Анализ дифференциальной экспрессии генов при образовании азотфиксирующих клубеньков и арбускулярной микоризы у Pisum sativum L. тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, кандидат наук Зорин Евгений Андреевич

• Зорин Евгений Андреевич
• кандидат наук
• 2023

Оглавление диссертации кандидат наук Зорин Евгений Андреевич

ГЛАВА 1. Обзор литературы

1. 1 Общие сведения о симбиозах, образуемых бобовыми растениями

1.2 Гены нодулинов, микоризинов и симбиозинов

1.2.1 Анализ экспрессии клубенёк-специфичных генов бобовых растений

1.2.2 Уникальность транскриптомных профилей азотфиксирующих клубеньков

1.2.3 Анализ экспрессии генов, специфичных для арбускулярно-микоризного симбиоза

1.2.4 Анализ экспрессии генов симбиозинов

1.3 Альтернативный сплайсинг как механизм регуляции экспрессии генов в симбиотических органах бобовых растений

1.4 Роль генов, кодирующих пептиды NCR в бобово-ризобиальном симбиозе

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2. 1 Биологический материал и экспериментальные условия

2.2 Молекулярно-биологические методы

2.3 Микробиологические методы

2.4 Биоинформатические методы

2.4.1 Анализ дифференциальной экспрессии генов

2.4.2 Выявление событий альтернативного сплайсинга

2.4.3 Идентификация генов, кодирующих пептиды NCR, предсказание их физико-химических свойств и 3D моделей

2.4.4 Построение филогенетических деревьев

2.4.5 Анализ соотношения dN/dS

2

2.4.6 Анализ однонуклеотидных замен

2.4.7 Определение геномной локализации генов NCR и сходство их внутри и между кластерами

2.4.8 Построение коэкспрессионных модулей, предсказание сайтов связывания с ТФ и идентификация промоторных регионов

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ

3.1 Идентификация генов нодулинов, микоризинов и симбиозинов

3.1.1 Идентификация генов нодулинов

3.1.2 Идентификация генов микоризинов

3.1.3 Выявление и описание генов симбиозинов

3.2 Анализ альтернативного сплайсинга в клубеньках и микоризованных корнях гороха посевного

3.2.1 Анализ альтернативного сплайсинга в клубеньках гороха посевного

3.2.2 Анализ альтернативного сплайсинга в микоризованных корнях гороха посевного

3.3 Выявление, описание и анализ экспрессии генов, кодирующих пептиды NCR

3.3.1 Поиск генов гороха посевного, кодирующих пептиды NCR

3.3.2 Анализ разнообразия генов, кодирующих пептиды NCR

3.3.3 Физико-химические свойства пептидов NCR гороха посевного

3.3.4 Предсказание и проверка антимикробных свойств пептидов NCR

3.3.5 Геномная локализация генов, кодирующих пептиды NCR

3.3.6 Экспрессионные профили генов NCR в клубеньках гороха линии SGE

3.3.7 Экспрессионный анализ генов NCR в клубеньках мутантных линий

SGEFix--1 (sym40-1) and SGEFix--2 (sym33-3)

3.3.8 Анализ коэкспрессии генов NCR и их регуляторных элементов

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ

4.1 Нодулины, микоризины и симбиозины гороха посевного

4.2 Альтернативный сплайсинг в симбиотических органах гороха посевного

4.3 Разнообразие, геномная локализация, эволюционные особенности и экспрессионные профили генов, кодирующих пептиды NCR

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Анализ дифференциальной экспрессии генов при образовании азотфиксирующих клубеньков и арбускулярной микоризы у Pisum sativum L.»

ВВЕДЕНИЕ

Бобовые растения способны вступать в мутуалистические симбиотические отношения с клубеньковыми бактериями (КБ) и грибами арбускулярной микоризы (АМ). Формирование симбиозов повышает устойчивость растений к стрессам и способствует получению стабильного урожая даже в условиях глобального изменения климата. Изучение молекулярных основ симбиозов, образуемых бобовыми, необходимо для повышения эффективности данных симбиозов при их использовании в современном сельском хозяйстве. Поскольку Российская Федерация является одним из мировых лидеров производства гороха (FAOSTAT 2020), целесообразным представляется исследование физиологии, биохимии и молекулярной генетики симбиозов, образуемых горохом посевным (Pisum sativum L.).

Ранее для P. sativum при помощи мутационного анализа были выявлены

отдельные регуляторные гены (т.н. Sym-гены), контролирующие некоторые

этапы развития симбиозов. В настоящее время технологии

высокопроизводительного секвенирования позволяют исследовать полный

набор генов, кодирующих «молекулярную машину симбиоза» и

необходимых для обеспечения метаболической интеграции симбионтов

(Mergaert et al., 2020; Gao et al., 2022). Среди таких генов выделяют гены

нодулинов (от англ. nodule - клубенёк), специфичные для бобово-

ризобиального симбиоза (БРС), гены микоризинов, специфичные для

арбускулярно-микоризного (АМ) симбиоза, а также гены симбиозинов, -

гены, экспрессия которых специфична для развития как БРС, так и АМ

(Küster et al., 2007). Таким образом, изменение экспрессии генов нодулинов,

микоризинов и симбиозинов вносит большой вклад в транскриптомные

изменения в клубеньках и микоризованных корнях бобовых растений,

обусловливая их специфичность, необходимую для интеграции растения-

хозяина и микросимбионта. Гены нодулинов, микоризинов и симбиозинов

частично исследованы на модельных бобовых Medicago truncatula Gaertn.,

5

Lotus japonicus (Regel.) K. Larsen и Glycine max (L.) Merr., в то время как симбиоз-специфичные гены гороха посевного, а также особенности их экспрессии, изучены к настоящему моменту недостаточно. Применение подходов транскриптомики (т.е. изучение всего набора экспрессирующихся генов - транскриптома) позволяет восполнить этот пробел в знаниях.

Транскриптомная изменчивость обусловливается не только дифференциальной экспрессией генов, но и дифференциальной экспрессией изоформ их мРНК. Данный феномен обеспечивается посттранскрипционным механизмом модификации мРНК, называемым альтернативный сплайсинг (АС). АС - механизм считывания нескольких изоформ транскриптов с одного гена (Chaudhary et al., 2019), приводящий к повышению транскриптомного и, нередко, протеомного разнообразия. Однако роль АС в регуляции экспрессии генов в ходе образования БРС и АМ практически не изучена (Rigo et al., 2019).

Значительная часть транскриптов, характерных для азотфиксирующих клубеньков у модельного бобового M. truncatula, относится к семейству генов, кодирующих регуляторные пептиды NCR (nodule-specific cysteine-rich peptides) (Mergaert et al., 2003; Nicoud et al., 2021). Пептиды NCR участвуют в фиксации азота и дифференцировки бактероидов у M. truncatula (Montiel et al., 2017). У гороха посевного это генное семейство не исследовано. Целесообразность изучения генов, кодирующих пептиды NCR, у гороха обусловлено их несомненной важностью для процессов дифференцировки бактероидов, а также формирования, функционирования и старения клубенька.

Таким образом, недостаток информации о транскриптомных изменениях в симбиотических системах гороха посевного, а также роли нодулинов, микоризинов и симбиозинов, событий АС, специфичных для симбиотических структур гороха, и особенностей экспрессии генов, кодирующих пептиды NCR, в развитии и функционировании симбиозов гороха посевного, обосновывает актуальность настоящей работы.

Таким образом, целью работы являлся анализ транскриптомных изменений в азотфиксирующих клубеньках и микоризованных корнях гороха посевного (Pisum sativum L.).

Для достижения поставленной цели сформулированы следующие задачи:

1) Идентификация генов, экспрессия которых является специфичной для азотфиксирующих клубеньков или микоризованных корней Pisum sativum (генов нодулинов и микоризинов, соответственно);

2) Выявление генов симбиозинов, повышение экспрессии которых характерно одновременно для клубеньков и микоризованных корней Pisum sativum, их характеристика;

3) Анализ событий альтернативного сплайсинга, специфичных для клубеньков и микоризованных корней Pisum sativum;

4) Характеристика семейства генов, кодирующих клубенёк-специфичные пептиды NCR, и изучение разнообразия представителей данного семейства у Pisum sativum;

5) Анализ разнообразия профилей экспрессии генов, кодирующих пептиды NCR, в клубеньках Pisum sativum линии SGE («дикого типа») и мутантных линий с нарушением дифференцировки бактероидов.

Научная новизна

В работе впервые выявлены гены симбиозинов гороха посевного, в том

числе симбиозины, экспрессия которых находится под контролем

транскрипционных факторов (ТФ) EFD и IPD3. Показано, что

азотфиксирующие клубеньки и микоризованные корни гороха

демонстрируют различия профилей альтернативного сплайсинга по

сравнению с интактными корнями. Выявлен ряд генов со специфичным для

образующих АМ растений паттерном АС. Впервые описан полный набор

генов, кодирующих пептиды NCR в геноме гороха посевного,

продемонстрирована кластерная организация этих генов и их согласованная

экспрессия в зависимости от возраста клубенька. На основании анализа коэкспрессии и исследования промоторных областей генов, кодирующих пептиды NCR, выявлены ТФ, предположительно регулирующие экспрессию данных генов, а также серию других генов, ассоциированных с азотфиксирующим симбиозом.

Практическая значимость

Выявленные гены симбиозинов представляются вероятными кандидатами на роль генов, определяющих эффективность симбиоза гороха с КБ и АМ, и могут быть в дальнейшем использованы при поиске маркеров эффективности симбиозов. Идентифицированные и описанные антимикробные пептиды NCR могут служить кандидатами на роль антибиотиков и, как следствие, иметь применение в медицине.

Положения, выносимые на защиту:

1) Азотфиксирующие клубеньки и микоризованные корни Pisum sativum характеризуются высоким уровнем транскриптомной специфичности: гены нодулинов составляют 48%, а микоризинов 25% от всех генов с индуцированной экспрессией в азотфиксирующих клубеньках и микоризованных корнях, соответственно.

2) Впервые проведённый анализ альтернативного сплайсинга в азотфиксирующих клубеньках и микоризованных корнях Pisum sativum показал, что в данных органах и тканях основные параметры альтернативного сплайсинга сходны, однако для отдельных мРНК характерны изоформы, специфичные для данных органов и тканей.

3) Представители генного семейства, кодирующего пептиды NCR у Pisum sativum, демонстрируют высокий уровень разнообразия. Гены, кодирующие пептиды NCR, расположены в геноме в составе кластеров, причём профили экспрессии всех генов из одного кластера сходны. Следовательно, основой молекулярной эволюции генов, кодирующих

пептиды NCR, являются дупликации с последующей дивергенцией.

8

Личный вклад соискателя

Исследования, посвященные анализу дифференциальной экспрессии генов в клубеньках и микоризвованных корнях P. sativum, проведены лично автором. Исключение составляет работа по количественной оценке мёртвых клеток исследуемых бактерий методом проточной цитометрии и оценке минимальной ингибирубщей и минимальной бактерицидной концентрации пептидов NCR и антибиотиков, выполненная совместно с Клюковой Мариной Сергеевной и Кичигиной Натальей Евгеньевной в ФГБНУ ВНИИСХМ. Материалы, вошедшие в совместные публикации, обсуждались с соавторами и руководителем работы.

Степень достоверности и апробация работы

Достоверность результатов обеспечена проведением исследований с использованием современных методик на высокотехнологичном оборудовании в ЦКП «Геномные технологии, протеомика и клеточная биология» ФГБНУ ВНИИСХМ.

Основные результаты исследования были доложены на российских и международных конференциях: VIII Международная научно-практическая конференция «Биотехнология как инструмент сохранения биоразнообразия растительного мира (физиолого-биохимические, эмбриологические, генетические и правовые аспекты)» (2018 г., Ялта, Республика Крым, Россия), Международный конгресс «VII съезд Вавиловского общества генетиков и селекционеров, посвященный 100-летию кафедры генетики СПбГУ, и ассоциированные симпозиумы» (2019 г., Санкт-Петербург, Россия), 2-ая международная конференция «Растения и микробы: будущее биотехнологии» (2020 г., Саратов, Россия ), IV школа-конференция для молодых ученых «Молекулярно-генетические и клеточные аспекты растительно-микробных взаимодействий» (2020 г., Санкт-Петербург, Россия), The 45th FEBS Virtual Congress (2021 г., Любляна, Словения).

Данная работа была финансово поддержана Российским фондом фундаментальных исследований (19-316-90058) и Научным центром мирового уровня «Агротехнологии будущего» (соглашение НЦМУ № 07515-2022-320 от 20.04.2022 г).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 15 работ, в том числе 4 статьи из списка, рекомендованного ВАК, которые включены в международную базу Scopus.

Структура и объём работы

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, результатов экспериментальной работы и их обсуждения, заключения, выводов, списка цитируемой литературы и приложения. Диссертация изложена на 126 страницах, содержит 9 таблиц, 22 рисунка. Список литературы включает 162 наименования, из них 161 - на иностранном языке

Благодарности

Автор выражает признательность и благодарность своему научному руководителю Владимиру Александровичу Жукову за обсуждение результатов, конструктивную критику данного исследования, за предоставление интересной темы диссертации и обеспечение условий для ее выполнения. Автор выражает благодарность своим коллегам, сотрудникам лаборатории генетики растительно-микробных взаимодействий ФГБНУ ВНИИСХМ Штарк Оксане Юрьевне, Ахтемовой Гульнар Асановне, Кулаевой Ольге Алексеевне, Романюк Дарье Андреевне, Сулиме Антону Сергеевичу, Жернакову Александру Игоревичу, Дворяниновой Людмиле Евгеньевне, Кичигиной Наталье Евгеньевне, Гордону Михаилу Львовичу, Клюковой Марине Сергеевне и Афонину Алексею Михайловичу за помощь в рабочем процессе и дружескую атмосферу.

ГЛАВА 1. Обзор литературы 1.1 Общие сведения о симбиозах, образуемых бобовыми растениями

Растения перманентно взаимодействуют с множеством микроорганизмов: вирусы, бактерии, грибы. Однако большая часть из них либо вредны, либо нейтральны, и лишь небольшая часть приносит растению пользу. По классификации Антона Де Бари (1879 г.) полезное взаимовыгодное сосуществование организмов относят к мутуалистическому симбиозу (Oulhen et al., 2016). Одной из наиболее изученных взаимовыгодных растительно-микробных систем являются

мутуалистические симбиозы, образуемые бобовыми растениями (Sprent, 2001). В процессе эволюции бобовые приобрели уникальную способность формировать два типа мутуалистических эндосимбиозов: азотфиксирующий симбиоз с клубеньковыми бактериями (БРС), объединяемыми под названием "ризобии", развившийся на основе более древнего симбиоза - арбускулярной микоризы (АМ) с грибами недавно выделенного отдела Glomeromycota (Parniske, 2008).

Для успешного установления любого симбиоза растению необходима удачная коммуникация с потенциальным партнёром. Широко распространено "общение" посредством хитина - молекул олигосахаридов, которые представляют из себя полимеры N-ацетилгликозаминов с ß-1,4-гликозидными связями различной степени полимеризации (Oldroyd, 2013; Zipfel and Oldroyd, 2017). Бактерия или гриб синтезирует и секретирует эти молекулы в окружающее пространство, будучи недалеко от растения, а оно, в свою очередь, принимает сигнал, распознаёт и определённым образом на него реагирует. Однако эти микробные сигнальные молекулы, необходимые для установления микоризного (Myc-факторы) или клубенькового (Nod-факторы) симбиоза, хотя и являются производными хитиновых олигосахаридов, имеют отличия - присутствие липидной модификации, что позволяет отнести их к классу липохитоолигосахаридов (Zipfel and Oldroyd, 2017).

Рецепция, например, Nod-фактора осуществляется растением

посредством рецепторных киназ. У лядвенца японского этот комплекс белков

кодируется генами LjNFRl, LjNFR5 и LjSYMRK, при этом киназа NFR5 имеет

усечённый цитоплазматический киназный домен и неактивна. У гороха

посевного гомологами этих генов являются PsSym37, PsSymlO и PsSym19.

Было показано, что ген PsSym37 кодирует рецептор, распознающий

структуру жирной кислоты на нередуцирующем конце Nod-фактора, в то

время как киназа, кодируемая геном PsSym19, вероятно, распознаёт

противоположный, редуцирующий, конец Nod-фактора (Тихонович et al.,

2015). Связывание рецептора с лигандом приводит к активации рецептор-

подобных протеинкиназ, что в свою очередь вызывает повышение

концентрации активных форм кислорода и приток кальция через

плазматическую мембрану (ситуация, аналогичная иммунному ответу).

Однако NADPH-оксидаза RBOH и кальциевый канал, локализованный на

плазматической мембране, которые участвуют в симбиотическом

сигналинге, всё ещё не определены. Распознавание липохитоолигосахарида

активирует кальциевые волны в ядре. 3-гидрокси-3-метилглутарил-CoA-

редуктаза (HMGR), которая в определённый момент взаимодействует с

рецепторной киназой SYMRK, участвует в производстве мевалоната,

который может рассматриваться как вторичный мессенджер передачи

сигнала из цитоплазмы в ядро (Kevei et al., 2007). Несколько ионных каналов,

локализованных на ядерной мембране, модулируют ток кальция из

перинуклеарного пространства и эндоплазматического ретикулума: это белок

DMI1 у M. truncatula, CASTOR/POLLUX у Lotus japonicus и SYM8 у Pisum

sativum. В комплексе с CNGC15 эти белки регулируют разнонаправленные

токи кальция и калия, позволяя ионам диффундировать без изменения

потенциала мембраны, а кальциевая АТФаза MCA8 закачивает кальций

обратно в перинуклеарное пространство и ЭР (Charpentier and Oldroyd, 2013).

Кальциевые волны в ядре активируют CCAMK - кальций-кальмодулин-

зависимую киназу (PsSYM9 у гороха), которая фосфорилирует CYCLOPS,

12

что, в конечном итоге, приводит к изменению транскрипции симбиотических генов. Сам CYCLOPS, по-видимому, является частью большого комплекса, состоящего из различных транскрипционных факторов, содержащих GRAS-домен, таких как NSP1 (SYM34 у гороха), NSP2 (SYM7 у гороха), DELLA (Kalo, 2005; Shtark et al., 2016; Zipfel and Oldroyd, 2017) .

На данный момент идентифицировано два типа ответов растения на инфицирование, которые негативно регулируют процесс клубенькообразования. Первый опосредован этилен-зависимым путём (Imin et al., 2013; Mohd-Radzman et al., 2015), который ограничивает процесс клубенькообразования и позитивно регулирует экспрессию генов устойчивости. Такой тип регуляции широко распространён у многих бобовых, однако отсутствует у некоторых видов сои. Другой способ регуляции - так называемые CLE-пептиды (от CLAVATA (CLV)/EMBRYO). Сигнальный путь, вовлекающий эти пептиды, регулирует компетентность корней растения к клубенькообразованию в зависимости от N-статуса, то есть от концентрации азота в окружающей почве (Hastwell et al., 2017). Существует ещё один класс пептидов — так называемые NODULE-SPECIFIC CYSTEINE-RICH (NCRs). Эта группа молекул регулирует дифференцировку клубеньковых бактерий в симбиотические формы - бактероиды. Геном M. truncatula содержит около 700 генов, кодирующих эти пептиды (Montiel et al., 2017).

Таким образом, процесс становления симбиотических отношений между бобовым растением и почвенными азотфиксирующими бактериями вовлекает большое количество разнообразных генов: от генов рецепторов и рецепторных киназ до различных транскрипционных факторов и пептидов. На данный момент открыта лишь небольшая доля молекул-участников процесса и исследования в этом направлении остаются актуальными. Экспрессия генов при клубенькообразовании регулируется сложной системой факторов различной природы, многие из которых остаются

неизученными (Kalo, 2005; Kevei et al., 2007; Hastwell et al., 2017; Zipfel and Oldroyd, 2017).

1.2 Гены нодулинов, микоризинов и симбиозинов

Изучение «молекулярной машины симбиоза» началось более сорока лет назад с идентификации «нодулинов» - белков, которые присутствуют в корнях сои (Glycine max (L.) Merr.), инокулированных клубеньковыми бактериями, но отсутствуют в неинокулированных корнях (Legocki and Verma, 1980). Клонирование генов наиболее представленных в клубеньках нодулинов помогло установить, что они выполняют структурную функцию (являются компонентами перибактероидной мембраны, которая окружает бактерии внутри клеток клубенька) или участвуют в биохимических реакциях ассимиляции азота (Verma et al., 1986). Значительный успех был достигнут в изучении генов, кодирующих нодулины, в ходе анализа дифференциальной экспрессии генов путем вычитающей гибридизации (subtractive hybridization), которая позволяет амплифицировать лишь те фрагменты кДНК, количество которых различается между исследуемыми и контрольными образцами (Kouchi and Hata, 1993). Среди генов нодулинов были выделены группы «ранних» и «поздних» генов (early и late nodulin genes), в соответствии со стадией развития клубенька, на которой детектировалось присутствие соответствующих транскриптов (Verma et al., 1986; Nap and Bisseling, 1990a, 1990b).

Подобный подход - выделение полиаденилированной мРНК с последующей трансляцией in vitro и иммунопреципитацией с антителами к известным нодулинам - был применён для идентификации полипептидов, специфичных для микоризованных корней сои (Wyss et al., 1990). В результате были идентифицированы пять полипептидов, которые (по аналогии с нодулинами) были названы «микоризинами» (Wyss et al., 1990). В дальнейшем для гена раннего нодулина M. truncatula MtENOD11 была

продемонстрирована экспрессия в клетках корня, содержащих арбускулы, что также даёт основание считать MtENOD11 микоризином (Journet et al., 2001).

Развитие технологии микрочипов (microarrays) сделало возможным проведение количественного анализа экспрессии генов в отношении модельных бобовых. Для M. truncatula было выявлено несколько сотен генов, уровень экспрессии которых повышается в азотфиксирующих клубеньках и/или в микоризованных корнях, причём около ста генов активируются в случае развития как БРС, так и АМ (Krajinski and Frenzel, 2007; Küster et al., 2007). По аналогии с генами нодулинов и микоризинов, было предложено называть гены, специфичные как для БРС, так и для АМ, генами симбиозинов (Küster et al., 2007). Появление технологии Секвенирования Следующего Поколения ( от англ. Next Generation Sequencing) открыло возможность широкомасштабного анализа уровня экспрессии генов с высокой точностью, в результате чего фокус исследований окончательно переключился с генов нодулинов и микоризинов (которые специфично экспрессируются только в одном или другом симбиозе и нигде больше) на гены, экспрессия которых индуцируется (up-regulated genes) в ходе развития того или другого симбиоза.

Таким образом, в строгом смысле термин «гены нодулинов» может относиться лишь к небольшому числу генов, экспрессия которых не детектируется ни в каких тканях, кроме азотфиксирующих клубеньков (Рисунок 1). Аналогично, под генами микоризинов следует понимать гены с профилем экспрессии, строго ассоциированным с микоризованными корнями (например, специфичные для клеток, содержащих арбускулы). Интересно, что выявленные в первых исследованиях микоризины, распознаваемые антителами к нодулинам (Wyss et al., 1990), в строгом смысле слова не являются «микоризинами», а должны быть отнесены к «симбиозинам». Во избежание путаницы мы предлагаем называть гены с повышенным уровнем экспрессии в симбиотических тканях и органах «клубенёк-специфичными»,

«микориза-специфичными» и «симбиоз-специфичными», а термины «гены нодулинов», а также «гены микоризинов» и «гены симбиозинов» применять лишь в их строгом смысле.

Рисунок 1. Разнообразие генов, индуцированных при БРС и АМ.

1.2.1 Анализ экспрессии клубенёк-специфичных генов бобовых растений

В последние два десятилетия развитие методов транскриптомики позволило облегчить поиск и анализ генов бобовых, вовлечённых в БРС. Ранние работы были выполнены при помощи анализа микрочипов, но в настоящее время подавляющее большинство подобных исследований выполняется посредством секвенирования мРНК клубеньков с последующим биоинформатическим анализом полученных данных.

В одной из первых работ в данной области (H0gslund et а1., 2009) было показано, что в клубеньках разного возраста Ь. ]аротсш при сравнении с неинокулированными корнями наблюдается дифференциальная экспрессия большого количества генов (1015 генов на сроке 1 день после инокуляции (д.п.и.) и 2930 на сроке 21 д.п.и.). Примечательно, что только 48 генов дифференциально экспрессируются одновременно в клубеньках различного

возраста (1, 3, 7, 21 д.п.и.). Эта группа генов включает нодулины, серпины, экспансины, пектинэстеразы и другие (H0gslund et а1., 2009). Вероятно, выявленные гены необходимы для процессов развития симбиотических мембран и роста инфекционных нитей, которые наблюдаются в ходе роста клубеньков на всех этапах их развития.

В дальнейшем улучшение качества сборок геномов модельных бобовых и увеличение числа аннотированных генов в них привело к существенному повышению глубины анализа данных. Так, Boscari и коллегам удалось выявить уже 10085 дифференциально экспрессирующихся в клубеньках M. truncatula генов относительно неинокулированных корней, причём экспрессия большей части из них, 8418 генов, была подавлена (Boscari et а1., 2013), что указывает на то, что повышение уровня экспрессии симбиоз-специфичных генов является необходимым, но не достаточным условием для нормального развития симбиотических органов. При этом результаты, полученные в данной работе, согласуются с опубликованными ранее результатами и расширяют имеющиеся знания об особенностях организации транскриптома азотфиксирующих клубеньков. В частности, было описано большое количество транскрипционных факторов, специфичных для клубеньков.

Сравнительные исследования экспрессии генов клубеньков M. truncatula и L. japonicus показали, что только для 53% дифференциально экспрессирующихся в клубеньках генов L. japonicus имеются ортологи в геноме M. truncatula, а наборы дифференциально экспрессирующихся генов исследуемых видов перекрываются на 1085 генов, что составляет 18% и 42% от общего числа дифференциально экспрессирующихся в клубеньках генов M. truncatula и L. japonicus, соответственно (Sanko-Sawczenko et а1., 2019). Несмотря на это, на более высоком уровне аннотации (биологический процесс и молекулярная функция), процессы, в которых принимают участие

дифференциально экспрессирующиеся в клубеньках гены обоих видов, весьма сходны.

1.2.2 Уникальность транскриптомных профилей азотфиксирующих клубеньков

Сравнение профилей экспрессии генов в различных тканях и органах растений показывает, что транскриптомные профили клубеньков значительно отличаются от других органов растения (Mergaert et al., 2020). Так, на основании данных, накопленных за последнее десятилетие, можно судить о том, что группа генов нодулинов, экспрессия которых строго специфична для клубеньков M. truncatula, насчитывает несколько сотен генов (Mergaert et al., 2020). Значительную их часть составляют гены, кодирующие клубенёк-специфичные цистеин богатые пептиды (пептиды NCR, nodule-specific cysteine-rich peptides) (Guefrachi et al., 2014). Пептиды NCR управляют дифференцировкой бактерий в симбиотическую форму (бактероиды) у некоторых бобовых растений, включая M. truncatula, горох (Pisum sativum L.), Cicer arietinum L. и др. (Mergaert et al., 2003; Montiel et al., 2017; Zorin et al., 2022). Кроме генов, кодирующих пептиды NCR, среди клубенёк-специфичных генов также были выявлены хорошо изученные и необходимые для БРС гены (например, кодирующие леггемоглобин, C-подобную фосфолипазу DNF2, цистеин-богатую рецептор-подобную киназу SymCRK, метаболиты транспортёров и другие) (Mergaert et al., 2020). Также к клубенёк-специфичным генам относятся представители генных семейств, кодирующих GRP (Glycine-Rich Peptide), функция которых пока неизвестна (Alunni et al., 2007), SNARP (Small Nodulin Acidic RNA-binding Protein ) (Laporte et al., 2010), секреторные кальмодулин-подобные белки (Liu et al., 2006). Отдельные представители других генных семейств, кодирующих короткие пептиды, вовлечённые в систему контроля азотного статуса растения (пептиды CLE), также экспрессируются в клубеньках (Okamoto et al., 2009; Mortier et al., 2010).

Экспрессию клубенёк-специфичных генов можно наблюдать на самых ранних стадиях развития клубеньков, в течение первых нескольких суток после инокуляции. Транскриптомный анализ корней M. truncatula на ранних этапах клубенькообразования (Gao et al., 2022) показал, что в первые 12 часов после инокуляции в транскриптомном профиле не происходит значительных изменений, а спустя 24 часа и 48 часов после инокуляции уже детектируется повышение экспрессии пяти и шести генов, соответственно. Наиболее сильный ответ наблюдается спустя 72 ч.п.и. и выражается в повышении экспрессии серии генов, кодирующих ранние нодулины, в том числе пептиды NCR (Gao et al., 2022). Слабый ответ на инокуляцию в первые двое суток может быть вызван низкой долей ткани развивающегося клубенька в исследуемом образце корня. Эту проблему позволяет решить сочетание РНК-секвенирования с методом микродиссекции (Jardinaud et al., 2016).

Появление и активное использование методов секвенирования одиночных клеток (Hwang et al., 2018) позволило изучить особенности экспрессии генов в инфицированных и неинфицированных клетках клубенька (Libault, 2018). Сравнивая экспрессию генов между инфицированнными и неинфицированными клетками клубенька L. japonicus, Wang и др. удалось выявить 939 генов, дифференциально экспрессирующихся в инфицированных клетках, 55 из которых кодировали транскрипционные факторы, а 73 - различные транспортёры. В частности, авторами было показано, что гены, кодирующие леггемоглобин (LjLbs) и сульфатный транспортёр (LjSST1) работают, в основном, в инфицированных клетках, в то время как транспортёр аммония (LjAMT1.1) и транскрипционный фактор ERF (LjERFl) активно экспрессируются, наоборот, в зоне неинфицированных клеток (Wang et al., 2022).

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Зорин Евгений Андреевич, 2023 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1) Тихонович, И. А., Андронов, Е. Е., Борисов, А. Ю., Долгих, Е. А., Жернаков, А. И., Жуков, В. А., et al. Принцип дополнительности геномов в расширении адаптационного потенциала растений // Генетика. — 2015. — Т. 51. — С. 973990.

2) Adrian Alexa, J. R. topGO. — 2017.

3) Afonin, A., Sulima, A., Zhernakov, A., and Zhukov, V. Draft genome of the strain RCAM1026 Rhizobium leguminosarum bv. viciae // Genomics Data. — 2017. — V. 11. — P. 85-86.

4) Alunni, B., Kevei, Z., Redondo-Nieto, M., Kondorosi, A., Mergaert, P., and Kondorosi, E. Genomic Organization and Evolutionary Insights on GRP and NCR Genes, Two Large Nodule-Specific Gene Families in Medicago truncatula // MPMI. — 2007. — V. 20. — P. 1138-1148.

5) Alves-Carvalho, S., Aubert, G., Carrere, S., Cruaud, C., Brochot, A.-L., Jacquin, F., et al. Full-length de novo assembly of RNA-seq data in pea ( Pisum sativum L.) provides a gene expression atlas and gives insights into root nodulation in this species // Plant J. — 2015. — V. 84. — P. 1-19.

6) Anand, L., and Rodriguez Lopez, C. M. ChromoMap: an R package for interactive visualization of multi-omics data and annotation of chromosomes // BMC Bioinformatics. — 2022. — V. 23. — P. 33.

7) Bailey, T. L., Boden, M., Buske, F. A., Frith, M., Grant, C. E., Clementi, L., et al. MEME SUITE: tools for motif discovery and searching // Nucleic Acids Research. — 2009. — V. 37. — P. 202-208.

8) Berget, S. M., Moore, C., and Sharp, P. A. Spliced segments at the 5' terminus of adenovirus 2 late mRNA // Proc Natl Acad Sci U S A. — 1977. — V. 74. — P. 3171-3175.

9) Boscari, A., Del Giudice, J., Ferrarini, A., Venturini, L., Zaffini, A.-L., Delledonne, M., et al. Expression dynamics of the Medicago truncatula transcriptome during the

symbiotic interaction with Sinorhizobium meliloti: which role for nitric oxide? // Plant Physiol. 2013. — V. 161. — P. 425-439.

10) Bourcy, M., Brocard, L., Pislariu, C. I., Cosson, V., Mergaert, P., Tadege, M., et al. Medicago truncatula DNF2 is a PI-PLC-XD-containing protein required for bacteroid persistence and prevention of nodule early senescence and defense-like reactions // New Phytol. — 2013. — V. 197. — P. 1250-1261.

11) Cerri, M. R., Frances, L., Kelner, A., Fournier, J., Middleton, P. H., Auriac, M.-C., et al. The Symbiosis-Related ERN Transcription Factors Act in Concert to Coordinate Rhizobial Host Root Infection // Plant Physiol. — 2016. — V. 230. — P. 30.

12) Chakraborty, J., Ghosh, P., Sen, S., and Das, S. Epigenetic and transcriptional control of chickpea WRKY40 promoter activity under Fusarium stress and its heterologous expression in Arabidopsis leads to enhanced resistance against bacterial pathogen // Plant Science. — 2018. — V. 276. — P. 250-267.

13) Charpentier, M., and Oldroyd, G. E. D. Nuclear Calcium Signaling in Plants // Plant Physiology. — 2013. — V. 163. — P. 496-503.

14) Charpentier, M., Sun, J., Wen, J., Mysore, K. S., and Oldroyd, G. E. D. (2014). Abscisic Acid Promotion of Arbuscular Mycorrhizal Colonization Requires a Component of the PROTEIN PHOSPHATASE 2A Complex // Plant Physiol. — 2014. — V. 166. — P. 2077-2090.

15) Chaudhary, S., Jabre, I., Reddy, A. S. N., Staiger, D., and Syed, N. H. Perspective on Alternative Splicing and Proteome Complexity in Plants // Trends in Plant Science. — 2019. — V. 24. — P. 496-506.

16) Cheval, C., Aldon, D., Galaud, J.-P., and Ranty, B. Calcium/calmodulin-mediated regulation of plant immunity // Biochimica et Biophysica Acta (BBA) -Molecular Cell Research. — 2013. — V. 1833. — P. 1766-1771.

17) Chow, L. T., Gelinas, R. E., Broker, T. R., and Roberts, R. J. An amazing sequence arrangement at the 5' ends of adenovirus 2 messenger RNA // Cell. — 1977. — V. 12. — P. 1-8.

18) Combier, J. P., de Billy, F., Gamas, P., Niebel, A., and Rivas, S. Transregulation of the expression of the transcription factor MtHAP2-1 by a uORF controls root nodule development // Genes & Development. — 2008. — V. 22. — P. 1549-1559.

19) Cre, M. N. [Aut. DRIMSeq. — 2017.

20) Danecek, P., Bonfield, J. K., Liddle, J., Marshall, J., Ohan, V., Pollard, M. O., et al. Twelve years of SAMtools and BCFtools // GigaScience. — 2021. — V. 10. — P. giab008.

21) de Zelicourt, A., Diet, A., Marion, J., Laffont, C., Ariel, F., Moison, M., et al. Dual involvement of a Medicago truncatula NAC transcription factor in root abiotic stress response and symbiotic nodule senescence: Root stress response and nodule senescence // The Plant Journal. — 2012. — V. 70. — P. 220-230.

22) Deguchi, Y., Banba, M., Shimoda, Y., Chechetka, S. A., Suzuri, R., Okusako, Y., et al. Transcriptome Profiling of Lotus japonicus Roots During Arbuscular Mycorrhiza Development and Comparison with that of Nodulation // DNA Research. — 2007. — V. 14. — P. 117-133.

23) Dobin, A., and Gingeras, T. R. Mapping RNA-seq Reads with STAR // Current Protocols in Bioinformatics. — 2015. — V. 51.

24) Downie, J. A., and Kondorosi, E. Why Should Nodule Cysteine-Rich (NCR) Peptides Be Absent From Nodules of Some Groups of Legumes but Essential for Symbiotic N-Fixation in Others? // Front. Agron. — 2021. — V. 3. — P. 654.

25) Duran, D., Albareda, M., Garcia, C., Marina, A.-I., Ruiz-Argueso, T., and Palacios, J.-M. Proteome Analysis Reveals a Significant Host-Specific Response in Rhizobium leguminosarum bv. viciae Endosymbiotic Cells // Molecular & Cellular Proteomics. — 2021. — V. 20. — P. 100.

26) Durgo, H., Klement, E., Hunyadi-Gulyas, E., Szucs, A., Kereszt, A., Medzihradszky, K. F., et al. Identification of nodule-specific cysteine-rich plant peptides in endosymbiotic bacteria // Proteomics. — 2015. — V. 15. — P. 22912295.

27) E, Z., Wang, L., and Zhou, J. Splicing and alternative splicing in rice and humans // BMB Reports. — 2013. — V. 46. — P. 439-447.

28) Edwards, C. R., Ritchie, W., Wong, J. J.-L., Schmitz, U., Middleton, R., An, X., et al. A dynamic intron retention program in the mammalian megakaryocyte and erythrocyte lineages // Blood. — 2016. — V. 127. — P. 24-34.

29) Etemadi, M., Gutjahr, C., Couzigou, J.-M., Zouine, M., Lauressergues, D., Timmers, A., et al. Auxin perception is required for arbuscule development in arbuscular mycorrhizal symbiosis // Plant Physiol. — 2014. — V. 166. — P. 281292.

30) Farkas, A., Maroti, G., Durg, H., Gyorgypal, Z., Lima, R. M., Medzihradszky, K. F., et al. Medicago truncatula symbiotic peptide NCR247 contributes to bacteroid differentiation through multiple mechanisms // Proceedings of the National Academy of Sciences. — 2014. — V. 111. — P. 5183-5188.

31) Filichkin, S. A., and Mockler, T. C. Unproductive alternative splicing and nonsense mRNAs: A widespread phenomenon among plant circadian clock genes // Biol Direct. — 2012. — V. 7. — P. 20.

32) Foo, E., Plett, J. M., Lopez-Raez, J. A., and Reid, D. Editorial: The Role of Plant Hormones in Plant-Microbe Symbioses // Front Plant Sci. — 2019. — V. 10. — P. 1391.

33) Fusconi, A. Regulation of root morphogenesis in arbuscular mycorrhizae: what role do fungal exudates, phosphate, sugars and hormones play in lateral root formation? // Annals of Botany. — 2014. — V. 113. — P. 19-33.

34) Gao, Y., Selee, B., Schnabel, E. L., Poehlman, W. L., Chavan, S. A., Frugoli, J. A., et al. Time Series Transcriptome Analysis in Medicago truncatula Shoot and Root Tissue During Early Nodulation // Front. Plant Sci. — 2022. — V. 13. — P. 861.

35) Gaude, N., Bortfeld, S., Duensing, N., Lohse, M., and Krajinski, F. Arbuscule-containing and non-colonized cortical cells of mycorrhizal roots undergo extensive and specific reprogramming during arbuscular mycorrhizal

development: Arbuscule-containing and non-colonized cortical cells // The Plant Journal. — 2012. — V. 69. — P. 510-528.

36) Gracz, J. Alternative splicing in plant stress response. bta 1, 9 — 17. — 2016.

37) Graham, M. A., Silverstein, K. A. T., Cannon, S. B., and VandenBosch, K. A. Computational Identification and Characterization of Novel Genes from Legumes // Plant Physiology. — 2004. — V. 135. — P. 1179-1197.

38) Gu, Y.-Q., Wildermuth, M. C., Chakravarthy, S., Loh, Y.-T., Yang, C., He, X., et al. Tomato Transcription Factors Pti4, Pti5, and Pti6 Activate Defense Responses When Expressed in Arabidopsis // Plant Cell. — 2002. — V. 14. — P. 817-831.

39) Guefrachi, I., Nagymihaly, M., Pislariu, C. I., Van de Velde, W., Ratet, P., Mars, M., et al. Extreme specificity of NCR gene expression in Medicago truncatula // BMC Genomics. — 2014. — V. 15. — P. 712.

40) Haag, A. F., Arnold, M. F. F., Myka, K. K., Kerscher, B., Dall'Angelo, S., Zanda, M., et al. Molecular insights into bacteroid development during Rhizobium— legume symbiosis // FEMS Microbiol Rev. — 2013. — V. 37. — P. 364-383.

41) Handa, Y., Nishide, H., Takeda, N., Suzuki, Y., Kawaguchi, M., and Saito, K. (2015). RNA-seq Transcriptional Profiling of an Arbuscular Mycorrhiza Provides Insights into Regulated and Coordinated Gene Expression in Lotus japonicus and Rhizophagus irregularis // Plant Cell Physiol. — 2015. — V. 56. — P. 1490-1511.

42) Hastwell, A. H., de Bang, T. C., Gresshoff, P. M., and Ferguson, B. J. CLE peptide-encoding gene families in Medicago truncatula and Lotus japonicus, compared with those of soybean, common bean and Arabidopsis // Sci Rep. — 2017. — V. 7. — P. 9384.

43) He, P., Warren, R. F., Zhao, T., Shan, L., Zhu, L., Tang, X., et al.

Overexpression of Pti5 in Tomato Potentiates Pathogen-Induced Defense Gene

Expression and Enhances Disease Resistance to Pseudomonas syringae pv. tomato

// MPMI. — 2001. — V. 14. — P. 1453-1457.

112

44) Herrera-Medina, M. J., Steinkellner, S., Vierheilig, H., Ocampo Bote, J. A., and García Garrido, J. M. Abscisic acid determines arbuscule development and functionality in the tomato arbuscular mycorrhiza // New Phytol. — 2007. — V. 175. — P. 554-564.

45) H0gslund, N., Radutoiu, S., Krusell, L., Voroshilova, V., Hannah, M. A., Goffard, N., et al. Dissection of symbiosis and organ development by integrated transcriptome analysis of lotus japonicus mutant and wild-type plants // PLoS One.

— 2009. — V. 4. — P. 6556.

46) Ho-Plágaro, T., and García-Garrido, J. M. Molecular Regulation of Arbuscular Mycorrhizal Symbiosis // Int J Mol Sci. — 2022. — V. 23. — P. 5960.

47) Horváth, B., Domonkos, Á., Kereszt, A., Szücs, A., Ábrahám, E., Ayaydin, F., et al. Loss of the nodule-specific cysteine rich peptide, NCR169, abolishes symbiotic nitrogen fixation in the Medicago truncatula dnf7 mutant // Proc Natl Acad Sci U S A. — 2015. — V. 112. — P. 15232-15237.

48) Huisman, R., Hontelez, J., Mysore, K. S., Wen, J., Bisseling, T., and Limpens, E. A symbiosis-dedicated SYNTAXIN OF PLANTS 13II isoform controls the formation of a stable host-microbe interface in symbiosis // New Phytol. — 2016.

— V. 211. — P. 1338-1351.

49) Huynh-Thu, V. A., Irrthum, A., Wehenkel, L., and Geurts, P. Inferring Regulatory Networks from Expression Data Using Tree-Based Methods // PLoS ONE. — 2010. — V. 5. — P. 12776.

50) Hwang, B., Lee, J. H., and Bang, D. Single-cell RNA sequencing technologies and bioinformatics pipelines // Exp Mol Med. — 2018. — V. 50. — P. 1-14.

51) Imin, N., Mohd-Radzman, N. A., Ogilvie, H. A., and Djordjevic, M. A. The peptide-encoding CEP1 gene modulates lateral root and nodule numbers in Medicago truncatula // Journal of Experimental Botany. — 2013. — V. 64. — P. 5395-5409.

52) Iñiguez, L. P., Ramírez, M., Barbazuk, W. B., and Hernández, G. Identification and analysis of alternative splicing events in Phaseolus vulgaris and Glycine max // BMC Genomics. — 2017. — V. 18. — P. 650.

53) Isozumi, N., Masubuchi, Y., Imamura, T., Mori, M., Koga, H., and Ohki, S. Structure and antimicrobial activity of NCR169, a nodule-specific cysteine-rich peptide of Medicago truncatula // Sci Rep. — 2021. — V. 11. — P. 9923.

54) Ivanova, K. A., Tsyganova, A. V., Brewin, N. J., Tikhonovich, I. A., and Tsyganov, V. E. Induction of host defences by Rhizobium during ineffective nodulation of pea (Pisum sativum L.) carrying symbiotically defective mutations sym40 (PsEFD), sym33 (PsIPD3/PsCYCLOPS) and sym42 // Protoplasma. — 2015. — V. 252. — P. 1505-1517.

55) Jardinaud, M.-F., Boivin, S., Rodde, N., Catrice, O., Kisiala, A., Lepage, A., et al. A Laser Dissection-RNAseq Analysis Highlights the Activation of Cytokinin Pathways by Nod Factors in the Medicago truncatula Root Epidermis // Plant Physiol. — 2016. — V. 171. — P. 2256-2276.

56) Journet, E.-P., El-Gachtouli, N., Vernoud, V., de Billy, F., Pichon, M., Dedieu, A., et al. Medicago truncatula ENOD11 : A Novel RPRP-Encoding Early Nodulin Gene Expressed During Mycorrhization in Arbuscule-Containing Cells // MPMI. — 2001. — V. 14. — P. 737-748.

57) Kalo, P. Nodulation Signaling in Legumes Requires NSP2, a Member of the GRAS Family of Transcriptional Regulators // Science. — 2005. — V. 308. — P. 1786-1789.

58) Kato, T., Kawashima, K., Miwa, M., Mimura, Y., Tamaoki, M., Kouchi, H., et al. Expression of Genes Encoding Late Nodulins Characterized by a Putative Signal Peptide and Conserved Cysteine Residues Is Reduced in Ineffective Pea Nodules // MPMI. — 2002. — V. 15. — P. 129-137.

59) Katoh, K. MAFFT: a novel method for rapid multiple sequence alignment based on fast Fourier transform // Nucleic Acids Research. — 2002. — V. 30. — P. 3059-3066.

60) Kevei, Z., Lougnon, G., Mergaert, P., Horvath, G. V., Kereszt, A., Jayaraman, D., et al. 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme a reductase 1 interacts with NORK and is crucial for nodulation in Medicago truncatula // Plant Cell. — 2007. — V. 19. — P. 3974-3989.

61) Kim, M., Chen, Y., Xi, J., Waters, C., Chen, R., and Wang, D. An antimicrobial peptide essential for bacterial survival in the nitrogen-fixing symbiosis // Proc Natl Acad Sci USA. — 2015. — V. 112. — P. 15238-15243.

62) Kouchi, H., and Hata, S. Isolation and characterization of novel nodulin cDNAs representing genes expressed at early stages of soybean nodule development // Molec. Gen. Genet. — 1993. — V. 238. — P. 106-119.

63) Kozlowski, L. P. IPC 2.0: prediction of isoelectric point and p K a dissociation constants // Nucleic Acids Research. — 2021. — V. 49. — P. 285-292.

64) Krajinski, F., and Frenzel, A. Towards the elucidation of AM-specific transcription in Medicago truncatula // Phytochemistry. — 2007. — V. 68. — P. 75-81.

65) Kreplak, J., Madoui, M.-A., Capal, P., Novak, P., Labadie, K., Aubert, G., et al. A reference genome for pea provides insight into legume genome evolution // Nat Genet. — 2015. — V. 51. — P. 1411-1422.

66) Küster, H., Vieweg, M. F., Manthey, K., Baier, M. C., Hohnjec, N., and Perlick, A. M. Identification and expression regulation of symbiotically activated legume genes // Phytochemistry. — 2007. — V. 68. — P. 8-18.

67) Laloum, T., Martin, G., and Duque, P. Alternative Splicing Control of Abiotic Stress Responses // Trends in Plant Science. — 2018. — V. 23. — P. 140-150.

68) Langmead, B., and Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2 // Nat Methods. — 2012. — V. 9. — P. 357-359.

69) Laporte, P., Satiat-Jeunemaitre, B., Velasco, I., Csorba, T., Van de Velde, W., Campalans, A., et al. A novel RNA-binding peptide regulates the establishment of the Medicago truncatula-Sinorhizobium meliloti nitrogen-fixing symbiosis: Small RNA-binding proteins in nodulation // The Plant Journal. — 2010. — V. 62. — P. 24-38.

70) Lecourieux, D., Ranjeva, R., and Pugin, A. Calcium in plant defence-signalling pathways // New Phytol. — 2006 — V. 171. — P. 249-269.

71) Lee, Y., and Rio, D. C. Mechanisms and Regulation of Alternative Pre-mRNA Splicing // Annu. Rev. Biochem. — 2015. — V. 84. — P. 291-323.

72) Legocki, R. P., and Verma, D. P. S. Identification of "nodule-specific" host proteins (nodulins) involved in the development of Rhizobium-Legume symbiosis // Cell. 1980. — V. 20. — P. 153-163.

73) Liao, Y., Smyth, G. K., and Shi, W. The R package Rsubread is easier, faster, cheaper and better for alignment and quantification of RNA sequencing reads // Nucleic Acids Research — 2019. — V. 47. — P. e47-e47

74) Libault, M. Transcriptional Reprogramming of Legume Genomes: Perspective and Challenges Associated With Single-Cell and Single Cell-Type Approaches During Nodule Development // Front. Plant Sci. — 2018. — V. 9. — P. 1600.

75) Lima, R. M., Kylarova, S., Mergaert, P., and Kondorosi, E. Unexplored Arsenals of Legume Peptides With Potential for Their Applications in Medicine and Agriculture // Front. Microbiol. — 2020. — V. 11. — P. 1307.

76) Liu, C.-Y., Zhang, F., Zhang, D.-J., Srivastava, A., Wu, Q.-S., and Zou, Y.-N. Mycorrhiza stimulates root-hair growth and IAA synthesis and transport in trifoliate orange under drought stress // Scientific Reports. — 2018. — V. 8. — P. 1978.

77) Liu, J., Miller, S. S., Graham, M., Bucciarelli, B., Catalano, C. M., Sherrier, D. J., et al. Recruitment of Novel Calcium-Binding Proteins for Root Nodule Symbiosis in // Medicago truncatula. Plant Physiology. — 2006. — V. 141. — P. 167-177.

78) Lopato, S., Kalyna, M., Dorner, S., Kobayashi, R., Krainer, A. R., and Barta, A. atSRp30, one of two SF2/ASF-like proteins from Arabidopsis thaliana, regulates splicing of specific plant genes // Genes Dev. — 1999. — V. 13. — P. 987-1001.

79) Madeira, F., Park, Y. mi, Lee, J., Buso, N., Gur, T., Madhusoodanan, N., et al. The EMBL-EBI search and sequence analysis tools APIs in 2019 // Nucleic Acids Research. — 2019. — V. 47. — P. W636-W641.

80) Manthey, K., Krajinski, F., Hohnjec, N., Firnhaber, C., Pühler, A., Perlick, A. M., et al. Transcriptome Profiling in Root Nodules and Arbuscular Mycorrhiza Identifies a Collection of Novel Genes Induced During Medicago truncatula Root Endosymbioses // MPMI. — 2004. — V. 17. — P. 1063-1077.

81) Maróti, G., Downie, J. A., and Kondorosi, É. Plant cysteine-rich peptides that inhibit pathogen growth and control rhizobial differentiation in legume nodules // Current Opinion in Plant Biology — 2015. — V. 26. — P. 57-63.

82) Maunoury, N., Redondo-Nieto, M., Bourcy, M., Van de Velde, W., Alunni, B., Laporte, P., et al. Differentiation of Symbiotic Cells and Endosymbionts in Medicago truncatula Nodulation Are Coupled to Two Transcriptome-Switches // PLoS ONE. — 2010. — V. 5. — P. e9519.

83) Mergaert, P., Kereszt, A., and Kondorosi, E. Gene Expression in Nitrogen-Fixing Symbiotic Nodule Cells in Medicago truncatula and Other Nodulating Plants // Plant Cell. — 2020. — V. 32. — P. 42-68.

84) Mergaert, P., Nikovics, K., Kelemen, Z., Maunoury, N., Vaubert, D., Kondorosi, A., et al. A Novel Family in Medicago truncatula Consisting of More Than 300 Nodule-Specific Genes Coding for Small, Secreted Polypeptides with Conserved Cysteine Motifs // Plant Physiology. — 2003. — V. 132. — P. 161-173.

85) Michael Love, S. A. DESeq2. — 2017

86) Mikuláss, K. R., Nagy, K., Bogos, B., Szegletes, Z., Kovács, E., Farkas, A., et al. Antimicrobial nodule-specific cysteine-rich peptides disturb the integrity of bacterial outer and inner membranes and cause loss of membrane potential // Ann Clin Microbiol Antimicrob. — 2016. — V. 15. — P. 43.

87) Mohd-Radzman, N. A., Binos, S., Truong, T. T., Imin, N., Mariani, M., and Djordjevic, M. A. Novel MtCEP1 peptides produced in vivo differentially regulate root development in Medicago truncatula // J Exp Bot. — 2015. — V. 66. — P. 5289-5300.

88) Montiel, J., Downie, J. A., Farkas, A., Bihari, P., Herczeg, R., Bálint, B., et al. Morphotype of bacteroids in different legumes correlates with the number and type of symbiotic NCR peptides // Proc Natl Acad Sci USA. — 2017. — V. 114.

— P. 5041-5046.

89) Mortier, V., Den Herder, G., Whitford, R., Van de Velde, W., Rombauts, S., D'haeseleer, K., et al. CLE Peptides Control Medicago truncatula Nodulation Locally and // Systemically. Plant Physiology. — 2010. — V. 153. — P. 222-237.

90) Nallu, S., Silverstein, K. A. T., Samac, D. A., Bucciarelli, B., Vance, C. P., and VandenBosch, K. A. Regulatory Patterns of a Large Family of Defensin-Like Genes Expressed in Nodules of Medicago truncatula // PLoS ONE. — 2013. — V. 8. — P. e60355.

91) Nanjareddy, K., Arthikala, M.-K., Gómez, B.-M., Blanco, L., and Lara, M. Differentially expressed genes in mycorrhized and nodulated roots of common bean are associated with defense, cell wall architecture, N metabolism, and P metabolism // PLoS One. — 2017. — V. 12. — P. e0182328.

92) Nap, J.-P., and Bisseling, T. Developmental Biology of a Plant-Prokaryote Symbiosis: The Legume Root Nodule // Science. — 1990. — V. 250. — P. 948954.

93) Nap, J.-P., and Bisseling, T. The roots of nodulins // Physiol Plant. — 1990.

— V. 79. — V. 407-414.

94) Ng, J. L. P., Perrine-Walker, F., Wasson, A. P., and Mathesius, U. The Control of Auxin Transport in Parasitic and Symbiotic Root-Microbe Interactions // Plants (Basel). — 2015. — V. 4. — P. 606-643.

95) Nicoud, Q., Barrière, Q., Busset, N., Dendene, S., Travin, D., Bourge, M., et al. Sinorhizobium meliloti Functions Required for Resistance to Antimicrobial NCR Peptides and Bacteroid Differentiation // mBio. — 2021. — V. 12. — P. e00895-21.

96) Nishida, H., Tanaka, S., Handa, Y., Ito, M., Sakamoto, Y., Matsunaga, S., et

al. A NIN-LIKE PROTEIN mediates nitrate-induced control of root nodule

symbiosis in Lotus japonicus // Nat Commun. — 2018. — V. 9. — P. 499.

118

97) Ohtani, M., Demura, T., and Sugiyama, M. Arabidopsis ROOT INITIATION DEFECTIVE1, a DEAH-Box RNA Helicase Involved in Pre-mRNA Splicing, Is Essential for Plant Development // The Plant Cell. — 2013. — V. 25. — P. 20562069.

98) Okamoto, S., Ohnishi, E., Sato, S., Takahashi, H., Nakazono, M., Tabata, S., et al. Nod Factor/Nitrate-Induced CLE Genes that Drive HAR1-Mediated Systemic Regulation of Nodulation // Plant and Cell Physiology. — 2009. — V. 50. — P. 6777.

99) Oldroyd, G. E. D. Speak, friend, and enter: signalling systems that promote beneficial symbiotic associations in plants // Nat Rev Microbiol. — 2013. — V. 11. — P. 252-263.

100) Oono, R., and Denison, R. F. Comparing Symbiotic Efficiency between Swollen versus Nonswollen Rhizobial Bacteroids // Plant Physiology. — 2010. — V. 154. — P. 1541— 1548.

101) Oulhen, N., Schulz, B. J., and Carrier, T. J. English translation of Heinrich Anton de Bary's 1878 speech, 'Die Erscheinung der Symbiose' ('De la symbiose') // Symbiosis. — 2016. — V. 69. — P. 131-139.

102) Ovchinnikova, E., Journet, E.-P., Chabaud, M., Cosson, V., Ratet, P., Duc, G., et al. IPD3 controls the formation of nitrogen-fixing symbiosomes in pea and Medicago Spp // Mol Plant Microbe Interact. — 2011. — V. 24. — P. 1333-1344.

103) Pan, H., Oztas, O., Zhang, X., Wu, X., Stonoha, C., Wang, E., et al. A symbiotic SNARE protein generated by alternative termination of transcription // Nature Plants. — 2016. — V. 2. — P. 151.

104) Pan, H., and Wang, D. Nodule cysteine-rich peptides maintain a working balance during nitrogen-fixing symbiosis // Nature Plants. — 2017. — V. 3. — P. 170.

105) Parniske, M. Arbuscular mycorrhiza: the mother of plant root endosymbioses // Nat Rev Microbiol. — 2008. — V. 6. — P. 763-775.

106) Patro, R., Duggal, G., Love, M. I., Irizarry, R. A., and Kingsford, C. Salmon provides fast and bias-aware quantification of transcript expression // Nat Methods. — 2017. — V. 14. — P. 417-419.

107) Pierre, O., Hopkins, J., Combier, M., Baldacci, F., Engler, G., Brouquisse, R., et al. Involvement of papain and legumain proteinase in the senescence process of Medicago truncatula nodules // New Phytol. — 2014. — V. 202. — P. 849-863.

108) Price, P. A., Tanner, H. R., Dillon, B. A., Shabab, M., Walker, G. C., and Griffitts, J. S. Rhizobial peptidase HrrP cleaves host-encoded signaling peptides and mediates symbiotic compatibility // Proc Natl Acad Sci USA. — 2015. — V. 112. — P. 244-249.

109) Qiao, Z., Pingault, L., Nourbakhsh-Rey, M., and Libault, M. Comprehensive Comparative Genomic and Transcriptomic Analyses of the Legume Genes Controlling the Nodulation Process // Front. Plant Sci. — 2016. — V. 7.

110) Quinlan, A. R., and Hall, I. M. (2010). BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features // Bioinformatics. — 2010. — V. 26. — P. 841842.

111) Ranty, B., Aldon, D., and Galaud, J.-P. Plant Calmodulins and Calmodulin-Related Proteins: Multifaceted Relays to Decode Calcium Signals // Plant Signaling & Behavior. — 2006. — V. 1. — P. 96-104.

112) Rayson, S., Arciga-Reyes, L., Wootton, L., De Torres Zabala, M., Truman, W., Graham, N., et al. A Role for Nonsense-Mediated mRNA Decay in Plants: Pathogen Responses Are Induced in Arabidopsis thaliana NMD Mutants // PLoS ONE. — 2012. — V. 7. — P. 319.

113) Recchia, G. H., Konzen, E. R., Cassieri, F., Caldas, D. G. G., and Tsai, S. M. Arbuscular Mycorrhizal Symbiosis Leads to Differential Regulation of Drought-Responsive Genes in Tissue-Specific Root Cells of Common Bean // Front. Microbiol. — 2019. — V. 9. — P. 1339.

114) Reddy, A. S. N., Marquez, Y., Kalyna, M., and Barta, A. Complexity of the Alternative Splicing Landscape in Plants // Plant Cell. — 2013. — V. 25. — P. 3657-3683.

115) Rigo, R., Bazin, J., Crespi, M., and Charon, C. Alternative Splicing in the Regulation of Plant— Microbe Interactions // Plant and Cell Physiology. — 2019.

— V. 60. — P. 1906 -1916.

116) Robinson, M. D., McCarthy, D. J., and Smyth, G. K. edgeR: a Bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data // Bioinformatics. — 2010. — V. 26. — P. 139-140.

117) Rodriguez, L., Gonzalez-Guzman, M., Diaz, M., Rodrigues, A., Izquierdo-Garcia, A. C., Peirats-Llobet, M., et al. C2-domain abscisic acid-related proteins mediate the interaction of PYR/PYL/RCAR abscisic acid receptors with the plasma membrane and regulate abscisic acid sensitivity in Arabidopsis // Plant Cell. — 2014. — V. 26. — P. 4802 -4820.

118) Roux, B., Rodde, N., Jardinaud, M.-F., Timmers, T., Sauviac, L., Cottret, L., et al. An integrated analysis of plant and bacterial gene expression in symbiotic root nodules using laser-capture microdissection coupled to RNA sequencing // Plant J.

— 2014. — V. 77. — P. 817-837.

119) Roy, S., Liu, W., Nandety, R. S., Crook, A., Mysore, K. S., Pislariu, C. I., et al. Celebrating 20 Years of Genetic Discoveries in Legume Nodulation and Symbiotic Nitrogen Fixation // Plant Cell. — 2020. — V. 32. — P. 15-41.

120) Russo, P. S. T., Ferreira, G. R., Cardozo, L. E., Bürger, M. C., Arias-Carrasco, R., Maruyama, S. R., et al. CEMiTool: a Bioconductor package for performing comprehensive modular co-expression analyses // BMC Bioinformatics. — 2018.

— V. 19. — P. 56.

121) Sablok, G., Powell, B., Braessler, J., Yu, F., and Min, X. J. Comparative landscape of alternative splicing in fruit plants // Current Plant Biology. — 2017.

— V. 9— 10. — P. 29-36.

122) Sakamoto, K., Ogiwara, N., Kaji, T., Sugimoto, Y., Ueno, M., Sonoda, M., et al. Transcriptome analysis of soybean (Glycine max) root genes differentially expressed in rhizobial, arbuscular mycorrhizal, and dual symbiosis // J Plant Res.

— 2019. — V. 132. — P. 541-568.

123) Sanko-Sawczenko, I., Lotocka, B., Mielecki, J., Rekosz-Burlaga, H., and Czarnocka, W. Transcriptomic Changes in Medicago truncatula and Lotus japonicus Root Nodules during Drought Stress // Int J Mol Sci. — 2019. — V. 20. — P. 1204.

124) Savaldi-Goldstein, S., Aviv, D., Davydov, O., and Fluhr, R. Alternative splicing modulation by a LAMMER kinase impinges on developmental and transcriptome expression // Plant Cell. — 2003. — V. 15. — P. 926-938.

125) Scheres, B., van Engelen, F., van der Knaap, E., van de Wiel, C., van Kammen, A., and Bisseling, T. Sequential induction of nodulin gene expression in the developing pea nodule // Plant Cell. — 1990. — V. 2. — P. 687-700.

126) Schliep, K. P. phangorn: phylogenetic analysis in R // Bioinformatics. — 2011. — V. 27. — P. 592-593.

127) Shang, X., Cao, Y., and Ma, L. Alternative Splicing in Plant Genes: A Means of Regulating the Environmental Fitness of Plants // IJMS. — 2017. — V. 18. — P. 432.

128) Shannon, P., Markiel, A., Ozier, O., Baliga, N. S., Wang, J. T., Ramage, D., et al. Cytoscape: A Software Environment for Integrated Models of Biomolecular Interaction Networks // Genome Res. — 2003. — V. 13. — P. 2498-2504.

129) Shaul, O. Unique Aspects of Plant Nonsense-Mediated mRNA Decay // Trends in Plant Science. — 2015. — V. 20. — P. 767-779.

130) Shirasawa, K., Sasaki, K., Hirakawa, H., and Isobe, S. — 2020. Genomic region associated with pod color variation in pea ( Pisum sativum ). Genomics.

131) Shtark, O. Y., Sulima, A. S., Zhernakov, A. I., Kliukova, M. S., Fedorina, J. V., Pinaev, A. G., et al. Arbuscular mycorrhiza development in pea (Pisum sativum L.) mutants impaired in five early nodulation genes including putative orthologs of NSP1 and NSP2 // Symbiosis. — 2016. — V. 68. — P. 129-144.

132) Suyama, M., Torrents, D., and Bork, P. PAL2NAL: robust conversion of protein sequence alignments into the corresponding codon alignments // Nucleic Acids Research. — 2006. — V. 34. — P. 609-612.

133) Tang, F., Yang, S., Liu, J., and Zhu, H. Rj4 , a Gene Controlling Nodulation Specificity in Soybeans, Encodes a Thaumatin-Like Protein But Not the One Previously Reported // Plant Physiol. — 2016. — V. 170. — P. 26-32.

134) Teufel, F., Almagro Armenteros, J. J., Johansen, A. R., Gislason, M. H., Pihl, S. I., Tsirigos, K. D., et al. SignalP 6.0 predicts all five types of signal peptides using protein language models // Nat Biotechnol. — 2022.

135) Tiricz, H., Szücs, A., Farkas, A., Pap, B., Lima, R. M., Maroti, G., et al. Antimicrobial Nodule-Specific Cysteine-Rich Peptides Induce Membrane Depolarization-Associated Changes in the Transcriptome of Sinorhizobium meliloti // Appl Environ Microbiol. — 2013. — V. 79. — P. 6737-6746.

136) Tominaga, T., Miura, C., Sumigawa, Y., Hirose, Y., Yamaguchi, K., Shigenobu, S., et al. (2021). Conservation and Diversity in Gibberellin-Mediated Transcriptional Responses Among Host Plants Forming Distinct Arbuscular Mycorrhizal Morphotypes. Front Plant Sci 12, 795695. doi: 10.3389/fpls.2021.795695.

137) Trincado, J. L., Entizne, J. C., Hysenaj, G., Singh, B., Skalic, M., Elliott, D. J., et al. SUPPA2: fast, accurate, and uncertainty-aware differential splicing analysis across multiple conditions // Genome Biol. — 2018. — V. 19. — P. 40.

138) Tromas, A., Parizot, B., Diagne, N., Champion, A., Hocher, V., Cissoko, M., et al. Heart of Endosymbioses: Transcriptomics Reveals a Conserved Genetic Program among Arbuscular Mycorrhizal, Actinorhizal and Legume-Rhizobial Symbioses // PLoS ONE. — 2012. — V. 7. — P. 447.

139) Tsyganov, V. E., Morzhina, E. V., Stefanov, S. Y., Borisov, A. Y., Lebsky, V. K., and Tikhonovich, I. A. The pea (Pisum sativum L.) genes sym33 and sym40 control infection thread formation and root nodule function // Mol Gen Genet. — 1998. — V. 259. — P. 491-503.

140) Tsyganov, V. E., Seliverstova, E. V., Voroshilova, V. A., Tsyganova, A. V., Pavlova, Z. B., Lebskii, V. K., et al. Double mutant analysis of sequential functioning of pea (Pisum sativum L.) genes Sym13, Sym33, and Sym40 during

symbiotic nodule development // Russ J Genet Appl Res. — 2011. — V. 1. — P. 343-348.

141) Tsyganov, V. E., Voroshilova, V. A., Herrera-Cervera, J. A., Sanjuan-Pinilla, J. M., Borisov, A. Y., Tikhonovich, I. A., et al. Developmental downregulation of rhizobial genes as a function of symbiosome differentiation in symbiotic root nodules of Pisum sativum // New Phytologist. — 2003. — V. 159. — P. 521-530.

142) Tsyganova, A. V., and Tsyganov, V. E. Organization of the endoplasmic reticulum in cells of effective and ineffective pea nodules (Pisum sativum L.) // Ecological genetics. — 2019. — V. 17. — P. 5-14.

143) Van de Velde, W., Zehirov, G., Szatmari, A., Debreczeny, M., Ishihara, H., Kevei, Z., et al. Plant Peptides Govern Terminal Differentiation of Bacteria in Symbiosis // Science. — 2010. — V. 327. — P. 1122-1126.

144) Verma, D. P. S., Fortin, M. G., Stanley, J., Mauro, V. P., Purohit, S., and Morrison, N. Nodulins and nodulin genes of Glycine max // Plant Mol Biol. — 1986. — V. 7. — P. 51-61.

145) Vitting-Seerup, K. — 2017. IsoformSwitchAnalyzeR.

146) Walters, B., Lum, G., Sablok, G., and Min, X. J. Genome-Wide Landscape of Alternative Splicing Events in Brachypodium distachyon // DNA Research. — 2013. — V. 20. — P. 163-171.

147) Wang, C., Zhu, H., Jin, L., Chen, T., Wang, L., Kang, H., et al. Splice variants of the SIP1 transcripts play a role in nodule organogenesis in Lotus japonicus // Plant Mol Biol. — 2013. — V. 82. — P. 97-111.

148) Wang, D., Griffitts, J., Starker, C., Fedorova, E., Limpens, E., Ivanov, S., et al. A nodule-specific protein secretory pathway required for nitrogen-fixing symbiosis // Science. — 2010. — V. 327. — P. 1126-1129.

149) Wang, G., Li, X., and Wang, Z. APD3: the antimicrobial peptide database as a tool for research and education // Nucleic Acids Res. — 2016. — V. 44. — P. 1087-1093.

150) Wang, L., Zhou, Y., Li, R., Liang, J., Tian, T., Ji, J., et al. Single cell-type

transcriptome profiling reveals genes that promote nitrogen fixation in the infected

124

and uninfected cells of legume nodules // Plant Biotechnology Journal. — 2022. — V. 20. — P. 616-618.

151) Wickham, H. — 2016. ggplot2: elegant graphics for data analysis. Second edition. Cham: Springer.

152) Wyss, P., Mellor, RobertB., and Wiemken, A. Vesicular-arbuscular mycorrhizas of wild-type soybean and non-nodulating mutants with Glomus mosseae contain symbiosis-specific polypeptides (mycorrhizins), immunologically cross-reactive with nodulins // Planta. — 1990. — V. 182.

153) Yang, T., Liu, R., Luo, Y., Hu, S., Wang, D., Wang, C., et al. Improved pea reference genome and pan-genome highlight genomic features and evolutionary characteristics // Nat Genet. — 2022. — V. 54. — P. 1553-1563.

154) Yang, Z. PAML 4: Phylogenetic Analysis by Maximum Likelihood // Molecular Biology and Evolution. — 2007. — V. 24. — P. 1586-1591.

155) Yokota, K., and Hayashi, M. Function and evolution of nodulation genes in legumes // Cell. Mol. Life Sci. — 2011. — V. 68. — P. 1341-1351.

156) Yu, G., Smith, D. K., Zhu, H., Guan, Y., and Lam, T. T. ggtree : an r package for visualization and annotation of phylogenetic trees with their covariates and other associated data // Methods Ecol Evol. — 2017. — V. 8. — P. 28-36.

157) Zenoni, S., Ferrarini, A., Giacomelli, E., Xumerle, L., Fasoli, M., Malerba, G., et al. Characterization of Transcriptional Complexity during Berry Development in Vitis vinifera Using RNA-Seq // Plant Physiol. — 2010. — V. 152. — P, 1787-1795.

158) Zhang, M., Zhong, X., Li, M., Yang, X., Abou Elwafa, S. F., Albaqami, M., et al. Genome-wide analyses of the Nodulin-like gene family in bread wheat revealed its potential roles during arbuscular mycorrhizal symbiosis // International Journal of Biological Macromolecules. — 2022. — V. 201. — P. 424-436.

159) Zhou, P., Silverstein, K. A., Gao, L., Walton, J. D., Nallu, S., Guhlin, J., et al. Detecting small plant peptides using SPADA (Small Peptide Alignment Discovery Application) // BMC Bioinformatics. — 2013. — V. 14. — P. 335.

160) Zhukov, V. A., Zhernakov, A. I., Kulaeva, O. A., Ershov, N. I., Borisov, A. Y., and Tikhonovich, I. A. De Novo Assembly of the Pea (Pisum sativum L.) Nodule Transcriptome // Int J Genomics. — 2015. — V. 69. — P. 594.

161) Zipfel, C., and Oldroyd, G. E. D. Plant signalling in symbiosis and immunity // Nature. — 2017. — V. 543. — P. 328-336.

162) Zorin, E. A., Kliukova, M. S., Afonin, A. M., Gribchenko, E. S., Gordon, M. L., Sulima, A. S., et al. (2022). A variable gene family encoding nodule-specific cysteine-rich peptides in pea (Pisum sativum L.) // Front. Plant Sci. — 2022. — V. 13. — P. 4726.