детектируемой ДНК-мишени. Несовпадения в первом нуклеотиде и центральной области (10, 12, 14 позиции) критически снижали активность, тогда как остальные замены оказывали меньшее влияние (Рис. 3.14. Г).

Рисунок 3.14. Тест-система для детекции оцДНК с использованием NbaSPARDA. А - схема работы тест-системы. Б - измерение предела чувствительности SPARDA. Показаны использованные концентрации оцДНК-мишени. ЯГи - относительные единицы флуоресценции. В -чувствительность различных тест-систем. Г - влияние мисматчей на активность SPARDA. Активность нормировали относительно флуоресцентного сигнала, полученного с полностью комплементарной мишенью («С»). На графиках Б, Г показаны средние значения со стандартными отклонениями из трех независимых повторностей.

Таким образом, комплекс SPARDA можно применять в тест-системе для обнаружения ДНК. SPARDA не только обладает высокой чувствительностью,

но и позволяет обнаруживать однонуклеотидные мисматчи между гидом и мишенью.

3.10. Многораундовое расщепление субстратов комплексом NbaSPARDA

Для получения представления о том, как действует комплекс SPARDA в клетках, необходимо определить, способен ли он осуществлять многораундовый катализ (как, например, TtAgo), или он является ферментом одного оборота (как, например, аргонавты мезофильных организмов или Cas9, из-за затрудненной диссоциации продуктов реакции). Описанные выше эксперименты были сделаны в однораундовых условиях, в которых концентрация комплекса была выше концентрации коллатерального субстрата. Для многораундовой кинетики SPARDA, гид и мишень были взяты в соотношении 1:1:1, а субстрат в десятикратном избытке над ними. В качестве субстратов использовали оцДНК и оцРНК длиной 55 нуклеотидов, чтобы также выяснить, какой из них (РНК или ДНК) является более предпочтительным.

Было обнаружено, что в течение 60 минут происходит практически полное расщепление десятикратного избытка субстрата, как оцДНК так и оцРНК, что свидетельствует о том, что SPARDA является многооборотным ферментом (Рис. 3.15. А, Б). Анализ кинетики реакции показывает, что ДНК и РНК субстраты расщепляются с сопоставимой скоростью (рис. 3.15. В).

Кроме того, мы проверили зависимость активности комплекса SPARDA от его концентрации в условиях 10-ти кратного избытка субстрата. Было показано, что важной особенностью SPARDA является резкое снижение активности при концентрации комплекса ниже 100 нМ (Рис. 3.15. Г). Можно предположить, что это происходит из-за неэффективного связывания гида или мишени в этих условиях.

Рисунок 3.15. Анализ многораундового расщепления ДНК и РНК комплексом NbaSPARDA. А - кинетика расщепления оцДНК-субстрата. Показан форез разделения продуктов расщепления 5'-32Р-меченой оцДНК длиной 55 нт. Б - кинетика расщепления оцРНК-субстрата. Показан форез разделения продуктов расщепления 3,-FAM-меченой оцРНК длиной 55 нт. В - сравнение кинетики расщепления для оцДНК и оцРНК Показаны средние значения со стандартными отклонениями для трех независимых повторностей. Г - расщепление избытка субстрата (оцРНК длиной 55 нт) при разных концентрациях комплекса NbaSPARDA с РНК-гидом и ДНК-мишенью. Продукты реакции визуализировали с помощью радиочувствительного экрана (форез А) и по флуоресценции FAM (форезы Б, Г). Положение субстрата показано слева от гелей.

Так как в клетках концентрация субстрата, вероятно, гораздо выше, чем комплекса SPARDA, то эти результаты помогают лучше понять механизм активации комплекса in vivo. В отличие от длинных эукариотических и прокариотических аргонавтов (кроме термофильных белков, таких как TtAgo), высвобождение продукта не является лимитирующей стадией для SPARDA. Видимо, это определяется тем, что катализ осуществляется в DREN-домене и субстрат (в дальнейшем продукт) не удерживается за счет комплементарных взаимодействий с гидом или мишенью.

Далее будет рассмотрено, как системы NbaSPARDA и CmeSPARDA функционируют в клетках E. coli.

3.11. Активация SPARDA чужеродной плазмидой

Ранее было показано, что длинные прокариотические аргонавты способны защищать клетки от чужеродной плазмиды, вызывая ее деградацию или гибель клеток (Olovnikov et al., 2013; Swarts et al., 2014a; Swarts et al., 2015a; Kuzmenko et al., 2020; Song et al., 2023). Короткие аргонавты с белками-партнерами также могут воздействовать на клетки с чужеродной плазмидой. Расщепление NAD(P)+, приводящее к клеточной смерти в присутствии чужеродной плазмиды, было продемонстрировано для систем с короткими аргонавтами SPARSA и SPARTA (Zaremba et al., 2022; Koopal et al., 2022).

Для выяснения действия SPARDA на чужеродную плазмиду клетки E. coli штамма BL21(DE3) были трансформированы пустым вектором pBAD (empty/E, далее в тексте будет упоминаться как контроль) или плазмидой pBAD, кодирующей разные варианты SPARDA: дикий тип (WT) Cme/NbaSPARDA или мутанты NbaSPARDA по MID и DREN доменам (CD и MID), а также второй («чужеродной») плазмидой - pACYC или pCDF (Рис. 16А). Нужно отметить, что плазмиды pACYC и pCDF принадлежат к разным группам несовместимости. Плазмида pBAD несет ген устойчивости к

ампициллину (Amp), тогда как у второй плазмиды есть ген устойчивости к хлорамфениколу (Cm) или стрептомицину (Sm) (для pACYC и pCDF, соответственно). Кроме того, чтобы изучить влияние SPARDA на клетки в отсутствие чужеродной плазмиды, были получены такие же клоны без второй плазмиды (Рис. 3.16. А).

Рисунок 3.16. Анализ активации системы SPARDA в клетках E. coli в присутствии плазмид. А - схема эксперимента (empty - пустой вектор, SPARDA WT - дикий тип SPARDA, SPARDA mut - мутантные варианты SPARDA). Б - кривые роста клеток контрольной культуры и культуры, экспрессирующей комплекс NbaSPARDA (а также его мутантные варианты) в присутствии второй плазмиды pCDF (справа) и без нее (слева). В - то же самое для CmeSPARDA. Г, Д - аналогичные кривые для CmeSPARDA и NbaSPARDA в случае второй плазмиды pACYC. Empty - контроль (пустой вектор), WT - дикий тип SPARDA, MID - MID-мутант NbaSPARDA, CD -CD-мутант NbaSPARDA. На графиках представлены средние значения со стандартными отклонениями из 6 независимых повторностей.

Для отобранных одиночных и двойных трансформантов с помощью планшетного спектрофотометра были получены кривые роста при

добавлении индуктора (для экспрессии SPARDA) и ампициллина (для поддержания плазмиды pBAD, кодирующей систему SPARDA). Было выявлено, что в отсутствие второй плазмиды экспрессия комплекса NbaSPARDA дикого типа существенно замедляла рост клеток примерно после 5 часов эксперимента (Рис. 3.16. Б, слева). Этого не происходило в случае контроля и при экспрессии обоих мутантов NbaSPARDA (Рис. 3.16. Б, слева). Необходимо подчеркнуть, что в отличие от дикого типа NbaSPARDA, экспрессия дикого типа CmeSPARDA практически не влияла на рост клеток без чужеродной плазмиды (Рис. 3.16. В, слева). В присутствии второй плазмиды pCDF при экспрессии SPARDA рост клеток полностью останавливался через ~2,5 часа в случае NbaSPARDA дикого типа и через ~5 часов в случае CmeSPARDA дикого типа (Рис. 3.16. Б, В, справа). Такого не наблюдалось для мутантов NbaSPARDA или контроля (Рис 3.16. Б, справа). Похожий эффект отмечался также для плазмиды pACYC. В клетках, экспрессирующих CmeSPARDA дикого типа, рост останавливался через ~5 часов после начала эксперимента (Рис. 3.16. Г), а в случае дикого типа NbaSPARDA сильно замедлялся через ~2,5 часа (Рис. 3.16. Д), тогда как в контрольных клетках или клетках, экспрессирующих мутанты NbaSPARDA, не наблюдалось никаких отклонений (Рис. 3.16. Д).

В этих условиях было также проведено измерение количества жизнеспособных клеток со второй плазмидой pCDF или pACYC (Рис. 3.16. А). Для дикого типа и мутантов NbaSPARDA пробы клеток отбирали через ~2,5 часа после индукции, затем делали серийные разведения, после чего клетки высевали на чашки с антибиотиками - ампициллином или стрептомицином/хлорамфениколом в случае pCDF/pACYC (Рис. 3.17. А). В результате было обнаружено, что количество клеток, содержащих NbaSPARDA дикого типа и чужеродную плазмиду pCDF, сильно снижалось (в ~800 раз) относительно числа клеток, содержащих контрольную «пустую» плазмиду или мутанты NbaSPARDA и pCDF (Рис. 3.17. Б). Сходный эффект

наблюдался при выращивании клеток на среде как с ампициллином, так и со стрептомицином (Рис. 3.17. А, Б). Значимое снижение числа клеток (в ~70 раз) было показано также и в случае плазмиды pACYC (Рис. 3.17. В). Количество клеток без второй плазмиды также было снижено для дикого типа NbaSPARDA, но не мутантов NbaSPARDA, что согласуется с кривыми роста (Рис. 3.17. Б, В). Однако этот эффект был меньше, чем в присутствии второй плазмиды (снижение количества клеток относительно контроля в ~4 раза случае чашек с pCDF и в ~17 раз в случае чашек с pACYC).

Рисунок 3.17. Анализ влияния NbaSPARDA на число клеток E. coli в зависимости от наличия в клетках второй плазмиды. А - серийные разведения (указаны слева) клеток контрольной культуры (Empty) и клеток, содержащих комплекс NbaSPARDA (WT) или его мутантные варианты (CD/MID), в присутствии второй второй плазмиды или без нее. Слева представлены чашки для плазмиды pACYC, справа для pCDF. Клетки выращивали на чашках в присутствии ампициллина (сверху) или антибиотика, соответствующего второй плазмиде (снизу). Б - количество жизнеспособных клеток в клеточных культурах, экспрессирующих

NbaSPARDA (дикий тип (WT), а также мутанты по MID-домену (MID) и DREN-домену (CD)) или содержащих пустой вектор pBAD («Е»), в присутствии pCDF или без нее для обоих антибиотиков через 2,5 часа после индукции SPARDA. Указаны статистически значимые изменения (слева направо: *P = 0,0266; **P = 0,0035; ***P = 0,0002). В - то же самое для плазмиды pACYC (слева направо: *P = 0,026, **P = 0,004, ****P = 0,00004). Показаны средние значения со стандартными отклонениями из трех независимых экспериментов (аналогичных эксперименту в А). Во всех случаях статистика рассчитывалась с использованием двустороннего t-критерия для независимых выборок с поправкой Бонферрони.

Аналогичный эффект наблюдался и для CmeSPARDA. Пробы клеток были отобраны через 6 и 7 часов после индукции для pCDF и pACYC соответственно (Рис. 3.18. А). Так же, как и для NbaSPARDA, количество клеток, содержащих CmeSPARDA и вторую плазмиду, резко падало и на чашках с ампициллином, и на чашках со стрептомицином/хлорамфениколом (в ~500 и ~100 раз для pCDF и pACYC, соответственно) (Рис. 3.18. Б). Однако важно отметить, что число клеток без второй плазмиды для CmeSPARDA было лишь незначительно меньше, чем для контроля, что соотносится со значениями кривых роста (Рис. 3.18. Б). Таким образом, CmeSPARDA оказывается нетоксичной при экспрессии в клетках в отсутствие чужеродной плазмиды.

А

CmeSPARDA

pBAD pCDF

10' 10-3 103 1СГ 105 10« 10-'

Empty WT Empty WT

— + L— + — + — +

••••••••• ••••••••• ! V> ••• ••• •••

В

Nba

Nba

pBAD ° E 3 CD WT S E CD WT pCDFM" - I- - & + + +

Amp

Sm

10 kb = 3kb55

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

№ pi

CO

CmeSPARDA •CDF. Amp +pCDF. Amp +pCDF. Sm

10" Ю»

£ 10*

о

10*

К:' Mfei 10" 10" H

10' ^H 10* ^H * 10*

Empty WT Empty WT Empty WT

CmeSPARDA -pACYC Amp +pACYC. Amp »pACYC, Cm

io"i-z- 10"

Г

Cme

pCDF q 6

pBAD & E I Cme 4 E Cme

ä +

Д

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

10" 10» г. о-

I- ■.....">•■

10* ^B I 10* H H_ »ял

2±TMi — i

S pCDF >pACYC

pBAD о. E % CD WT £ CD WT i WT

Nba

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17

Empty WT Empty WT Empty WT

Рисунок 3.18. А, Б - анализ влияния CmeSPARDA на число клеток E. coli в зависимости от наличия в клетках второй плазмиды. А - серийные разведения (указаны слева) клеток контрольной культуры Empty) и клеток, содержащих CmeSPARDA (WT), в присутствии второй второй плазмиды pCDF или без нее. Клетки выращивали на чашках в присутствии ампициллина (слева) или антибиотика, соответствующего второй плазмиде (справа). Б, верхняя панель - количество жизнеспособных клеток в клеточных культурах, экспрессирующих CmeSPARDA дикого типа (WT) или содержащих пустой вектор pBAD (Empty), в присутствии pCDF или без нее для обоих антибиотиков. Указаны статистически значимые различия (слева направо: **P = 0,002, **P = 0,005, ****P = 0,00005). Б, нижняя панель - то же самое для плазмиды pACYC (слева направо: **P = 0,008, **P = 0,002, ****P = 0,000006). Представлены средние значения со стандартными отклонениями из трех независимых повторностей. Во всех случаях статистика рассчитывалась с использованием двустороннего t -критерия для

независимых выборок с поправкой Бонферрони. В-Д - анализ влияния SPARDA на деградацию плазмидной ДНК в клетках. В - анализ деградации чужеродной плазмиды через 3,5 часа роста после индукции NbaSPARDA. Положение плазмид pBAD и pCDF показано справа от геля. Деградация наблюдается только в дорожках 15 -16 (плазмидная ДНК, выделенная из клеток, экспрессирующих дикий тип NbaSPARDA и содержащих плазмиду pCDF). Г - анализ деградации плазмидной ДНК в случае CmeSPARDA через 7 часов роста после индукции. Деградация наблюдается только в дорожках 11-12 (в клетках, экспрессирующих дикий тип CmeSPARDA и содержащих плазмиду pCDF). Д - анализ деградации плазмидной ДНК для NbaSPARDA спустя 6 часов роста после индукции. Для В-Д: М - маркер длин фрагментов ДНК, WT - дикий тип NbaSPARDA, CD - мутант по DREN-домену NbaSPARDA, E - контроль (пустой вектор), Cme - дикий тип CmeSPARDA.

Хотя условия способствовали поддержанию плазмиды pBAD, кодирующей SPARDA, титр клеток для обеих протестированных систем SPARDA одинаково снижался на обоих антибиотиках, соответствующих pBAD и второй плазмиде. Следовательно, чужеродная плазмида не подвергается более сильной деградации, чем экспрессионная плазмида: происходит гибель клеток, содержащих обе плазмиды, а не избирательная элиминация чужеродной плазмиды. В совокупности эти результаты свидетельствуют о том, что в клетках с чужеродной плазмидой происходит активация системы SPARDA, вызывающая гибель или дормантное состояние клеток. Таким образом, SPARDA действует по механизму абортивной инфекции, обеспечивая иммунитет на уровне клеточной популяции.

3.12. Расщепление ДНК системой SPARDA в клетках бактерий

В экспериментах in vitro была показана способность SPARDA расщеплять плазмидную ДНК. Чтобы проверить, может ли SPARDA

осуществлять деградацию ДНК в клетках, были выделены плазмидная и геномная ДНК из клеток с чужеродной плазмидой и без нее.

В клетках, содержащих чужеродную плазмиду pCDF, плазмидная ДНК выделялась сильно деградированной, как в случае NbaSPARDA дикого типа (Рис. 3.18. В, дорожки 15-16), так и в случае CmeSPARDA дикого типа (Рис. 3.18. Г, дорожки 11-12). Этого не наблюдалось для контроля или каталитически неактивного мутанта NbaSPARDA, что говорит об участии DREN-домена в расщеплении плазмиды (Рис. 3.18. В, дорожки 11-12 и 1314). В отсутствие второй плазмиды деградации не происходит - это подтверждает, что активация комплекса SPARDA индуцируется чужеродной плазмидой (Рис. 3.18. В, дорожки 8-9; Рис. 3.18. Г, дорожки 6-7). Нужно добавить, что для NbaSPARDA отбор проб проводили на ранних стадиях роста (через 3,5 часа). Выделение плазмидной ДНК на более поздних стадиях роста (спустя 6 часов) показывает, что и в клетках без второй плазмиды, экспрессирующих дикий тип NbaSPARDA, также индуцируется деградация ДНК (Рис. 3.18. Д, дорожки 8-9). Это соответствует тому, что NbaSPARDA, но не CmeSPARDA, оказывает токсическое действие на клетки даже в отсутствие второй плазмиды.

Кроме того, было обнаружено, что помимо плазмидной ДНК, и NbaSPARDA, и CmeSPARDA также расщепляют геномную ДНК в клетках со второй плазмидой pCDF (Рис. 3.19. А, дорожки 8-9 и 17-18). При этом выделенная геномная ДНК из клеток без pCDF не подвергалась деградации (Рис. 3. 19. А, дорожки 6 -7 и 15-16).

Несмотря на то, что in vitro SPARDA расщепляет РНК-субстраты не менее эффективно, чем ДНК-субстраты, выделенная из клеток с чужеродной плазмидой тотальная РНК (рРНК) не была деградирована (Рис. 3.19. Б), независимо от присутствия второй плазмиды. Возможно, это объясняется недоступностью рРНК в клетках для расщепления комплексом SPARDA.

А

pBAD

Nba

Cme

pCDFM - + - +

kh 3 kb—

a

en

1 kb

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18

В

2-я пл. pBAD

10 kb .

M

pCDF

E CD WT E CD WT

Nba

7ч

ЗкЬ — 1 kb от

>-23S " "16S

1 2 3 4 5 6 7 8

10 11 12 13 14

pBAD

pBAD pCDF

pBADNbaSPARDA

pBAD_NbaSPARDA pCDF

pBAD pBAD pCDF pBAD_CmeSPARDA pBAD_CmeSPARDA pCDF

Рисунок 3.19. А - анализ деградации геномной ДНК в клетках, эксперссирующих SPARDA. Геномная ДНК была выделена из клеток, содержащих пустой вектор pBAD (E) или pBAD, кодирующий NbaSPARDA (Nba, дорожки 6-9) или CmeSPARDA (Cme, дорожки 15-18), в присутствии pCDF или без нее. Пробы отобраны через 4 часа 20 мин и 7 часов роста после индукции для NbaSPARDA и CmeSPARDA, соответственно. Деградация геномной ДНК наблюдается в дорожках 8-9 и 17-18 (в клетках, экспрессирующих SPARDA и содержащих pCDF). Б - анализ целостности рРНК в клетках, содержащих пустой вектор pBAD (E) или pBAD, кодирующий варианты NbaSPARDA (дикий тип (WT) и мутант по DREN -

домену (CD)). Пробы были отобраны через 7 часов роста после индукции. В - микроскопия клеток, содержащих пустой вектор (pBAD) или дикий тип SPARDA (CmeSPARDA сверху, NbaSPARDA снизу) в присутствии pCDF или без нее, окрашенных SYTO9 и йодидом пропидия. Пробы были отобраны через 5 и 7 часов после индукции для NbaSPARDA и CmeSPARDA, соответственно.

Таким образом, можно сделать вывод, что активация SPARDA чужеродной ДНК вызывает неизбирательное расщепление плазмидной и геномной ДНК в клетках.

3.13. Влияние SPARDA на целостность бактериальных клеток

Чтобы лучше понять, что происходит с клетками при активации SPARDA, была сделана микроскопия бактериальных культур в условиях, когда наблюдается токсический эффект комплекса на рост клеток при измерении кривых роста культуры. Клетки окрашивали йодидом пропидия и красителем SYTO9. Йодид пропидия окрашивает клетки с поврежденными мембранами в красный цвет, но не может проникать в интактные клетки, которые окрашиваются SYTO9 в зеленый цвет. С помощью йодида пропидия и SYTO9 были визуализированы клетки с контрольной «пустой» плазмидов, а также клетки, экспрессирующие CmeSPARDA и NbaSPARDA, содержащие или не содержащие вторую плазмиду (pCDF). Несмотря на значительное падение титров клеток, практически все они были окрашены в зеленый цвет, что указывает на отсутствие лизиса (Рис. 3.19. В). Следовательно, при активации система SPARDA может индуцировать гибель или дормантное состояние клеток, не вызывая их лизиса.

3.14. Анализ нуклеиновых кислот, ассоциированных с NbaSPARDA в клетках

При экспрессии в клетках E. coli комплекс NbaSPARDA соочищается вместе с короткими РНК длиной 14-22 нуклеотида, которые, вероятно, соответствуют гидовым молекулам, связанным in vivo (Рис. 3.20. А). Примечательно, что NbaSPARDA дикого типа и каталитически неактивный мутант достаточно прочно связаны с клеточными РНК-гидами - после трех стадий хроматографии (никель-хелатной, гепариновой и ионообменной) их можно увидеть на форезе (Рис. 3.20. А). Кроме того, соотношение оптической плотности, измеренной при 260 и 280 нм (ОД260/280), в итоговых препаратах равно 0,98 (0,82 для CD-мутанта), что свидетельствует о наличии в белковом препарате нуклеиновых кислот (Рис. 3.20. А). При этом MID-мутант уже после первой стадии хроматографии (никель-хелатной) не содержит короткие РНК (Рис. 3.20. Б), тем самым подтверждая, что мутации в MID-кармане нарушают связывание гидов. Чтобы избавиться от эндогенных РНК при анализе активности SPARDA in vitro, мы разработали модифицированный протокол очистки SPARDA, с добавлением ЭДТА во время гепариновой и анионообменной хроматографии. При этом происходит практически полная очистка белка от РНК (Рис. 3.20. В), за исключением небольшой фракции (см. рис. 3.13. А). Именно такие препараты были использованы при проведении описанных выше биохимических экспериментов.

Для исследования механизмов активации SPARDA in vivo были выделены короткие РНК, связанные с NbaSPARDA в клетках E. coli в присутствии чужеродной плазмиды pACYC, из препаратов белка, полученных после никель-хелатной хроматографии. Параллельно была получена тотальная РНК из этих клеток (три независимых повторности). После этого были сделаны библиотеки коротких РНК и тотальной РНК, затем проводилось их секвенирование и биоинформатический анализ.

Чтобы выявить возможные предпочтения SPARDA к определенным мотивам в последовательности гидовых РНК, была проанализирована относительная частота четырех нуклеотидов в каждом положении, начиная с 5'-конца гида. В построенном лого нуклеотидов наблюдается сильное предпочтение NbaSPARDA к динуклеотидам AU на 5'-конце (Рис. 3.20. Г) -такая же специфичность была продемонстрирована в экспериментах in vitro (Рис. 3.9. Б, Г). Аналогичное предпочтение было ранее выявлено у короткого аргонавта GsAgo (из бактерии Geobacter sulfurreducens) системы SPARSA и у длинных неактивных аргонавтов - AfAgo и аргонавта системы BRAN (Zaremba et al., 2022; Song et al., 2023; Manakova et al., 2024). Короткие аргонавты системы SPARTA также демонстрируют небольшую преференцию к первым двум нуклеотидам, однако не к AU, а к АА на 5'-конце (Koopal et al., 2022).

А

SPARDA WT

■Б о

га о

& о

nt м Ni X 5

50

30 26 22

16

SPARDA CD

Б О

го о

П. м Ni | |

50

30 26 22

16

I

I

SPARDA MID

■С О

го о

5- £

nt м Ni х 5

50 w_

30 а.

26 —

22 —

В

SPARDA WT

Б Я

го о

8" о

nt м Ni х 2

50

30 26 22

16

0.98

0.82

0.53

OD 260/280 0.55

Г

1.0п

О

о

¡Ü 0.54

о

Q.

m

0.0-

rAA6AuWAU

АййУеш

I I I I-1-I-I-г-I-|-I-I-1—

10 15

позиция нуклеотида

Рисунок 3.20. Анализ коротких гидовых РНК. Связанных с комплексом NbaSPARDA в клетках E. coli. А - форез нуклеиновых кислот, ассоциированных с комплексом NbaSPARDA дикого типа (WT) и с каталитическим мутантом NbaSPARDA (CD) на трех стадиях хроматографии.

Б - то же самое для MID-мутанта NbaSPARDA (MID). В - то же самое для NbaSPARDA дикого типа (WT) при добавлении ЭДТА после никель-хелатной хроматографии. Под форезами подписано соотношение оптической плотности, измеренной при 260 и 280 нм в итоговых препаратах белков. Г -лого нуклеотидов библиотек коротких РНК. Указана позиция нуклеотида относительно 5'-конца гида.

После этого гидовые РНК были картированы на плазмидные и геномные последовательности. Картирование на обе плазмиды (pBAD, экспрессирующую белок, а также pACYC) и геном (штамм MG1655) показало, что большинство прочтений коротких РНК имеют геномное происхождение (83%). Меньшая часть выравнивается на чужеродную плазмиду pACYC (1,8%) и чуть больше на pBAD (14,9%) (таблица 2). Схожая картина отмечалась при картировании для системы SPARSA (Zaremba et al., 2022).

Для тотальной РНК был получен похожий результат: на геном выравнивается 86,4% всех прочтений, на плазмиды pACYC и pBAD 3,3% и 10,3%, соответственно (таблица 2).

Чтобы посмотреть, какие гены в составе плазмид обогащены прочтениями гидовых РНК, был произведен подсчет прочтений для обеих цепей - кодирующей (+) и некодирующей (-) для каждого гена, - а также нормализация прочтений на длину гена и глубину библиотеки с использованием параметра RPKM (reads per kilobase rep million, число прочтений на 1 килобазу на 1 миллион картированных прочтений в библиотеке). Далее были построены графики распределения прочтений по генам для обеих плазмид. Для pBAD большинство ридов коротких РНК картируется на гены аргонавта и белка-партнера, небольшая часть на ген устойчивости и некодирующую цепь ориджина репликации плазмиды pBR322 (Рис. 3.21. А). В случае тотальной РНК ситуация аналогичная, кроме того, что меньше прочтений приходится на ориджин репликации pBR322 (Рис. 3.21. Б). Построение графика отношения коротких РНК к тотальной РНК показало

небольшое обогащение некодирующей цепи ориджина репликации pBR322 (Рис. 3.21. В).

Для плазмиды pACYC прочтения гидовых РНК и тотальной РНК в основном картируются на гены устойчивости к антибиотикам (Рис. 3.21. Г, Д). Отношение коротких РНК к тотальной РНК демонстрирует незначительное обогащение для гена устойчивости к тетрациклину, некодирующим областям и кодирующей цепи ориджина репликации р15А (Рис. 3.21. Е).

Рисунок 3.21. Анализ обогащения плазмидных генов гидовыми РНК по отношению к тотальной РНК в клетках E. coli. А - распределение количества прочтений коротких РНК по генам плазмиды pBAD (содержащей NbaSPARDA). Б - аналогично для бибчлиотек тотальной РНК. В - отношение количества прочтений коротких РНК к тотальной РНК для генов плазмиды pBAD (содержащей NbaSPARDA). Г, Д, Е - то же самое для плазмиды pACYC.

Схемы плазмид показаны над графиками. Во всех случаях число прочтенийнормализовано с использованием параметра ЯРКМ. Прочтения по смысловой цепи генов показаны синим цветом, по антисмысловой -оранжевым. На диаграммах представлены средние значения со страндарными отклонениями из трех независимых повторностей.

Таким образом, в отличие от системы ЗРАЕЗА (7агетЬа et а1., 2022), у NЪaSPARDA не наблюдается обогащения в области ориджина репликации чужеродной плазмиды.

Для генома анализ отношения коротких РНК к тотальной РНК показал обогащение для некоторых регуляторных РНК и некодирующих транскриптов (Рис. 3.22). При этом не наблюдалось обогащения для профагов или В-элементов. Список наиболее обогащенных генов приведен на рис. 3.22.

Рисунок 3.22. Распределение отношения количества гидовых РНК, связанных с NbaSPARDA, к тотальной РНК для генома E. coli (MG1655). Количества прочтений коротких РНК и тотальной РНК вычислены для каждого гена с

использованием значений RPKM, после чего рассчитано их отношение. На графике представлены cредние значения из трех независимых повторностей. Различными цветами показаны антисмысловые РНК (asRNA), гены IS-элементов, профагов (prophages) и тРНК (tRNA). Список генов, наиболее обогащенных гидовыми РНК по отношению к уровню РНК-транскриптов, приведен снизу

Также был построен график корреляции между количествами коротких РНК (отложены по оси у) и клеточных транскриптов (отложены по оси х) (Рис. 3.23). Коэффициент корреляции Спирмена равен 0,85, что указывает на сильную корреляцию. Нужно отметить, что транскрипты, кодируемые плазмидами, перепредставлены (отмечены для рВЛО и pACYC на Рис. 3.23).

длинные РНК, RPKM

Рисунок 3.23. Корреляция между количеством коротких гидовых РНК и тотальной РНК, выделенных их клеток E. coli, экспрессирующих NbaSPARDA и содержащих вторую плазмиду pACYC (среднее значение трех независимых повторностей). Плазмидные гены показаны фиолетовым (pBAD) и зеленым (pACYC) цветами. Регуляторные антисмысловые РНК, гены профагов и IS-

элементы показаны оранжевым, розовым и бирюзовым цветом соответственно. Количество РНК показано в RPKM.

Таким образом, NbaSPARDA предпочтительно загружается гидами из плазмид. При этом отношения количества (средние значения RPKM для всех генов) коротких РНК и тотальной РНК для плазмид и генома сравнимы (таблица 2), поэтому нельзя сказать, что в клетках происходит предпочтительный процессинг плазмидных транскриптов в гидовые РНК. Вероятно, наблюдаемое обогащение определяется многокопийностью плазмид и высоким уровнем транскрипции плазмидных генов

В целом, можно сделать вывод, что комплекс NbaSPARDA связывает гиды из высокотранскрибируемых генов. Такая же картина наблюдается для системы SPARTA, но не для SPARSA (Koopal et al., 2022; Zaremba et al., 2022). Также NbaSPARDA может иметь предпочтения к некодирующим транскриптам, так как в отсутствие трансляции они могут подвергаться расщеплению клеточными нуклеазами.

3.15. Активация SPARDA при фаговой инфекции

Роль прокариотических аргонавтов в защите клеток от бактериофагов на данный момент еще недостаточно хорошо изучена. В большинстве работ изучается действие аргонавтов на чужеродные плазмиды (Olovnikov et al., 2013; Swarts et al., 2014a; Swarts et al., 2015a; Zander et al., 2017; Kuzmenko et al., 2020; Kropocheva et al., 2021; Zaremba et al., 2022; Koopal et al., 2022; Song et al., 2023). Для длинных активных аргонавтов в настоящее время есть всего несколько исследований, демонстрирующих антифаговый эффект (Kuzmenko et al., 2020; Zeng et al., 2022; Xing et al., 2022; Lisitskaya et al., 2023). Кроме того, антифаговое действие показано для «расщепленного» аргонавта и ассоциированного эффектора из клады длинных неактивных

аргонавтов (Zeng et al., 2022). Для коротких аргонавтов защита при фаговой инфекции показана пока только для системы SPARSA, однако подробно не изучалась (Zaremba et al., 2022).

Влияние системы SPARDA на фаговую инфекцию было изучено на примере нескольких классических бактериофагов, инфицирующих E. coli, включая Р1, лямбда (X), Т5 и Р2. Были проведены эксперименты по изучению влияния системы SPARDA на кривые роста культуры, титры фага и количество жизнеспособных клеток при фаговой инфекции (Рис. 3.24. А).

Для того, чтобы проверить способность SPARDA защищать клетки от лизиса, вызванного фагами, сначала были получены кривые роста культуры клеток при низкой множественности инфекции для CmeSPARDA, NbaSPARDA и мутантов NbaSPARDA. В этом случае фаг был добавлен одновременно с разведенными из ночных культур клетками и индуктором экспрессии SPARDA. Рост культур, экспрессирующих SPARDA, сравнивался с контролем - клетками, содержащими пустой вектор. Было показано, что CmeSPARDA задерживает лизис (который выглядит как резкое падение оптической плотности культуры) для фагов лямбда (X) и P1 (Рис. 3.24. Б), а NbaSPARDA предотвращает лизис во время инфекции фагами лямбда, P1, P2 и T5 (Рис. 3.24. В). При этом клетки, экспрессирующие мутанты NbaSPARDA по DREN и MID-доменам, лизировались так же, как и контроль, что подтверждает зависимость защитного эффекта от нуклеазной активности и связывания гидов (Рис. 3.24. В). Однако при низкой множественности инфекции должно пройти несколько циклов репликации фага, прежде чем можно будет наблюдать влияние фага на рост клеток. Поэтому такой эксперимент не может дать четкого представления о механизме действия SPARDA при инфекции.

Рисунок 3.24. Анализ влияния SPARDA на фаговую инфекцию в клетках E. coli при низкой множественности инфекции. А - схема эксперимента. Б -кривые роста в отсутствие фага (слева), а также при низкой множественности инфекции (MOI, multiplicity of infection) (справа) в контрольных клетках (содержащих пустой pBAD) и в культуре клеток, экспрессирующих CmeSPARDA дикого типа. В - аналогичные кривые для культур с контролем, комплексом NbaSPARDA и его мутантными вариантами. Добавленные бактериофаги подписаны над графиками. Примерные значения множественности инфекции (MOI) указаны сверху и справа для CmeSPARDA и NbaSPARDA, соответственно. На панели Б кривые получены в штамме BL21(DE3), на панели В в штамме MG1655 Z1. Средние значения со стандартными отклонениями приведены для 4 или 5 независимых повторностей для панелей Б и В, соответственно.

Чтобы получить более ясное понимание об антифаговом эффекте SPARDA, важно проанализировать влияние на первые циклы репликации фага. Для этого был изучен рост клеток при высокой множественности

инфекции, при этом добавление фага происходило на более поздних стадиях роста, спустя 3 часа 20 минут после индукции экспрессии SPARDA. Было обнаружено, что при множественности инфекции 0,1 NbaSPARDA задерживает лизис для фага P1 и предотвращает лизис для фагов лямбда (X), T5, а также P2, а при множественности инфекции 1 задерживает лизис для фага P1 и предотвращает для X (Рис. 3.25. А, Б, В). В случае CmeSPARDA лизис задерживался при заражении фагами лямбда и P1 при обоих значениях множественности инфекции (Рис. 3.25. А, Б). Кривые роста бактериальных культур в ходе инфекции фагами Р1 и лямбда (при множественности инфекции 0,1 и 1) по сравнению с контрольными культурами отдельно суммированы на рис. 3.25. В и Г (для NbaSPARDA и CmeSPARDA, соответственно). Так как система NbaSPARDA оказывает токсичное действие на рост клеток и в отсутствие инфекции (Рис. 3.25. В), то затруднительно в полной мере установить ее влияние на бактериофаги. Вследствие этого дальнейшие эксперименты проводили с CmeSPARDA, которая не проявляет токсичности для клеток.

Рисунок 3.25. Анализ влияния SPARDA на фаговую инфекцию в клетках E. coli при высокой множественности инфекции. А - кривые роста культур, содержащих контроль (пустую pBAD), CmeSPARDA и NbaSPARDA в отсутствие фага или при множественности инфекции (MOI) равной 0,1. Б -аналогично для множественности инфекции (MOI) равной 1. Добавленные бактериофаги указаны над графиками. Время добавления бактериофага отмечено на кривой серой звездочкой (синяя звездочка показывает время отбора проб, см. ниже). Empty - контроль, Nba - NbaSPARDA, Cme -CmeSPARDA. В - Рост культур, инфицированных фагами P1 и X (MOI 0,1 или 1,0), экспрессирующих NbaSPARDA или содержащих контрольную пустую плазмиду, по сравнению с контрольными культурами, выращенными в отсутствие фагов (MOI 0). Г - то же самое для CmeSPARDA. Время

добавления фага показано красной стрелкой, а время отбора проб для определения титров фагов и количества жизнеспособных клеток показано вертикальной пунктирной линией. На всех графиках для получения кривых роста использовали штамм BL21(DE3). Во всех случаях показаны средние значения со стандартными отклонениями для 4 независимых повторностей.

В следующей серии экспериментов были проведены измерения количества жизнеспособных клеток (CFU, colony forming units) и титров фага (PFU, plaque forming units) при высокой множественности инфекции для фагов лямбда и P1. Пробы отбирали в то время, когда уже начался лизис в контрольной культуре, но не в культуре клеток, экспрессирующих CmeSPARDA. Время добавления фага отмечено красной стрелкой, а время отбора проб пунктирной вертикальной линией на рис. 3.25. Г. В отсутствие фага количество жизнеспособных клеток было практически одинаково в контрольной культуре и в культуре с CmeSPARDA (Рис. 3.26. А), что подтверждает нетоксичность CmeSPARDA. При этом во время фаговой инфекции CmeSPARDA значительно увеличивала количество жизнеспособных клеток относительно контроля - в ~10 и ~100 раз для фагов P1 и лямбда (А) соответственно (Рис. 3.26. А). Одновременно с этим в клетках с CmeSPARDA был снижен титр фага P1 в 10 раз, однако титр фага лямбда был сопоставим с контролем (Рис. 3.26. Б).

Рисунок 3.26. Влияние CmeSPARDA на число клеток и титры фага при инфекции. А - количество жизнеспособных клеток (в случае контроля (-) и CmeSPARDA (Cme)) в отсутствие фага и при инфекции фагами лямбда и P1. **P = 0,0014; ***P = 0,00056. Б - титры фагов P1 и лямбда в клетках с контролем (-) или в клетках, экспрессирующих CmeSPARDA (Cme). ***P = 0.00082. В - анализ эффективности образования бляшек фагов P1, X и T5 на чашках с клетками E. coli, экспрессирующими CmeSPARDA (справа) или содержащими контрольную пустую плазмиду (слева). Серийные разведения фаговых стоков указаны слева. Г - титры фагов из эксперимента панели В. ****P = 0,000056. На всех графиках приведены средние значения со стандартными отклонениями из 4 независимых повторностей. Во всех случаях статистика была рассчитана с использованием двустороннего t-критерия для независимых выборок с поправкой Бонферрони.

Для CmeSPARDA также был сделан эксперимент по анализу эффективности образования бляшек (EOP, efficiency of plating) для фагов P1,

X и T5 (Рис. 3.26. В). В этом эксперименте на чашку с бактериальной культурой, экспрессирующей систему SPARDA, раскапывали 10-кратные разведения бактериофага и определяли максимальное разведение, при котором еще наблюдается образование бляшек. Было обнаружено, что при экспрессии CmeSPARDA титр фага лямбда резко падает: наблюдалось снижение в ~1000 раз относительно контроля (Рис. 3.26. Г). В случае фагов P1 и T5 эффект отсутствовал. Стоит отметить, что проверка NbaSPARDA в таком эксперименте невозможна, так как из-за токсичности для клеток на чашке не происходит образование газона.

В совокупности результаты убедительно показывают, что при заражении клеток бактериофагами лямбда и P1 система SPARDA активируется и, вероятно, препятствует репликации фага, что приводит к предотвращению или задержке лизиса. Различия в эффектах для фагов лямбда и P1 в экспериментах по эффективности образования бляшек и определению титров фагов, скорее всего, связаны с различиями в том, как развивается инфекция в жидкой культуре и на чашках с агаром. Таким образом, можно заключить, что SPARDA способна обеспечивать защиту клеток от бактериофагов. Точный механизм активации SPARDA пока остается неизвестен, но можно предположить, что, как и в случае плазмид, при фаговой инфекции происходит активная загрузка SPARDA гидовыми РНК, образующимися из фаговых транскриптов, а затем предпочтительное узнавание фаговой ДНК, которая присутствует клетках в большом числе копий.

3.16. Антифаговый эффект при кооперации long-A аргонавта AmAgo и нуклеазы Agap-HEPN

Анализ активности системы SPARDA в клетках E. coli показал, что эта система активируется в присутствии в клетках многокопийных элементов -плазмид или бактериофагов. Вероятно, они являются источником гидовых

РНК и одновременно многокопийными мишенями для активации комплексов. Этот механизм существенно отличается от предполагаемых механизмом действия изученных ранее каталитически активных аргонавтов. В настоящий момент способность защищать клетки от фагов продемонстрирована только для аргонавтов из клады long-A, которые являются ДНК-гид-зависимыми ДНК-нуклеазами (Kuzmenko et al., 2020; Lisitskaya et al., 2023). Хотя известны каталитически активные аргонавты, которые, как и SPARDA связывают РНК-гиды и узнают ДНК-мишени (Kaya et al., 2016), их активность in vivo не исследовалась.

Для того, чтобы понять, способны ли длинные активные аргонавты, имеющие ту же специфичность, что и SPARDA (связывающие РНК-гиды и расщепляющие ДНК -мишени), проявлять антифаговую активность в клетках бактерий, мы решили исследовать недавно открытый в нашей лаборатории аргонавт AmAgo из бактерии Alteromonas macleodii - один из представителей ранее неизученной подклады, относящейся к long-A аргонавтам (Рис. 3.27.

А).

5' НО-® 3'

Iffnt target DNA

Рисунок 3.27. Белок AmAgo, ассоциированный с нуклеазой Agap -HEPN. А -филогенетическое дерево длинных аргонавтов группы long-A. Ранее исследованные клады аргонавтов, имеющих разную специфичность к гидам

и мишеням, показаны разными цветами: темно-серый - ДНК-гиды и ДНК-мишени (DNA > DNA); зеленый - ДНК-гиды и РНК -мишени (DNA > RNA); оранжевый - РНК-гиды и ДНК-мишени (RNA > DNA). Клада, содержащшая AmAgo, показана малиновым цветом (AmAgo group). По внешнему кругу обозначено наличие предсказанной каталитической активности у соответствующих длинных аргонавтов (фиолетовый - есть активность; красный - нет активности из-за замен в каталитическом центре). Во втором круге обозначены различные варианты MID -кармана, участвующего в связывании гида. Под деревом схематично показано расположение генов Agap-HEPN и AmAgo в геноме A. macleodii. Как и в случае SPARDA, гены перекрываются на 4 нуклеотида. Б - схема нуклеазной реакции, катализируемой аргонавтом AmAgo. Показаны РНК-гид (guide RNA), ДНК-мишень (target DNA) и место разрезания.

Белки этой группы содержат каталитические остатки в домене PIWI, но отличаются измененным MID-карманом, вследствие чего они могут обладать необычными свойствами. Необходимо отметить, что в геномах последовательности всех аргонавтов данной группы перекрываются с прежде неизвестным белком, названным Agap (pAgo-associated protein). В экспериментах сотрудников лаборатории было показано, что в системе in vitro AmAgo является активным аргонавтом, связывающим РНК-гиды с аденином и гидроксильной группой на 5 '-конце и разрезающим ДНК-мишени (Рис. 3.27. Б), а Agap представляет собой РНКазу, принадлежащую к суперсемейству HEPN (Higher Eukaryotes and Prokaryotes Nucleotide-binding). HEPN нуклеазы расщепляют РНК-субстраты с образованием гидроксила на 5'-конце и фосфата на З'-конце. Было обнаружено, что Agap-HEPN специфично расщепляет РНК между остатками гуанина и аденина с образованием фрагментов с 5'-концевым аденином и OH-группой - как раз такие гиды AmAgo связывает in vitro. Кроме того, было показано, что белок Agap-HEPN необходим для образования гидов, связываемых AmAgo в клетках E. coli, в то

время как нуклеазная активность самого AmAgo для этого не требуется. Из этого можно сделать вывод, что Agap-HEPN в клетках генерирует РНК-гиды для AmAgo.

Задачей наших экспериментов была проверка антифаговой активности аргонавта AmAgo и белка Agap-HEPN в условиях, аналогичных тем, в которых была исследована активности системы SPARDA. Для экспериментов с бактериофагами были получены культуры, содержащие AmAgo вместе с Agap-HEPN, их мутанты по каталитическим остаткам, а также AmAgo без Agap-HEPN (Рис. 3.28. А). В качестве контроля использовали клетки с пустым вектором. Следует отметить, что AmAgo и Agap-HEPN вместе или AmAgo отдельно не оказывают токсичного влияния на рост культуры (Рис. 3.28. Б, левый график). Как и в случае SPARDA, тестовые кривые роста клеток, полученные при низкой множественности инфекции, показали, что экспрессия AmAgo и Agap-HEPN защищает культуру E. coli от лизиса при инфекции фагами лямбда и Р1. Эти два фага были выбраны для дальнейшего детального исследования при высокой множественности инфекции.

Аналогично экспериментам для SPARDA, при высокой множественности инфекции фаг добавляли через 3 часа 20 минут после индукции экспрессии аргонавта. Полученные кривые роста показали, что совместная экспрессия AmAgo c Agap-HEPN задерживала лизис клеток для фагов P1 и лямбда (в случае Р1 при множественности инфекции равной 0,1 и 1; в случае лямбда при множественности инфекции равной 0,1 и 0,01) (Рис. 3.28. Б). Однако такой же эффект наблюдался при экспрессии каталитически неактивного мутанта AmAgo вместе с Agap-HEPN. Из этого следует, что нуклеазная активность AmAgo не является необходимой для защиты от фагов (Рис. 3.28. Б). В то же время, для каталитического мутанта Agap-HEPN или для AmAgo без Agap-HEPN лизис культуры происходил так же, как и в контроле с пустой плазмидой (Рис. 3.28. Б), что свидетельствует о ключевой роли Agap-HEPN в антифаговом эффекте. Однако в отсутствие

полноразмерного аргонавта Agap-HEPN не оказывал антифагового действия (Рис. 3.28. Б). Таким образом, для антифаговой активности важны и AmAgo и Agap-HEPN.

Рисунок 3.28. Анализ антифаговой активности AmAgo. А - схемы генетических конструкций, используемых для экспрессии AmAgo и Agap -HEPN. Контрольный штамм содержал пустую плазмиду («none»). Позиции аминокислотных замен в каталитических мутантах dAmAgo и dAgap показаны черными полосками. Б - кривые роста культур, содержащих пустую плазмиду или различные сочетания AmAgo с Agap -HEPN (см. А). Бактериофаги и множественность инфекции (MOI) подписаны над графиками. Время отбора проб для определения титров фагов, числа жизнеспособных клеток и микроскопии обозначено вертикальными пунктирными линиями для соответствующих графиков. Представлены средние значения со стандартными отклонениями из 3 -5 независимых повторностей. В - титры для фага P1 (при множественности инфекции 0,1) и фага лямбда (при множественности инфекции 0,01), измеренные через 10 часов после начала роста культуры. Г - количество жизнеспособных клеток в тех же условиях и в контрольной культуре без фагов. Показаны средние значения со стандартными отклонениями для 3 -5 независимых повторностей.

Статистически значимые различия показаны звездочками (*P<0,05; **P< 0,01). Статистика рассчитывалась с использованием двустороннего t-критерия для независимых выборок.

Титры фагов (PFU) и количество жизнеспособных клеток (CFU) были измерены для контроля, а также культур, экспрессирующих AmAgo и Agap-HEPN или каталитический мутант AmAgo и Agap-HEPN. Пробы отбирали в то время, когда в контрольной культуре по кривым роста наблюдалось завершение лизиса (отмечено вертикальной пунктирной линией, Рис. 3.28. Б). Было обнаружено, что как в клетках с экспрессией AmAgo и Agap-HEPN, так и в клетках с экспрессией неактивного мутанта AmAgo и Agap-HEPN происходило снижение титров для обоих фагов (в ~40-50 и ~1000 раз для P1 и лямбда соответственно), а также увеличение количества жизнеспособных клеток в ~100 раз (и для лямбда, и для P1) (Рис. 3.28. В, Г). Важно добавить, что в отсутствие фага количество клеток в пробах было сравнимым. Это подтверждает то, что AmAgo и Agap-HEPN сами по себе не воздействуют на клетки.

В случае фага P1 с отобранными пробами была также сделана микроскопия. Визуализация клеток с использованием SYTO9 и йодида пропидия показала, что в пробах с контролем практически все клетки были окрашены в красный цвет вследствие лизиса, тогда как в пробах с AmAgo и Agap-HEPN или каталитическим мутантом AmAgo и Agap-HEPN, подавляющая часть клеток имела зеленую окраску (Рис. 3.29).

контроль АтАдо Адар (¿АтАдо Адар

•ч

О

О

■ч

»н

о.

2.2 ±1.9% 93.5 ±2.1% 92.5 ±1.5%

Рисунок 3.29. Защита клеток от фаг-индуцированного лизиса белками AmAgo и Agap-HEPN. Контрольная культура или культуры клеток, экспрессирующих AmAgo или dAmAgo вместе с Agap-HEPN (подписано вверху рисунка) были окрашены красителем SYTO9 и йодидом пропидия через 10 часов после начала роста культуры либо в отсутствие фагов, либо во время заражения фагом Р1 (подписано слева от рисунка). Процент живых (окрашенных в зеленый цвет) клеток в культурах, инфицированных фагом, показан внизу (средние значения и стандартные отклонения получены из трех биологических повторностей).

Таким образом, можно подвести итог, что длинный активный аргонавт AmAgo, действуя совместно с РНКазой Agap-HEPN, как и SPARDA защищает клетки при инфекции фагами лямбда и P1. При этом нуклеазная активность AmAgo не является критически важной, а нуклеазная активность Agap-HEPN является необходимой для антифагового действия. По -видимому, Agap-HEPN необходим для генерации РНК -гидов, которые связываются AmAgo и обеспечивают узнавание целевой фаговой ДНК. При этом в случае мутаций в нуклеазном центре аргонавта антифаговый эффект

потенциально может достигаться за счет связывания аргонавта с геномом фага после загрузки соответствующих гидов, даже без расщепления фагового генома.

3.17. Заключение

В данной работе был исследован новый тип бактериальных защитных систем, состоящих из коротких белков-аргонавтов и их белков-партнеров. Основными объектами исследований послужили короткие аргонавты NbaAgo и CmeAgo, закодированные в одном опероне с ранее не изученным белком-партнером DUF4365-APAZ. Было установлено, что домен DUF4365 обладает ДНКазной и РНКазной активностью, вследствие чего он был назван DREN. Было показано формирование стабильного комплекса короткого аргонавта и DREN-APAZ, который был назван нами SPARDA. В отличие от длинных активных аргонавтов, которые разрезают комплементарные гидам мишени, в системе SPARDA функция аргонавта заключается в активации белка-партнера DREN-APAZ, который расщепляет коллатеральный субстрат. Это было подтверждено с помощью мутаций в активном центре домена DREN и гид-связывающем кармане аргонавта: CD-мутант был полностью неактивен, а у MID-мутанта происходило резкое падение активности. Как для CmeSPARDA, так и для NbaSPARDA проявление неспецифической коллатеральной активности комплекса происходит только при связывании аргонавтом РНК-гида и комплементарной ему ДНК-мишени. SPARDA имеет широкую субстратную специфичность и может эффективно расщеплять оцДНК, оцРНК, дцДНК, плазмидную ДНК и РНК-ДНК дуплекс. SPARDA является многооборотным ферментом, осуществляющим расщепление субстратов в физиологическом диапазоне pH и температуры, используя магний или марганец в качестве кофакторов.

При гетерологичной экспрессии в E. coli, комплекс SPARDA активируется в присутствии чужеродной плазмиды, индуцируя гибель или

дормантное состояние клеток, тем самым защищая бактериальную популяцию по механизму абортивной инфекции. Было обнаружено, что при активации в клетках SPARDA неизбирательно деградирует плазмидную и геномную ДНК, но не влияет на целостность рРНК. При этом в отличие от некоторых других систем абортивной инфекции (Lopatina et al., 2020), SPARDA не повреждает клеточную мембрану, действуя иным способом. В клетках с чужеродной плазмидой SPARDA связывает короткие РНК, которые содержат динуклеотид AU на 5'-конце, но не имеет других нуклеотидных предпочтений. Хотя биоинформатический анализ не показал предпочтений к гидовым РНК из плазмиды, была выявлена сильная корреляция между уровнем транскрипции генов и связыванием соответствующих гидовых РНК комплексом SPARDA. Это может обеспечивать активацию комплекса за счет высокого уровня экспрессии плазмидных генов и наличия многих копий плазмиды-мишени в клетках (см. ниже).

При заражении клеток бактериофагами лямбда (X) или P1 SPARDA задерживает или предотвращает лизис в жидкой культуре, снижая число вирусных частиц и увеличивая количество жизнеспособных клеток. Предотвращение лизиса было также показано в экспериментах по эффективности образования бляшек для фага лямбда. Вероятно, как и в случае плазмидной ДНК, при развитии фаговой инфекции и накоплении фаговых транскриптов и фаговых геномов может происходить активация комплекса SPARDA с последующим расщеплением фаговой и геномной ДНК. Исследование детальных механизмов антифаговой защиты с системой SPARDA является важной задачей дальнейших исследований.

Похожие антифаговые эффекты были продемонстрированы для длинного активного аргонавта AmAgo, закодированного с РНКазой Agap-HEPN. Как и SPARDA, AmAgo является специфичным к РНК-гидам и ДНК-мишеням. И так же как и SPARDA, AmAgo вместе с Agap-HEPN существенно замедляет лизис культуры клеток во время инфекции фагами лямбда и P1,

вызывая значительное снижение титров для обоих фагов. Более того, было показано, что AmAgo и Agap-HEPN напрямую защищают клетки от разрушения фагом, увеличивая число клеток с интактной мембраной. Хотя механизмы действия SPARDA и AmAgo c Agap-HEPN различаются, вероятно, что обе системы обеспечивают антифаговую защиту клеток путем ингибирования репликации фага.

В дальнейшем еще предстоит детально изучить причины активации SPARDA. Однако можно предположить, что при попадании в клетку чужеродной ДНК - плазмиды или бактериофага, SPARDA связывает образующиеся транскрипты и после связывания мишени начинает расщепление ДНК и, возможно, РНК, связывая новые образующиеся фрагменты и продолжая деградацию, что приводит к смерти или состоянию покоя клетки (Рис. 3.30).

Рисунок 3.30. Предположительный механизм действия SPARDA в клетках E. coli. См. комментарии в тексте.

Вероятно, высокий уровень транскрипции и большое количество копий плазмиды или фага будет способствовать распознаванию ДНК-мишени, тогда как в случае хромосомных генов низкое число мишеней (в сочетании с невысокими уровнями экспрессии SPARDA) не будет активировать

комплекс. Аналогичный механизм активации можно предположить для белка AmAgo, но существенным отличием в этом случае является то, что происходит расщепление специфических ДНК-мишеней, комплементарных РНК-гидам.

Интересно, что, несмотря на разные механизмы действия и активации системы SPARDA и системы AmAgo-Agap-HEPN, в обоих случаях важное значение для обеспечения антифагового иммунитета имеет закодированный рядом с аргонавтом белок, который обладает нуклеазной активностью. В случае SPARDA нуклеаза DREN участвует в неспецифическом расщеплении ДНК, а в случае аргонавта AmAgo нуклеаза Agap-HEPN, по-видимому, необходима для образования гидов, связываемых аргонавтом. При этом, несмотря на наличие у аргонавта AmAgo полноценного нуклеазного центра, каталитический мутант AmAgo сохраняет антифаговое действие. Таким образом, само по себе узнавание ДНК-мишени при связывании специфичных гидов AmAgo, видимо, способно останавливать развитие фаговой инфекции. Проверка этой гипотезы требует дальнейших исследований.

В то время как AmAgo сохраняет антифаговую активность при мутациях в нуклеазном центре, короткий аргонавт из системы SPARDA, который исходно лишен нуклеазной активности, не обладает антифаговым действием при инактивации эффекторного DREN-домена. Можно предположить, что эволюция защитных систем, состоящих из коротких белков-аргонавтов и белков-партнеров, была направлена на отбор систем, обеспечивающих активацию различных эффекторных доменов при узнавании многокопийных мишеней, и подавление неспецифической активности самих аргонавтов, обусловленной их связыванием с ДНК.

Можно заключить, что SPARDA является новой иммунной системой прокариот, в которой нуклеазная активность белка-партнера высвобождается при гид-зависимом узнавании чужеродной ДНК -мишени. Используя эту особенность, мы показали возможность применения SPARDA в тест-системе для обнаружения ДНК с высокой чувствительностью. Таким образом,

SPARDA не только углубляет наше понимание прокариотических защитных систем, но и позволяет создавать новые инструменты для биотехнологии.

148 ВЫВОДЫ

1. SPARDA является иммунной системой бактерий, состоящей из короткого белка-аргонавта и белка DREN-APAZ, имеющего нуклеазную активность.

2. Короткие аргонавты CmeAgo и NbaAgo исследованных систем SPARDA образуют гетеродимерные комплексы с белками-партнерами. При связывании РНК-гида и ДНК-мишени происходит активация комплекса и высвобождение коллатеральной нуклеазной активности DREN-домена.

3. При активации комплекс SPARDA неспецифически расщепляет ДНК и РНК-субстраты различной структуры, осуществляя многораундовую реакцию. Наибольшая активность SPARDA наблюдается в присутствии ионов магния или марганца при температуре 25-40оС.

4. С использованием SPARDA разработана тест-система для обнаружения ДНК. Предел чувствительности метода достигает 150 пМ оцДНК, что сравнимо с тест-системами на основе Cas12/Cas13.

5. Наличие чужеродной плазмиды в клетках индуцирует активацию SPARDA, что приводит к неизбирательному расщеплению ДНК и гибели или дормантному состоянию клетки, обеспечивая защиту бактериальной популяции по механизму абортивной инфекции.

6. Комплекс SPARDA связывает в клетках E. coli короткие гидовые РНК, соответствующие высоко транскрибируемым генам, в том числе, плазмидного происхождения.

7. SPARDA способна задерживать или предотвращать лизис клеток E. coli при инфекции фагами лямбда (А) и P1. Экспрессия SPARDA снижает титры фагов и увеличивает количество жизнеспособных клеток.

8. Длинный активный аргонавт AmAgo, имеющий сходную со SPARDA специфичность к РНК-гидам и ДНК-мишеням, обладает антифаговой активностью, для проявления которой необходима нуклеаза-партнер Agap-HEPN, кодируемая совместно с аргонавтом.

149

БЛАГОДАРНОСТИ

Автор выражает огромную благодарность своему научному руководителю Андрею Владимировичу Кульбачинскому за ценные советы, конструктивные и мотивирующие обсуждения, а также за постоянную поддержку во время работы и при написании диссертации. Автор чрезвычайно признателен Марии Андреевне Простовой за обучение большому количеству методов, многочисленные научные дискуссии, полезные замечания и всестороннюю помощь на протяжении выполнения работы. Автор искренне благодарен Лидии Александровне Лисицкой за подробные объяснения различных методик и моральную поддержку, а также Владимиру Александровичу Пантелееву за значительную помощь в работе с бактериофагами. Автор признателен Дарье Михайловне Есюниной за неизменное участие в обсуждениях и консультации, а также Николаю Николаевичу Случанко за неоднократное совместное проведение экспериментов по гель-фильтрации. Автор благодарит всех сотрудников лаборатории иммунных систем прокариот за доброжелательное отношение и дружескую атмосферу.

150

4. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Andersen P.R., Tirian L., Vunjak M., Brennecke J. A heterochromatin-dependent transcription machinery drives piRNA expression // Nature. 2017. V. 549. № 7670. P. 54-59.

2. Aravin A.A., Hannon G.J., Brennecke J. The Piwi-piRNA pathway provides an adaptive defense in the transposon arms race // Science. 2007. V. 318. № 5851. P. 761-764.

3. Aravin A.A., Sachidanandam R., Bourc'his D., Schaefer C., Pezic D., Toth K.F., Bestor T., Hannon G.J. A piRNA pathway primed by individual transposons is linked to de novo DNA methylation in mice // Mol Cell. 2008. V. 31. № 6. P. 785799.

4. Bartel D.P. Metazoan MicroRNAs // Cell. 2018. V. 173. № 1. P. 20-51.

5. Bastiaanssen C., Bobadilla Ugarte P., Kim K., Finocchio G., Feng Y., Anzelon T.A., Köstlbacher S., Tamarit D., Ettema T.J.G., Jinek M., MacRae I.J., Joo C., Swarts D.C., Wu F. RNA-guided RNA silencing by an Asgard archaeal Argonaute // Nat Commun. 2024. V. 15. P. 5499.

6. Bell S.D., Botting C.H., Wardleworth B.N., Jackson S.P., White M.F. The interaction of Alba, a conserved archaeal chromatin protein, with Sir2 and its regulation by acetylation // Science. 2002. V. 296. № 5565. P. 148-151.

7. Bernstein E., Caudy A.A., Hammond S.M., Hannon G.J. Role for a bidentate ribonuclease in the initiation step of RNA interference // Nature. 2001. V. 409. № 6818. P. 363-366.

8. Bhattacharjee S., Roche B., Martienssen R.A. RNA-induced initiation of transcriptional silencing (RITS) complex structure and function // RNA Biol. 2019. V. 16. № 9. P. 1133-1146.

9. Blesa A., César C.E., Averhoff B., Berenguer J. Noncanonical cell-to-cell DNA transfer in Thermus spp. is insensitive to argonaute-mediated interference // J

Bacteriol. 2015. V. 197. № 1. P. 138-146.

10. Blevins T., Rajeswaran R., Aregger M., Borah B.K., Schepetilnikov M., Baerlocher L., Farinelli L., Meins F., Hohn T., Pooggin M.M. Massive production of small RNAs from a non-coding region of Cauliflower mosaic virus in plant defense and viral counter-defense // Nucleic Acids Res. 2011. V. 39. № 12. P. 50035014.

11. Bohmert K., Camus I., Bellini C., Bouchez D., Caboche M., Benning C. AGO1 defines a novel locus of Arabidopsis controlling leaf development. // EMBO J. 1998. V. 17. № 1. P. 170-180.

12. Boualem A., Dogimont C., Bendahmane A. The battle for survival between viruses and their host plants // Curr Opin Virol. 2016. V. 17. P. 32-38.

13. Bourges A.C., Torres Montaguth O.E., Tadesse W., Labesse G., Aertsen A., Royer C.A., Declerck N. An oligomeric switch controls the Mrr-induced SOS response in E. coli // DNA Repair (Amst). 2021. V. 97. P. 103009.

14. Bravo J.P.K., Ramos D.A., Fregoso Ocampo R., Ingram C., Taylor D.W. Plasmid targeting and destruction by the DdmDE bacterial defence system // Nature. 2024. V. 630. № 8018. P. 961-967.

15. Brennecke J., Aravin A.A., Stark A., Dus M., Kellis M., Sachidanandam R., Hannon G.J. Discrete small RNA-generating loci as master regulators of transposon activity in Drosophila // Cell. 2007. V. 128. № 6. P. 1089-1103.

16. Burroughs A.M., Iyer L.M., Aravind L. Two novel PIWI families: roles in inter-genomic conflicts in bacteria and Mediator-dependent modulation of transcription in eukaryotes // Biol Direct. 2013. V. 8. P. 13.

17. Carthew R.W., Sontheimer E.J. Origins and Mechanisms of miRNAs and siRNAs // Cell. 2009. V. 136. № 4. P. 642-655.

18. Catalanotto C., Azzalin G., Macino G., Cogoni C. Gene silencing in worms and fungi // Nature. 2000. V. 404. № 6775. P. 245.

19. Claycomb J.M. Ancient endo-siRNA pathways reveal new tricks // Curr Biol. 2014. V. 24. № 15. P. 703-715.

20. Dmytrenko O., Neumann G.C., Hallmark T., Keiser D.J., Crowley V.M., Vialetto E., Mougiakos I., Wandera K.G., Domgaard H., Weber J., Gaudin T., Metcalf J., Gray B.N., Begemann M.B., Jackson R.N., Beisel C.L. Cas12a2 elicits abortive infection through RNA-triggered destruction of dsDNA // Nature. 2023. V. 613. № 7944. P. 588-594.

21. Dodds P.N., Rathjen J.P. Plant immunity: towards an integrated view of plant-pathogen interactions // Nat Rev Genet. 2010. V. 11. № 8. P. 539-548.

22. Doxzen K.W., Doudna J.A. DNA recognition by an RNA-guided bacterial Argonaute // PLoS One. 2017. V. 12. № 5. P. e0177097.

23. Elkayam E., Kuhn C.-D., Tocilj A., Haase A.D., Greene E.M., Hannon G.J., Joshua-Tor L. The structure of human argonaute-2 in complex with miR-20a // Cell. 2012. V. 150. № 1. P. 100-110.

24. Faehnle C.R., Elkayam E., Haase A.D., Hannon G.J., Joshua-Tor L. The making of a slicer: activation of human Argonaute-1 // Cell Rep. 2013. V. 3. № 6. P. 19011909.

25. Fang X., Qi Y. RNAi in Plants: An Argonaute-Centered View // Plant Cell. 2016. V. 28. № 2. P. 272-285.

26. Finocchio G., Koopal B., Potocnik A., Heijstek C., Westphal A.H., Jinek M., Swarts D.C. Target DNA-dependent activation mechanism of the prokaryotic immune system SPARTA // Nucleic Acids Res. 2024. V. 52. № 4. P. 2012-2029.

27. Fire A., Xu S., Montgomery M.K., Kostas S.A., Driver S.E., Mello C.C. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans // Nature. 1998. V. 391. № 6669. P. 806-811.

28. Frank F., Sonenberg N., Nagar B. Structural basis for 5'-nucleotide base-specific recognition of guide RNA by human AGO2 // Nature. 2010. V. 465. № 7299. P.

818-822.

29. Gao M., Wei W., Li M.-M., et al. Ago2 facilitates Rad51 recruitment and DNA double-strand break repair by homologous recombination // Cell Res. 2014. V. 24. № 5. P. 532-541.

30. Garb J., Lopatina A., Bernheim A., Zaremba M., Siksnys V., Melamed S., Leavitt A., Millman A., Amitai G., Sorek R. Multiple phage resistance systems inhibit infection via SIR2-dependent NAD+ depletion // Nat Microbiol. 2022. V. 7. № 11. P. 1849-1856.

31. Gay N.J., Symmons M.F., Gangloff M., Bryant C.E. Assembly and localization of Toll-like receptor signalling complexes // Nat Rev Immunol. 2014. V. 14. № 8. P. 546-558.

32. Gerdts J., Brace E.J., Sasaki Y., DiAntonio A., Milbrandt J. SARM1 activation triggers axon degeneration locally via NAD+ destruction // Science. 2015. V. 348. № 6233. P. 453-457.

33. Ghildiyal M., Seitz H., Horwich M.D., Li C., Du T., Lee S., Xu J., Kittler E.L.W., Zapp M.L., Weng Z., Zamore P.D. Endogenous siRNAs derived from transposons and mRNAs in Drosophila somatic cells // Science. 2008. V. 320. № 5879. P. 10771081.

34. Golovinas E., Rutkauskas D., Manakova E., Jankunec M., Silanskas A., Sasnauskas G., Zaremba M. Prokaryotic Argonaute from Archaeoglobus fulgidus interacts with DNA as a homodimer // Sci Rep. 2021. V. 11. № 1. P. 4518.

35. Gootenberg J.S., Abudayyeh O.O., Lee J.W., et al. Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2 // Science. 2017. V. 356. № 6336. P. 438-442.

36. Guo H., Ingolia N.T., Weissman J.S., Bartel D.P. Mammalian microRNAs predominantly act to decrease target mRNA levels // Nature. 2010. V. 466. № 7308. P. 835-840.

37. Hammond S.M., Bernstein E., Beach D., Hannon G.J. An RNA-directed

nuclease mediates post-transcriptional gene silencing in Drosophila cells // Nature. 2000. V. 404. № 6775. P. 293-296.

38. Hickman A.B., Li Y., Mathew S.V., May E.W., Craig N.L., Dyda F. Unexpected structural diversity in DNA recombination: the restriction endonuclease connection // Mol Cell. 2000. V. 5. № 6. P. 1025-1034.

39. Horsefield S., Burdett H., Zhang X., et al. NAD+ cleavage activity by animal and plant TIR domains in cell death pathways // Science. 2019. V. 365. № 6455. P. 793-799.

40. Hutvagner G., Zamore P.D. A microRNA in a multiple-turnover RNAi enzyme complex // Science. 2002. V. 297. № 5589. P. 2056-2060.

41. Imai S., Armstrong C.M., Kaeberlein M., Guarente L. Transcriptional silencing and longevity protein Sir2 is an NAD-dependent histone deacetylase // Nature. 2000. V. 403. № 6771. P. 795-800.

42. Jolly S.M., Gainetdinov I., Jouravleva K., Zhang H., Strittmatter L., Bailey S.M., Hendricks G.M., Dhabaria A., Ueberheide B., Zamore P.D. Thermus thermophilus Argonaute Functions in the Completion of DNA Replication // Cell. 2020. V. 182. № 6. P. 1545- 1559.e18.

43. Joshua-Tor L. The Argonautes // Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 2006. V. 71. P. 67-72.

44. Kalia M., Willkomm S., Claussen J.C., Restle T., Bonvin A.M.J.J. Novel Insights into Guide RNA 5'-Nucleoside/Tide Binding by Human Argonaute 2 // Int J Mol Sci. 2015. V. 17. № 1. P. 22.

45. Kawamata T., Tomari Y. Making RISC // Trends Biochem Sci. 2010. V. 35. № 7. P. 368-376.

46. Kawamura Y., Saito K., Kin T., Ono Y., Asai K., Sunohara T., Okada T.N., Siomi M.C., Siomi H. Drosophila endogenous small RNAs bind to Argonaute 2 in somatic cells // Nature. 2008. V. 453. № 7196. P. 793-797.

47. Kawaoka S., Izumi N., Katsuma S., Tomari Y. 3' end formation of PIWI-interacting RNAs in vitro // Mol Cell. 2011. V. 43. № 6. P. 1015-1022.

48. Kaya E., Doxzen K.W., Knoll K.R., Wilson R.C., Strutt S.C., Kranzusch P.J., Doudna J.A. A bacterial Argonaute with noncanonical guide RNA specificity // Proc Natl Acad Sci U S A. 2016. V. 113. № 15. P. 4057-4062.

49. Kim S.-Y., Jung Y., Lim D. Argonaute system of Kordia jejudonensis is a heterodimeric nucleic acid-guided nuclease // Biochem Biophys Res Commun. 2020. V. 525. № 3. P. 755-758.

50. Koonin E.V., Makarova K.S., Wolf Y.I. Evolutionary Genomics of Defense Systems in Archaea and Bacteria // Annu Rev Microbiol. 2017. V. 71. P. 233-261.

51. Koopal B., Mutte S.K., Swarts D.C. A long look at short prokaryotic Argonautes // Trends Cell Biol. 2023. V. 33. № 7. P. 605-618.

52. Koopal B., Potocnik A., Mutte S.K., Aparicio-Maldonado C., Lindhoud S., Vervoort J.J.M., Brouns S.J.J., Swarts D.C. Short prokaryotic Argonaute systems trigger cell death upon detection of invading DNA // Cell. 2022. V. 185. № 9. P. 1471- 1486.e19.

53. Kropocheva E., Kuzmenko A., Aravin A.A., Esyunina D., Kulbachinskiy A. A programmable pAgo nuclease with universal guide and target specificity from the mesophilic bacterium Kurthia massiliensis // Nucleic Acids Res. 2021. V. 49. № 7. P. 4054-4065.

54. Kuhn C.-D., Joshua-Tor L. Eukaryotic Argonautes come into focus // Trends Biochem Sci. 2013. V. 38. № 5. P. 263-271.

55. Kuzmenko A., Oguienko A., Esyunina D., Yudin D., Petrova M., Kudinova A., Maslova O., Ninova M., Ryazansky S., Leach D., Aravin A.A., Kulbachinskiy A. DNA targeting and interference by a bacterial Argonaute nuclease // Nature. 2020. V. 587. № 7835. P. 632-637.

56. Kuzmenko A., Yudin D., Ryazansky S., Kulbachinskiy A., Aravin A.A.

Programmable DNA cleavage by Ago nucleases from mesophilic bacteria Clostridium butyricum and Limnothrix rosea // Nucleic Acids Res. 2019. V. 47. № 11. P. 5822-5836.

57. Lee K.Z., Mechikoff M.A., Kikla A., Liu A., Pandolfi P., Fitzgerald K., Gimble F.S., Solomon K.V. NgAgo possesses guided DNA nicking activity // Nucleic Acids Res. 2021. V. 49. № 17. P. 9926-9937.

58. Li F., Wang A. RNA-Targeted Antiviral Immunity: More Than Just RNA Silencing // Trends Microbiol. 2019. V. 27. № 9. P. 792-805.

59. Lisch D. Regulation of transposable elements in maize // Curr Opin Plant Biol. 2012. V. 15. № 5. P. 511-516.

60. Lisitskaya L., Aravin A.A., Kulbachinskiy A. DNA interference and beyond: structure and functions of prokaryotic Argonaute proteins // Nat Commun. 2018. V. 9. № 1. P. 5165.

61. Lisitskaya L., Kropocheva E., Agapov A., Prostova M., Panteleev V., Yudin D., Ryazansky S., Kuzmenko A., Aravin A.A., Esyunina D., Kulbachinskiy A. Bacterial Argonaute nucleases reveal different modes of DNA targeting in vitro and in vivo // Nucleic Acids Res. 2023. V. 51. № 10. P. 5106-5124.

62. Lisitskaya L., Shin Y., Agapov A., Olina A., Kropocheva E., Ryazansky S., Aravin A.A., Esyunina D., Murakami K.S., Kulbachinskiy A. Programmable RNA targeting by bacterial Argonaute nucleases with unconventional guide binding and cleavage specificity // Nat Commun. 2022. V. 13. № 1. P. 4624.

63. Liu J., Carmell M.A., Rivas F.V., Marsden C.G., Thomson J.M., Song J.-J., Hammond S.M., Joshua-Tor L., Hannon G.J. Argonaute2 is the catalytic engine of mammalian RNAi // Science. 2004. V. 305. № 5689. P. 1437-1441.

64. Liu Y., Esyunina D., Olovnikov I., Teplova M., Kulbachinskiy A., Aravin A.A., Patel D.J. Accommodation of Helical Imperfections in Rhodobacter sphaeroides Argonaute Ternary Complexes with Guide RNA and Target DNA // Cell Rep. 2018.

V. 24. № 2. P. 453-462.

65. Loeff L., Adams D.W., Chanez C., Stutzmann S., Righi L., Blokesch M., Jinek M. Molecular mechanism of plasmid elimination by the DdmDE defense system // Science. 2024. V. 385. № 6705. P. 188-194.

66. Lopatina A., Tal N., Sorek R. Abortive Infection: Bacterial Suicide as an Antiviral Immune Strategy // Annu Rev Virol. 2020. V. 7. № 1. P. 371-384.

67. Lu X., Xiao J., Wang L., Zhu B., Huang F. The nuclease-associated short prokaryotic Argonaute system nonspecifically degrades DNA upon activation by target recognition // Nucleic Acids Res. 2024. V. 52. № 2. P. 844-855.

68. Ma Q., Wood T.K. Protein acetylation in prokaryotes increases stress resistance // Biochem Biophys Res Commun. 2011. V. 410. № 4. P. 846-851.

69. MacRae I.J., Ma E., Zhou M., Robinson C.V., Doudna J.A. In vitro reconstitution of the human RISC-loading complex // Proceedings of the National Academy of Sciences. 2008. V. 105. № 2. P. 512-517.

70. Makarova K.S., Aravind L., Wolf Y.I., Koonin E.V. Unification of Cas protein families and a simple scenario for the origin and evolution of CRISPR-Cas systems // Biology Direct. 2011. V. 6. № 1. P. 38.

71. Makarova K.S., Wolf Y.I., Oost J. van der, Koonin E.V. Prokaryotic homologs of Argonaute proteins are predicted to function as key components of a novel system of defense against mobile genetic elements // Biol Direct. 2009. V. 4. P. 29.

72. Manakova E., Golovinas E., Poceviciüte R., Sasnauskas G., Silanskas A., Rutkauskas D., Jankunec M., Zagorskaite E., Jurgelaitis E., Grybauskas A., Venclovas C., Zaremba M. The missing part: the Archaeoglobus fulgidus Argonaute forms a functional heterodimer with an N-L1-L2 domain protein // Nucleic Acids Res. 2024. V. 52. № 5. P. 2530-2545.

73. Middleton C.L., Parker J.L., Richard D.J., White M.F., Bond C.S. Substrate recognition and catalysis by the Holliday junction resolving enzyme Hje // Nucleic

Acids Res. 2004. V. 32. № 18. P. 5442-5451.

74. Miyoshi T., Ito K., Murakami R., Uchiumi T. Structural basis for the recognition of guide RNA and target DNA heteroduplex by Argonaute // Nat Commun. 2016. V. 7. P. 11846.

75. Montgomery T.A., Howell M.D., Cuperus J.T., Li D., Hansen J.E., Alexander A.L., Chapman E.J., Fahlgren N., Allen E., Carrington J.C. Specificity of ARGONAUTE7-miR390 interaction and dual functionality in TAS3 trans-acting siRNA formation // Cell. 2008. V. 133. № 1. P. 128-141.

76. Nakanishi K., Ascano M., Gogakos T., Ishibe-Murakami S., Serganov A.A., Briskin D., Morozov P., Tuschl T., Patel D.J. Eukaryote-specific insertion elements control human ARGONAUTE slicer activity // Cell Rep. 2013. V. 3. № 6. P. 18931900.

77. Nakanishi K., Weinberg D.E., Bartel D.P., Patel D.J. Structure of yeast Argonaute with guide RNA // Nature. 2012. V. 486. № 7403. P. 368-374.

78. Oberdoerffer P., Michan S., McVay M., et al. DNA damage-induced alterations in chromatin contribute to genomic integrity and age-related changes in gene expression // Cell. 2008. V. 135. № 5. P. 907-918.

79. Ofir G., Herbst E., Baroz M., Cohen D., Millman A., Doron S., Tal N., Malheiro D.B.A., Malitsky S., Amitai G., Sorek R. Antiviral activity of bacterial TIR domains via immune signalling molecules // Nature. 2021. V. 600. № 7887. P. 116-120.

80. Olina A., Agapov A., Yudin D., Sutormin D., Galivondzhyan A., Kuzmenko A., Severinov K., Aravin A.A., Kulbachinskiy A. Bacterial Argonaute Proteins Aid Cell Division in the Presence of Topoisomerase Inhibitors in Escherichia coli // Microbiol Spectr. 2023. V. 11. № 3. P. e0414622.

81. Olina A., Kuzmenko A., Ninova M., Aravin A.A., Kulbachinskiy A., Esyunina D. Genome-wide DNA sampling by Ago nuclease from the cyanobacterium Synechococcus elongatus // RNA Biol. 2020. V. 17. № 5. P. 677-688.

82. Olovnikov I., Chan K., Sachidanandam R., Newman D.K., Aravin A.A. Bacterial argonaute samples the transcriptome to identify foreign DNA // Mol Cell. 2013. V. 51. № 5. P. 594-605.