Исследование новых программируемых нуклеаз из семейства бактериальных белков-Аргонавтов тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, кандидат наук Кропочева Екатерина Вадимовна

• Кропочева Екатерина Вадимовна
• кандидат наук
• 2023

Оглавление диссертации кандидат наук Кропочева Екатерина Вадимовна

Список сокращений

1 Введение

1.1 Актуальность

1.2 Цель и задачи

1.3 Научная новизна и значимость работы

1.4 Методология и методы исследования

1.5 Положения, выносимые на защиту

1.6 Апробация работы

1.7 Личное участие автора в проведении исследований

1.8 Структура и объем работы

2 Обзор литературы

2.1 История открытия белков-Аргонавтов. Роль в РНК-интерференции у эукариот

2.2 Распространение белков-Аргонавтов среди прокариот, разнообразие доменного строения, организация оперонов

2.3 Нуклеазная активность прокариотических Aргонавтов

2.4 Функции Аргонавтов в клетках бактерий

2.5 Возможные области применения Аргонавтов в качестве нуклеаз

2.6 Заключение

3. Материалы и методы

3.1. Методы работы с бактериальными культурами

3.1.1 Бактериальные штаммы

3.1.2 Питательные среды и антибиотики

3.1.3 Определение оптической плотности бактериальных культур

3.1.4 Получение компетентных клеток

3.1.5 Трансформация E. coli

3.2. Методы работы с НК

3.2.1 Выделение плазмидной ДНК

3.2.2 Секвенирование генетических конструкций

3.2.3 Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

3.2.4 Электрофоретическое разделение ДНК в агарозном геле

3.2.5 Выделение фрагментов ДНК из агарозного геля

3.2.6 Сборка генетических конструкций

3.2.7 Электрофоретическое разделение НК в полиакриламидном геле

3.2.8 Выделение фрагментов ДНК из полиакриламидного геля

3.2.9 Переосаждение НК

3.3 Получение рекомбинантных плазмид

3.3.1 Получение плазмиды pET28b-KmaAgo и ее варианта с заменами

3.3.2 Получение плазмиды pET28b-RslAgo

3.3.3 Получение плазмиды pBAD-EmaAgo

3.4 Методы работы с белками

3.4.1 Электрофорез белков в денатурирующем геле по Лэммли

3.5 Выделение и очистка рекомбинантных белков-Аргонавтов

3.5.1 Получение очищенного препарата белка KmaAgo

3.5.2 Получение очищенного препарата белка RslAgo

3.5.3 Получение очищенного препарата белка EmaAgo

3.6 Изучение нуклеазной активности белков-Аргонавтов

3.6.1 Расщепление однонитевых НК

3.6.2 Расщепление дцДНК с помощью KmaAgo

3.6.3 Расщепление структурированной РНК с помощью KmaAgo

3.7 Анализ роста клеток

3.8 Изучение влияния KmaAgo на поддержание плазмид в клетках E. coli

3.9 Изучение ассоциированных с KmaAgo коротких нуклеиновых кислот

3.9.1 Выделение ассоциированных с KmaAgo нуклеиновых кислот из клеток E. coli

3.9.2 Приготовление библиотек коротких нуклеиновых кислот для секвенирования

3.9.3 Биоинформатический анализ коротких ДНК, ассоциированных с KmaAgo

4 Результаты и обсуждение

4.1 Выбор белков-Аргонавтов для исследования

4.2 Выделение и очистка белков-Аргонавтов из клеток E. coli

4.3 Изучение нуклеазной активности белков-Аргонавтов по отношению к одноцепочечным мишеням

4.3.1 Определение специфичности белков-Аргонавтов по отношению к ДНК- и РНК-гидам и мишеням

4.3.2 Определение оптимальных условий реакции разрезания оцДНК с помощью KmaAgo

4.3.3 Определение оптимальных параметров гидовой ДНК для KmaAgo

4.3.4 Изучение влияния мисматчей между гидом и мишенью на эффективность разрезания мишени KmaAgo

4.3.5 Многораундное расщепление оцДНК Аргонавтом KmaAgo

4.4 Расщепление двуцепочечной суперскрученной ДНК с помощью KmaAgo

4.5 Расщепление структурированной РНК с помощью KmaAgo

4.6 Влияние экспрессии KmaAgo на рост культуры клеток E. coli

4.7 Влияние KmaAgo на поддержание плазмид в клетках E. coli

4.8 Анализ ассоциированных с KmaAgo нуклеиновых кислот в клетках E. coli

5 Выводы

Список литературы

Приложение

Список сокращений

ДДТ - дитиотрейтол

ДМСО - диметилсульфоксид

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

дцДНК - двухцепочечная ДНК

ИПТГ - изопропил^^-1-тиогалактопиранозид

мРНК - матричная РНК

НАД+ - никотинамиддинуклеотид

НК - нуклеиновая кислота

нт - нуклеотид

оцДНК - одноцепочечная ДНК

пн - пара нуклеотидов

ПЦР - полимеразная цепная реакция

РНК - рибонуклеиновая кислота

ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота

AaAgo - Аргонавт из Aquifex aeolicus

AfAgo - Аргонавт из Archaeoglobus fulgidus

CbAgo - Аргонат из Clostridium butyricum

CRISPR - короткие палиндромные повторы, регулярно расположенные группами

EmaAgo - Аргонавт из Exiguobacterium marinum

HEPES - 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновая кислота

KmaAgo - Аргонавт из Kurthia massiliensis

MjAgo - Аргонавт из Methanocaldococcus jannaschii

MpAgo - Аргонавт из Marinitoga piezophila

NgAgo - Аргонавт из Natronobacterium gregoryi

PfAgo - Аргонавт из Pyrococcus furiosus

PIPES - пиперазин-Ы,№-бис(2-этансульфоновая кислота)

PMSF- фенилметилсульфонил фторид

RslAgo - Аргонавт из Runella slithyformis

TtAgo - Аргонавт из Thermus thermophilus

1 Введение

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Исследование новых программируемых нуклеаз из семейства бактериальных белков-Аргонавтов»

1.1 Актуальность

Белки-Аргонавты составляют крупное семейство гид-специфических эндонуклеаз. Наиболее полно они изучены в эукариотических организмах, где являются важным компонентом систем РНК-интерференции, эпигенетической регуляции и других процессов. В комплексе с гидовой РНК эти белки способны распознавать комплементарные РНК-мишени и расщеплять их или привлекать дополнительные белковые факторы. Белки-Аргонавты, как правило, включают четыре домена: N-концевой домен, PAZ, MID и PIWI. Способность Аргонавтов к расщеплению нуклеиновых кислот определяется наличием каталитических аминокислотных остатков в активном центре домена PIWI.

Также белки-Аргонавты обнаружены в геномах бактерий и архей. Разнообразие прокариотических Аргонавтов гораздо выше, чем эукариотических, однако на данный момент охарактеризовано лишь несколько представителей. Они способны связывать гидовые нуклеиновые кислоты и вносить разрывы в комплементарные им мишени в строго определенном месте, то есть являются сайт-специфическими программируемыми нуклеазами и потенциальными перспективными инструментами генетической инженерии. Большинство описанных прокариотических Аргонавтов предпочтительно использует 5'-фосфорилированный ДНК-гид для разрезания ДНК-мишени, также существуют белки, предпочитающие в качестве гидовой нуклеиновой кислоты РНК без фосфата на 5'-конце. Пока остается неизвестным, насколько строго специфичны

Аргонавты прокариот к ДНК и могут ли какие-то из них узнавать и разрезать РНК-мишени. Физиологическая роль Аргонавтов в клетках прокариот на данный момент остается невыясненной. Предполагается, что они, подобно своим эукариотическим гомологам, могут принимать участие в защите клетки от чужеродных нуклеиновых кислот, прежде всего, плазмид и фагов. Исследование структурно-функционального разнообразия белков семейства Аргонавтов у прокариот важно для понимания механизмов их работы in vitro и в клетках бактерий и архей, а также может привести к открытию новых вариантов программируемых нуклеаз с различной активностью и специфичностью.

Можно надеяться, что сравнение особенностей расщепления нуклеиновых кислот различными Аргонавтами позволит найти интересные варианты этих белков с новыми свойства in vitro и in vivo, в том числе, способные расщеплять не только ДНК, но и РНК. Следует отметить, что с практической точки зрения белки-Аргонавты могут обладать некоторыми преимуществами по сравнению с Cas-нуклеазами, в том числе, они имеют меньший размер, не требуют наличия в мишени специальных мотивов для узнавания и используют более короткие гидовые молекулы. В качестве объектов изучения в данной работе мы отобрали ряд белков-Аргонавтов мезофильных бактерий, имеющих полную каталитическую тетраду в домене PIWI и, таким образом, потенциально обладающих нуклеазной активностью. Способность Аргонавтов из мезофильных микроорганизмов функционировать в диапазоне температур, физиологичном для клеток эукариот, позволяет рассматривать их в качестве потенциального инструмента для манипулирования генетической информацией в живых клетках. Детальное

исследование биохимических характеристик и специфичности новых белков-Аргонавтов является важным шагом в этом направлении.

1.2 Цель и задачи

Цель исследования: изучить функциональную активность новых белков-Аргонавтов из мезофильных бактерий и найти белки, способные к расщеплению как ДНК-, так и РНК-мишеней.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Получить очищенные препараты белков-Аргонавтов из шести видов мезофильных бактерий с помощью гетерологической экспрессии в клетках E. coll.

2. Определить специфичность Аргонавтов к гидовым нуклеиновым кислотам и нуклеиновым кислотам-мишеням и выявить белки, способные расщеплять как ДНК, так и РНК.

3. Установить оптимальные параметры для расщепления ДНК и РНК белками-Аргонавтами, обладающими широкой специфичностью.

4. Изучить специфичность действия исследуемых белков-Аргонавтов в гетерологической системе E. coll.

1.3 Научная новизна и значимость работы

В работе впервые охарактеризованы шесть белков-Аргонавтов из мезофильных прокариотических организмов. Показано, что четыре Аргонавта являются ДНК-зависимыми ДНК-нуклеазами, один - ДНК-зависимой РНК-нуклеазой, а Аргонавт из бактерии Kurthia massiliensis (KmaAgo) способен использовать как ДНК, так и

РНК-гиды для разрезания ДНК- и РНК-мишеней. Температурный оптимум активности KmaAgo находится в диапазоне 42-55° С, максимальная активность наблюдается в случае ДНК-гидов и ДНК-мишеней. Оптимальная длина гидов для данного Аргонавта составляет 16-20 нт, фосфорилирование гида по 5'-концу увеличивает скорость и точность разрезания мишени. Показано, что однонуклеотидные мисматчи по-разному влияют на эффективность реакции в зависимости от природы гида и мишени; в случае ДНК-гидов и мишеней наибольшее снижение скорости реакции наблюдается при внесении мисматчей в 3'-половину гида. При использовании гидов, направленным к двум цепям, KmaAgo способен разрезать плазмидную ДНК. При разрезании высокоструктурированной РНК KmaAgo наиболее активен в одноцепочечных участках. В клетках E. coli KmaAgo связывается с короткими ДНК без предпочтения к определенным участкам генома и не оказывает влияния на поддержание плазмид в изученных условиях. Таким образом, KmaAgo является уникальным вариантом белка-Аргонавта, который обладает универсальной специфичностью к ДНК и РНК и способен разрезать как однонитевые, так и двунитевые мишени с высокой специфичностью.

1.4 Методология и методы исследования

Для изучения белков-Аргонавтов в системе in vitro последовательности их генов были амплифицированы с помощью ПЦР и встроены в векторные плазмиды для экспрессии в гетерологической системе E. coli. Посредством химической трансформации этими плазмидами клеток кишечной палочки были получены

штаммы, экспрессирующие целевые белки. Далее они были очищены с помощью хроматографии в несколько стадий. Препараты белков использовали для изучения нуклеазной активности Аргонавтов in vitro, инкубируя Аргонавты с синтетическими олигонуклеотидами-гидами и мишенями, в качестве которых использовали синтетические олигонуклеотиды, плазмиды или высокоструктурированную РНК. Для анализа продуктов расщепления использовали метод электрофореза в полиакриламидном или агарозном геле. Для изучения нуклеиновых кислот, ассоциированных с Аргонавтом в клетках E. coli, их выделяли методом фенол-хлороформной экстракции и анализировали методом электрофореза в денатурирующем полиакриламидном геле. Спектр связанных с Аргонавтом коротких ДНК анализировали с помощью высокопроизводительного секвенирования. Влияние Аргонавта на поддержание плазмид изучали с помощью выращивания штаммов кишечной палочки, содержащих или не содержащих KmAgo, на питательных средах с маркерными антибиотиками.

1.5 Положения, выносимые на защиту

1. Белки-Аргонавты EmaAgo, MaeAgo, CmiAgo, CepAgo являются ДНК-зависимыми ДНК-нуклеазами, RslAgo - ДНК-зависимая РНК-нуклеаза, а KmaAgo обладает универсальной специфичностью и может использовать в качестве гида и мишени как ДНК, так и РНК.

2. Наибольшая активность белка-Аргонавта KmaAgo наблюдается в случае ДНК-гидов и мишеней в присутствии Mn2+ в качестве кофактора, в диапазоне температур от 37 до 65 °C.

3. KmAgo предпочтительно использует 5'-фосфорилированные гиды длиной 16-20 нт. Однонуклеотидные мисматчи между гидом и мишенью могут снижать скорость реакции и изменять точку расщепления.

4. KmaAgo способен расщеплять плазмидную ДНК с использованием пар гидов, направленных к противоположным цепям.

5. Эффективность расщепления РНК KmaAgo зависит от ее вторичной структуры и снижается в двунитевых участках.

6. При экспрессии KmaAgo в клетках E. coli он связывается с короткими ДНК без выраженной специфичности к определенным участкам генома. Экспрессия KmaAgo не вызывает потери плазмид в клетках E. coli.

1.6 Апробация работы

Результаты работы опубликованы в 3 статьях в рецензируемых научных журналах:

1. Kropocheva, E., Kuzmenko, A., Aravin, A. A., Esyunina, D., and Kulbachinskiy, A. A programmable pAgo nuclease with universal guide and target specificity from the mesophilic bacterium Kurthia massiliensis // Nucleic acids research. - 2021. - V. 49. -№7. - С. 4054-4065.

2. Lisitskaya L, Shin Y, Agapov A, Olina A, Kropocheva E, Ryazansky S, Aravin AA, Esyunina D, Murakami KS, Kulbachinskiy A. Programmable RNA targeting by bacterial Argonaute nucleases with unconventional guide binding and cleavage specificity // Nat Commun. - 2022. - V. 13. - №1. - С. 4624.

3. Кропочева Е.В., Лисицкая Л.А., Агапов А.А., Мусабиров А.А., Кульбачинский А.В., Есюнина Д.М. Прокариотические белки-аргонавты как инструмент биотехнологии // Молекулярная биология. - 2022. - V. 56. - №6. - С. 915-936.

а также представлены на 9 международных конференциях:

1. Kropocheva, E., Esyunina, D., Aravin, A., Kulbachinskiy, A. Various modes of nucleic acid processing by mesophilic bacterial Argonaute proteins//FEBS Open Bio. -2019. - V. 9. - №. S1. - С. Art. No. P. 10-010.

2. Кропочева, Е.В., Есюнина, Д.М., Аравин, А.А., Кульбачинский, А.В. Необычная субстратная специфичность белка-Аргонавта из мезофильной бактерии// II объединенный научный форум: VI съезд физиологов СНГ, VI съезд биохимиков России, IX российский симпозиум «Белки и пептиды» (Сочи, 1-6 октября 2019). Научные труды. Acta Naturae. Спецвыпуск. Т. 2. - С. 32.

3. Кропочева, Е.В., Есюнина, Д.М., Аравин, А.А., Кульбачинский, А.В. Выделение белка-аргонавта из Runella slithyformis и исследование его каталитической активности// Тезисы докладов VIII международной школы молодых ученых по молекулярной генетике «Генетическая организация и молекулярные механизмы функционирования живых систем», 19-23 ноября 2018, Москва - Звенигород. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. Спецвыпуск. 2019. T.37

4. Kuzmenko, А., Yudin, D., Olina, A., Kropocheva, E., Lisitskaya, L., Oguienko, A., Esyunina, D., Ryazansky, S., Kulbachinskiy, A., Aravin, A. Programmable DNA and RNA processing by prokaryotic Argonaute proteins// 84th Symposium: RNA control and regulation, May 29 - June 3, 2019, Cold Spring Harbor, NY, USA.

5. Кузьменко А.В., Юдин Д.А., Кропочева Е.В., Лисицкая Л.А., Олина А.В., Огиенко А.Д., Кудинова А.Г., Петрова М.А., Рязанский С.С., Есюнина Д.М., Аравин А.А., Кульбачинский А.В. ДНК-интерференция и белки-аргонавты в клетках бактерий // II объединенный научный форум: VI съезд физиологов СНГ, VI

съезд биохимиков России, IX российский симпозиум «Белки и пептиды» (Сочи, Дагомыс, 1-6 октября 2019). Научные труды. Acta Naturae. Спецвыпуск. Т. 2. - С. 9.

6. Kropocheva, E., Oguienko, A., Kudinova, A., Petrova, M., Ryazansky, S., Aravin, A., Kulbachinskiy, A. Functional activities of DNA-guided and RNA-guided bacterial Argonaute proteins //FEBS Open Bio. - 2018. - V. 8. - №. S1. - С. Art. No. P. 01-074.

7. Кропочева, Е.В., Олина, А.В., Кузьменко, А.В., Аравин, А.А., Кульбачинский, А.В. Исследование нуклеазной активности белка-Аргонавта из мезофильной бактерии Kurthia massiliensis//Гены и клетки. - 2018. - №2 Материалы Международного конгресса CRISPR-2018, C. 71-72

8. Кузьменко, А.В., Юдин, Д.А., Кропочева, Е.В., Олина, А.В., Котов, А.А., Рязанский, С.С., Есюнина, Д.М., Аравин, А.А., Кульбачинский А.В. Бактериальные белки-Аргонавты как потенциальный инструмент для редактирования геномов//Гены и клетки. - 2018. - №2 Материалы Международного конгресса CRISPR-2018, C. 39

9. Кропочева Е.В., Лисицкая Л.А., Кузьменко А.В., Аравин А.А., Есюнина Д.М., Кульбачинский А.В. Активность ДНК-зависимых ДНК-нуклеаз из семейства Аргонавтов в системе in vitro // III объединенный научный форум: VII съезд физиологов СНГ, VII съезд биохимиков России, X российский симпозиум «Белки и пептиды» (Сочи 3-8 октября 2021). Научные труды. Т. 2. - С. 36.

1.7 Личное участие автора в проведении исследований

Все ключевые эксперименты: создание генно-инженерных конструкций для экспрессии белков KmaAgo, RslAgo, EmaAgo в клетках кишечной палочки, подбор условий и хроматографическая очистка белков, изучение нуклеазной активности белков-Аргонавтов, подбор оптимальных условий для расщепления одноцепочечных ДНК и РНК, плазмидной ДНК и структурированной РНК

Аргонавтом KmaAgo, анализ влияния экспресси KmaAgo на рост клеток кишечной палочки и поддержание плазмид, выделение коротких нуклеиновых кислот, ассоциированных с KmaAgo в клетках кишечной палочки и подготовка библиотек для высокопроизводительного секвенирования. Также автор принимал участие в подготовку и редактирование научных публикаций по теме диссертации. Препараты очищенных белков MaeAgo, CmiAgo и CepAgo были получены сотрудниками Лаборатории биологии РНК и эпигенетики НИЦ «Курчатовский институт» - ИМГ Лисицкой Л.А. и Кузьменко А.В. Биоинформатический анализ данных секвенирования библиотек коротких ДНК был проведен Кузьменко А.В., а также сотрудником Лаборатории биохимической генетики животных НИЦ «Курчатовский институт» - ИМГ Рязанским С.С.

1.8 Структура и объем работы

Диссертационная работа включает следующие разделы: Введение, Обзор литературы, Материалы и методы, Результаты и обсуждение, Заключение, Выводы. Работа изложена на 156 странцах, содержит 24 рисунка. Список литературы содержит 108 источников.

2 Обзор литературы

2.1 История открытия белков-Аргонавтов. Роль в РНК-интерференции у эукариот

Аргонавты - семейство программируемых нуклеаз, обнаруженное как у эукариот, так и у прокариот. Изначально Аргонавты были описаны как компоненты системы РНК-интерференции эукариотических организмов. РНК-интерференция -это процесс подавления экспрессии генов с помощью малых РНК. Изучение РНК-интерференции началось в 1990х годах, когда было обнаружено, что при внедрении в растительный организм нескольких гомологичных генетических конструкций может происходить снижение их экспрессии. Растения табака последовательно трансформировали двумя векторами, в которых гены устойчивости к канамицину и гигромицину содержались под одинаковым промотором. При этом часть растений теряли устойчивость к первому антибиотику за счет метилирования промотора гена устойчивости (Matzke et э1., 1989). Сходный эффект был обнаружен при трансформации табака конструкцией, содержащей ген Р-глюкуронидазы. В эксперименте были получены растения с высоким и низким уровнем экспрессии фермента. Обнаружилось, что растения с низким уровнем экспрессии содержат две или более копии трансгена, и уровень метилирования этих генетических конструкций выше, чем в случае единственной копии гена у растений с высоким уровнем экспрессии (Hobbs et э1., 1990). При внедрении в геном дополнительного гена халконсинтазы с целью усилить интенсивность антоциановой окраски цветков петуньи исследователи получили обратный эффект

- цветки генетически-модифицированных растений потеряли окраску или приобрели белые пятна. Было показано, что исчезновение антоциановой окраски связано со снижением количества мРНК, кодирующейся геномом растения, так и геном, внедренным в ходе эксперимента. Для описания эффекта подавления экспрессии гена при увеличении количества его копий был предложен термин «ко-супрессия» (Napoli et al., 1990; Van Der Krol et al., 1990).

В 1992 году сходный эффект был обнаружен у красной хлебной плесени (Neurospora crassa). При трансформации клеток этого организма генетическими конструкциями, содержащими фрагменты генов синтеза красных пигментов каротиноидов, наблюдалось ослабление или исчезновение окраски. Мицелий с нарушениями окраски имел сниженное количество мРНК соответствующего гена. В ходе культивирования некоторые трансформанты возвращались к исходной окраске за счет потери части искусственно введенных копий гена. Исследователи назвали это явление инактивации экспрессии генов при трансформации гомологичными последовательностями «подавлением» («quelling»). Отличие от «ко-супрессии» заключается в том, что внедренные конструкции не обязательно должны были транскрибироваться (Romano and Macino, 1992).

Известно, что растения, зараженные вирусной инфекцией, приобретают устойчивость к близкородственным штаммам вируса. На заре генной инженерии растений было выдвинуто предположение, что эффект перекрестной защиты можно воспроизвести, внедрив один из вирусных генов в геном растения. И действительно, в 1986 году было получено растение табака, несущее ген капсидного белка вируса табачной мозаики и устойчивое к этому вирусу (Abel et

al., 1986; Lindbo and Falk, 2017). При изучении приобретения устойчивости растений к вирусу гравировки табака (Tobacco etch virus, TEV) было показано, что внедрение нетранслируемой версии гена (с тремя стоп-кодонами, следующими сразу после старт-кодона) также приводит к приобретению устойчивости. Это означает, что для приобретения устойчивости необязательно наличие вирусного белка. При попадании вируса в организм трансгенных растений происходило снижение уровня мРНК капсидного белка вируса, в то время как уровень транскрипции оставался неизменным. Это наблюдение позволило авторам предположить, что существует некий механизм направленного разрушения мРНК в цитоплазме клеток (Lindbo et al., 1993).

В 1995 была предложена модель, объясняющая замалчивание генов в описанных экспериментах. Согласно предположению авторов, основным действующим фактором являются короткие РНК. Эти РНК формируют двунитевые участки с целевой мРНК и, тем самым, привлекают неизвестный белковый «Фактор №2» к мРНК. После этого мРНК расщепляется за счет нуклеазной активности «Фактора №2». Затем направляющая малая РНК освобождается и может вступать в следующий акт узнавания и расщепления целевой РНК. При этом длина гидовой РНК должна быть не меньше 10 нуклеотидов для обеспечения специфичности, но ненамного больше 20, чтобы сохранялась способность к связыванию и диссоциации при взаимодействии с целевыми РНК (Dougherty and Parks, 1995).

Исследования на модельном организме - нематоде Caenorhabditis elegans -позволили лучше понять механизмы замалчивания генов. В 1993 году было

обнаружено, что продукт гена lin4 - короткая РНК - комплементарна участкам 3'-нетранслируемой области гена lin14 и подавляет экспрессию белка LIN14. Регуляция количества белка с помощью короткой РНК позволяет обеспечить его работу на конкретном этапе развития нематоды (Lee et al., 1993; Wightman et al., 1993). Позже была открыта другая мишень lin4, а затем вторая регуляторная малая РНК, задействованная в регуляции развития нематоды - let. Так была обнаружена система посттранскрипционной регуляции экспрессии генов с помощью эндогенных коротких регуляторных РНК (Ambros et al., 2003; Mondol and Pasquinelli, 2012).

В 1995 году была опубликована работа по исследованию функции гена par-1, участвующего в регуляции деления зиготы у нематоды. Для получения червей с пониженным содержанием белка PAR-1 авторы статьи использовали инъекцию антисмысловой РНК в C. elegans. Эта процедура действительно вызывала снижение активности гена par-1. Однако, в контрольном эксперименте с использованием смысловой РНК неожиданно для исследователей также проявлялся эффект замалчивания гена (Guo and Kemphues, 1995). Методика снижения активности гена с помощью антисмысловых и смысловых РНК получила название РНК-интерференция (РНКи) (Rocheleau et al., 1997).

Чтобы объяснить одинаковый эффект при внедрении антисмысловых и смысловых РНК в опыте Guo and Kemphues, исследователи предположили, что в использованных в опыте препаратах РНК содержались короткие двунитевые участки. Такие участки могли получаться из-за неидеальной работы РНК-полимеразы, используемой для получения РНК in vitro. В более ранних

исследованиях при транскрипции с конструкций, встроенных в геном, также могли получаться непродолжительные участки двунитевой РНК. Чтобы проверить эту гипотезу, исследователи сделали инъекции очищенных препаратов смысловой и антисмысловой РНК, а также двуцепочечной РНК в организм нематоды. Эти фрагменты соответствовали гену unc-22, отвечающему за нормальное функционирование мышц у нематоды. В случае отключения этого гена поперечнополосатая мускулатура червя развивается неправильно, что можно наблюдать по нарушению двигательной активности. Введение одноцепочечной РНК не давало значительного результата, в то время как двуцепочечная РНК вызывала эффективное замалчивание гена unc-22 даже в очень низких концентрациях. РНК-интерференция, вызванная двуцепочечной РНК, сопровождалась падением количества мРНК, соответствующей этому гену. Этот эффект мог быть вызван как снижением транскрипции этого гена, так и разрушением уже синтезированной мРНК. Чтобы разобраться в этом вопросе, исследователи внедрили в клетки нематоды двуцепочечные РНК, соответствующие интронам или промоторным областям целевого гена. Эти манипуляции не привели к эффективному подавлению активности гена, что позволило сделать вывод о том, что РНК-интерференция обеспечивается посттранскрипционным механизмом, работающим на уровне зрелой мРНК. Однако авторы не стали исключать возможность существования дополнительного механизма, работающего на уровне хроматина или регуляции транскрипциии (Fire et al., 1998).

Поскольку подавление генов происходит даже в том случае, когда количество введенной двуцепочечной РНК значительно меньше количества мРНК целевого гена, авторы предположили вовлечение ферментативного компонента в эту

систему. Неизвестный фермент, ферментативный комплекс или последовательность ферментов должны обеспечивать увеличение количества гидовой РНК, а также расплетание термодинамически стабильного дуплекса РНК для узнавания целевой мРНК за счет комплементарных взаимодействий. Гипотеза о существовании в клетке белкового механизма для осуществления процесса РНК-интерференции предполагает, что РНК-интерференция - естественный процесс. Такой механизм может участвовать в физиологической регуляции генов или в защите клетки от экзогенной РНК, например, при вирусной инфекции (Fire et al., 1998). Были выявлены мутанты С. elegans, не способные к РНК-интерференции (rde, RNA interference-deficient). Некоторые мутанты имели повышенную активность мобильных генетических элементов - транспозонов. Это позволяет предположить, что подавление их перемещения - одна из функций РНК-интерференции (Tabara et al., 1999).

В ходе РНК-интерференции образуются короткие РНК длиной 21-23 нуклеотида (Hammond et al., 2000; Zamore et al., 2000). Исследование фрагментов двуцепочечной РНК длиной 21-23 нуклеотида показало, что что на 5'-конце этих РНК находится фосфатная группа, на З'-конце - гидроксильная, при этом 3'- конец выступает на два нуклеотида. Такие особенности характерны для продуктов реакции расщепления РНКазы III. Также было обнаружено, что место расщепления мРНК при участии двуцепочечной РНК находится на расстоянии 10 нуклеотидов от 5'-конца региона, комплементарного двуцепочечной РНК (Bass, 2000; Elbashir et al., 2001). Нуклеаза, подобная РНКазе III, была идентифицирована в клеточной культуре дрозофилы и названа Dicer (от английского dice - нарезать кубиками),

так как она способна расщеплять РНК на одинаковые короткие фрагменты (Bernstein et al., 2001).

При фракционировании тотального лизата удалось выделить фракцию, содержащую фрагменты РНК и способную к расщеплению целевой мРНК. Предполагаемый белковый комплекс, содержащий нуклеазу, ответственную за расщепление мРНК, авторы назвали RISC (RNA-induced silencing complex) (Hammond et al., 2000; Zamore et al., 2000). После разрезания двуцепочеченой РНК на короткие фрагменты начинается вторая фаза РНК-интреференции, в ходе которой происходит узнавание мРНК с помощью одной из цепей короткой РНК и разрезание мРНК при участии комплекса RISC. Исследование состава комплекса показало, что одним из его компонентов является белок из семейства Аргонавтов (S. M. Hammond et al., 2001). Участие белков из семейства Аргонавтов в процессе РНК-интерференции подтверждается более ранними генетическими исследованиями. Мутанты C. elegans по гену rde-1, кодирующему белок из семейства Аргонавтов, имеют сниженный уровень РНК-интерференции (Tabara et al., 1999). Мутация в гене qde-2 (quelling deficient - 2) у гриба N. crassa приводит к сходным последствиям (Catalanotto et al., 2000). У дрозофилы белок-Аргонавт Aubergine задействован в подавлении экспрессии тандемных повторов, а также ретротранспозонов в зародышевой линии (Aravin et al., 2001). Также было обнаружено, что мутанты по РНК-интерференции у растений арабидопсиса имеют нарушения в гене ago1 (Fagard et al., 2000). Первоначально мутантные по гену ago1 растения были получены при изучении развития листа. Морфология таких растений сильно отличается от нормальной, в том числе них отсутствует листовая пластинка. Видоизмененные листья мутантов напомнили исследователям щупальца

осьминога рода Argonauta. Поэтому ген, в который была внесена мутация, был назван аргонавтом (argonaute-1), далее это название было распространено на все семейство родственных белков (Bohmert et al., 1998). Поскольку белки-Аргонавты вовлечены одновременно в регуляцию роста и развития и в процесс разрушения чужеродной РНК, возникает предположение, что РНК-интерференция также может контролировать экспрессию эндогенных белок-кодирующих генов (Hammond et al., 2001).

В 2004 году удалось доказать, что именно Аргонавт отвечает за нуклеазную активность комплекса RISC. Был успешно выделен и проанализирован с помощью рентгеноструктурной кристаллографии полноразмерный Аргонавт из архебактерии Pyrococcus furiosus. Этот белок состоит из четырех доменов: N-концевого, PAZ, MID и PIWI, формирующих двулопастную структуру с полостью для нуклеиновых кислот в середине. PAZ-домен содержит карман с консервативными остатками ароматических аминокислот для связывания 3'-концевого выступа гидовой РНК. Структура PIWI-домена позволяет однозначно отнести его к семейству ферментов, подобных РНКазе Н. Для таких нуклеаз характерно наличие двух остатков аспарагиновой кислоты и одного остатка глутаминовой кислоты, необходимых для реакции расщепления РНК. В PIWI-домене аргонавта из P. furiosus присутствуют все три каталитических остатка. Для реакции, осуществляемой РНКазами этого семейства, характерно наличие фосфата на 5'-конце и гидроксильной группы на 3'-конце образующихся продуктов. Биохимические исследования показали, что именно такие продукты обрузаются при гидролизе РНК комплексом RISC (Martinez and Tuschl, 2004). В совокупности эти данные доказывают, что за нуклеазную активность комплекса RISC отвечает именно белок-Аргонавт (J. J.

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Кропочева Екатерина Вадимовна, 2023 год

Список литературы

1. Abel, P. P., Nelson, R. S., De, B., Hoffmann, N., Rogers, S. G., Fraley, R. T., & Beachy, R. N. (1986). Delay of disease development in transgenic plants that express the tobacco mosaic virus coat protein gene. Science, 232(4751), 738-743. https://doi.org/10.1126/science.3457472

2. Ambros, V., Bartel, B., Bartel, D. P., Burge, C. B., Carrington, J. C., Chen, X., Dreyfuss, G., Eddy, S. R., Griffiths-Jones, S., Marshall, M., Matzke, M. A., Ruvkin, G., & Tuschl, T. (2003). A uniform system for microRNA annotation. RNA, 9(3), 279. https://doi.org/10.1261/RNA.2183803

3. Aravin, A. A., Hannon, G. J., & Brennecke, J. (2007). The Piwi-piRNA pathway provides an adaptive defense in the transposon arms race. In Science (Vol. 318, Issue 5851, pp. 761-764). Science. https://doi.org/10.1126/science.1146484

4. Aravin, A. A., Naumova, N. M., Tulin, A. V., Vagin, V. V., Rozovsky, Y. M., & Gvozdev, V. A. (2001). Double-stranded RNA-mediated silencing of genomic tandem repeats and transposable elements in the D. melanogaster germline. Current Biology, 77(13), 1017-1027. https://doi.org/10.1016/S0960-9822(01)00299-8

5. Bartel, D. P. (2009). MicroRNA Target Recognition and Regulatory Functions. Cell, 136(2), 215-233. https://doi.org/10.1016/j.cell.2009.01.002.MicroRNA

6. Bass, B. L. (2000). Double-stranded RNA as a template for gene silencing. In Cell (Vol. 101, Issue 3, pp. 235-238). Elsevier B.V. https://doi.org/10.1016/S0092-8674(02)71133-1

7. Bernstein, E., Caudy, A. A., Hammond, S. M., & Hannon, G. J. (2001). Role for a

bidentate ribonuclease in the initiation step of RNA interference. Nature, 409(6818), 363-366. https://doi.org/10.1038/35053110

8. Blesa, A., César, C. E., Averhoff, B., & Berenguer, J. (2015). Noncanonical Cell-to-Cell DNA Transfer in Thermus spp. Is Insensitive to Argonaute-Mediated Interference. Journal of Bacteriology, 197(1), 138. https://doi.org/10.1128/JB.02113-14

9. Bohmert, K., Camus, I., Bellini, C., Bouchez, D., Caboche, M., & Banning, C. (1998). AGO1 defines a novel locus of Arabidopsis controlling leaf development. EMBO Journal, 17(1), 170-180. https://doi.org/10.1093/emboj/17.L170

10. Burroughs, A. M., Iyer, L. M., & Aravind, L. (2013). Two novel PIWI families: Roles in inter-genomic conflicts in bacteria and Mediator-dependent modulation of transcription in eukaryotes. Biology Direct, <S(1), 13. https://doi.org/10.1186/1745-6150-8-13

11. Cao, Y., Sun, W., Wang, J., Sheng, G., Xiang, G., Zhang, T., Shi, W., Li, C., Wang, Y., Zhao, F., & Wang, H. (2019). Argonaute proteins from human gastrointestinal bacteria catalyze DNA-guided cleavage of single- and double-stranded DNA at 37 °C. Cell Discovery, 5(1), 1-4. https://doi.org/10.1038/S41421-019-0105-Y

12. Catalanotto, C., Azzalin, G., Macino, G., & Cogoni, C. (2000). Gene silencing in worms and fungi. Nature, 404(6775), 245. https://doi.org/10.1038/35005169

13. Dayeh, D. M., Cantara, W. A., Kitzrow, J. P., Musier-Forsyth, K., & Nakanishi, K. (2018). Argonaute-based programmable RNase as a tool for cleavage of highly-structured RNA. Nucleic Acids Research, 46(16), e98.

https://doi.org/10.1093/NAR/GKY496

14. Doron, S., Melamed, S., Ofir, G., Leavitt, A., Lopatina, A., Keren, M., Amitai, G., & Sorek, R. (2018). Systematic discovery of antiphage defense systems in the microbial pangenome. Science (New York, N.Y.), 359(6379), eaar4120. https://doi.org/10.1126/science.aar4120

15. Dougherty, W. G., & Parks, T. D. (1995). Transgene and gene suppression: telling us something new? Current Opinion in Cell Biology, 7(3), 399-405. https://doi.org/10.1016/0955-0674(95)80096-4

16. Doxzen, K. W., & Doudna, J. A. (2017). DNA recognition by an RNA-guided bacterial Argonaute. PLoS ONE, 12(5), e0177097. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0177097

17. Elbashir, S. M., Lendeckel, W., & Tuschl, T. (2001). RNA interference is mediated by 21- and 22-nucleotide RNAs. Genes and Development, 15(2), 188200. https://doi.org/10.1101/gad.862301

18. Enghiad, B., & Zhao, H. (2017). Programmable DNA-guided artificial restriction enzymes. ACS Synthetic Biology, 6(5), 752-757. https://doi.org/10.1021/ACSSYNBIO.6B00324

19. Fagard, M., Boutet, S., Morel, J. B., Bellini, C., & Vaucheret, H. (2000). AGO1, QDE-2, and RDE-1 are related proteins required for post-transcriptional gene silencing in plants, quelling in fungi, and RNA interference in animals. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 97(21), 11650-11654. https://doi.org/10.1073/pnas.200217597

20. Filius, M., Cui, T. J., Ananth, A. N., Docter, M. W., Hegge, J. W., Oost, J. van der, & Joo, C. (2020). High-speed super-resolution imaging using protein-assisted DNA-PAINT. Nano Letters, 20(4), 2264.

https://doi.org/10.1021/ACS.NANOLETT.9B04277

21. Fire, A., Xu, S., Montgomery, M. K., Kostas, S. A., Driver, S. E., & Mello, C. C. (1998). Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in caenorhabditis elegans. Nature, 391(6669), 806-811. https://doi.org/10.1038/35888

22. Gao, F., Shen, X. Z., Jiang, F., Wu, Y., & Han, C. (2016). DNA-guided genome editing using the Natronobacterium gregoryi Argonaute. Nature Biotechnology, 34(7), 768-773. https://doi.org/10.1038/NBT.3547

23. Gao, F., Shen, X. Z., Jiang, F., Wu, Y., & Han, C. (2017). Retraction: DNA-guided genome editing using the Natronobacterium gregoryi Argonaute. Nature Biotechnology, 35(8), 797. https://doi.org/10.1038/NBT0817-797A

24. Garcia-Quintans, N., Bowden, L., Berenguer, J., & Mencia, M. (2019). DNA interference by a mesophilic Argonaute protein, CbcAgo. F1000Research, 8, 321. https://doi.org/10.12688/F1000RESEARCH.18445.2

25. Guo, S., & Kemphues, K. J. (1995). par-1, a gene required for establishing polarity in C. elegans embryos, encodes a putative Ser/Thr kinase that is asymmetrically distributed. Cell, 81(4), 611-620. https://doi.org/10.1016/0092-8674(95)90082-9

26. Hammond, S. M., Boettcher, S., Caudy, A. A., Kobayashi, R., & Hannon, G. J. (2001). Argonaute2, a link between genetic and biochemical analyses of RNAi. Science (New York, N.Y.), 293(5532), 1146-1150.

https://doi.org/10.1126/SCIENCE.1064023

27. Hammond, Scott M., Bernstein, E., Beach, D., & Hannon, G. J. (2000). An RNA-directed nuclease mediates post-transcriptional gene silencing in Drosophila cells. Nature, 404(6775), 293-296. https://doi.org/10.1038/35005107

28. He, R., Wang, L., Wang, F., Li, W., Liu, Y., Li, A., Wang, Y., Mao, W., Zhai, C., & Ma, L. (2019). Pyrococcus furiosus Argonaute-mediated nucleic acid detection. Chemical Communications (Cambridge, England), 55(88), 13219-13222. https://doi.org/10.1039/C9CC07339F

29. Hegge, J. W., Swarts, D. C., Chandradoss, S. D., Cui, T. J., Kneppers, J., Jinek, M., Joo, C., & Van Der Oost, J. (2019). DNA-guided DNA cleavage at moderate temperatures by Clostridium butyricum Argonaute. Nucleic Acids Research, 47(11), 5809-5821. https://doi.org/10.1093/nar/gkz306

30. Hegge, J. W., Swarts, D. C., & Van Der Oost, J. (2018). Prokaryotic argonaute proteins: novel genome-editing tools? Nature Reviews Microbiology, 16(1), 5-11. https://doi.org/10.1038/nrmicro.2017.73

31. Hobbs, S. L. A., Kpodar, P., & DeLong, C. M. O. (1990). The effect of T-DNA copy number, position and methylation on reporter gene expression in tobacco transformants. Plant Molecular Biology, 15(6), 851-864. https://doi.org/10.1007/BF00039425

32. Holoch, D., & Moazed, D. (2015). RNA-mediated epigenetic regulation of gene expression. In Nature Reviews Genetics (Vol. 16, Issue 2, pp. 71-84). Nature Publishing Group. https://doi.org/10.1038/nrg3863

33. Hunt, E. A., Evans, T. C., Jr., & Tanner, N. A. (2018). Single-stranded binding proteins and helicase enhance the activity of prokaryotic Argonautes in vitro. PLoS ONE, 13(8), e0203073. https://doi.org/10.1371/JOURNAL.PONE.0203073

34. Hunt, E. A., Tamanaha, E., Bonanno, K., Cantor, E. J., & Tanner, N. A. (2021). Profiling Thermus thermophilus Argonaute guide DNA sequence preferences by functional screening. Frontiers in Molecular Biosciences, 8, 670940.

https://doi.org/10.3389/FMOLB.2021.670940

35. Jolly, S. M., Gainetdinov, I., Jouravleva, K., Zhang, H., Strittmatter, L., Bailey, S. M., Hendricks, G. M., Dhabaria, A., Ueberheide, B., & Zamore, P. D. (2020). Thermus thermophilus Argonaute functions in the completion of DNA replication. Cell, 182(6), 1545-1559.e18. https://doi.org/10.1016ZJ.CELL.2020.07.036

36. Jung, S. R., Kim, E., Hwang, W., Shin, S., Song, J. J., & Hohng, S. (2013). Dynamic anchoring of the 3'-end of the guide strand controls the target dissociation of argonaute-guide complex. Journal of the American Chemical Society, 135(45), 16865-16871. https://doi.org/10.1021/ja403138d

37. Ka, D., Oh, H., Park, E., Kim, J. H., & Bae, E. (2020). Structural and functional evidence of bacterial antiphage protection by Thoeris defense system via NAD+ degradation. Nature Communications, 11(1), 1-8. https://doi.org/10.1038/s41467-020-16703-w

38. Katoch, R., & Thakur, N. (2013). Advances in RNA interference technology and its impact on nutritional improvement, disease and insect control in plants. Applied Biochemistry and Biotechnology, 169(5), 1579-1605. https://doi.org/10.1007/s12010-012-0046-5

39. Kaya, E., Doxzen, K. W., Knoll, K. R., Wilson, R. C., Strutt, S. C., Kranzusch, P. J., & Doudna, J. A. (2016). A bacterial Argonaute with noncanonical guide RNA specificity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 113(15), 4057-4062. https://doi.org/10.1073/pnas.1524385113

40. Khin, N. C., Lowe, J. L., Jensen, L. M., & Burgio, G. (2017). No evidence for genome editing in mouse zygotes and HEK293T human cell line using the DNA-guided Natronobacterium gregoryi Argonaute (NgAgo). PloS One, 12(6),

e0178768. https://doi.org/10.1371/JOURNAL.PONE.0178768

41. Kim, S. Y., Jung, Y., & Lim, D. (2020). Argonaute system of Kordia jejudonensis is a heterodimeric nucleic acid-guided nuclease. Biochemical and Biophysical Research Communications, 525(3), 755-758.

https://doi.org/10.1016/j.bbrc.2020.02.145

42. Kropocheva, E., Kuzmenko, A., Aravin, A. A., Esyunina, D., & Kulbachinskiy, A. (2021). A programmable pAgo nuclease with universal guide and target specificity from the mesophilic bacterium Kurthia massiliensis. Nucleic Acids Research, 49(7), 4054-4065. https://doi.org/10.1093/NAR/GKAB182

43. Kuzmenko, A., Oguienko, A., Esyunina, D., Yudin, D., Petrova, M., Kudinova, A., Maslova, O., Ninova, M., Ryazansky, S., Leach, D., Aravin, A. A., & Kulbachinskiy, A. (2020). DNA targeting and interference by a bacterial Argonaute nuclease. Nature, 587(7835), 632-637. https://doi.org/10.1038/s41586-020-2605-1

44. Kuzmenko, A., Yudin, D., Ryazansky, S., Kulbachinskiy, A., & Aravin, A. A. (2019). Programmable DNA cleavage by Ago nucleases from mesophilic bacteria Clostridium butyricum and Limnothrix rosea. Nucleic Acids Research, 47(11), 5822. https://doi.org/10.1093/NAR/GKZ379

45. Lapinaite, A., Doudna, J. A., & Cate, J. H. D. (2018). Programmable RNA recognition using a CRISPR-associated Argonaute. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 115(13), 3368-3373. https://doi.org/10.1073/PNAS.1717725115

46. Lee, R. C., Feinbaum, R. L., & Ambrost, V. (1993). The C. elegans Heterochronic Gene lin-4 Encodes Small RNAs with Antisense Complementarity to &II-14. Cell,

75, 843-854.

47. Lee, S., Turchiano, Ata, H., Nowsheen, S., Romito, M., Lou, Z., Ryu, S. M., Ekker, S. C., Cathomen, T., & Kim, J. S. (2016). Failure to detect DNA-guided genome editing using Natronobacterium gregoryi Argonaute. Nature Biotechnology, 35(1), 17-18. https://doi.org/10.1038/NBT.3753

48. Lei, J., Sheng, J., Cheung, P. P., Wang, S., Li, Y., Gao, X., Zhang, Y., Wang, Y., & Huang, X. (2019). Two symmetric arginine residues play distinct roles in Thermus thermophilus Argonaute DNA guide strand-mediated DNA target cleavage. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 116(3), 845-853. https://doi.org/10.1073/PNAS.1817041116

49. Levy, A., Goren, M. G., Yosef, I., Auster, O., Manor, M., Amitai, G., Edgar, R., Qimron, U., & Sorek, R. (2015). CRISPR adaptation biases explain preference for acquisition of foreign DNA. Nature 2015 520:7548, 520(7548), 505-510. https://doi.org/10.1038/nature14302

50. Lindbo, J. A., Silva-Rosales, L., Proebsting, W. M., & Dougherty, W. G. (1993). Induction of a highly specific antiviral state in transgenic plants: Implications for regulation of gene expression and virus resistance. Plant Cell, 5(12), 1749-1759. https://doi.org/10.1105/tpc.5.12.1749

51. Lindbo, John A., & Falk, B. W. (2017). The impact of "coat protein-mediated virus resistance" in applied plant pathology and basic research. In Phytopathology (Vol. 107, Issue 6, pp. 624-634). American Phytopathological Society. https://doi.org/10.1094/PHYT0-12- 16-0442-RVW

52. Lisitskaya, L., Aravin, A. A., & Kulbachinskiy, A. (2018). DNA interference and beyond: structure and functions of prokaryotic Argonaute proteins. Nature

Communications, 9(1), 1-12. https://doi.org/10.1038/S41467-018-07449-7

53. Liu, J., Carmell, M. A., Rivas, F. V., Marsden, C. G., Thomson, J. M., Song, J. J., Hammond, S. M., Joshua-Tor, L., & Hannon, G. J. (2004). Argonaute2 is the catalytic engine of mammalian RNAi. Science, 305(5689), 1437-1441. https://doi.org/10.1126/science.1102513

54. Liu, Yang, Li, W., Jiang, X., Wang, Y., Zhang, Z., Liu, Q., He, R., Chen, Q., Yang, J., Wang, L., Wang, F., & Ma, L. (2021). A programmable omnipotent Argonaute nuclease from mesophilic bacteria Kurthia massiliensis. Nucleic Acids Research, 49(3), 1597-1608. https://doi.org/10.1093/NAR/GKAA1278

55. Liu, Yiwei, Esyunina, D., Olovnikov, I., Teplova, M., Kulbachinskiy, A., Aravin, A. A., & Patel, D. J. (2018). Accommodation of helical imperfections in Rhodobacter sphaeroides Argonaute ternary complexes with guide RNA and target DNA. Cell Reports, 24(2), 453-462. https://doi.org/10.1016/J.CELREP.2018.06.021

56. Ma, J. B., Yuan, Y. R., Meister, G., Pei, Y., Tuschl, T., & Patel, D. J. (2005). Structural basis for 5' -end-specific recognition of guide RNA by the A. fulgidus Piwi protein. Nature, 434(7033), 666-670. https://doi.org/10.1038/nature03514

57. Makarova, K. S., Wolf, Y. I., Snir, S., & Koonin, E. V. (2011). Defense Islands in Bacterial and Archaeal Genomes and Prediction of Novel Defense Systems. Journal of Bacteriology, 193(21), 6039-6056. https://doi.org/10.1128/JB.05535-11

58. Makarova, K. S., Wolf, Y. I., van der Oost, J., & Koonin, E. V. (2009). Prokaryotic homologs of Argonaute proteins are predicted to function as key components of a novel system of defense against mobile genetic elements. Biology

Direct, 4, 29. https://doi.org/10.1186/1745-6150-4-29

59. Martinez, J., & Tuschl, T. (2004). RISC is a 5' phosphomonoester-producing RNA endonuclease. Genes and Development, 18(9), 975-980.

https://doi.org/10.1101/gad.1187904

60. Matzke, M. A., Primig, M., Trnovsky, J., & Matzke, A. J. M. (1989). Reversible methylation and inactivation of marker genes in sequentially transformed tobacco plants. The EMBO Journal, 8(3), 643-649. https://doi.org/10.1002Zj.1460-2075.1989.tb03421.x

61. Matzke, Marjori A., Kanno, T., & Matzke, A. J. M. (2015). RNA-directed DNA methylation: The evolution of a complex epigenetic pathway in flowering plants. Annual Review of Plant Biology, 66, 243-267. https://doi.org/10.1146/annurev-arplant-043014-114633

62. Meister, G. (2013). Argonaute proteins: functional insights and emerging roles. In Nature Reviews Genetics (Vol. 14, Issue 7, pp. 447-459). Nat Rev Genet. https://doi.org/10.1038/nrg3462

63. Millman, A., Bernheim, A., Stokar-Avihail, A., Fedorenko, T., Voichek, M., Leavitt, A., Oppenheimer-Shaanan, Y., & Sorek, R. (2020). Bacterial Retrons Function In Anti-Phage Defense. Cell, 183(6), 1551-1561.e12. https://doi.org/10.1016AJ.CELL.2020.09.065

64. Miyoshi, T., Ito, K., Murakami, R., & Uchiumi, T. (2016). Structural basis for the recognition of guide RNA and target DNA heteroduplex by Argonaute. Nature Communications, 7. https://doi.org/10.1038/ncomms11846

65. Mondol, V., & Pasquinelli, A. E. (2012). Let's Make It Happen: The Role of let-7 MicroRNA in Development. Current Topics in Developmental Biology:

MicroRNAs in Development, 99, 1-30. https://doi.org/10.1016/B978-0-12-387038-4.00001-X

66. Napoli, C., Lemieux, C., & Jorgensen, R. (1990). Introduction of a Chimeric Chalcone Synthase Gene into Petunia Results in Reversible Co-Suppression of Homologous Genes in trans. The Plant Cell, 2(4), 279-289. https://doi.org/10.1105/tpc.2.4.279

67. Nowotny, M. (2009). Retroviral integrase superfamily: The structural perspective. In EMBO Reports (Vol. 10, Issue 2, pp. 144-151). EMBO Rep. https://doi.org/10.1038/embor.2008.256

68. Ofir, G., Herbst, E., Baroz, M., Cohen, D., Millman, A., Doron, S., Tal, N., Malheiro, D. B. A., Malitsky, S., Amitai, G., & Sorek, R. (2021). Antiviral activity of bacterial TIR domains via signaling molecules that trigger cell death. Nature, 600(7887), 116-120. https://doi.org/10.1101/2021.01.06.425286

69. Ofir, Gal, Melamed, S., Sberro, H., Mukamel, Z., Silverman, S., Yaakov, G., Doron, S., & Sorek, R. (2018). DISARM is a widespread bacterial defence system with broad anti-phage activities. Nature Microbiology, 3(1), 90-98. https://doi.org/10.1038/s41564-017-0051-0

70. Olina, A., Kuzmenko, A., Ninova, M., Aravin, A. A., Kulbachinskiy, A., & Esyunina, D. (2020). Genome-wide DNA sampling by Ago nuclease from the cyanobacterium Synechococcus elongatus. RNA Biology, 17(5), 677. https://doi.org/10.1080/15476286.2020.1724716

71. Olovnikov, I., Chan, K., Sachidanandam, R., Newman, D. K., & Aravin, A. A. (2013). Bacterial Argonaute samples the transcriptome to identify foreign DNA. Molecular Cell, 51(5), 594-605. https://doi.org/10.1016AJ.MOLCEL.2013.08.014

72. Ozata, D. M., Gainetdinov, I., Zoch, A., O'Carroll, D., & Zamore, P. D. (2019). PIWI-interacting RNAs: small RNAs with big functions. In Nature Reviews Genetics (Vol. 20, Issue 2, pp. 89-108). Nature Publishing Group. https://doi.org/10.1038/s41576-018-0073-3

73. Parker, J. S., Roe, S. M., & Barford, D. (2004). Crystal structure of a PIWI protein suggests mechanisms for siRNA recognition and slicer activity. EMBO Journal, 23(24), 4727-4737. https://doi.org/10.1038/sj.emboj.7600488

74. Parker, J. S., Roe, S. M., & Barford, D. (2005). Structural insights into mRNA recognition from a PIWI domain-siRNA guide complex. Nature, 434(7033), 663666. https://doi.org/10.1038/nature03462

75. Rashid, U. J., Paterok, D., Koglin, A., Gohlke, H., Piehler, J., & Chen, J. C. H. (2007). Structure of Aquifex aeolicus Argonaute highlights conformational flexibility of the PAZ domain as a potential regulator of RNA-induced silencing complex function. Journal of Biological Chemistry, 282(18), 13824-13832. https://doi.org/10.1074/jbc.M608619200

76. Rocheleau, C. E., Downs, W. D., Lin, R., Wittmann, C., Bei, Y., Cha, Y. H., Ali, M., Priess, J. R., & Mello, C. C. (1997). Wnt signaling and an APC-related gene specify endoderm in early C. elegans embryos. Cell, 90(4), 707-716. https://doi.org/10.1016/S0092-8674(00)80531-0

77. Rogers, K., & Chen, X. (2013). Biogenesis, turnover, and mode of action of plant microRNAs. In Plant Cell (Vol. 25, Issue 7, pp. 2383-2399). Plant Cell. https://doi.org/10.1105/tpc.113.113159

78. Romano, N., & Macino, G. (1992). Quelling: transient inactivation of gene expression in Neurospora crassa by transformation with homologous sequences.

Molecular Microbiology, 6(22), 3343-3353. https://doi.org/10.1111/j.1365-2958.1992.tb02202.x

79. Ryazansky, S., Kulbachinskiy, A., & Aravin, A. A. (2018). The expanded universe of prokaryotic Argonaute proteins. MBio, 9(6), 1-20. https://doi.org/10.1128/mBio.01935-18

80. Sheng, G., Gogakos, T., Wang, J., Zhao, H., Serganov, A., Juranek, S., Tuschl, T., Patel, D. J., & Wang, Y. (2017). Structure/cleavage-based insights into helical perturbations at bulge sites within T. thermophilus Argonaute silencing complexes. Nucleic Acids Research, 45(15), 9149.

https://doi.org/10.1093/NAR/GKX547

81. Sheng, G., Zhao, H., Wang, J., Rao, Y., Tian, W., Swarts, D. C., van der Oost, J., Patel, D. J., & Wang, Y. (2014). Structure-based cleavage mechanism of Thermus thermophilus Argonaute DNA guide strand-mediated DNA target cleavage. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 111(2), 652-657. https://doi.org/10.1073/pnas.1321032111

82. Shin, S., Jung, Y., Uhm, H., Song, M., Son, S., Goo, J., Jeong, C., Song, J.-J., Kim, V. N., & Hohng, S. (2020). Quantification of purified endogenous miRNAs with high sensitivity and specificity. Nature Communications, 11(1), 6033. https://doi.org/10.1038/S41467-020-19865-9

83. Song, J., Hegge, J. W., Mauk, M. G., Chen, J., Till, J. E., Bhagwat, N., Azink, L. T., Peng, J., Sen, M., Mays, J., Carpenter, E. L., van der Oost, J., & Bau, H. H. (2020). Highly specific enrichment of rare nucleic acid fractions using Thermus thermophilus Argonaute with applications in cancer diagnostics. Nucleic Acids Research, 48(4), e19. https://doi.org/10.1093/NAR/GKZ1165

84. Song, J. J., Smith, S. K., Hannon, G. J., & Joshua-Tor, L. (2004). Crystal structure of Argonaute and its implications for RISC slicer activity. Science (New York, N.Y.), 305(5689), 1434-1437. https://doi.org/10.1126/science.1102514

85. Spear, A. M., Loman, N. J., Atkins, H. S., & Pallen, M. J. (2009). Microbial TIR domains: not necessarily agents of subversion? Trends in Microbiology, 17(9), 393-398. https://doi.org/10.1016/j.tim.2009.06.005

86. Swarts, D. C., Hegge, J. W., Hinojo, I., Shiimori, M., Ellis, M. A., Dumrongkulraksa, J., Terns, R. M., Terns, M. P., & van der Oost, J. (2015). Argonaute of the archaeon Pyrococcus furiosus is a DNA-guided nuclease that targets cognate DNA. Nucleic Acids Research, 43(10), 5120-5129. https://doi.org/10.1093/nar/gkv415

87. Swarts, D. C., Jore, M. M., Westra, E. R., Zhu, Y., Janssen, J. H., Snijders, A. P., Wang, Y., Patel, D. J., Berenguer, J., Brouns, S. J. J., & van der Oost, J. (2014). DNA-guided DNA interference by a prokaryotic Argonaute. Nature, 507(7491), 258-261. https://doi.org/10.1038/nature12971

88. Swarts, D. C., Koehorst, J. J., Westra, E. R., Schaap, P. J., & Van Der Oost, J. (2015). Effects of Argonaute on gene expression in Thermus thermophilus. PLoS ONE, 10(4), e0124880. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0124880

89. Swarts, D. C., Makarova, K., Wang, Y., Nakanishi, K., Ketting, R. F., Koonin, E. V., Patel, D. J., & Van Der Oost, J. (2014). The evolutionary journey of Argonaute proteins. In Nature Structural and Molecular Biology (Vol. 21, Issue 9, pp. 743753). Nature Publishing Group. https://doi.org/10.1038/nsmb.2879

90. Swarts, D. C., Szczepaniak, M., Sheng, G., Chandradoss, S. D., Zhu, Y., Timmers, E. M., Zhang, Y., Zhao, H., Lou, J., Wang, Y., Joo, C., & van der Oost, J. (2017).

Autonomous generation and loading of DNA guides by bacterial Argonaute. Molecular Cell, 65(6), 985-998.e6. https://doi.org/10.1016/j.molcel.2017.01.033

91. Tabara, H., Sarkissian, M., Kelly, W. G., Fleenor, J., Grishok, A., Timmons, L., Fire, A., & Mello, C. C. (1999). The rde-1 gene, RNA interference, and transposon silencing in C. elegans. Cell, 99(2), 123-132. https://doi.org/10.1016/S0092-8674(00)81644-X

92. Taton, A., Erikson, C., Yang, Y., Rubin, B. E., Rifkin, S. A., Golden, J. W., & Golden, S. S. (2020). The circadian clock and darkness control natural competence in cyanobacteria. Nature Communications, 11(1), 1-11. https://doi.org/10.1038/s41467-020-15384-9

93. Van Der Krol, A. R., Mur, L. A., Beld, M., Mol, J. N. M., & Stuitje, A. R. (1990). Flavonoid genes in petunia: Addition of a limited number of gene copies may lead to a suppression of gene expression. Plant Cell, 2(4), 291-299. https://doi.org/10.1105/tpc.2A291

94. Wang, L., He, R., Lv, B., Yu, X., Liu, Y., Yang, J., Li, W., Wang, Y., Zhang, H., Yan, G., Mao, W., Liu, L., Wang, F., & Ma, L. (2021). Pyrococcus furiosus Argonaute coupled with modified ligase chain reaction for detection of SARS-CoV-2 and HPV. Talanta, 227, 122154. https://doi.org/10.1016/J.TALAN TA.2021.122154

95. Wang, Y., Juranek, S., Li, H., Sheng, G., Tuschl, T., & Patel, D. J. (2008). Structure of an Argonaute silencing complex with a seed-containing guide DNA and target RNA duplex. In Nature (Vol. 456, Issue 7224, pp. 921-926). Nature Publishing Group. https://doi.org/10.1038/nature07666

96. Wang, Y., Juranek, S., Li, H., Sheng, G., Wardle, G. S., Tuschl, T., & Patel, D. J.

(2009). Nucleation, propagation and cleavage of target RNAs in Ago silencing complexes. Nature, 461(7265), 754-761. https://doi.org/10.1038/nature08434

97. Wang, Y., Sheng, G., Juranek, S., Tuschl, T., & Patel, D. J. (2008a). Structure of the guide-strand-containing argonaute silencing complex. Nature, 456(7219), 209-213. https://doi.org/10.1038/nature07315

98. Wang, Y., Sheng, G., Juranek, S., Tuschl, T., & Patel, D. J. (2008b). Structure of the guide-strand-containing Argonaute silencing complex. Nature, 456(7219), 209-213. https://doi.org/10.1038/nature07315

99. Wightman, B., Ha, L., & Ruvkun, G. (1993). Posttranscriptional Regulation of the Heterochronic Gene lin-14 by W-4 Mediates Temporal Pattern Formation in C. elegans. 75, 855-862.

100. Willkomm, S., Makarova, K. S., & Grohmann, D. (2018). DNA silencing by prokaryotic Argonaute proteins adds a new layer of defense against invading nucleic acids. In FEMSMicrobiology Reviews (Vol. 42, Issue 3, pp. 376-387). Oxford University Press. https://doi.org/10.1093/femsre/fuy010

101. Willkomm, S., Oellig, C. A., Zander, A., Restle, T., Keegan, R., Grohmann, D., & Schneider, S. (2017). Structural and mechanistic insights into an archaeal DNA-guided Argonaute protein. Nature Microbiology, 2, 1-7. https://doi.org/10.1038/nmicrobiol.2017.35

102. Willkomm, S., Zander, A., Gust, A., & Grohmann, D. (2015). A prokaryotic twist on Argonaute function. In Life (Vol. 5, Issue 1, pp. 538-553). MDPI AG. https://doi.org/10.3390/life5010538

103. Xiao, G., Fu, X., Zhang, J., Liu, S., Wang, Z., Ye, T., & Zhang, G. (2021). Rapid and cost-effective screening of CRISPR/Cas9-induced mutants by DNA-

guided Argonaute nuclease. Biotechnology Letters, 43(11), 2105-2110. https://doi.org/10.1007/S10529-021-03177-Z

104. Xing, J., Ma, L., Cheng, X., Ma, J., Wang, R., Xu, K., Mymryk, J. S., & Zhang, Z. (2021). Expression and Functional Analysis of the Argonaute Protein of Thermus thermophilus (TtAgo) in E. coli BL21(DE3). Biomolecules, 11(4). https://doi.org/10.3390/BI0M11040524

105. Yuan, Y. R., Pei, Y., Chen, H. Y., Tuschl, T., & Patel, D. J. (2006). A potential protein-RNA recognition event along the RISC-loading pathway from the structure of A. aeolicus Argonaute with externally bound siRNA. Structure, 14(10), 1557-1565. https://doi.org/10.1016Zj.str.2006.08.009

106. Yuan, Y. R., Pei, Y., Ma, J. B., Kuryavyi, V., Zhadina, M., Meister, G., Chen, H. Y., Dauter, Z., Tuschl, T., & Patel, D. J. (2005). Crystal structure of A. aeolicus Argonaute, a site-specific DNA-guided endoribonuclease, provides insights into RISC-mediated mRNA cleavage. Molecular Cell, 19(3), 405-419. https://doi.org/10.1016/j.molcel.2005.07.011

107. Zamore, P. D., Tuschl, T., Sharp, P. A., & Bartel, D. P. (2000). RNAi: Double-stranded RNA directs the ATP-dependent cleavage of mRNA at 21 to 23 nucleotide intervals. Cell, 101(1), 25-33. https://doi.org/10.1016/s0092-8674(00)80620-0

108. Zander, S, W., S, O., M, van W., L, E., S, B., S, S., P, T., S, S., A, K., SV, A., F, W., & D, G. (2017). Guide-independent DNA cleavage by archaeal Argonaute from Methanocaldococcus jannaschii. Nature Microbiology, 2. https://doi.org/10.1038/NMICR0BI0L.2017.34

Приложение 1.

Таблица 1. Последовательности олигонуклеотидов, использованных в работе.

Название Последовательность (5'-3') Описание

КшаЛ§о №е1 асасссастласлтаа лласттлтлтллслал ЛЛтаатстсЛс Праймер для ПЦР

КшаЛ§о ХИо1 геу асасссстсалаттллл саллтаасллаттсатс талтт Праймер для ПЦР

Б596Л_КшаЛ§о_д шк_геу атЛтаттсасассЛЛЛЛ тсссастстаталлтта талтлтастт Праймер для сайт-направленного мутагенеза

D596A_KmаAgo_q шк foг лласлтлтслсллттсл слаласааалттттаас асаллслтлс Праймер для сайт-направленного мутагенеза

Б527Л_КшаЛ§о_д шк_геу ттлсслттттслталст алссасллтассалтл лллслатсла Праймер для сайт-направленного мутагенеза

Б527Л_КшаЛ§о_д uik_fwd сталстаттттлтсаас лттасаатслатслтал лллтаатлл Праймер для сайт-направленного мутагенеза

RslЛgo_NheI_foг асасссастласлталс слалтлталалстллт Праймер для ПЦР

лтттттслолтлолллл с

RslAgo Х^1 геу ососссстсолотслтл лслтттслтсттттллл лтттстостстстсо Праймер для ПЦР

EmaЛgo ОЛ остоооллстослоос тоотлтоллссллтотт лтттллслоллтоо Праймер для ПЦР

EmaЛgo_GЛ_гev ослолтстсолостсоо лтсттлтлслллсоосл лтосстсттслтоттс Праймер для ПЦР

pBЛD_thrWQ_г лсслосстослоттссс лостоссососоослс слоостлосслтлсслт олтолтолтолтолто лоллссс Праймер для ПЦР

pBЛQ_MCS_d олтссолостсололтс тослосто Праймер для ПЦР

Kma-740-seq-foг сотлтлслссолотлл ллтлттслтллссо Праймер для секвенирования последовательности гена KmaЛgo

Еша-750^ед Праймер для секвенирования последовательности гена Ешал§о

Я81-790^ед^ог стталтттлатасслст сслтттлса Праймер для секвенирования последовательности гена К^1л§о

pBAD-for лта ссл тла сл т ттт тлт сс Праймер для секвенирования вставки в вектор pBAD

рБЛБ-геу алт ттл лтс тот лтс лаа ста Праймер для секвенирования вставки в вектор pBAD

Т7-&г тлл тлс алс тсл стл тла аа Праймер для секвенирования вставки в вектор рЕт28Ь

Т7-геу лта стл атт лтт аст сла Праймер для секвенирования

вставки в вектор рЕт28Ь

^38о оттлолстттллотслл т 18 нт ДНК-гид, формирует 5'-о пару с о-мишенью

о-мишень тттлтслллллолотлт толсттлллотстллсс тлтлоолтлсттлсло 50 нт ДНК-мишень

g-38G-РНК оиилолсиииллоисл ли 18 нт РНК-гид, формирует 5'-о пару с о-мишенью

о-мишень-РНК ииилислллллолоил ииолсиилллоисилл ссилилоолилсиилс ло 50 нт РНК-мишень

g59-A лтоостотллотлтсст л 18 нт ДНК-гид для А-мишени-Су5 и 102 нт-мишени

Л-мишень-су5 лоолтлсттлслосслт сололооолслостсо лстлотслсстолотсо -Су5 50 нт ДНК-мишень с флуоресцентной меткой Су-5

§-38а -10нт аттлалсттт 10 нт ДНК-гид, формирует 5'-а пару с а-мишенью

§-38а -12нт аттлалстттлл 12 нт ДНК-гид, формирует 5'-а пару с а-мишенью

§-38а -14нт аттлалстттллат 14 нт ДНК-гид, формирует 5'-а пару с а-мишенью

§-38а - 16нт аттлалстттллатсл 16 нт ДНК-гид, формирует 5'-а пару с а-мишенью

§-38а -20нт аTTAаACTTTAAаTCAA тлс 20 нт ДНК-гид, формирует 5'-а пару с а-мишенью

§-38а -22нт аTTAаACTTTAAаTCAA тлстс 22 нт ДНК-гид, формирует 5'-а пару с а-мишенью

В-38А АTTAGACTTTAAGTCAA т 18 нт ДНК-гид, формирует 5'-А пару с А-мишенью

8-38Т ТTTAGACTTTAAGTCAA т 18 нт ДНК-гид, формирует 5'-Т пару с Т-мишенью

8-38С СTTAGACTTTAAGTCAA т 18 нт ДНК-гид, формирует 5'-С пару с С-мишенью

А-мишень TTTATCAAAAAаAаTAT талсттллла TCTAATCTATAааATAC ттлсла 50 нт ДНК-мишень для §-38А-гида

Т-мишень TTTATCAAAAAаAаTAT талсттллла TCTAAACTATAааATAC ттлсла 50 нт ДНК-мишень для §-38Т-гида

С-мишень TTTATCAAAAAGAGTAT талсттллла TCTAAаCTATAааATAC ттлсла 50 нт ДНК-мишень для §-38С-гида

§75-с саластатссстстсал т 5'-С гид для 102 нт мишени

В88-т саластатссстстсал т 5'-Т гид для 102 нт мишени

102 нт мишень оллллтттлтсллллл олотлттолсттлллот стллсстлтлоолтлст тлслосслтсололоо олслостсолстлотсл сстолотсолттооолт оо мишень для g-38G, g-59Л, g75-C и g88-Т гидов

g-38G mm1 сттлолстттллотслл т гид формирует пару с мисматчем в 1 позиции с о-мишенью

g-38G mm2 оАтлолстттллотслл т гид формирует пару с мисматчем в 2 позиции с о-мишенью

g-38G mm3 отАлолстттллотслл т гид формирует пару с мисматчем в 3 позиции с о-мишенью

g-38G mm4 отттолстттллотслл т гид формирует пару с мисматчем в 4 позиции с о-мишенью

§-38а шш5 аTTACACTTTAAаTCAA т гид формирует пару с мисматчем в 5 позиции с а-мишенью

§-38а шшб аттAатстттAAатсAA т гид формирует пару с мисматчем в 6 позиции с а-мишенью

§-38а шш7 GTTAGAGTTTAAGTCAA т гид формирует пару с мисматчем в 7 позиции с а-мишенью

§-38а шш8 аTTAаACЛTTAAаTCAA т гид формирует пару с мисматчем в 8 позиции с а-мишенью

§-38а шш9 аTTAаACTЛTAAаTCAA т гид формирует пару с мисматчем в 9 позиции с а-мишенью

§-38а _шш10 аTTAаACTTЛAAаTCAA т гид формирует пару с мисматчем в 10

позиции с о-мишенью

g-38G mm11 оттлолсттттлотслл т гид формирует пару с мисматчем в 11 позиции с о-мишенью

g-38G mm12 оттлолстттлтотслл т гид формирует пару с мисматчем в 12 позиции с о-мишенью

g-38G mm13 оттлолстттллстслл т гид формирует пару с мисматчем в 13 позиции с о-мишенью

g-38G _mm14 оттлолстттллоАслл т гид формирует пару с мисматчем в 14 позиции с о-мишенью

g-38G mm15 оттлолстттллотолл т гид формирует пару с мисматчем в 15 позиции с о-мишенью

§-38а шш1б аттAаACтттAAатстA т гид формирует пару с мисматчем в 16 позиции с а-мишенью

§-38а шш17 GTTAGACTTTAAGTCAT т гид формирует пару с мисматчем в 17 позиции с а-мишенью

§-38а _шш18 аTTAаACTTTAAаTCAA л гид формирует пару с мисматчем в 18 позиции с а-мишенью

а-мишень тт33 TTTATCAAAAAаAаTAT TGACTTAAAGTCTAAGC TATAааATACTTACAа формирует пару с мисматчем в позиции 1 §38-а гида

а-мишень тт32 TTTATCAAAAAаAаTAT TаACTTAAAаTCTATCC TATAааATACTTACAа формирует пару с мисматчем в позиции 2 §38-а гида

а-мишень тт31 TTTATCAAAAAаAаTAT TаACTTAAAаTCTTACC TATAааATACTTACAа формирует пару с мисматчем в позиции 3 §38-а гида

о-мишень тт30 тттлтслллллолотлт толсттлллотслллсс тлтлоолтлсттлсло формирует пару с мисматчем в позиции 4 g38-G гида

о-мишень тт29 тттлтслллллолотлт толсттлллототллсс тлтлоолтлсттлсло формирует пару с мисматчем в позиции 5 g38-G гида

о-мишень тт28 тттлтслллллолотлт толсттлллолстллсс тлтлоолтлсттлсло формирует пару с мисматчем в позиции 6 g38-G гида

о-мишень тт27 тттлтслллллолотлт толсттлллстстллсс тлтлоолтлсттлсло формирует пару с мисматчем в позиции 7 g38-G гида

о-мишень тт27 тттлтслллллолотлт толсттлллстстллсс тлтлоолтлсттлсло формирует пару с мисматчем в позиции 8 g38-G гида

о-мишень тт26 тттлтслллллолотлт толсттллтотстллсс тлтлоолтлсттлсло формирует пару с мисматчем в позиции 9 g38-G гида

о-мишень тт25 тттлтслллллолотлт толсттлтлотстллсс тлтлоолтлсттлсло формирует пару с мисматчем в позиции 10 g38-G гида

а-мишень тт24 TTTATCAAAAAаAаTAT TGACTTTAAGTCTAACC TATAааATACTTACAа формирует пару с мисматчем в позиции 1 §38-а гида

а-мишень тт23 TTTATCAAAAAаAаTAT TаACTAAAAаTCTAACC TATAааATACTTACAа формирует пару с мисматчем в позиции 11 §38-а гида

а-мишень тт22 TTTATCAAAAAGAGTAT TаACATAAAаTCTAACC TATAааATACTTACAа формирует пару с мисматчем в позиции 12 §38-а гида

а-мишень тт21 TTTATCAAAAAаAаTAT TаAаTTAAAаTCTAACC TATAааATACTTACAа формирует пару с мисматчем в позиции 13 §38-а гида

а-мишень тт20 TTTATCAAAAAаAаTAT TаTCTTAAAаTCTAACC TATAааATACTTACAа формирует пару с мисматчем в позиции 14 §38-а гида

а-мишень тт19 TTTATCAAAAAаAаTAT TCACTTAAAGTCTAACC TATAааATACTTACAа формирует пару с мисматчем в позиции 15 §38-а гида

а-мишень тт18 TTTATCAAAAAаAаTAT AаACTTAAAаTCTAACC TATAааATACTTACAа формирует пару с мисматчем в позиции 1б §38-а гида

тттлтслллллалатлл формирует пару с

талсттлллатстллсс мисматчем в позиции

а-мишень тт17 тлтлаалтлсттлсла 17 §38-а гида

тттлтслллллалаттт формирует пару с

талсттлллатстллсс мисматчем в позиции

а-мишень тт16 тлтлаалтлсттлсла 18 §38-а гида

су3- 50 нт ДНК-мишень с

тттлтслллллалатлт флуоресцентной

талсттлллатстлллс меткой су3 для

Т-мишень Су3 тлтлаалтлсттлсла §-38Т-гида

алтстттллаллаала

лтлтлсслтаслсслсс

лсслтслтслтслсслс

аатаалаатласаала последовательность

алаатластааллста вставки в плазмиду

рШт вставка сл рШт1.2

ллллллллллссссас

сстатслаааасаааа

рШт-мишень вставка тттттттттатллллса лсаасслаталласттс аластсаатлссалстс лааталстлатсалас последовательность вставки в плазмиду рШт1.2

аAттAссAасAаасста

ттAттAасаAтссAаAт

сслаллсссаалсссс

аататсалттааалтаа

стлттсассататссст

стсаAтаастатAAатA

тсстлтлааттлалстт

TAAаTCAATACTCTTTT

таATAAAттттсаааAт

CTGGATCCAAATAGAAT

TCACTаAAAAAAAAAC

сссассалласаааат

таATAACAстасаассA гид для разрезания

§л8-45 л плазмиды рШт

AатастассATAAссAт гид для разрезания

§л8-25 а плазмиды рШт

тAтасAатастассATA гид для разрезания

§л8-20 л плазмиды рШт

AаAAттAтасAатаста гид для разрезания

§л8-15 с плазмиды рШт

ACTGCATAATTCTCTTA гид для разрезания

§л8-10 с плазмиды рШт

§л8-5 талслатллалаллтт лт гид для разрезания плазмиды рШт

gS0 тстсттлстатслтасс л гид для разрезания плазмиды рШт

§л80 тааслталслатллал ал гид для разрезания плазмиды рШт

gЛS+5 лсаалтааслталсла тл гид для разрезания плазмиды рШт

gЛS+10 лтсттлсаалтааслта л гид для разрезания плазмиды рШт

gЛS+15 ллласлтсттлсаалта а гид для разрезания плазмиды рШт

gЛS+20 лслалллласлтсттл са гид для разрезания плазмиды рШт

gЛS+25 слатслслалллласл тс гид для разрезания плазмиды рШт

gЛS+45 лтлслстлттстслалл т гид для разрезания плазмиды рШт

g38-G ЛS+5 лалатлтталсттллла т гид для разрезания плазмиды рШт-мишень

Б-оп AAGGACAGTATTTGGTA т гид для разрезания плазмиды рШт-мишень

§-оп л8+5 CаCAаATACCAAATACT а гид для разрезания плазмиды рШт-мишень

68-1 асаллслтстслалал л гид для разрезания 68 РНК

68-2 ATGAAATATCGGCTCAG гид для разрезания 68 РНК

68-3 ттатаатAтаAAATAтс гид для разрезания 68 РНК

68-4 слслттсттатаатлта гид для разрезания 68 РНК

68-5 тстсаалсаалссала с гид для разрезания 68 РНК

68-6 ллтататсатсаслатт гид для разрезания 68 РНК

68-7 тсAAаатаAAтататса гид для разрезания 68 РНК

6S-8 астатллссстталлсс гид для разрезания 6S РНК

6S-9 саслаастатллссстт гид для разрезания 6S РНК

6S-10 сассаслаастатллсс гид для разрезания 6S РНК