Характеристика генов гороха (Pisum sativum L.), вовлечённых в формирование арбускулярной микоризы тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.02.07, кандидат биологических наук Кузнецова, Елена Владиславовна

• Кузнецова, Елена Владиславовна
• кандидат биологических наук
• 2010

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Кузнецова, Елена Владиславовна

Список сокращений

Введение

Глава I. Обзор литературы

1.1. Арбускулярная микориза (AM)- один из наиболее распространённых симбиозов в природе

1.2. Формирование AM симбиоза

1.2.1. Стадии формирования AM

1.2.2. Цитологическая реорганизация растительной клетки в процессе формирования AM

1.2.3. Микоризные мутанты растений

1.3. Молекулярные основы AM симбиоза

1.3.1. Ранние сигнальные взаимодействия

1.3.2. Гены растения, активируемые на ранних стадиях формирования AM симбиоза

1.3.3. AM специфичная экспрессия растительных и грибных генов

1.3.4. Широкомасштабные исследования симбиоз-зависимых изменений транскриптома растений и грибов

1.3.5. Влияние sym мутаций растений на активность генов симбиотических партнёров при образовании AM

1.3.6. Сходство AM симбиоза и симбиоза бобовых растений с клубеньковыми бактериями (Rhizobium)

1.4. Генетическое картирование симбиотических генов бобовых растений для последующего позиционного клонирования генов

1.4.1. Клонирование симбиотических генов гороха

1.4.2. Использование молекулярных EST (expressed sequence tag-based) маркеров для генетического картирования

I.4.3. Использование синтении между геномами бобовых растений для картирования генов

Глава II. Материалы и методы

IL1. Биологический материал

11.2. Условия вегетации растений и отбор образцов для анализа

11.3. Определение параметров микоризации корней

11.4. Вырезание лазером кортикальных клеток, содержащих арбускулы (метод Laser Capture Microdissection)

1Г.4.1. Подготовка тканей к микродиссекции

II.4.2. Микродиссекция клеток, содержащих арбускулы

11.5. Гибридологический анализ • 66

11.6. Выделение нуклеиновых кислот

11.6.1. Выделение РНК из корней растений

11.6.2. Выделение РНК из вырезанных лазером клеток, содержащих арбускулы

11.6.3. Выделение ДНК из листьев растений 69 И.6.4. Выделение плазмидной ДНК

11.7. Разделение нуклеиновых кислот электрофорезом в геле

11.7.1. Электрофорез ДНК в агарозном геле

11.7.2. Разделение РНК в денатурирующем агарозном геле 71 II. 8. Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

П.8.1.ПЦР

11.8.2. Конструирование праймеров

11.8.3. Синтез кДНК

11.8.4. Абсолютный количественный ПЦР «в реальном времени» 78 II.9. Секвенирование фрагментов ДНК 79 II. 10. Клонирование продуктов ПЦР 80 П.11. Разрезание ДНК фрагментов эндонуклеазами рестрикции 81 11.12. Разработка молекулярных маркеров для генетического картирования

II.13. Статистическая обработка данных

Глава III. Результаты и обсуждение

III. 1. Влияние мутаций в генах PsSym36, PsSym33 и PsSym40 на формирование арбускулярной микоризы

III. 1.1. Введение

111.1.2. Результаты

III. 1.2.1. Развитие арбускулярной микоризы

III. 1.2.2. Рост растений

III. 1.3. Обсуждение

111.2. Экспрессия генов Glomus intraradices при формировании AM у мутантов гороха RisNod24 (Pssym36), SGEFix~-2 (Pssym33) и SGEFix-1 (Pssym40)

111.2.1. Введение

111.2.2. Результаты

111.2.2.1. Мутант RisNod24 (Pssym36)

111.2.2.2. Мутант SGEFix"-2 (Pssym33)

111.2.2.3. Мутант SGEFix-1 (Pssym40)

111.2.3. Обсуждение

111.3. Дифференциальная экспрессия генов Pisum sativum L., предположительно связанных с формированием AM, в корнях мутантов гороха RisNod24 (Pssym36), SGEFix"-2 {Pssym33) и SGEFix"-l (Pssym40)

111.3.1. Введение

111.3.2. Результаты

111.3.2.1. Мутант RisNod24 (Pssym36)

111.3.2.2. Мутант SGEFix"-2 (Pssym33)

111.3.2.3. Мутант SGEFix"-1 (Pssym40)

111.3.3. Обсуждение

111.4. Анализ транскрипции генов G. intraradices в клетках, содержащих арбускулы

Ш.4.1. Введение

111.4.2. Результаты

111.4.3. Обсуждение 125 III.5. Локализация генов PsSymSö и PsSym40 на генетической карте гороха

111.5.1. Введение

111.5.2. Результаты

111.5.2.1. Получение и скрининг F2 популяций

111.5.2.2. Конструирование молекулярных EST маркеров

111.5.2.3. Картирование генов 132 III. 5.3. Обсуждение

Глава IV. Заключение

Выводы

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Характеристика генов гороха (Pisum sativum L.), вовлечённых в формирование арбускулярной микоризы»

Арбускулярно-микоризный (AM) симбиоз является одним из древнейших и наиболее распространённых симбиозов на планете. Его роль, в природных экосистемах огромна, а возможности использования в сельском хозяйстве весьма заманчивы. Симбиоз между корнями растения и грибами отдела Glomeromycota возник около 450 миллионов лет назад. В настоящее время более 80% наземных растений-формируют AM; которая-играет огромную роль в улучшении минерального питания растений, увеличивает их устойчивость к биотическим и абиотическим стрессовым факторам.

Горох (Pisum sativum L.) является одним из наиболее изученных модельных объектов генетики AM. Проведённые ранее исследования позволили получить симбиотические (Sym) мутанты гороха с нарушениями формирования и функционирования арбускулярной микоризы. Эти мутанты являются ценными инструментами изучения генетики растительно-микробных симбиотических взаимоотношений, так как дают возможность исследовать симбиоз на конкретных этапах его формирования, а клонирование Sym генов позволяет определить молекулярные основы мутаций и предположить функцию молекулярных продуктов изучаемых генов.

Другим приоритетным направлением генетики симбиоза является идентификация генов растений и AM грибов, экспрессия которых существенно изменяется в процессе формирования и функционирования AM симбиоза. Такие гены можно рассматривать в качестве молекулярных маркеров процессов (сигналинга, защитных реакций, метаболизма), происходящих в растении и грибе при симбиозе. Использование в исследованиях такого рода симбиотических мутантов растений с блоком развития AM существенно увеличивает информативность подхода и позволяет связать происходящие изменения с конкретными стадиями развития симбиоза.

Данная работа посвящена изучению генетики формирования и функционирования арбускулярной микоризы, поскольку «молекулярногенетический диалог» между растением и AM грибом определяет успех симбиотических взаимоотношений.

Цель и задачи исследования. Целью исследования являлось изучение роли поздних симбиотических генов гороха PsSym36, PsSym33 и PsSym40 в формировании функционального AM симбиоза. Были поставлены следующие задачи исследования:

1. изучение эффекта мутаций в генах PsSym36, PsSym33 и PsSym40 на экспрессию генов Glomus intraradices при формировании AM симбиоза;

2. изучение экспрессии генов гороха (Pisum sativum L.), предположительно связанных с формированием AM симбиоза, при микоризации корней растений дикого типа и мутантов RisNod24 (.Pssym36), SGEFix"-2

Pssym33) и SGEFix"-l (.Pssym40);

3. анализ экспрессии генов G .intraradices в растительных клетках, содержащих арбускулы;

4. разработка молекулярных маркеров и анализ сцепления генов PsSym36, PsSym40 и маркеров для локализации генов на генетической карте гороха с целью их последующего точного картирования и позиционного клонирования.

Работа осуществлялась в рамках программы кооперации лаборатории генетики растительно-микробных взаимодействий (ВНИИСХМ РАСХН, Санкт-Петербург, Россия) и научно-исследовательского подразделения Plant-Microbe-Environment (UMR INRA 1088/CNRS 5184/Université de Bourgogne PME, Дижон, Франция). Изучение эффекта мутаций в генах PsSym36, PsSym33 и PsSym40 на экспрессию грибных и растительных генов в процессе формирования и функционирования AM симбиоза проводилось в подразделении Plant-Microbe-Environment института INRA во Франции (Дижон), а разработка условий для локализации симбиотических генов гороха PsSym36 и PsSym40 на генетической карте - в лаборатории генетики растительно-микробных взаимодействий ВНИИ сельскохозяйственной микробиологии в России (Санкт-Петербург).

Научная новизна. Впервые проведено исследование влияния мутаций в симбиотических генах гороха посевного (Pisum sativum L.) PsSym36, PsSym33 и PsSym40 на экспрессию восьми генов P. sativum и десяти генов G. intraradices, предположительно вовлечённых в формирование функционального AM симбиоза. Было показано, что блокирование развития арбу скул, в корнях мутанта RisNod24 (Pssym36) приводит к существенному снижению экспрессии большей части анализированных грибных и растительных генов, в то время-как более высокие темпы микоризации корней мутанта SGEFix"-l (Pssym40) коррелируют с более высоким, чем у растений дикого типа, уровнем экспрессии изученных грибных генов. Мутации в генах PsSym33" и PsSym40 имеют менее выраженный эффект на экспрессию анализированных генов гороха, чем мутация в гене PsSym36. Использование метода микродиссекции клеток лазером позволило осуществить выделение РНК из клеток, содержащих арбускулы, и впервые продемонстрировать преимущественную экспрессию генов G. intraradices, кодирующих супероксиддисмутазу (SOD), стеароил-СоА-десатуразу (DESAT) и пептидил-пролил-изомеразу (PEPISOM), в арбу скулах.

Методическая и практическая значимость. Методология и молекулярные инструменты, разработанные в данном исследовании, могут быть использованы в дальнейшем при изучении растительных и грибных генов, контролирующих формирование и функционирование AM. Полученный растительный материал (популяции растений поколений F1 и F2), разработанные молекулярные маркеры, а также данные картирования могут существенно облегчить дальнейшую работу по локализации генов гороха PsSym36 и PsSym40 на генетической карте для последующего точного картирования и позиционного клонирования данных генов. Полученные данные экспрессии растительных и грибных генов могут послужить базой для последующей работы по определению роли генов PsSym36} PsSym33 и PsSym40 в формировании симбиотических взаимоотношений растения с клубеньковыми бактериями и грибами арбускуляриой микоризы. Результаты проведённых исследований могут быть использованы в курсах генетики развития и функционирования растительно-микробных систем профильных институтов и университетов.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на международном симпозиуме и школе молодых учёных «The third Baltic sea region symposium and postgraduate course on agro-biotechnology focused on root-microbe systems» (Saint-Petersburg, Russia, 2007), конференциях «Plant-Microbial Interactions 2008 Conference» (Krakow, Poland, 2008), «Forum des Jeunes Chercheurs» (Besancon, France, 2008), «International Conference on Mycorrhiza 2009 ICOM6» (Belo Horizonte, Brazil, 2009), 9-м конгрессе IPMB «Leading Biology through Plant Science» (St. Louis, USA, 2009).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 статьи и 6 тезисов докладов на международных научных конференциях.