Повышение целевой активности высокоспецифичных форм эндонуклеазы Cas9 путем комбинации случайного и направленного мутагенеза тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, кандидат наук Давлетшин Артем Игоревич

• Давлетшин Артем Игоревич
• кандидат наук
• 2024

Оглавление диссертации кандидат наук Давлетшин Артем Игоревич

Оглавление

Список сокращений

1. Введение

2. Обзор литературы

2.1. Развитие технологии редактирования генома: мегануклеазы, ZFN, TALEN, CRISPR/Cas

2.2. История открытия CRISPR/Cas9

2.3. Характеристика систем CRISPR/Cas

2.4. Механизм работы CRISPR-систем

2.5. Система CRISPR/Cas9 как инструмент редактирования генома

2.6. Перспективы и ограничения системы CRISPR/Cas9 для редактирования генома человека

2.7. Разработка геномных редакторов следующего поколения

2.8. Saccharomyces cerevisiae как модельный объект для редактирования генома

3. Материалы и методы

3.1. Материалы

3.2. Методы

3.2.1. Условия культивации микроорганизмов

3.2.2. Амплификация фрагментов усовершенствованных форм Cas9 и ПЦР-мутагенез

3.2.3. Электрофорез фрагментов ДНК в агарозном геле

3.2.4. Сборка высокоспецифичных вариантов Cas9

3.2.5. Трансформация дрожжевых клеток

3.2.7. Выделение плазмидной ДНК из дрожжей

3.2.8. Приготовление химических компетентных клеток E. coli и трансформация плазмидной ДНК

3.2.9. Выделение плазмидной ДНК из бактерий

3.2.10. ПЦР-анализ плазмидной ДНК

3.2.13. Оценка активности полученных форм Сas9

3.2.14. Оценка специфичности полученных форм Сas9

3.2.15. Молекулярно-динамическое моделирование структур Сав9

3.2.16. Статистический анализ

4. Результаты и обсуждение

4.1. Получение тест-системы для скрининга новых вариантов Сав9

4.2. Комбинации аминокислотных замен, повышающих специфичность и эффективность редактирования ДНК, позволяют оптимизировать свойства Сав9

4.3. Повышение активности новых форм Сав9 путем случайного мутагенеза

4.4. Повышение целевой активности высокоспецифичных форм Cas9 методом

рационального дизайна

5. Заключение

Выводы

Список литературы

Приложения

Список сокращений

Cas - CRISPR associated protein (CRISPR-ассоциированный белок) CRISPR - Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (короткие палиндромные повторы, регулярно расположенные группами) crPHK - CRISPR РНК

DSB - double stranded break (двухцепочечный разрыв ДНК) HR - homologous recombination (гомологичная рекомбинация) KAc - ацетат калия

LB - Lysogeny Broth (лизогенная среда или среда Лурии-Бертани)

MD - molecular dynamics (молекулярная динамика)

NHEJ - non-homologous end joining

ORF - Open Reading Frame (открытая рамка считывания)

PAM - protospacer adjacent motif (мотив, ассоциированный с протоспейсером)

PID - PAM-interacting domain (PAM-распознающий домен)

RNP - ribonucleoprotein particle (рибонуклеопротеин)

SDS - додецилсульфат натрия

sgPHK - single guide РНК

SOB - Super Optimal Broth

TALEN - transcription activator-like effector nuclease

TE/LiAc - Tris-EDTA/ацетат лития

tracrPHK - trans-activating CRISPR RNA

Tris - трис(гидроксиметил)аминометан

YNB - Yeast Nitrogen Base

YPD - yeast extract peptone dextrose medium

ZFN - zinc finger nuclease

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

ПЦР - полимеразная цепная реакция

РНК - рибонуклеиновая кислота

ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота

1. Введение

Актуальность темы исследования

Редактирование генома (целенаправленное внесение изменений в ДНК in vivo) имеет огромное значение как для фундаментальной науки, так и для практического применения в биотехнологии и медицине. Поэтому работы в этой области активно ведутся с 1970-х годов (Smith 1970; Kelly 1970; Belikova 1967). Первые исследования по изменению геномной ДНК в эукариотических клетках были проведены на дрожжах (Scherer 1979). Позднее подобные эксперименты были проведены и с клетками млекопитающих (Smithies 1985; Capecchi 1989). Эксперименты показали, что эукариотические клетки способны встраивать чужеродную ДНК в геном посредством гомологичной рекомбинации (HR). Было замечено, что индукция двухцепочечных разрывов (DSB) в месте предполагаемого редактирования ДНК активирует системы репарации и значительно увеличивает частоту встраивания экзогенной ДНК в геном. Современные методы редактирования геномов основаны на использовании эндонуклеаз, которые вносят DSB и запускают процессы репарации ДНК в клетке (Rouet 1994). На сегодняшний день разработано несколько систем редактирования генома, использующих эндонуклеазы, направляемые на определенные геномные локусы-мишени. Наиболее широко используются системы на основе CRISPR/Cas, в частности CRISPR/Cas9 из бактерии Streptococcus pyogenes. Система CRISPR/Cas (от англ. Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR associated protein) - это адаптивная защитная система бактерий и архей, предохраняющая клетки от чужеродной ДНК. Локус CRISPR кодирует короткие РНК (направляющие РНК или спейсеры), комплементарные участкам чужеродных ДНК (бактериофаги, плазмиды). Направляющие РНК образуют комплекс с эндонуклеазами семейства Cas, способными вносить в ДНК-мишень двухцепочечные разрывы. Комплекс направляющей РНК с Cas-белком «сканирует» ДНК в поисках участков, комплементарных направляющей РНК.

При обнаружении такого участка Cas вносит в него DSB и таким образом инактивирует ДНК-мишень в составе генома бактериофага или чужеродной плазмиды (Garneau 2010; Rauch 2017). Геномные редакторы на основе системы CRISPR/Cas9 получили широкое распространение из-за простоты манипуляций, позволяющих легко нацелить эндонуклеазу Cas9 на определенную последовательность ДНК, в том числе такие системы могут использоваться для редактирования эукариотических геномов. При этом вместе с векторами, кодирующими компоненты системы CRISPR/Cas9, в клетки вносят фрагмент ДНК, фланкированный участками, комплементарными окружению локуса-мишени. В результате происходит интеграция экзогенного фрагмента ДНК по месту двухцепочечного разрыва, осуществляемого Cas9, за счет работы системы HR (Yeh 2019; Anzalone 2020).

Несмотря на то, что система CRISPR/Cas9 стала значимым инструментом редактирования ДНК, геномные редакторы на её основе не лишены недостатков, главным из которых является недостаточно высокая специфичность. Внесение двухцепочечных разрывов в нецелевые локусы геномной ДНК может приводить к нежелательным мутациям и инактивации генов (Fu 2013; Kuscu 2014; Tsai 2015). Это ограничивает применение Cas9 в генетической терапии (van Haasteren 2020). Основой нецелевой активности и источником нежелательных мутаций при использовании технологии CRISPR/Cas9 является способность Cas9 вносить двухцепочечные разрывы при неполной комплементарности направляющей РНК и ДНК-мишени. Поэтому специфичность эндонуклеазы Cas9 является важнейшей характеристикой при разработке методик как редактирования генома в целях фундаментальных научных задач, так и терапевтического применения CRISPR/Cas9 для генетической коррекции.

Для повышения специфичности Cas9 и точности геномного редактирования используются подходы направленной эволюции, метод рационального дизайна, создание химерных белков и др. (Adli 2018; Tao 2023; Saber Sichani 2023; Huang 2022). На сегодняшний день разработано большое количество высокоточных вариантов эндонуклеазы Cas9, но повышение специфичности зачастую

сопровождается значительным снижением активности при расщеплении ДНК-мишени (Jones 2021). Внесение аминокислотных замен, повышающих активность высокоспецифичных вариантов Cas9, может позволить преодолеть этот недостаток, и такие модифицированные варианты могут служить перспективными кандидатами для дальнейшего улучшения технологии редактирования генома с возможностями расширенного использования в терапии наследственных заболеваний.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Повышение целевой активности высокоспецифичных форм эндонуклеазы Cas9 путем комбинации случайного и направленного мутагенеза»

Цель работы

Целью данной работы является получение новых высокоспецифичных и высокоактивных вариантов эндонуклеазы Cas9 из микроорганизма Streptococcus pyogenes.

Задачи работы

1. Получение комбинаций аминокислотных замен, описанных ранее в литературе, повышающих специфичность или активность эндонуклеазы Cas9.

2. Разработка тест-системы на основе дрожжей Saccharomyces cerevisiae для оценки активности и специфичности новых вариантов Cas9.

3. Получение новых аминокислотных замен, повышающих активность высокоточных вариантов Cas9, с использованием случайного мутагенеза in vitro.

4. Получение новых аминокислотных замен, повышающих активность высокоточных форм Cas9 и не влияющих на специфичность, путем рационального дизайна.

Научная новизна

Основным направлением данной работы является получение новых аминокислотных замен, которые достоверно повышают целевую активность высокоспецифичных, но низкоактивных форм эндонуклеазы Cas9 без существенной потери специфичности при использовании в качестве тест-системы дрожжей S. cerevisiae.

Способность Cas9 гидролизовать ДНК бактериофагов и плазмид при неполной комплементарности направляющей РНК с мишенью эволюционно выгодна для бактерий в силу высокой частоты мутаций у бактериофагов, однако становится серьезным недостатком при использовании системы CRISPR/Cas9 в технологии редактирования генома. Кроме того, бактериальные геномы намного меньше эукариотических по размеру, поэтому вероятность присутствия в эукариотическом геноме последовательностей, частично комплементарных той или иной направляющей РНК, достаточно высока. Поэтому первые модификации Cas9 дикого типа были направлены на повышение специфичности. В результате более точные геномные редакторы были получены, но оказалось, что высокоспецифичные эндонуклеазы Cas9, как правило, имеют сниженную эндонуклеазную активность in vivo. При этом известные на сегодня модификации, повышающие активность Cas9, снижают специфичность (Vakulskas 2018). Поэтому следующим шагом в оптимизации системы CRISPR/Cas9 стал поиск таких аминокислотных замен, которые компенсировали бы низкую активность модифицированных форм Cas9 при сохранении высокой специфичности. В нашей работе мутации, повышающие специфичность Cas9, полученные разными коллективами авторов [Cas HF1 (Kleinstiver 2016), eSpCas(1.1) (Slaymaker 2016), HypaCas9 (J. S. Chen 2017), EvoCas9 (Casini 2018), HiFiCas9 (Vakulskas 2018), SniperCas9 (Lee 2018), D1135E (Kleinstiver 2015)] были скомбинированы друг с другом и с двумя аминокислотными заменами D147Y и P411T (iCas), которые повышают активность Cas9 в отношении эукариотического хроматина (Bao 2015) (Таблица 1). В некоторых случаях, такая комбинация приводила к увеличению эндонуклеазной активности Cas9 при сохранении высокой специфичности. Таким образом, представляется перспективным использование комбинаций замен, одни из которых повышают активность, а другие - специфичность Cas9, компенсируя действие друг друга.

Далее в ходе работы путем случайного мутаганаза была получена новая аминокислотная замена L1206P, повышающая активность некоторых высокоточных вариантов Cas9 при сохранении повышенной специфичности.

Новая аминокислотная замена L1206P также повышала эффективность редактирования ДНК в составе стабильной нуклеосомы. Был локализован пространственный регион в составе PAM-распознающего домена (protospacer adjacent motif) Cas9, аминокислотные замены в котором повышают активность работы высокоспецифичных форм Cas9 при использовании в тест-системе S. cerevisiae.

С использованием трехмерной структуры эндонуклеазы Cas9 (Nishimasu 2014; Zhu 2019) и метода рационального дизайна получены новые замены E1341H и A1345L в составе PAM-распознающего домена белка Cas9, повышающие активность высокоточных форм Cas9 при сохранении высокой специфичности.

Для быстрого тестирования специфичности и активности новых модификаций Cas9 была получена тест-система на основе гена ADE2 дрожжей S. cerevisiae. Такой подход делает возможным проверку больших наборов мутаций Cas9 для быстрого отбора наиболее перспективных форм с целью их дальнейшего тестирования для возможности применения при редактировании клеток млекопитающих.

Научная и практическая значимость

На данный момент технология редактирования генома на основе системы CRISPR/Cas9 востребована в таких отраслях, как фундаментальные исследования, биотехнология, генная терапия наследственных заболеваний (Pellagatti 2015; Khalil 2020; Van der Oost 2023). Продемонстрирована возможность использования системы CRISPR/Cas9 для редактирования генома стволовых клеток кишечника человека с целью лечения муковисцидоза (Schwank 2013), гемофилии (Ohmori 2015), мышечной дистрофии Дюшенна на мышиной модели (Min 2019), получение клеток, устойчивых к ВИЧ-1 (Hou 2015; Savic 2016) и др. В 2023 году технология CRISPR/Cas9 была одобрена для клинического применения с целью терапии серповидно-клеточной анемии и ß-талассемии (Wong 2023). Была апробирована методика применения системы CRISPR/Cas9 для лечения транстиретинового амилоидоза in vivo на человеке (Gillmore 2021). Системы

редактирования генома также активно используются в сельском хозяйстве для редактирования геномов растений и получения новых сельскохозяйственных культур (Ma 2016; Nidhi 2021). Получение новых сортов с высокой урожайностью и устойчивостью к вредителям, гербицидам и неблагоприятным воздействиям окружающей среды (морозы, засухи) является важным направлением в сельском хозяйстве.

Однако, как было отмечено выше, природная эндонуклеаза Cas9 обладает рядом недостатков, основным из которых является относительно высокая нецелевая активность, что является главной проблемой для использования системы CRISPR/Cas9 в медицинских целях. Внесение двухцепочечных разрывов в нецелевые локусы при неспецифическом связывании направляющей РНК и геномной ДНК может приводить к нежелательным мутациям, цитотоксичности и онкогенезу (Fu 2013; Kuscu 2014; Tsai 2015). Поэтому специфичность работы эндонуклеазы Cas9 является важнейшей характеристикой при разработке методик терапевтического применения системы CRISPR/Cas9. Эндонуклеазная активность Cas9 является вторым важным параметром, от которого зависит эффективность редактирования (процент клеток, получающих требуемую мутацию при редактировании как in vitro, так и in vivo). Получение новых оптимизированных форм Cas9 способно расширить возможности редактирования геномов в различных областях. Таким образом, разработка отечественных ферментов для редактирования генома является стратегически важным направлением развития биотехнологии и медицины.

В работе получена и апробирована дрожжевая тест-система, позволяющая проводить быстрый скрининг большого количества новых форм Cas9 с целью определения их активности и специфичности, для отбора наиболее удачных вариантов. Получены несколько новых перспективных вариантов Cas9 с повышенной специфичностью и уровнем активности, близким к Cas9 дикого типа (при подборе направляющих РНК к открытым участкам хроматина).

Методология и методы диссертационного исследования

Работа выполнена с использованием современных молекулярно-биологических методов исследования. Для получения плазмидных конструкций, кодирующих усовершенствованные формы эндонуклеазы Cas9 и направляющие РНК, были применены методы сайт-направленного ПЦР-мутагенеза и рекомбинационного клонирования в дрожжах S. cerevisiae. Влияние полученных мутаций на третичную структуру Cas9 оценивали методами молекулярной динамики (MD). Исследования активности и специфичности мутантных эндонуклеаз Cas9 проводились на культуре гаплоидного штамма дрожжей S. cerevisiae BY4741 и его производного варианта BY4741Atrp1.

Положения и результаты, выносимые на защиту

1. 1. Получены новые варианты эндонуклеазы Cas9, несущие комбинации описанных ранее мутаций Cas HF1, eSpCas(1.1), HypaCas9, EvoCas9, HiFiCas9, SniperCas9 и D1135E, повышающих специфичность редактирования ДНК, и мутаций iCas, повышающих эндонуклеазную активность Cas9.

2. Разработана тест-система для быстрой и эффективной оценки активности и специфичности новых вариантов белка Cas9 на дрожжах S. cerevisiae.

3. С помощью случайного мутагенеза в PAM-распознающем домене Cas9 получена новая аминокислотная замена L1206P, повышающая активность некоторых высокоточных вариантов Cas9 при сохранении повышенной специфичности. Замена L1206P повышала активность редактирования ДНК в составе стабильной нуклеосомы. Локализован пространственный регион, аминокислотные замены в котором могут повысить активность высокоспецифичных форм Cas9.

4. Путем рационального дизайна в составе PAM-распознающего домена белка Cas9 получен кластер новых замен, повышающих активность высокоточных форм Cas9 при сохранении их высокой специфичности. Таким образом, PAM-распознающий домен может являться мишенью для модификаций с целью дальнейшей оптимизации свойств эндонуклеазы Cas9.

Личный вклад автора

Основные результаты диссертационной работы получены лично автором и при его непосредственном участии. Автор принимал участие в планировании экспериментов, осуществлял постановку экспериментов, анализ экспериментальных данных, обобщение и подготовку результатов к публикации.

Апробация результатов

Результаты диссертационной работы были представлены на международных и отечественных научных конференциях:

1. Д.С. Спасская, А.И. Давлетшин, Д.С. Карпов. CRISPR/CAS9 как альтернатива контрселекции по URA3 для прицельной интеграции ДНК в геном Saccharomyces cerevisiaell Биотехнология наука и практика 2020, Ялта, 22-26 Сентября, С. 572-573.

2. А.И. Давлетшин, Д.Г. Гарбуз, Д.С. Спасская, В.В. Тютяева, Д.С. Карпов. Разработка новых форм белка SpyCas9 и проверка их активности с использованием тест-системы Saccharomyces cerevisiae на основе гена-мишени ADE2ll XXXIII Зимняя молодежная научная школа, Москва, 8-11 февраля 2021, С. 51.

3. А.И. Давлетшин. Получение варианта SpyCas9, сочетающего высокую эффективность и специфичность редактирования ДНК в дрожжах Saccharomyces cerevisiaell Международный молодежный форум «Ломоносов-2021», Москва, 1223 апреля 2021.

4. D. Karpov, D. Spasskaya, A. Davletshin, D. Garbuz. Restoring of wild-type activity level of high-fidelity SpyCas9 forms// FEBS, Virtual meeting, 3 - 8 July 2021.

5. Davletshin A.I., Spasskaya D.S., Tutaeva V.V., Garbuz D.G., Karpov D.S. Towards next-generation SpyCas9 editors with high on-target activity and specificity// Genome Engineering: CRISPR Frontiers, Virtual meeting, 18 - 20 August 2021.

6. Давлетшин А.И., Спасская Д.С., Тютяева В.В., Гарбуз Д.Г., Карпов Д.С. Получение новых SpyCas9 нуклеаз с повышенной специфичностью

редактирования ДНК в дрожжах Saccharomyces cerevisiae// 3-й Российский микробиологический конгресс, Псков, 26 сентября - 1 октября 2021. С. 127.

7. А.И. Давлетшин, Д.С. Спасская, В.В. Тютяева, Д.Г. Гарбуз, Д.С. Карпов. Получение более специфичных и активных вариантов SpyCas9 редактора путем белковой эволюции// 10-Я ВСЕРОССИЙСКАЯ НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКАЯ КОНФЕРЕНЦИЯ «ГЕНОМНОЕ СЕКВЕНИРОВАНИЕ И РЕДАКТИРОВАНИЕ 2022», Москва, 18 - 19 мая 2022.

8. Давлетшин А.И., Спасская Д.С., Тютяева В.В., Матвеева А.А., Гарбуз Д.Г., Карпов Д.С. Улучшение геномных редакторов на основе S. pyogenes Cas9// 4-й Российский микробиологический конгресс, Томск, 24 - 29 сентября 2023. С. 145.

9. Давлетшин А. И., Спасская Д. С., Тютяева В. В., Матвеева А. А., Гарбуз Д. Г., Карпов Д. С. Повышение активности высокоточных форм Cas9 путем направленного мутагенеза// От микробиологии к генетическим технологиям, Новосибирск, 22 - 25 сентября 2023, С. 82.

10. Матвеева А.А., Давлетшин А.И., Спасская Д.С., Тютяева В.В., Гарбуз Д.Г., Карпов Д.С. Повышение активности высокоточных форм эндонуклеазы Cas9 путем случайного мутагенеза и рационального дизайна// Генетические технологии в исследованиях природных соединений, Владивосток, 3 - 7 октября 2023, С. 80.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 4 печатных работы в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК для публикации материалов диссертационных работ по биологии:

1) Спасская Д.С., Давлетшин А.И., Тютяева В.В., Кулагин К.А., Гарбуз Д.Г., Карпов Д.С. (2022) Тест-система для оценки активности мутантных вариантов Cas9 в дрожжах Saccharomyces cerevisiae. Молекулярная биология, 56(6), 937948.

2) Spasskaya, D. S., Davletshin, A. I., Bachurin, S. S., Tutyaeva, V. V., Garbuz, D.

G., & Karpov, D. S. (2023) Improving the on-target activity of high-fidelity Cas9 editors by combining rational design and random mutagenesis. Applied Microbiology and Biotechnology, 107(7-8), 2385 - 2401.

3) Davletshin, A. I., Matveeva, A. A., Bachurin, S. S., Karpov, D. S., & Garbuz, D. G. (2023) Increasing the Activity of the High-Fidelity SpyCas9 Form in Yeast by Directed Mutagenesis of the PAM-Interacting Domain. International Journal of Molecular Sciences, 25(1), 444.

4) Maxim A. Kovalev, Artem I. Davletshin & Dmitry S. Karpov. (2024) Engineering Cas9: next generation of genomic editors. Applied Microbiology and Biotechnology, 108(1), 209

Структура и объем диссертации

Диссертационная работа изложена на 136 страницах и состоит из разделов: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты и обсуждение», «Заключение», «Выводы», «Список литературы» и «Приложения». Рукопись включает 1 таблицу, 24 рисунка и 4 приложения. Список литературы содержит 226 источника.

2. Обзор литературы

История редактирования генома началась в 1970-х годах, когда была показана возможность модификации нуклеиновых кислот in vivo с помощью гомологичной рекомбинации (HR). Редактирование генома живой клетки открыло новые возможности для молекулярной биологии и биохимии (Capecchi 1989). Однако использование HR для генетической модификации имело множество ограничений и не всегда давало стабильный результат. В попытке преодолеть эти ограничения было замечено, что внесение двухцепочечных разрывов (DSB) в ДНК многократно увеличивает частоту гомологичной рекомбинации и позволяет более эффективно вносить изменения в гены-мишени. С этого момента главными инструментами для редактирования генома стали эндонуклеазы, которые вносили DSB в геномную ДНК.

Системы репарации клетки используют два основных пути восстановления разрывов ДНК. В большинстве случаев активируется система негомологичного соединения концов (NHEJ), которая соединяет поврежденные концы молекулы ДНК с помощью лигазы и не нуждается в идентичных последовательностях ДНК, использующихся при репарации по механизму гомологичной рекомбинации (Chang 2017). Система NHEJ работает с меньшей точностью, чем гомологичная рекомбинация, и репарация разрывов ДНК с ее участием часто сопровождается инсерциями или делециями («инделами»). Редактирование геномов с использованием системы NHEJ может использоваться для инактивации генов за счет сдвига рамки считывания при появлении «инделов» (Chang 2017; Courtney 2016; Zhen 2015; S. Chen 2016). Если же нужно внести в геном экзогенный фрагмент ДНК, то используется механизм репарации по пути HR. Редактирование по этому пути требует использования фрагмента ДНК, несущего целевое изменение, фланкированного участками, гомологичными окружению редактируемого локуса, а также наличия в клетке активной системы HR (Sung 2006; Xue 2021). В этом заключается одна из основных проблем современных

технологий редактирования генома: необходимо направить репарацию по пути гомологичной рекомбинации и выбрать эндонуклеазу для внесения DSB в строго определенный локус генома.

На сегодняшний день существуют четыре системы редактирования генома, в основе которых лежит использование программируемых эндонуклеаз: мегануклеазы, Zinc Finger Nucleases (ZFN), Transcription activator-like effector nucleases (TALEN), CRISPR/Cas (Gaj 2013).

2.1. Развитие технологии редактирования генома: мегануклеазы, ZFN, TALEN, CRISPR/Cas Мегануклеазы. Первыми геномными редакторами, использованными для внесения специфичных двухцепочечных разрывов, были мегануклеазы (Epinat 2003). Мегануклеазы - это высокоспецифичные эндонуклеазы, имеющие большой сайт распознавания от 14 до 40 нуклеотидов. Главное преимущество таких геномных редакторов заключается в уникальности распознаваемой последовательности (Silva 2011). Выделяют несколько структурных семейств мегануклеаз, самым распространенным и изученным из которых является семейство LAGLIDADG. Последовательность LAGLIDADG представляет собой консервативную аминокислотную последовательность, которая участвует в ферментативной активности белка. В данное семейство входят самые распространенные мегануклеазы I-CreI и I-SceI (Chevalier 2005).

Существенным недостатком геномных редакторов на основе мегануклеаз оказался малый набор доступных ДНК-мишеней, из-за чего вероятность обнаружения белка со специфичностью к целевому локусу генома была крайне низкой. При этом создание белков с новой специфичностью является трудоемким процессом из-за сложности разделения нуклеазного и ДНК-связывающего доменов нуклеазы. Использование эндонуклеаз значительно расширило возможности целевого редактирования генов, однако большая часть генома все еще была недоступна для редактирования с использованием мегануклеаз.

Zinc Finger Nucleases (ZFN). Следующий шаг на пути развития технологии редактирования генома стало открытие и использование белков с доменами типа "цинковый палец" (zinc finger, ZF). "Цинковые пальцы" представляют собой небольшие белковые домены, которые стабилизируются ионами цинка и способны специфически связываться с ДНК. При этом каждый "цинковый палец" распознает 3 нуклеотида. Расшифровка кода "цинковых пальцев" и объединение нескольких ZF-доменов в одном белке позволили создавать искусственные ДНК-связывающие домены, которые можно нацелить на желаемое место в геноме (Gaj 2013). Получение химерного белка из нескольких "цинковых пальцев" и домена расщепления ДНК эндонуклеазы FokI привело к созданию программируемых нуклеаз (ZFN). Создание ZFN не только значительно расширило возможности для редактирования геномов в живых клетках, но и открыло возможность терапевтического применения редакторов генома (Miller 2007).

Тranscription activator-like effectors (TALE). Следующий шаг в разработке искусственных нуклеаз был сделан после открытия эффекторов, подобных активаторам транскрипции - TALE (от англ. transcription activator-like effectors). В природе такие белки являются факторами вирулентности бактерий-фитопаразитов из рода Xanthomonas. Бактерии, заражая клетки растений, синтезируют TALE, которые проникают в ядро растительной клетки и перестраивают ее метаболизм для обеспечения потребностей бактерий (Lee 2016; Закиян 2018).

Структура TALE представляет собой повторы аминокислотных модулей, каждый из которых распознает 1 нуклеотид в ДНК. Такая структура позволила быстро расшифровать "TALE-код" и составить таблицу, по которой можно комбинировать модули для нацеливания TALE на нужный участок генома. Подобно цинковым пальцам, объединение эндонуклеазы FokI с подобранной комбинацией модулей TALE позволило получить программируемую нуклеазу, называемую Transcription activator-like effector nuclease (TALEN) (Christian 2010; Li 2011; Gupta 2014; Maeder 2016). По сравнению с ZFN, TALEN легче собирать из подобранных модулей, и они менее цитотоксичны. Однако не все участки

генома поддаются модификации с помощью стратегии, основанной на TALEN (Wei 2013; Cox 2015; Becker 2021).

Постепенное улучшение геномных редакторов последовательно увеличивало эффективность редактирования генома. Однако нацеливание искусственных нуклеаз на новые локусы генома требовало разработки индивидуального геномного редактора для каждой новой генно-инженерной задачи. Поэтому широкое распространение ZFNs и TALENs было ограничено из-за трудностей при белковой инженерии новых нуклеаз.

CRISPR/Cas. Система CRISPR/Cas произвела революцию и сделала геномное редактирование простым и быстрым процессом. CRISPR - это особые локусы в геноме бактерий и архей, которые вместе с белками Cas участвуют в защите клеток от чужеродных нуклеиновых кислот, таких как вирусы и плазмиды. Любая CRISPR/Cas система состоит из двух принципиальных элементов: CRISPR-кассет и Cas-белков. CRISPR-кассета выполняет роль памяти о патогенах, ранее встреченных клеткой, и является источником коротких РНК (сгРНК), которые комплементарны чужеродной ДНК или РНК. Cas-белки могут выполнять разные функции, но в большинстве случаев в каждой системе CRISPR/Cas присутствуют специфические эндонуклеазы, которые в комплексе с сгРНК распознают чужеродные нуклеиновые кислоты, вносят в них разрывы и таким образом инактивируют (Gasiunas 2012).

Использование белков Cas для внесения двухцепочечных разрывов и программируемого расщепления ДНК было впервые предложено в 2012 году (Jinek 2012). Наиболее удобным для использования оказался белок Cas9 из S. pyogenes. В отличие от систем TALEN и ZFN, при использовании CRISPR/Cas9 место внесения двухцепочечных разрывов в геном определяет не аминокислотная последовательность белка, а короткая РНК длиной 20 нуклеотидов, которая вносится в клетки вместе с эндонуклеазой Cas и может быть легко синтезирована в соответствии с последовательностью локуса-мишени (Wei 2013).

Таким образом, использование CRISPR/Cas для редактирования геномов не требует белковой инженерии, и единственное ограничение состоит в

необходимости наличия короткой последовательности PAM (Protospacer adjacent motif), состоящей из нескольких нуклеотидов перед выбранной ДНК-мишенью. В геноме последовательность PAM встречается достаточно часто, в среднем каждые 8 - 16 нуклеотидов (Cho 2013; Hu 2018), поэтому геномные редакторы на основе CRISPR/Cas9 быстро стали самой простой и удобной системой редактирования генома (Adli 2018).

2.2. История открытия CRISPR/Cas9

Локусы CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats -короткие палиндромные повторы, регулярно расположенные группами) были обнаружены в геномах бактерий в 1980-х годах, но долгое время их функции были не известны (Ishino 1987; Mojica 1993; Mojica 1995). Структура локусов CRISPR представлена прямыми повторяющимися последовательностями, которые разделены уникальными спейсерами - участками ДНК, которые комплементарны чужеродным нуклеиновым кислотам. В 2002 году были открыты гены, ассоциированные с локусами CRISPR, названные Cas (CRISPR-associated proteins) (Jansen 2002). Распространенность генов Cas и локусов CRISPR оказалась невероятно высока: они обнаруживались в отсеквенированных геномах примерно 40% бактерий и 90% архей (Marraffini 2010; Волотовский 2017).

С развитием методов секвенирования и пополнением базы GenBank появилась возможность сопоставить последовательности спейсеров с отсеквенированными ДНК. Поиск совпадений показал, что спейсеры в локусах CRISPR гомологичны последовательностям ДНК из бактериофагов и плазмид, впоследствии названным протоспейсерами (Mojica 2005). Из этого был сделан вывод о роли CRISPR/Cas в качестве аналога иммунной системы, помогающего прокариотам защищаться от чужеродных генетических элементов (Makarova 2006). Дальнейшее изучение систем CRISPR/Cas привело к открытию мотива, ассоциированного с протоспейсером - PAM (от англ. protospacer adjacent motif). Такая последовательность из нескольких нуклеотидов необходима для встраивания новых протоспейсеров в локусы CRISPR и позволяет бактерии

отличать собственную ДНК от чужеродной. PAM необходим для работы некоторых типов систем CRISPR/Cas, в частности систем типа IIA, к которым относится Cas9 (Mojica 2009; Shah 2013; Sternberg 2014).

В дальнейшем теория об иммунной системе прокариот была подтверждена экспериментально. Была продемонстрирована возможность специфично обеспечить защиту Escherichia coli от фага X (Brouns 2008). При этом была показана необходимость наличия транскриптов CRISPR-кассеты (crPHK) для работы белков Cas. Эти же эксперименты косвенно продемонстрировали, что мишенью CRISPR/Cas является фаговая ДНК. Чуть позднее было показано, что система CRISPR/Cas специфически расщепляет двухцепочечную ДНК плазмид и бактериофагов внутри последовательности протоспейсера в определенных местах рядом с PAM (Garneau 2010; Shah 2013). Это позволило предположить, что белки Cas могут работать как направляемые нуклеазы, которые можно специфичным образом нацеливать на различные ДНК-мишени, подбирая к ним соответствующие crPHK.

На сегодня известны два класса систем CRISPR/Cas, в составе каждого класса присутствуют несколько типов CRISPR-кассет и белков Cas, отличающихся по структуре и механизмам функционирования. Наиболее широко используемая в геномном редактировании система CRISPR/Cas9 относится к второму типу класса 2 (рис. 1). Особенностью этой системы является участие в ее работе дополнительной малой РНК, ^га^РИК от англ. trans-activating CRISPR RNA), необходимой для созревания направляющей РНК (crPHK) (Deltcheva 2011). Было показано, что система CRISPR/Cas9 Streptococcus thermophilus может быть перенесена в E. coli и что эта система обеспечивает защиту от трансформации чужеродными плазмидами и фаговой инфекции (Sapranauskas 2011). При этом также было установлено, что Cas9 является единственным необходимым белком для защиты, обеспечиваемой CRISPR (Gasiunas 2012). Стало понятно, что для работы системы CRISPR/Cas9 нужны всего лишь 3 компонента: crPHK, tracrPHK и белок Cas9, которые, возможно, могут работать не только в бактериях, но и в других организмах.

Таким образом, основные механизмы работы системы CRISPR/Cas9 были раскрыты, и была выдвинута гипотеза о возможности нацелить ее не только на фаговые и плазмидные ДНК, но и на любые другие ДНК-мишени. И уже в 2012 году объединенная группа Дженнифер Дудны и Эммануэль Шарпантье почти одновременно с группой Виргиниюса Шикшниса опубликовали первые работы, продемонстрировавшие потенциал системы CRISPR/Cas9 для использования в качестве программируемого редактора генома, в том числе и в клетках человека (Jinek 2012; Gasiunas 2012; Jinek 2013). При этом удалось еще больше упростить систему, объединив сгРНК и tracrPHK в одну химерную направляющую РНК или sgPHK (от англ. single guide RNA).

Таким образом, интерес к белкам Cas, как геномным редакторам, был вызван прежде всего простотой подбора новых ДНК-мишеней, так как избирательность Cas9 является следствием комплементарности направляющей РНК и редактируемой ДНК, а не модификаций самого белка (в отличие от ZFN и TALEN).

2.3. Характеристика систем CRISPR/Cas Общая структура систем CRISPR/Cas. В настоящее время наиболее широко используются редакторы генома на основе Cas9 из S. pyogenes. Однако системы CRISPR/Cas характеризуются большим разнообразием и различаются между собой как структурно, так и функционально, хотя в целом имеют общий план строения (рис. 1). Любая система CRISPR/Cas состоит из двух принципиальных элементов: CRISPR-кассет и Cas-белков.

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Давлетшин Артем Игоревич, 2024 год

Список литературы

1. Abraham, M. J., Murtola, T., Schulz, R., Pall, S., Smith, J. C., Hess, B., & Lindahl, E. (2015). GROMACS: High performance molecular simulations through multi-level parallelism from laptops to supercomputers. SoftwareX, 1, 19-25.

2. Adli M (2018). The CRISPR tool kit for genome editing and beyond. Nature communications, 9(1), 1911.

3. Allemailem, K. S., Almatroodi, S. A., Almatroudi, A., Alrumaihi, F., Al Abdulmonem, W., Al-Megrin, W. A. I., ... & Khan, A. A. (2023). Recent Advances in Genome-Editing Technology with CRISPR/Cas9 Variants and Stimuli-Responsive Targeting Approaches within Tumor Cells: A Future Perspective of Cancer Management. International Journal of Molecular Sciences, 24(8), 7052.

4. Allen, E. H., Courtney, D. G., Atkinson, S. D., Moore, J. E., Mairs, L., Poulsen, E. T., ... & Moore, C. T. (2016). Keratin 12 missense mutation induces the unfolded protein response and apoptosis in Meesmann epithelial corneal dystrophy. Human molecular genetics, 25(6), 1176-1191.

5. Anantharaman, V., Makarova, K. S., Burroughs, A. M., Koonin, E. V., & Aravind, L. (2013). Comprehensive analysis of the HEPN superfamily: identification of novel roles in intra-genomic conflicts, defense, pathogenesis and RNA processing. Biology direct, <5(1), 1-28.

6. Anders, C., Niewoehner, O., Duerst, A., & Jinek, M. (2014). Structural basis of PAM-dependent target DNA recognition by the Cas9 endonuclease. Nature, 513(7519), 569-573.

7. Anzalone, A. V., Koblan, L. W., & Liu, D. R. (2020). Genome editing with CRISPR-Cas nucleases, base editors, transposases and prime editors. Nature biotechnology, 35(7), 824-844.

8. Bao, Z., Xiao, H., Liang, J., Zhang, L., Xiong, X., Sun, N., ... & Zhao, H. (2015). Homology-integrated CRISPR-Cas (HI-CRISPR) system for one-step

multigene disruption in Saccharomyces cerevisiae. ACS synthetic biology, 4(5), 585594.

9. Barrangou, R. (2012). RNA-mediated programmable DNA cleavage. Nature biotechnology, 30(9), 836-838.

10. Barrangou, R., & Marraffini, L. A. (2014). CRISPR-Cas systems: prokaryotes upgrade to adaptive immunity. Molecular cell, 54(2), 234-244.

11. Becker, S., & Boch, J. (2021). TALE and TALEN genome editing technologies. Gene and Genome Editing, 2, 100007.

12. Belikova, A. M., Zarytova, V. F., & Grineva, N. I. (1967). Synthesis of ribonucleosides and diribonucleoside phosphates containing 2-chloro-ethylamine and nitrogen mustard residues. Tetrahedron letters, 8(37), 3557-3562.

13. Birnboim, H., & Doly, J. (1979). A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA. Nucleic acids research, 7(6), 1513-1523.

14. Bisaria, N., Jarmoskaite, I., & Herschlag, D. (2017). Lessons from enzyme kinetics reveal specificity principles for RNA-guided nucleases in RNA interference and CRISPR-based genome editing. Cell systems, 4(1), 21-29.

15. Bravo, J. P., Liu, M. S., Hibshman, G. N., Dangerfield, T. L., Jung, K., McCool, R. S., ... & Taylor, D. W. (2022). Structural basis for mismatch surveillance by CRISPR-Cas9. Nature, 603(7900), 343-347.

16. Brouns, S. J., Jore, M. M., Lundgren, M., Westra, E. R., Slijkhuis, R. J., Snijders, A. P., ... & Van Der Oost, J. (2008). Small CRISPR RNAs guide antiviral defense in prokaryotes. Science, 327(5891), 960-964.

17. Capecchi, M. R. (1989). Altering the genome by homologous recombination. Science, 244(4910), 1288-1292.

18. Carroll, D. (2012). A CRISPR approach to gene targeting. Molecular Therapy, 20(9), 1658-1660.

19. Casalino, L., Nierzwicki, L., Jinek, M., & Palermo, G. (2020). Catalytic mechanism of non-target DNA cleavage in CRISPR-Cas9 revealed by ab initio molecular dynamics. ACS catalysis, 70(22), 13596-13605.

20. Casini, A., Olivieri, M., Petris, G., Montagna, C., Reginato, G., Maule, G., ... & Cereseto, A. (2018). A highly specific SpCas9 variant is identified by in vivo screening in yeast. Nature biotechnology., 36(3), 265-271.

21. Chang, H. H., Pannunzio, N. R., Adachi, N., & Lieber, M. R. (2017). Nonhomologous DNA end joining and alternative pathways to double-strand break repair. Nature reviews Molecular cell biology, 18(8), 495-506.

22. Chen, J. S., Dagdas, Y. S., Kleinstiver, B. P., Welch, M. M., Sousa, A. A., Harrington, L. B., ... & Doudna, J. A. (2017). Enhanced proofreading governs CRISPR-Cas9 targeting accuracy. Nature, 550(7676), 407-410.

23. Chen, S., Lee, B., Lee, A. Y. F., Modzelewski, A. J., & He, L. (2016). Highly efficient mouse genome editing by CRISPR ribonucleoprotein electroporation of zygotes. Journal of Biological Chemistry, 291(28), 14457-14467.

24. Chen, X., Liu, J., Janssen, J. M., & Gonfalves, M. A. (2017). The chromatin structure differentially impacts high-specificity CRISPR-Cas9 nuclease strategies. Molecular Therapy-Nucleic Acids, 8, 558-563.

25. Chen, X., Rinsma, M., Janssen, J. M., Liu, J., Maggio, I., & Gonfalves, M. A. (2016). Probing the impact of chromatin conformation on genome editing tools. Nucleic acids research, 44(13), 6482-6492.

26. Cheng, H., Zhang, F., & Ding, Y. (2021). CRISPR/Cas9 delivery system engineering for genome editing in therapeutic applications. Pharmaceutics, 13(10), 1649.

27. Chevalier, B., Monnat, R. J., & Stoddard, B. L. (2005). The LAGLIDADG homing endonuclease family. Homing endonucleases and inteins, 33-47.

28. Cho, S. W., Kim, S., Kim, J. M., & Kim, J. S. (2013). Targeted genome engineering in human cells with the Cas9 RNA-guided endonuclease. Nature biotechnology, 31(3), 230-232.

29. Christian, M., Cermak, T., Doyle, E. L., Schmidt, C., Zhang, F., Hummel, A., ... & Voytas, D. F. (2010). Targeting DNA double-strand breaks with TAL effector nucleases. Genetics, 186(2), 757-761.

30. Cofsky, J. C., Soczek, K. M., Knott, G. J., Nogales, E., & Doudna, J. A. (2022). CRISPR-Cas9 bends and twists DNA to read its sequence. Nature structural & molecular biology, 29(4), 395-402.

31. Collias, D., Leenay, R. T., Slotkowski, R. A., Zuo, Z., Collins, S. P., McGirr, B. A., ... & Beisel, C. L. (2020). A positive, growth-based PAM screen identifies noncanonical motifs recognized by the S. pyogenes Cas9. Science advances, 6(29), eabb4054.

32. Concordet, J. P., & Haeussler, M. (2018). CRISPOR: intuitive guide selection for CRISPR/Cas9 genome editing experiments and screens. Nucleic acids research, 46(W1), W242-W245.

33. Cong, L., Ran, F. A., Cox, D., Lin, S., Barretto, R., Habib, N., ... & Zhang, F. (2013). Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science, 339(6121), 819-823.

34. Corsi, G. I., Qu, K., Alkan, F., Pan, X., Luo, Y., & Gorodkin, J. (2022). CRISPR/Cas9 gRNA activity depends on free energy changes and on the target PAM context. Nature Communications, 13(1), 3006.

35. Courtney, D. G., Moore, J. E., Atkinson, S. D., Maurizi, E., Allen, E. H. A., Pedrioli, D. M. L., ... & Moore, C. B. T. (2016). CRISPR/Cas9 DNA cleavage at SNP-derived PAM enables both in vitro and in vivo KRT12 mutation-specific targeting. Gene therapy, 23(1), 108-112.

36. Cox, D. B. T., Platt, R. J., & Zhang, F. (2015). Therapeutic Genome Editing: Prospects and Challenges. Nature medicine, 21(2), 121.

37. Cradick, T. J., Fine, E. J., Antico, C. J., & Bao, G. (2013). CRISPR/Cas9 systems targeting P-globin and CCR5 genes have substantial off-target activity. Nucleic acids research, 41(20), 9584-9592.

38. Daer, R., Hamna, F., Barrett, C. M., & Haynes, K. A. (2020). Site-directed targeting of transcriptional activation-associated proteins to repressed chromatin restores CRISPR activity. APL bioengineering, 4(1).

39. Datsenko, K. A., Pougach, K., Tikhonov, A., Wanner, B. L., Severinov, K., & Semenova, E. (2012). Molecular memory of prior infections activates the CRISPR/Cas adaptive bacterial immunity system. Nature communications, 3(1), 945.

40. Degreif, D., Kremenovic, M., Geiger, T., & Bertl, A. (2018). Preloading budding yeast with all-in-one CRISPR/Cas9 vectors for easy and high-efficient genome editing. Journal of Biological Methods, 5(3).

41. Deltcheva, E., Chylinski, K., Sharma, C. M., Gonzales, K., Chao, Y., Pirzada, Z. A., ... & Charpentier, E. (2011). CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III. Nature, 471(7340), 602-607.

42. DiCarlo, J. E., Norville, J. E., Mali, P., Rios, X., Aach, J., & Church, G. M. (2013). Genome engineering in Saccharomyces cerevisiae using CRISPR-Cas systems. Nucleic acids research, 41(7), 4336-4343.

43. Ding, X., Seebeck, T., Feng, Y., Jiang, Y., Davis, G. D., & Chen, F. (2019). Improving CRISPR-Cas9 genome editing efficiency by fusion with chromatin-modulating peptides. The CRISPR journal, 2(1), 51-63.

44. Dubois, M. (2022). And... cut! Identifying chromatin features affecting CRISPR-Cas9 activity in plants.

45. Duina, A. A., Miller, M. E., & Keeney, J. B. (2014). Budding yeast for budding geneticists: a primer on the Saccharomyces cerevisiae model system. Genetics, 197(1), 33-48.

46. Dunbar, C. E., High, K. A., Joung, J. K., Kohn, D. B., Ozawa, K., & Sadelain, M. (2018). Gene therapy comes of age. Science (New York, NY), 359(6372), eaan4672.

47. Epinat, J. C., Arnould, S., Chames, P., Rochaix, P., Desfontaines, D., Puzin, C., ... & Lacroix, E. (2003). A novel engineered meganuclease induces homologous recombination in yeast and mammalian cells. Nucleic acids research, 31(11), 2952-2962.

48. Ergunay, T., Ayhan, O., Celen, A. B., Georgiadou, P., Pekbilir, E., Abaci, Y. T., ... & Sahin, U. (2022). Sumoylation of Cas9 at lysine 848 regulates protein stability and DNA binding. Life Science Alliance, 5(4).

49. Evitt, N. H., Mascharak, S., & Altman, R. B. (2015). Human germline CRISPR-Cas modification: toward a regulatory framework. The American Journal of Bioethics, 15(12), 25-29.

50. Farzadfard, F., Perli, S. D., & Lu, T. K. (2013). Tunable and multifunctional eukaryotic transcription factors based on CRISPR/Cas. ACS synthetic biology, 2(10), 604-613.

51. Forster, J., Famili, I., Fu, P., Palsson, B. 0., & Nielsen, J. (2003). Genome-Scale Reconstruction of the Saccharomyces cerevisiae Metabolic Network. Genome Research, 13(2), 244.

52. Fu, Y., Foden, J. A., Khayter, C., Maeder, M. L., Reyon, D., Joung, J. K., & Sander, J. D. (2013). High frequency off-target mutagenesis induced by CRISPR-Cas nucleases in human cells. Nature biotechnology, 31(9), 822.

53. Fu, Y., Foden, J. A., Khayter, C., Maeder, M. L., Reyon, D., Joung, J. K., & Sander, J. D. (2013). High-frequency off-target mutagenesis induced by CRISPR-Cas nucleases in human cells. Nature biotechnology, 31(9), 822-826.

54. Fu, Y., Sander, J. D., Reyon, D., Cascio, V. M., & Joung, J. K. (2014). Improving CRISPR-Cas nuclease specificity using truncated guide RNAs. Nature biotechnology, 32(3), 279-284.

55. Gaj, T., Gersbach, C. A., & Barbas, C. F. (2013). ZFN, TALEN, and CRISPR/Cas-based methods for genome engineering. Trends in biotechnology, 31(7), 397-405.

56. Galindo-Murillo, R., Robertson, J. C., Zgarbova, M., Sponer, J., Otyepka, M., Jurecka, P., & Cheatham III, T. E. (2016). Assessing the current state of amber force field modifications for DNA. Journal of chemical theory and computation, 12(8), 4114-4127.

57. Garneau, J. E., Dupuis, M. E., Villion, M., Romero, D. A., Barrangou, R., Boyaval, P., ... & Moineau, S. (2010). The CRISPR/Cas bacterial immune system cleaves bacteriophage and plasmid DNA. Nature, 468(7320), 67-71.

58. Garrett, R. A., Vestergaard, G., & Shah, S. A. (2011). Archaeal CRISPR-based immune systems: exchangeable functional modules. Trends in microbiology, 19(11), 549-556.

59. Gasiunas, G., Barrangou, R., Horvath, P., & Siksnys, V. (2012). Cas9-crRNA ribonucleoprotein complex mediates specific DNA cleavage for adaptive immunity in bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences, 109(39), E2579-E2586.

60. Gertz, M. A., Benson, M. D., Dyck, P. J., Grogan, M., Coelho, T., Cruz, M., ... & Merlini, G. (2015). Diagnosis, prognosis, and therapy of transthyretin amyloidosis. Journal of the American College of Cardiology, 66(21), 2451-2466.

61. Gietz, R. D., & Schiestl, R. H. (2007). High-efficiency yeast transformation using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method. Nature protocols, 2(1), 31-34.

62. Gillmore, J. D., Gane, E., Taubel, J., Kao, J., Fontana, M., Maitland, M. L., ... & Lebwohl, D. (2021). CRISPR-Cas9 in vivo gene editing for transthyretin amyloidosis. New England Journal of Medicine, 385(6), 493-502.

63. Globyte, V., Lee, S. H., Bae, T., Kim, J. S., & Joo, C. (2019). CRISPR/Cas9 searches for a protospacer adjacent motif by lateral diffusion. The EMBO journal, 38(4), e99466.

64. Greiner, J. V., Lindsay, M. E., Kenyon, K. R., Herman, J. P., & Reddy, C. V. (2017). Meesmann epithelial corneal dystrophy: recurrence following photorefractive keratectomy. Canadian Journal of Ophthalmology, 52(6), e211-e213.

65. Gupta, R. M., & Musunuru, K. (2014). Expanding the genetic editing tool kit: ZFNs, TALENs, and CRISPR-Cas9. The Journal of clinical investigation, 124(10), 4154-4161.

66. Haft, D. H., Selengut, J., Mongodin, E. F., & Nelson, K. E. (2005). A guild of 45 CRISPR-associated (Cas) protein families and multiple CRISPR/Cas subtypes exist in prokaryotic genomes. PLoS computational biology, 1(6), e60.

67. Hakim, C. H., Kumar, S. R., Perez-Lopez, D. O., Wasala, N. B., Zhang, D., Yue, Y., ... & Duan, D. (2021). Cas9-specific immune responses compromise local and

systemic AAV CRISPR therapy in multiple dystrophic canine models. Nature communications, 12(1), 6769.

68. Hall, B., Cho, A., Limaye, A., Cho, K., Khillan, J., & Kulkarni, A. B. (2018). Genome editing in mice using CRISPR/Cas9 technology. Current protocols in cell biology, 81(1), e57.

69. Handelmann, C. R., Tsompana, M., Samudrala, R., & Buck, M. J. (2023). The impact of nucleosome structure on CRISPR/Cas9 fidelity. Nucleic Acids Research, 51(5), 2333-2344.

70. Heler, R., Samai, P., Modell, J. W., Weiner, C., Goldberg, G. W., Bikard, D., & Marraffini, L. A. (2015). Cas9 specifies functional viral targets during CRISPR-Cas adaptation. Nature, 519(7542), 199-202.

71. Hilleman, M. R. (1987). Yeast recombinant hepatitis B vaccine. Infection, 15(1), 3-7.

72. Hilton, I. B., D'ippolito, A. M., Vockley, C. M., Thakore, P. I., Crawford, G. E., Reddy, T. E., & Gersbach, C. A. (2015). Epigenome editing by a CRISPR-Cas9-based acetyltransferase activates genes from promoters and enhancers. Nature biotechnology, 33(5), 510-517.

73. Hoffman, C. S., & Winston, F. (1987). A ten-minute DNA preparation from yeast efficiently releases autonomous plasmids for transformaion of Escherichia coli. Gene, 57(2-3), 267-272.

74. Hou, P., Chen, S., Wang, S., Yu, X., Chen, Y., Jiang, M., ... & Guo, D. (2015). Genome editing of CXCR4 by CRISPR/cas9 confers cells resistant to HIV-1 infection. Scientific reports, 5(1), 15577.

75. Hu, J. H., Miller, S. M., Geurts, M. H., Tang, W., Chen, L., Sun, N., ... & Liu, D. R. (2018). Evolved Cas9 variants with broad PAM compatibility and high DNA specificity. Nature, 556(7699), 57-63.

76. Hu, W., Kaminski, R., Yang, F., Zhang, Y., Cosentino, L., Li, F., ... & Khalili, K. (2014). RNA-directed gene editing specifically eradicates latent and prevents new HIV-1 infection. Proceedings of the National Academy of Sciences, 111(31), 11461-11466.

77. Huang, H., Lv, W., Li, J., Huang, G., Tan, Z., Hu, Y., ... & Lin, Y. (2023). Comparison of DNA targeting CRISPR editors in human cells. Cell & Bioscience., 13(1), 11.

78. Huang, X., Yang, D., Zhang, J., Xu, J., & Chen, Y. E. (2022). Recent advances in improving gene-editing specificity through CRISPR-Cas9 nuclease engineering. Cells, 11(14), 2186.

79. Hussain, W., Mahmood, T., Hussain, J., Ali, N., Shah, T., Qayyum, S., & Khan, I. (2019). CRISPR/Cas system: a game changing genome editing technology, to treat human genetic diseases. Gene, 685, 70-75.

80. Hwang, W. Y., Fu, Y., Reyon, D., Maeder, M. L., Tsai, S. Q., Sander, J. D., ... & Joung, J. K. (2013). Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system. Nature biotechnology, 31(3), 227-229.

81. Isaac, R. S., Jiang, F., Doudna, J. A., Lim, W. A., Narlikar, G. J., & Almeida, R. (2016). Nucleosome breathing and remodeling constrain CRISPR-Cas9 function. Elife, 5, e13450.

82. Ishino, Y., Shinagawa, H., Makino, K., Amemura, M., & Nakata, A. (1987). Nucleotide sequence of the iap gene, responsible for alkaline phosphatase isozyme conversion in Escherichia coli, and identification of the gene product. Journal of bacteriology, 169(12), 5429-5433.

83. Ivanov, I. E., Wright, A. V., Cofsky, J. C., Aris, K. D. P., Doudna, J. A., & Bryant, Z. (2020). Cas9 interrogates DNA in discrete steps modulated by mismatches and supercoiling. Proceedings of the National Academy of Sciences, 117(11), 58535860.

84. Jackson, R. N., Golden, S. M., van Erp, P. B., Carter, J., Westra, E. R., Brouns, S. J., ... & Wiedenheft, B. (2014). Crystal structure of the CRISPR RNA-guided surveillance complex from Escherichia coli. Science, 345(6203), 1473-1479.

85. Jansen, R., Embden, J. D. V., Gaastra, W., & Schouls, L. M. (2002). Identification of genes that are associated with DNA repeats in prokaryotes. Molecular microbiology, 43(6), 1565-1575.

86. Jiang, C., & Pugh, B. F. (2009). A compiled and systematic reference map of nucleosome positions across the Saccharomyces cerevisiae genomes. Genome biology, 70(10), 1-11.

87. Jiang, F., Taylor, D. W., Chen, J. S., Kornfeld, J. E., Zhou, K., Thompson, A. J., ... & Doudna, J. A. (2016). Structures of a CRISPR-Cas9 R-loop complex primed for DNA cleavage. Science, 351(6275), 867-871.

88. Jiang, F., Zhou, K., Ma, L., Gressel, S., & Doudna, J. A. (2015). A Cas9-guide RNA complex preorganized for target DNA recognition. Science, 348(6242), 1477-1481.

89. Jinek, M., Chylinski, K., Fonfara, I., Hauer, M., Doudna, J. A., & Charpentier, E. (2012). A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. science, 337(6096), 816-821.

90. Jinek, M., East, A., Cheng, A., Lin, S., Ma, E., & Doudna, J. (2013). RNA-programmed genome editing in human cells. eLife, 2.

91. Jinek, M., Jiang, F., Taylor, D. W., Sternberg, S. H., Kaya, E., Ma, E., ... & Doudna, J. A. (2014). Structures of Cas9 endonucleases reveal RNA-mediated conformational activation. Science, 343(6176), 1247997.

92. Johnson, V. (2024). After Exa-Cel: Exploring the Next Wave of CRISPR Gene Editing Strategies. Victoria.

93. Jones, S. K., Hawkins, J. A., Johnson, N. V., Jung, C., Hu, K., Rybarski, J. R., ... & Finkelstein, I. J. (2021). Massively parallel kinetic profiling of natural and engineered CRISPR nucleases. Biophysical Journal, 120(3), 138a.

94. Jore, M. M., Lundgren, M., Van Duijn, E., Bultema, J. B., Westra, E. R., Waghmare, S. P., ... & Brouns, S. J. (2011). Structural basis for CRISPR RNA-guided DNA recognition by Cascade. Nature structural & molecular biology, 18(5), 529-536.

95. Jumper, J., Evans, R., Pritzel, A., Green, T., Figurnov, M., Ronneberger, O., ... & Hassabis, D. (2021). Highly accurate protein structure prediction with AlphaFold. Nature, 596(7873), 583-589.

96. Karvelis, T., Gasiunas, G., Miksys, A., Barrangou, R., Horvath, P., & Siksnys, V. (2013). crRNA and tracrRNA guide Cas9-mediated DNA interference in Streptococcus thermophilus. RNA biology, 10(5), 841-851.

97. Kelly Jr, T. J., & Smith, H. O. (1970). A restriction enzyme from Hemophilus influenzae: II. Base sequence of the recognition site. Journal of molecular biology, 51(2), 393-409.

98. Khalil, A. M. (2020). The genome editing revolution. Journal of genetic engineering and biotechnology, 18(1), 1-16.

99. Kim, Y. H., Kim, N., Okafor, I., Choi, S., Min, S., Lee, J., ... & Kim, H. H. (2023). Sniper2L is a high-fidelity Cas9 variant with high activity. Nature Chemical Biology, 1-9.

100. Kleinstiver, B. P., Pattanayak, V., Prew, M. S., Tsai, S. Q., Nguyen, N. T., Zheng, Z., & Joung, J. K. (2016). High-fidelity CRISPR-Cas9 nucleases with no detectable genome-wide off-target effects. Nature, 529(7587), 490-495.

101. Kleinstiver, B. P., Prew, M. S., Tsai, S. Q., Topkar, V. V., Nguyen, N. T., Zheng, Z., ... & Joung, J. K. (2015). Engineered CRISPR-Cas9 nucleases with altered PAM specificities. Nature, 523(7561), 481-485.

102. Koonin, E. V., & Makarova, K. S. (2019). Origins and evolution of CRISPR-Cas systems. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences, 374(1772).

103. Koonin, E. V., Makarova, K. S., & Zhang, F. (2017). Diversity, classification and evolution of CRISPR-Cas systems. Current opinion in microbiology, 37, 67-78.

104. Kovalev, M. A., Davletshin, A. I., & Karpov, D. S. (2024). Engineering Cas9: next generation of genomic editors. Applied Microbiology and Biotechnology, 108(1), 1-19.

105. Krupovic, M., Makarova, K. S., Forterre, P., Prangishvili, D., & Koonin, E. V. (2014). Casposons: a new superfamily of self-synthesizing DNA transposons at the origin of prokaryotic CRISPR-Cas immunity. BMC biology, 12(1), 1-12.

106. Kulcsar, P. I., Talas, A., Huszar, K., Ligeti, Z., Toth, E., Weinhardt, N., ... & Welker, E. (2017). Crossing enhanced and high fidelity SpCas9 nucleases to optimize specificity and cleavage. Genome biology, 18(1), 1-17.

107. Kunin, V., Sorek, R., & Hugenholtz, P. (2007). Evolutionary conservation of sequence and secondary structures in CRISPR repeats. Genome biology, 8, 1-7.

108. Kuscu, C., Arslan, S., Singh, R., Thorpe, J., & Adli, M. (2014). Genome-wide analysis reveals characteristics of off-target sites bound by the Cas9 endonuclease. Nature biotechnology, 32(7), 677-683.

109. Kwon, D. Y., Zhao, Y. T., Lamonica, J. M., & Zhou, Z. (2017). Locus-specific histone deacetylation using a synthetic CRISPR-Cas9-based HDAC. Nature communications, 8(1), 15315.

110. Lander, E. S. (2016). The Heroes of CRISPR. Cell, 164(1-2), 18-28.

111. Lee, J. K., Jeong, E., Lee, J., Jung, M., Shin, E., Kim, Y. H., ... & Kim, J. S. (2018). Directed evolution of CRISPR-Cas9 to increase its specificity. Nature communications, 9(1), 3048.

112. Lee, J., Chung, J. H., Kim, H. M., Kim, D. W., & Kim, H. (2016). Designed nucleases for targeted genome editing. Plant biotechnology journal, 14(2), 448-462.

113. Lee, J., Lim, K., Kim, A., Mok, Y. G., Chung, E., Cho, S. I., ... & Kim, J. S. (2023). Prime editing with genuine Cas9 nickases minimizes unwanted indels. Nature Communications, 14(1), 1786.

114. Li, F., Wing, K., Wang, J. H., Luu, C. D., Bender, J. A., Chen, J., ... & Hewitt, A. W. (2020). Comparison of CRISPR/Cas endonucleases for in vivo retinal gene editing. Frontiers in Cellular Neuroscience, 14, 570917.

115. Li, Q., Qin, Z., Wang, Q., Xu, T., Yang, Y., & He, Z. (2019). Applications of Genome Editing Technology in Animal Disease Modeling and Gene Therapy. Computational and structural biotechnology journal, 17, 689-698.

116. Li, T., Huang, S., Zhao, X., Wright, D. A., Carpenter, S., Spalding, M. H., ... & Yang, B. (2011). Modularly assembled designer TAL effector nucleases for

targeted gene knockout and gene replacement in eukaryotes. Nucleic acids research, 39(14), 6315-6325.

117. Liljeruhm, J., Funk, S. K., Tietscher, S., Edlund, A. D., Jamal, S., Wistrand-Yuen, P., ... & Forster, A. C. (2018). Engineering a palette of eukaryotic chromoproteins for bacterial synthetic biology. Journal of biological engineering, 12(1), 1-10.

118. Lin, S. R., Yang, H. C., Kuo, Y. T., Liu, C. J., Yang, T. Y., Sung, K. C., ... & Chen, P. J. (2014). The CRISPR/Cas9 system facilitates clearance of the intrahepatic HBV templates in vivo. Molecular Therapy-Nucleic Acids, 3.

119. Liu, B., Chen, S., Rose, A. L., Chen, D., Cao, F., Zwinderman, M., ... & Haisma, H. J. (2020). Inhibition of histone deacetylase 1 (HDAC1) and HDAC2 enhances CRISPR/Cas9 genome editing. Nucleic acids research, 48(2), 517-532.

120. Liu, C., Zhang, L., Liu, H., & Cheng, K. (2017). Delivery strategies of the CRISPR-Cas9 gene-editing system for therapeutic applications. Journal of controlled release, 266, 17-26.

121. Liu, G., Yin, K., Zhang, Q., Gao, C., & Qiu, J. L. (2019). Modulating chromatin accessibility by transactivation and targeting proximal dsgRNAs enhances Cas9 editing efficiency in vivo. Genome biology, 20, 1-11.

122. Liu, M. S., Gong, S., Yu, H. H., Jung, K., Johnson, K. A., & Taylor, D. W. (2020). Engineered CRISPR/Cas9 enzymes improve discrimination by slowing DNA cleavage to allow release of off-target DNA. Nature Communications, 11(1), 3576.

123. Luthra, R., Kaur, S., & Bhandari, K. (2021). Applications of CRISPR as a potential therapeutic. Life Sciences, 284, 119908.

124. Ma, H., Marti-Gutierrez, N., Park, S. W., Wu, J., Lee, Y., Suzuki, K., ... & Mitalipov, S. (2017). Correction of a pathogenic gene mutation in human embryos. Nature, 548(7668), 413-419.

125. Ma, X., Zhu, Q., Chen, Y., & Liu, Y. G. (2016). CRISPR/Cas9 platforms for genome editing in plants: developments and applications. Molecular plant, 9(7), 961-974.

126. Maeder, M. L., & Gersbach, C. A. (2016). Genome-editing technologies for gene and cell therapy. Molecular Therapy, 24(3), 430-446.

127. Makarova, K. S., Grishin, N. V., Shabalina, S. A., Wolf, Y. I., & Koonin, E. V. (2006). A putative RNA-interference-based immune system in prokaryotes: computational analysis of the predicted enzymatic machinery, functional analogies with eukaryotic RNAi, and hypothetical mechanisms of action. Biology direct, 1(1), 1-26.

128. Makarova, K. S., Haft, D. H., Barrangou, R., Brouns, S. J., Charpentier, E., Horvath, P., ... & Koonin, E. V. (2011). Evolution and classification of the CRISPR-Cas systems. Nature Reviews Microbiology, 9(6), 467-477.

129. Makarova, K. S., Wolf, Y. I., Alkhnbashi, O. S., Costa, F., Shah, S. A., Saunders, S. J., ... & Koonin, E. V. (2015). An updated evolutionary classification of CRISPR-Cas systems. Nature Reviews Microbiology, 13(11), 722-736.

130. Mali, P., Yang, L., Esvelt, K. M., Aach, J., Guell, M., DiCarlo, J. E., ... & Church, G. M. (2013). RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science (New York, NY), 339(6121), 823-826.

131. Malzahn, A., Lowder, L., & Qi, Y. (2017). Plant genome editing with TALEN and CRISPR. Cell & bioscience, 7(1), 1-18.

132. Marcoux, J., Mangione, P. P., Porcari, R., Degiacomi, M. T., Verona, G., Taylor, G. W., ... & Bellotti, V. (2015). A novel mechano-enzymatic cleavage mechanism underlies transthyretin amyloidogenesis. EMBO molecular medicine, 7(10), 1337-1349.

133. Marraffini, L. A., & Sontheimer, E. J. (2010). CRISPR interference: RNA-directed adaptive immunity in bacteria and archaea. Nature Reviews Genetics, 11(3), 181-190.

134. Miller, J. C., Holmes, M. C., Wang, J., Guschin, D. Y., Lee, Y. L., Rupniewski, I., ... & Rebar, E. J. (2007). An improved zinc-finger nuclease architecture for highly specific genome editing. Nature biotechnology, 25(7), 778-785.

135. Min, Y. L., Li, H., Rodriguez-Caycedo, C., Mireault, A. A., Huang, J., Shelton, J. M., ... & Olson, E. N. (2019). CRISPR-Cas9 corrects Duchenne muscular

dystrophy exon 44 deletion mutations in mice and human cells. Science advances, 5(3), eaav4324.

136. Mojica, F. J. M., Díez-Villaseñor, C., García-Martínez, J., & Almendros, C. (2009). Short motif sequences determine the targets of the prokaryotic CRISPR defence system. Microbiology (Reading, England), 155(Pt 3), 733-740.

137. Mojica, F. J. M., Ferrer, C., Juez, G., & Rodríguez-Valera, F. (1995). Long stretches of short tandem repeats are present in the largest replicons of the Archaea Haloferax mediterranei and Haloferax volcanii and could be involved in replicon partitioning. Molecular microbiology, 17(1), 85-93.

138. Mojica, F. J., Díez-Villaseñor, C. S., García-Martínez, J., & Soria, E. (2005). Intervening sequences of regularly spaced prokaryotic repeats derive from foreign genetic elements. Journal of molecular evolution, 60, 174-182.

139. Mojica, F. J., Juez, G., & Rodriguez-Valera, F. (1993). Transcription at different salinities of Haloferax mediterranei sequences adjacent to partially modified PstI sites. Molecular microbiology, 9(3), 613-621.

140. Nasrallah, A., Sulpice, E., Kobaisi, F., Gidrol, X., & Rachidi, W. (2022). CRISPR-Cas9 Technology for the Creation of Biological Avatars Capable of Modeling and Treating Pathologies: From Discovery to the Latest Improvements. Cells, 11(22), 3615.

141. Nidhi, S., Anand, U., Oleksak, P., Tripathi, P., Lal, J. A., Thomas, G., ... & Tripathi, V. (2021). Novel CRISPR-Cas systems: an updated review of the current achievements, applications, and future research perspectives. International journal of molecular sciences, 22(7), 3327.

142. Nierzwicki, L., East, K. W., Binz, J. M., Hsu, R. V., Ahsan, M., Arantes, P. R., ... & Palermo, G. (2022). Principles of target DNA cleavage and the role of Mg in the catalysis of CRISPR-Cas9. Nature catalysis, 5(10), 912-922.

143. Nishimasu, H., Ran, F. A., Hsu, P. D., Konermann, S., Shehata, S. I., Dohmae, N., ... & Nureki, O. (2014). Crystal structure of Cas9 in complex with guide RNA and target DNA. Cell, 156(5), 935-949.

144. Nunez, J. K., Lee, A. S., Engelman, A., & Doudna, J. A. (2015). Integrase-mediated spacer acquisition during CRISPR-Cas adaptive immunity. Nature, 519(7542), 193-198.

145. Ohmori, T., Mizukami, H., Ozawa, K., Sakata, Y., & Nishimura, S. (2015). New approaches to gene and cell therapy for hemophilia. Journal of Thrombosis and Haemostasis, 13, S133-S142.

146. Pacesa, M., Loeff, L., Querques, I., Muckenfuss, L. M., Sawicka, M., & Jinek, M. (2022). R-loop formation and conformational activation mechanisms of Cas9. Nature, 609(7925), 191-196.

147. Pattanayak, V., Lin, S., Guilinger, J. P., Ma, E., Doudna, J. A., & Liu, D. R. (2013). High-throughput profiling of off-target DNA cleavage reveals RNA-programmed Cas9 nuclease specificity. Nature biotechnology, 31(9), 839-843.

148. Pedrazzoli, E., Bianchi, A., Umbach, A., Amistadi, S., Brusson, M., Frati, G., ... & Casini, A. (2023). An optimized SpCas9 high-fidelity variant for direct protein delivery. Molecular Therapy.

149. Pellagatti, A., Dolatshad, H., Valletta, S., & Boultwood, J. (2015). Application of CRISPR/Cas9 genome editing to the study and treatment of disease. Archives of toxicology, 89, 1023-1034.

150. Pettersen, E. F., Goddard, T. D., Huang, C. C., Couch, G. S., Greenblatt, D. M., Meng, E. C., & Ferrin, T. E. (2004). UCSF Chimera—a visualization system for exploratory research and analysis. Journal of computational chemistry, 25(13), 16051612.

151. Pickar-Oliver, A., & Gersbach, C. A. (2019). The next generation of CRISPR-Cas technologies and applications. Nature reviews Molecular cell biology, 20(8), 490-507.

152. Pougach, K., Semenova, E., Bogdanova, E., Datsenko, K. A., Djordjevic, M., Wanner, B. L., & Severinov, K. (2010). Transcription, processing and function of CRISPR cassettes in Escherichia coli. Molecular microbiology, 77(6), 1367-1379.

153. Prokhorova, D., Matveeva, A., Zakabunin, A., Ryabchenko, A., & Stepanov, G. (2023). Influence of N1-Methylpseudouridine in Guide RNAs on CRISPR/Cas9 Activity. International Journal of Molecular Sciences, 24(23), 17116.

154. Pronk, J. T. (2002). Auxotrophic yeast strains in fundamental and applied research. Applied and environmental microbiology, 68(5), 2095-2100.

155. Ramanan, V., Shlomai, A., Cox, D. B., Schwartz, R. E., Michailidis, E., Bhatta, A., ... & Bhatia, S. N. (2015). CRISPR/Cas9 cleavage of viral DNA efficiently suppresses hepatitis B virus. Scientific reports, 5(1), 10833.

156. Ran, F. A., Hsu, P. D., Lin, C. Y., Gootenberg, J. S., Konermann, S., Trevino, A. E., ... & Zhang, F. (2013). Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity. Cell, 154(6), 1380-1389.

157. Rauch, B. J., Silvis, M. R., Hultquist, J. F., Waters, C. S., McGregor, M. J., Krogan, N. J., & Bondy-Denomy, J. (2017). Inhibition of CRISPR-Cas9 with bacteriophage proteins. Cell, 168(1), 150-158.

158. Ray, U., & Raghavan, S. C. (2020). Modulation of DNA double-strand break repair as a strategy to improve precise genome editing. Oncogene, 39(41), 63936405.

159. Raymond, C. K., Pownder, T. A., & Sexson, S. L. (1999). General method for plasmid construction using homologous recombination. Biotechniques, 26(1), 134141.

160. Rouet, P., Smih, F., & Jasin, M. (1994). Introduction of double-strand breaks into the genome of mouse cells by expression of a rare-cutting endonuclease. Molecular and cellular biology, 14(12), 8096-8106.

161. Rychahou, P. G., & Evers, B. M. (2010). Hydrodynamic delivery protocols. RNA Interference: From Biology to Clinical Applications, 189-195.

162. Saber Sichani, A., Ranjbar, M., Baneshi, M., Torabi Zadeh, F., & Fallahi, J. (2023). A Review on Advanced CRISPR-Based Genome-Editing Tools: Base Editing and Prime Editing. Molecular Biotechnology, 65(6), 849-860.

163. Saha, A., Arantes, P. R., & Palermo, G. (2022). Dynamics and mechanisms of CRISPR-Cas9 through the lens of computational methods. Current opinion in structural biology, 75, 102400.

164. Sakovina, L., Vokhtantsev, I., Vorobyeva, M., Vorobyev, P., & Novopashina, D. (2022). Improving Stability and Specificity of CRISPR/Cas9 System by Selective Modification of Guide RNAs with 2'-fluoro and Locked Nucleic Acid Nucleotides. International Journal of Molecular Sciences, 23(21), 13460.

165. Sakurai, T., Kamiyoshi, A., Kawate, H., Mori, C., Watanabe, S., Tanaka, M., ... & Shindo, T. (2016). A non-inheritable maternal Cas9-based multiple-gene editing system in mice. Scientific reports, 6(1), 20011.

166. Sapranauskas, R., Gasiunas, G., Fremaux, C., Barrangou, R., Horvath, P., & Siksnys, V. (2011). The Streptococcus thermophilus CRISPR/Cas system provides immunity in Escherichia coli. Nucleic acids research, 39(21), 9275-9282.

167. Savic, N., & Schwank, G. (2016). Advances in therapeutic CRISPR/Cas9 genome editing. Translational Research, 168, 15-21.

168. Scherer, S., & Davis, R. W. (1979). Replacement of chromosome segments with altered DNA sequences constructed in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences, 76(10), 4951-4955.

169. Schmid-Burgk, J. L., Gao, L., Li, D., Gardner, Z., Strecker, J., Lash, B., & Zhang, F. (2020). Highly parallel profiling of Cas9 variant specificity. Molecular cell, 78(4), 794-800.

170. Schwank, G., Koo, B. K., Sasselli, V., Dekkers, J. F., Heo, I., Demircan, T., ... & Clevers, H. (2013). Functional repair of CFTR by CRISPR/Cas9 in intestinal stem cell organoids of cystic fibrosis patients. Cell stem cell, 13(6), 653-658.

171. Shah, S. A., Erdmann, S., Mojica, F. J., & Garrett, R. A. (2013). Protospacer recognition motifs: mixed identities and functional diversity. RNA biology, 10(5), 891-899.

172. Shan, Q., & Gao, C. (2015). Research progress of genome editing and derivative technologies in plants. Yi Chuan= Hereditas, 37(10), 953-973.

173. Shen, B., Zhang, J., Wu, H., Wang, J., Ma, K., Li, Z., ... & Huang, X. (2013). Generation of gene-modified mice via Cas9/RNA-mediated gene targeting. Cell research, 23(5), 720-723.

174. Shipman, S. L., Nivala, J., Macklis, J. D., & Church, G. M. (2016). Molecular recordings by directed CRISPR spacer acquisition. Science, 353(6298), aaf1175.

175. Shor, O., Rabinowitz, R., Offen, D., & Benninger, F. (2022). Computational normal mode analysis accurately replicates the activity and specificity profiles of CRISPR-Cas9 and high-fidelity variants. Computational and Structural Biotechnology Journal, 20, 2013-2019.

176. Silva, G., Poirot, L., Galetto, R., Smith, J., Montoya, G., Duchateau, P., & Pâques, F. (2011). Meganucleases and other tools for targeted genome engineering: perspectives and challenges for gene therapy. Current gene therapy, 11(1), 11-27.

177. Singh, D., Sternberg, S. H., Fei, J., Doudna, J. A., & Ha, T. (2016). Realtime observation of DNA recognition and rejection by the RNA-guided endonuclease Cas9. Nature communications, 7(1), 12778.

178. Slaymaker, I. M., Gao, L., Zetsche, B., Scott, D. A., Yan, W. X., & Zhang, F. (2016). Rationally engineered Cas9 nucleases with improved specificity. Science, 351(6268), 84-88.

179. Smith, H. O., & Welcox, K. W. (1970). A restriction enzyme from Hemophilus influenzae: I. Purification and general properties. Journal of molecular biology, 51(2), 379-391.

180. Smithies, O., Gregg, R. G., Boggs, S. S., Koralewski, M. A., & Kucherlapati, R. S. (1985). Insertion of DNA sequences into the human chromosomal P-globin locus by homologous recombination. Nature, 317(6034), 230-234.

181. Soni, R., Carmichael, J. P., & Murray, J. A. (1993). Parameters affecting lithium acetate-mediated transformation of Saccharomyces cerevisiae and development of a rapid and simplified procedure. Current genetics, 24, 455-459.

182. Spasskaya, D. S., Davletshin, A. I., Bachurin, S. S., Tutyaeva, V. V., Garbuz, D. G., & Karpov, D. S. (2023). Improving the on-target activity of high-fidelity

Cas9 editors by combining rational design and random mutagenesis. Applied microbiology and biotechnology, 107(7-8), 2385-2401.

183. Spasskaya, D. S., Davletshin, A. I., Tutyaeva, V. V., Kulagin, K. A., Garbuz, D. G., & Karpov, D. S. (2022). A Test System for Assessment of the Activity of Mutant Cas9 Variants in Saccharomyces cerevisiae. Molecular Biology, 56(6), 874884.

184. Spasskaya, D. S., Kotlov, M. I., Lekanov, D. S., Tutyaeva, V. V., Snezhkina, A. V., Kudryavtseva, A. V., ... & Karpov, D. S. (2021). CRISPR/Cas9-mediated genome engineering reveals the contribution of the 26S proteasome to the extremophilic nature of the yeast Debaryomyces hansenii. ACS Synthetic Biology, 10(2), 297-308.

185. Spencer, J. F. T., & Spencer, D. M. (1983). Genetic improvement of industrial yeasts. Annual review of microbiology, 37(1), 121-142.

186. Sternberg, S. H., Redding, S., Jinek, M., Greene, E. C., & Doudna, J. A. (2014). DNA interrogation by the CRISPR RNA-guided endonuclease Cas9. Biophysical Journal, 106(2), 695a.

187. Stovicek, V., Borodina, I., & Forster, J. (2015). CRISPR-Cas system enables fast and simple genome editing of industrial Saccharomyces cerevisiae strains. Metabolic Engineering Communications, 2, 13-22.

188. Sung, P., & Klein, H. (2006). Mechanism of homologous recombination: mediators and helicases take on regulatory functions. Nature reviews Molecular cell biology, 7(10), 739-750.

189. Tao, J., Bauer, D. E., & Chiarle, R. (2023). Assessing and advancing the safety of CRISPR-Cas tools: from DNA to RNA editing. Nature Communications, 14(1), 212.

190. Tsai, S. Q., Zheng, Z., Nguyen, N. T., Liebers, M., Topkar, V. V., Thapar, V., ... & Joung, J. K. (2015). GUIDE-seq enables genome-wide profiling of off-target cleavage by CRISPR-Cas nucleases. Nature biotechnology, 33(2), 187-197.

191. Vakulskas, C. A., Dever, D. P., Rettig, G. R., Turk, R., Jacobi, A. M., Collingwood, M. A., ... & Behlke, M. A. (2018). A high-fidelity Cas9 mutant delivered

as a ribonucleoprotein complex enables efficient gene editing in human hematopoietic stem and progenitor cells. Nature medicine, 24(8), 1216-1224.

192. Van der Oost, J., & Patinios, C. (2023). The genome editing revolution. Trends in Biotechnology, 41(3), 396-409.

193. van Haasteren, J., Li, J., Scheideler, O. J., Murthy, N., & Schaffer, D. V. (2020). The delivery challenge: fulfilling the promise of therapeutic genome editing. Nature biotechnology, 38(7), 845-855.

194. Vanegas, K. G., Jarczynska, Z. D., Strucko, T., & Mortensen, U. H. (2019). Cpf1 enables fast and efficient genome editing in Aspergilli. Fungal Biology and Biotechnology, 6, 1-10.

195. Veres, A., Gosis, B. S., Ding, Q., Collins, R., Ragavendran, A., Brand, H., ... & Musunuru, K. (2014). Low incidence of off-target mutations in individual CRISPR-Cas9 and TALEN targeted human stem cell clones detected by whole-genome sequencing. Cell stem cell, 15(1), 27-30.

196. Verkuijl, S. A., & Rots, M. G. (2019). The influence of eukaryotic chromatin state on CRISPR-Cas9 editing efficiencies. Current opinion in biotechnology, 55, 68-73.

197. Waaijers, S., Portegijs, V., Kerver, J., Lemmens, B. B., Tijsterman, M., van den Heuvel, S., & Boxem, M. (2013). CRISPR/Cas9-targeted mutagenesis in Caenorhabditis elegans. Genetics, 195(3), 1187-1191.

198. Wang, H., Yang, H., Shivalila, C. S., Dawlaty, M. M., Cheng, A. W., Zhang, F., & Jaenisch, R. (2013). One-Step Generation of Mice Carrying Mutations in Multiple Genes by CRISPR/Cas-Mediated Genome Engineering. Cell, 153(4), 910.

199. Wang, J., Li, J., Zhao, H., Sheng, G., Wang, M., Yin, M., & Wang, Y. (2015). Structural and mechanistic basis of PAM-dependent spacer acquisition in CRISPR-Cas systems. Cell, 163(4), 840-853.a

200. Wang, J., Xu, Z. W., Liu, S., Zhang, R. Y., Ding, S. L., Xie, X. M., ... & Lu, F. M. (2015). Dual gRNAs guided CRISPR/Cas9 system inhibits hepatitis B virus replication. World journal of gastroenterology: WJG, 21(32), 9554.b

201. Wei, C., Liu, J., Yu, Z., Zhang, B., Gao, G., & Jiao, R. (2013). TALEN or Cas9-rapid, efficient and specific choices for genome modifications. Journal of genetics and genomics, 40(6), 281-289.

202. Wei, Y., Chesne, M. T., Terns, R. M., & Terns, M. P. (2015). Sequences spanning the leader-repeat junction mediate CRISPR adaptation to phage in Streptococcus thermophilus. Nucleic acids research, 43(3), 1749-1758.

203. Wong, C. (2023). UK first to approve CRISPR treatment for diseases: what you need to know. Nature, 623(7988), 676-677.

204. Wright, A. V., Liu, J. J., Knott, G. J., Doxzen, K. W., Nogales, E., & Doudna, J. A. (2017). Structures of the CRISPR genome integration complex. Science, 357(6356), 1113-1118.

205. Wu, S. S., Li, Q. C., Yin, C. Q., Xue, W., & Song, C. Q. (2020). Advances in CRISPR/Cas-based gene therapy in human genetic diseases. Theranostics, 10(10), 4374.

206. Xin, C., Yin, J., Yuan, S., Ou, L., Liu, M., Zhang, W., & Hu, J. (2022). Comprehensive assessment of miniature CRISPR-Cas12f nucleases for gene disruption. Nature communications, 13(1), 5623.

207. Xue, C., & Greene, E. C. (2021). DNA repair pathway choices in CRISPR-Cas9-mediated genome editing. Trends in Genetics, 37(7), 639-656.

208. Yang, L., Grishin, D., Wang, G., Aach, J., Zhang, C. Z., Chari, R., ... & Church, G. (2014). Targeted and genome-wide sequencing reveal single nucleotide variations impacting specificity of Cas9 in human stem cells. Nature communications, 5(1), 5507.

209. Yang, M., Peng, S., Sun, R., Lin, J., Wang, N., & Chen, C. (2018). The conformational dynamics of Cas9 governing DNA cleavage are revealed by single-molecule FRET. Cell reports, 22(2), 372-382.

210. Yeh, C. D., Richardson, C. D., & Corn, J. E. (2019). Advances in genome editing through control of DNA repair pathways. Nature cell biology, 21(12), 14681478.

211. Yin, H., Xue, W., Chen, S., Bogorad, R. L., Benedetti, E., Grompe, M., ... & Anderson, D. G. (2014). Genome editing with Cas9 in adult mice corrects a disease mutation and phenotype. Nature biotechnology, 32(6), 551.

212. Yosef, I., Goren, M. G., & Qimron, U. (2012). Proteins and DNA elements essential for the CRISPR adaptation process in Escherichia coli. Nucleic acids research, 40(12), 5569-5576.

213. Zatsepina, O., Karpov, D., Chuvakova, L., Rezvykh, A., Funikov, S., Sorokina, S., ... & Evgen'ev, M. (2020). Genome-wide transcriptional effects of deletions of sulphur metabolism genes in Drosophila melanogaster. Redox Biology, 36, 101654.

214. Zhang, G. C., Kong, I. I., Kim, H., Liu, J. J., Cate, J. H., & Jin, Y. S. (2014). Construction of a quadruple auxotrophic mutant of an industrial polyploid Saccharomyces cerevisiae strain by using RNA-guided Cas9 nuclease. Applied and environmental microbiology, 80(24), 7694-7701.

215. Zhang, G., Gao, X., Song, Y. K., Vollmer, R. D. B. S., Stolz, D. B., Gasiorowski, J. Z., ... & Liu, D. (2004). Hydroporation as the mechanism of hydrodynamic delivery. Gene therapy, 11(8), 675-682.

216. Zhang, J. H., Adikaram, P., Pandey, M., Genis, A., & Simonds, W. F. (2016). Optimization of genome editing through CRISPR-Cas9 engineering. Bioengineered, 7(3), 166-174.

217. Zhang, J. P., Yang, Z. X., Zhang, F., Fu, Y. W., Dai, X. Y., Wen, W., ... & Zhang, X. B. (2021). HDAC inhibitors improve CRISPR-mediated HDR editing efficiency in iPSCs. Science China Life Sciences, 64, 1449-1462.

218. Zhang, Q., Chen, Z., Wang, F., Zhang, S., Chen, H., Gu, X., ... & Sun, B. (2021). Efficient DNA interrogation of SpCas9 governed by its electrostatic interaction with DNA beyond the PAM and protospacer. Nucleic Acids Research, 49(21), 1243312444.

219. Zhang, Q., Wen, F., Zhang, S., Jin, J., Bi, L., Lu, Y., ... & Sun, B. (2019). The post-PAM interaction of RNA-guided spCas9 with DNA dictates its target binding and dissociation. Science advances, 5(11), eaaw9807.

220. Zhdanova, P. V., Chernonosov, A. A., Prokhorova, D. V., Stepanov, G. A., Kanazhevskaya, L. Y., & Koval, V. V. (2022). Probing the Dynamics of Streptococcus pyogenes Cas9 Endonuclease Bound to the sgRNA Complex Using Hydrogen-Deuterium Exchange Mass Spectrometry. International Journal of Molecular Sciences, 23(3), 1129.

221. Zhen, S., Hua, L., Liu, Y. H., Gao, L. C., Fu, J., Wan, D. Y., ... & Gao, X. (2015). Harnessing the clustered regularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR)/CRISPR-associated Cas9 system to disrupt the hepatitis B virus. Gene therapy, 22(5), 404-412.

222. Zhu, W., Lei, R., Le Duff, Y., Li, J., Guo, F., Wainberg, M. A., & Liang, C. (2015). The CRISPR/Cas9 system inactivates latent HIV-1 proviral DNA. Retrovirology, 12, 1-7.

223. Zhu, X., Clarke, R., Puppala, A. K., Chittori, S., Merk, A., Merrill, B. J., ... & Subramaniam, S. (2019). Cryo-EM structures reveal coordinated domain motions that govern DNA cleavage by Cas9. Nature structural & molecular biology, 26(8), 679-685.

224. Волотовский, И., & Полешко, А. (2017). CRISPR/Cas9-№creMa редактирования геномов. Прорыв в медицинской биологии и генной терапии?. Наука и инновации, 12(178), 59-64.

225. Закиян, С. М., Медведев, С. П., Дементьева, Е. В., & Власов, В. В. (2018). Редактирование генов и геномов. Новосибирск: Издательство СО РАН.

226. Новопашина, Д. С., Ахметова, Е. А., Мещанинова, М. И., Вохтанцев, И. П., Жарков, Д. О., Веньяминова, А. Г. Модифицированная направляющая РНК, обладающая способностью инактивировать систему редактирования генома CRISPR/Cas9, и способ ее получения / Свидетельство о государственной регистрации №2765159 от 26.012022 г.

Приложения

Приложение 1

Олигонуклеотиды, использовавшиеся для получения комбинаций мутаций сяб9, тест-систем и направляющих РНК.

Олигонуклеотиды, использовавшиеся для получения направляющих РНК

ЛОБ2 -Ш-ИРЯ-Р ОЛОСТОСОЛТТООСЛОЛЛОСТТЛЛТТОТАОАОАСТАТССАСАОТТТТЛОЛ остлолллтлослло

БсШЛ-РИР-Р ОЛОСТОСОЛТТООСЛОЛЛОСТТОАОТЛААААЛТТОТАСТТОООТТТТЛОЛ остлолллтлослло

ЛББ2-1-КРЯ-Р ОЛОСТОСОЛТТООСЛОЛЛОСТТАОТТАСССЛАЛОТОТТССТООТТТТЛОЛ остлолллтлослло

8сЛББ2-Ш-016Л (ЛЬ11) ОЛОСТОСОЛТТООСЛОЛЛОСТТЛЛТТАТАОАОАСТАТССАСАОТТТТЛОЛ остлолллтлослло

ЛББ2-2-КРЯ ОЛОСТОСОЛТТООСЛОЛЛОСТТОАОАСОТСССТАТТОЛЛТОТОТТТТЛОЛ остлолллтлослло

ЛББ2-3-КРЯ ОЛОСТОСОЛТТООСЛОЛЛОСТТООЛЛОСТТТООЛЛОТАСТОАОТТТТЛОЛ остлолллтлослло

ЛББ2-4-КРЯ ОЛОСТОСОЛТТООСЛОЛЛОСТТОТССТТТОТАСОССОАЛААЛОТТТТЛОЛ остлолллтлослло

ЛББ2-И1-МОЛ ОЛОСТОСОЛТТООСЛОЛЛОСТТАТТОТАОАОАСТАТССАСЛЛОТТТТЛОЛ остлолллтлослло

ЛББ2-И1-МЛО ОЛОСТОСОЛТТООСЛОЛЛОСТТСЛЛТТОТАОАОАСТАТССАСОТТТТЛОЛ остлолллтлослло

Олигонуклеотиды, использовавшиеся для получения мутаций сяб9

ИСа89-№о1-Р тлссллсллсслтоолсллоллотлстсслттооо

ЬСа89-БсоК1поКЬ8-Я стстстсттоллттслоссстостотстсслссоло

Юа89-Б147У-Р осттотлолслотлсттлтллоост

iCas9-D147Y-R GATCAACCGCAAGTCAGCCTTATAAGTACT

iCas9-P4iiT-F TCGACAATGGAAGCATCACCCACCA

iCas9-P4iiT-R TCGCCCAGGTGAATCTGGTGGGTGATGCT

hCas9-Dii35E-F AAGAAATACGGCGGATTCGAATCTCC

hCas9-D1135E-R TGTAAGCGACTGTAGGAGATTCGAAT

Cas9-HFi-TEFi- N497A-F CCAGTCCTTCATCGAAAGGATGACTGCCTTTGACAAGAATTTACCGAACGA

Cas9-HFi-TEFi- N497A-R TCGTTCGGTAAATTCTTGTCAAAGGCAGTCATCCTTTCGATGAAGGACTGG

Cas9-HFi-TEFi- Q926A-F ACGTCAGCTCGTGGAAACCCGCGCCATCACCAAGCACGTGGCCCAAATTC

Cas9-HFi-TEFi- Q926A-R GAATTTGGGCCACGTGCTTGGTGATGGCGCGGGTTTCCACGAGCTGACGT

HypaCas9-R CATCGGCGATCAAAGCGGCGAAGGCCCGGTTGGCAAATCCATCGGACTTA AG

HypaCas9-F AAGTCCGATGGATTTGCCAACCGGGCCTTCGCCGCTTTGATCGCCGATGAC TCTC

HypaCas9 -check-R GGCGATCAAAGCGGCGAAGG

EvoCas9-TEFi- M495V-F CTGCCCAGTCCTTCATCGAAAGGGTGACCAACTTCGATAAGAACCTGC

EvoCas9-TEFi- M495V-R GCAGGTTCTTATCGAAGTTGGTCACCCTTTCGATGAAGGACTGGGCAGAG

EvoCas9-TEFi- R661Q-F CGGAGATACACCGGCTGGGGCCAGCTGTCAAGAAAACTGATCAATGGGAT

EvoCas9-TEFi- R661Q-R ATCCCATTGATCAGTTTTCTTGACAGCTGGCCCCAGCCGGTGTATCTCCG

HiFi-Cas9-F GTCCGATGGATTTGCCAACGCTAACTTCATGCAG

HiFi-Cas9-R GTCATCATGGATCAACTGCATGAAGTTAGCGTTGGCAA

Sniper-TEFi- F539S-F CGTCACAGAAGGGATGAGAAAGCCAGCAGCCTCCCTGAGCGGCGAGCAGA

Sniper-TEFi- F539S-R TCTGCTCGCCGCTCAGGGAGGCTGCTGGCTTTCTCATCCCTTCTGTGACG

Sniper-TEFi - K890N-F TGGCGCCAGCTGCTGAACGCCAATCTGATCACACAACGGAAGTTCGA

Sniper-TEFi - K890N-R TCGAACTTCCGTTGTGTGATCAGATTGGCGTTCAGCAGCTGGCGCCA

Cas9-L1206P-F CCAAGTACTCTCTCTTTGAGCCTGAAAACG

Cas9-Li206P-R TCGTTTCCGGCCGTTTTCAGGCTCAAAGAG

Cas9-S204F-F GAAGAGAACCCGATCAACGCATTCGGAGTTGAC

Cas9-S204F-R GGATTGCTTTGGCGTCAACTCCGAATGCGTT

Cas9-A259P-F CTTTAAATCTAACTTCGACCTGCCCGAAGAT

Cas9-A259P-R CAGTTGAAGCTTGGCATCTTCGGGCAGGTCGA

p414-Cas9-48-XhoI-F AAGCGTCAAGGAACTGCTGGG

p414-Cas9-55-EcoRI-F CCGAAGATAATGAGCAGAAGCA

E1341H+A1345L-F GAAAGCGGTACACCTCTACAAAACACGTCCTGGACCTCACACTGATTC

E1341H+A1345L-R ATTGACTGATGAATCAGTGTGAGGTCCAGGACGTGTTTTGTAGAGGTGTAC C

E1341D-F GAAAGCGGTACACCTCTACAAAAGATGTCCTG

E1341D-R GTGGCGTCCAGGACATCTTTTGTAGAGGTGTACC

E1341H-F GAAAGCGGTACACCTCTACAAAACACGTCCTG

E1341H-R GTGGCGTCCAGGACGTGTTTTGTAGAGGTGTACC

A1345L-F CTCTACAAAAGAGGTCCTGGATCTCACACTGATTC

A1345L-R ATTGACTGATGAATCAGTGTGAGATCCAGG

A1345P-F CTCTACAAAAGAGGTCCTGGATCCCACACTGATTC

A1345P-R ATTGACTGATGAATCAGTGTGGGATCCAGG

tCYC1-int-R GGGCGTGAATGTAAGCGTGAC

Олигонуклеотиды, использовавшиеся для получения штамма BY4741 с делецией гена TRP1

TRP1-URA3 -rec-F GTGAGTATACGTGATTAAGCACACAAAGGCAGCTTGGAGTATGTCGAAAG CTACATATAAGGAACG

TRP1-URA3 -rec-R AGTGCACAAACAATACTTAAATAAATACTACTCAGTAATAACCTAGTTTTG CTGGCCGCATCTTCTC

TRP1-check-F CAGATGGCAGTAGTGGAAGAT

TRP1-check-R GTAAAAGTCAACCCCCTGCGATG

Олигонуклеотиды, использовавшиеся в тест-системах на основе гена ADE2, URA3 и Tinsel

antiURA3 GAGTAAAAAATTGTACTTGG

TAG-ADE-for GGTTTAGTGTTTTCTTACCCAATTGTATAGACTATCCACAAGACAATATTTG

TAG-ADE-rev GAACGGAGTCCGGAACTCTAGCAGGCGCATAACATAAGTCACAAATATTGT CTTGTG

ADE2-1-RPR GAGCTGCGATTGGCAGAAGCTTAGTTACCCAAAGTGTTCCTGGTTTTAGAG CTAGAAATAGCAAG

ADE2-2-RPR GAGCTGCGATTGGCAGAAGCTTGAGACGTCCCTATTGAATGTGTTTTAGAG CTAGAAATAGCAAG

ADE2-3-RPR GAGCTGCGATTGGCAGAAGCTTGGAAGCTTTGGAAGTACTGAGTTTTAGAG CTAGAAATAGCAAG

ADE2-4-RPR GAGCTGCGATTGGCAGAAGCTTGTCCTTTGTACGCCGAAAAAGTTTTAGAG CTAGAAATAGCAAG

ADE2-lit-NGA GAGCTGCGATTGGCAGAAGCTTATTGTAGAGACTATCCACAAGTTTTAGAG CTAGAAATAGCAAG

ADE2-lit-NAG GAGCTGCGATTGGCAGAAGCTTCAATTGTAGAGACTATCCACGTTTTAGAG CTAGAAATAGCAAG

TRP i -Tinsel-rec-F GTGAGTATACGTGATTAAGCACACAAAGGCAGCTTGGAGTATGGCATCTTT AGTCAAAAAGGATATGT

TRP i -Tinsel-rec-R AGTGCACAAACAATACTTAAATAAATACTACTCAGTAATAACCTAACCAGT AGCCTTCTCAGGTAC

TRP-ch-Fi GTAGTTATAAGAAAGAGACC

Tinsel-ch-R GTGTACGTTCCCAAGTGAAGC

Приложение 2

Схема рекомбинационного клонирования в дрожжах.

На первом этапе дрожжевые клетки трансформируются смесью линеаризованного вектора и фрагментов рамки счтывания СаБ9 с перекрывающимися концами длиной 40 пар нуклеотидов. Дрожжевые клетки осуществляют сборку конструкции по пути гомологичной рекомбинации перекрывающихся фрагментов. Далее плазмидная ДНК выделяется из дрожжевой культуры и переносится в Е.еоМ для последующей наработки в количестве, достаточном для проверки методом секвенирования.

Приложение 3

Новые формы сяб9, полученные путем комбинации известных аминокислотных замен, случайного и рационального мутагенеза.

№ Форма Cas9 Запланированные мутации Cas9 Случайные аминокислотн ые замены Относительная целевая активность (с б§РНК ЛББ2-ЬЦ), %

1 Са8 ИБ 2а Ж97Л, Я661Л, 0695Л, 0926Л 56

2 Са8 ИБ ББ 1а Ж97Л, Я661Л, 0695Л, 0926Л, Б1135Б 15.75

3 Са8 ИБ ББ 2 Ж97Л, Я661Л, 0695Л, 0926Л, Б1135Б делеция F491 0

4 Юа8 ИБ Б147У, Р411Т, Ж97Л, Я661Л, 0695Л, 0926Л 43.75

5 Юаз ИБ ББ 2Ь Б147У, Р411Т, Ж97Л, Я661Л, 0695Л, 0926Л, Б1135Б 27.15

6 Юа8 ИБ ББ 4 Б147У, Р411Т, Ж97Л, Я661Л, 0695Л, 0926Л, Б1135Б Л1081Т, Ь1291Р 7.75

7 Юа8 ИБ ББ 2 Б147У, Р411Т, Ж97Л, Я661Л, 0695Л, 0926Л, Б1135Б Б11348 18

8 е8рСа8 2а К848Л, К1003Л, Я1060Л 99

9 е8рСа8 3 К848Л, К1003Л, Я1060Л Ь524Б 71.6

10 е18рСа8 Б147У, Р411Т, К848Л, К1003Л, Я1060Л 105.9

11 Иура Са8 1 Ш92Л, М694Л, 0695Л, И698Л Р5378 82.4

12 Иура Са8 1а Ш92Л, М694Л, 0695Л, И698Л 76.2

13 Иура Са8 ББ 1 Ш92Л, М694Л, 0695Л, И698Л, 27.8

D1135E

14 Hypa Cas DE 2 N692A, M694A, Q695A, H698A, D1135E S204F, A259P, L1206P 72.29

15 Hypa Cas DE 21 N692A, M694A, Q695A, H698A, D1135E S204F 30

16 Hypa Cas DE 22 N692A, M694A, Q695A, H698A, D1135E A259P 29

17 Hypa Cas DE 23 N692A, M694A, Q695A, H698A, D1135E L1206P 83

18 iHypa Cas D147Y, P411T, N692A, M694A, Q695A, H698A 72.8

19 iHypa Cas DE D147Y, P411T, N692A, M694A, Q695A, H698A, D1135E 70.2

20 EvoCas 2 M495V, Y515N, K526E, R661Q < 1

21 EvoCas 1 M495V, Y515N, K526E, R661Q G453R, V856A < 1

22 EvoCas DE M495V, Y515N, K526E, R661Q, D1135E < 1

23 iEvoCas 3a D147Y, P411T, M495V, Y515N, K526E, R661Q 1.75

24 iEvoCas 3 D147Y, P411T, M495V, Y515N, K526E, R661Q K775R 3

25 iEvoCas DE D147Y, P411T, M495V, Y515N, K526E, R661Q, D1135E 0.67

26 HiFi R691A 73

27 iHiFi D147Y, P411T, R691A 76

28 HiFi DE R691A, D1135E 17

29 iHiFi DE D147Y, P411T, R691A, D1135E 27

30 HiFi-PT R691A R691A, P411T 76

31 Sniper Cas F539S, M763I, K890N 82

32 iSniper Cas D147Y, P411T, F539S, M763I, K890N 87

33 iSniper Cas a D147Y, P411T, F539S, M763I, K890N P1322H 22

34 Sniper Cas DE F539S, M763I, K890N, D1135E 29

35 iSniper Cas DE D147Y, P411T, F539S, M763I, K890N, D1135E 47.6

36 iSniper Cas DE a D147Y, P411T, F539S, M763I, K890N, D1135E H984D 45

37 Sniper Cas LP D147Y, P411T, F539S, M763I, K890N, D1135E, L1206P 84

38 iSniper Cas LP D147Y, P411T, F539S, M763I, K890N, L1206P 96

39 Sniper Cas DE LP F539S, M763I, K890N, D1135E, L1206P 53.96

40 iSniper Cas DE LP D147Y, P411T, F539S, M763I, K890N, D1135E, L1206P 93

41 iCas DE D147Y, P411T, D1135E 100

42 HiFi LP R691A, L1206P 77

43 iHiFi LP D147Y, P411T, R691A, L1206P 69

44 HiFi DE LP R691A, D1135E, L1206P 55

45 iHiFi DE LP D147Y, P411T, R691A, D1135E, L1206P 47

46 iCas HF LP N497A, R661A, Q695A, Q926A, D147Y, P411T, L1206P 42.75

47 iCas HF DE LP N497A, R661A, Q695A, Q926A, D147Y, P411T, D1135E, L1206P 30.5

48 HypaCas LP N692A, M694A, Q695A, H698A, L1206P 97.25

49 HypaCas DE LP (Hypa Cas DE 2) N692A, M694A, Q695A, H698A, D1135E, L1206P 72.29

50 iHypaCas LP N692A, M694A, Q695A, H698A, D147Y, P411T, L1206P 79

51 iEvoCas LP M495V, Y515N, K526E, R661Q, D147Y, P411T, L1206P 1.51

52 iEvoCas DE LP M495V, Y515N, K526E, R661Q, D147Y, P411T, D1135E, L1206P 0.3

53 Wild-tipe Cas9 LP L1206P 93.11

54 Hypa Cas DELA N692A,M694A, Q695A,H698A, D1135E, L1206A 7.85

55 Hypa Cas DELS N692A,M694A, Q695A,H698A, D1135E, L1206S 6.47

56 Hypa Cas DE-LF N692A,M694A, Q695A,H698A, D1135E, L1206F 7.21

57 Hypa Cas DE-LQ N692A,M694A, Q695A,H698A, D1135E, L1206Q 53.59

58 Hypa Cas DE-LH N692A,M694A, Q695A,H698A, D1135E, L1206H 62.47

59 Hypa Cas DELE N692A,M694A, Q695A,H698A, D1135E, L1206E 45

60 Wild-tipe Cas9 EH E1341H 103

61 Wild-tipe Cas9 AL A1345L 113

62 Wild-tipe Cas9 EH/AL E1341H, A1345L 106

63 SniperCas DE ED F539S, M763I, K890N, D1135E, E1341D 31.1

64 SniperCas DE EH F539S, M763I, K890N, D1135E, E1341H 58.7

65 SniperCas DE AL F539S, M763I, K890N, D1135E, A1345L 57.7

66 SniperCas DE AP F539S, M763I, K890N, D1135E, A1345P 28.8

67 SniperCas DE EH/AL F539S, M763I, K890N, D1135E, E1341H, A1345L 61.8

68 Sniper Cas DE LP ED F539S, M763I, K890N, D1135E, L1206P, E1341D 50.4

69 Sniper Cas DE LP EH F539S, M763I, K890N, D1135E, L1206P, E1341H 33.8

70 Sniper Cas DE LP AL F539S, M763I, K890N, D1135E, L1206P, A1345L 55.6

71 Sniper Cas DE LP AP F539S, M763I, K890N, D1135E, L1206P, A1345P 0.44

72 iSniper Cas EH D147Y, P411T, F539S, M763I, K890N, E1341H 82

73 iSniper Cas EH/AL D147Y, P411T, F539S, M763I, K890N, E1341H, A1345L 78

74 iSniper Cas DE EH D147Y, P411T, F539S, M763I, K890N, D1135E, E1341H 59

75 iSniper Cas DE EH/AL D147Y, P411T, F539S, M763I, K890N, D1135E, E1341H, A1345L 70.6

76 Wild-tipe Cas9 100

Приложение 4

Сравнение геометрии Cas9 дикого типа и его мутантных производных в областях аминокислотных остатков 147, 411, 1135 и 1206.