Катионные липосомы 2X3-DOPE и проникающий в клетку пептид EB1 для доставки терапевтических РНК тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, кандидат наук Высочинская Вера Валерьевна

• Высочинская Вера Валерьевна
• кандидат наук
• 2024

Оглавление диссертации кандидат наук Высочинская Вера Валерьевна

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 РНК-терапия

1.2 Терапевтические мРНК

1.3 Терапевтические миРНК

1.3.1 РНК-интерференция. Малые интерферирующие РНК

1.3.2 Хронический миелолейкоз

1.3.3 Ингибирование химерного онкогена BCR-ABL с использованием малых интерферирующих РНК

1.4 Проблема и методы доставки терапевтических НК

1.4.2 Невирусные системы доставки миРНК

1.4.3 Полимерные наночастицы

1.4.4 Липидные наночастицы

1.4.5 Проникающие в клетку пептиды

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1 Клеточные линии

2.2 миРНК

2.3 Синтез мРНК in vitro

2.4 Пептиды

2.5 Катионные липосомы

2.6 Приготовление комплексов РНК с катионными липосомами

2.7 Приготовление комплексов миРНК с пептидом EB1

2.8 Определение размеров и измерение Z- потенциала комплексов

2.9 Гель-ретардация комплексов

2.10 Количественное определение эффективности связывания мРНК катионными липосомами

2.11 Просвечивающая электронная микроскопия (ПЭМ)

2.12 Атомно-силовая микроскопия (АСМ)

2.13 Трансфекция

2.14 Определение метаболической активности клеток

2.15 Флуоресцентная микроскопия

2.16 Проточная цитофлуориметрия

2.17 Люминесцентный анализ

2.18 Введение комплексов катионных липосом с мРНК-Fluc и визуализация биолюминесценции

in vivo

2.19 Ингибирование эндоцитоза

2.20 Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия клеток

2.21 Иммунофлуоресцентный анализ

2.22 Выделение РНК, обратная транскрипция и ПЦР-РВ

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1 Получение и исследование катионных липосом для доставки мРНК

3.1.1 Получение и физико-химическая характеристика катионных липосом

3.1.2 Получение и физико-химическая характеристика комплексов катионных липосом с модельными мРНК (липоплексов): исследование влияния липидной композиции катионных липосом на формирование липоплексов

3.1.3 Исследование влияния композиции катионных липосом на эффективность внутриклеточной доставки модельных мРНК в клетки эукариот

3.1.4 Исследование эффективности доставки мРНК-Fluc катионными липосомами 2Х3-DOPE 1:3 in vivo

3.2 Получение и исследование катионных липосом для доставки миРНК

3.2.1 Модель in vitro для изучения эффективности средств доставки миРНК

3.2.1 Физико-химическая характеризация исследуемых носителей и их комплексов с миРНК

3.2.2 Оценка эффективности доставки миРНК исследуемыми комплексами в клетки К-562

3.2.3 Исследование цитотоксичности пептида ЕВ1 и катионных липосом 2X3-DOPE-PEG

3.2.4 Исследование механизмов проникновения комплексов в клетки К-562

3.2.5 Исследование эндосомального высвобождения миРНК при доставке в клетки К-562 исследуемыми комплексами

3.2.6 Оценка эффективности подавления экспрессии гена BCR-ABL исследуемыми комплексами с миРНК на клеточной линии К-562

3.2.7 Оценка антипролиферативной активности исследуемыми комплексами с миРНК на клеточной линии К-562

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ПРИЛОЖЕНИЕ А. Благодарности

ВВЕДЕНИЕ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Катионные липосомы 2X3-DOPE и проникающий в клетку пептид EB1 для доставки терапевтических РНК»

Актуальность

РНК-терапия представляет собой новое направление в лечении и профилактике заболеваний c использованием молекул на основе РНК. Наибольших успехов достигла РНК-терапия на основе матричной РНК (мРНК) для создания вакцин и терапевтических препаратов и малых интерферирующих РНК (миРНК), подавляющих экспрессию патологического гена.

Препараты на основе РНК можно разделить на два основных класса: макромолекулярные РНК-препараты, синтезированные с помощью метода in vitro транскрипции (мРНК-препараты) и олигонуклеотидные препараты, синтезированные химическими методами (антисмысловые олигонуклеотиды, малые интерферирующие РНК (миРНК) и РНК-аптамеры) [1]. За последнее десятилетие конструкции на основе мРНК стали новым и очень привлекательным классом биологических препаратов, которые можно использовать для кодирования любого белка, представляющего интерес, непосредственно in vivo. Терапевтическое использование мРНК является одним из наиболее перспективных подходов к борьбе с широким спектром заболеваний. Успехи в разработке мРНК вакцин против COVID-19 продемонстрировали огромный потенциал новой технологии. В дополнение к профилактическим мРНК-вакцинам от инфекционных заболеваний и терапевтическим мРНК-вакцинам, применяемым в онкологии, наблюдается возрастающий интерес к мРНК-терапии более широкого спектра заболеваний, в том числе метаболических, генетических, сердечно-сосудистых, воспалительных и других [2]. С момента открытия механизма РНК-интерференции миРНК используются как специфичный и эффективный способ подавления экспрессии различных генов, в том числе и с терапевтической целью. Несколько препаратов на основе миРНК недавно было одобрено для клинического применения у пациентов с редкими наследственными заболеваниями [3].Терапевтические миРНК представляют собой уникальный и многообещающий класс препаратов, предоставляющий возможность терапии широкого спектра заболеваний с установленными генетическими мишенями, включая инфекционные, онкологические и моногенные заболевания

[4].

Независимо от терапевтического механизма и метода получения РНК большой размер, отрицательный заряд и чувствительность к деградации РНКазами в биологических жидкостях приводят к невозможности пассивного проникновения этих молекул в клетки-мишени для реализации биологического эффекта. Для преодоления клеточных и физиологических барьеров с целью эффективной доставки молекул РНК были разработаны как вирусные, так и невирусные системы доставки, защищающие РНК от деградации и обеспечивающие интернализацию и высвобождение в целевые клетки. Применение вирусных векторов для генотерапии

продемонстрировало успешные клинические результаты, но эффективность такого подхода может быть ограничена существующим иммунитетом, вирусной иммунногенностью, нежелательной геномной интеграцией, сложностями, связанными с масштабированием, и дорогостоящим производством. Данные ограничения стимулировали поиск альтернативных невирусных средств доставки нуклеиновых кислот (НК), что привело к достижениям в разработке таких синтетических материалов для внутриклеточной доставки РНК, как полимерные наночастицы, проникающие в клетки пептиды (cell penetrating peptides, CPP) и липосомальные наночастицы (ЛНЧ) [5].

Несмотря на стремительное внедрение в клиническую практику ЛНЧ для доставки терапевтических РНК проблема разработки новых эффективных носителей для реализации РНК-терапии в клинической практике остается актуальной задачей.

Степень разработанности темы исследования

На сегодняшний день ЛНЧ считаются наиболее перспективными средствами доставки терапевтических нуклеиновых кислот [6,7]. ЛНЧ вошли в состав первого одобренного для клинического применения препарата для генотерапии на основе миРНК - Патисирана (Patisiran, Onpattro), разработанного компанией Alnylam для лечения пациентов с редким наследственным заболеванием - транстиретин-опосредованным амилоидозом [8]. ЛНЧ также одобрены к клиническому использованию Американским Управлением по контролю качества продуктов и лекарственных средств (Food and drug administration, FDA) в составе мРНК-вакцин против SARS-CoV-2, разработанных компаниями Pfizer/BioNTech/Acuitas и Moderna [9].

ЛНЧ, одобренные для клинического применения, состоят из четырех компонентов: катионного или ионизируемого липида, липида-хелпера, холестерина и липида, модифицированного полиэтиленгликолем (ПЭГ). Катионные и ионизируемые липиды считаются основными структурными компонентами в составе ЛНЧ, обеспечивающими компактизацию НК. Несмотря на стремительное внедрение в практику нескольких РНК-вакцин против SARS-CoV-2, задача разработки новых средств доставки терапевтических НК остается актуальной. На сегодняшний день не достигнуто консенсуса относительно связи между широким разнообразием структурных компонентов липосом для доставки НК и их эффективностью как in vitro, так и in vivo. Активно изучается структура липосомальных систем доставки, и продемонстрированы некоторые аспекты влияния каждого из компонентов ЛНЧ и их физико-химических параметров на механизм и эффективность внутриклеточного проникновения комплексов носителей с НК в клетку с целью оптимизации их биологической активности [10].

В качестве перспективных основных структурных компонентов липосомальных средств доставки НК рассматриваются поликатионные амфифилы на основе холестерола и природных

полиаминов, в частности - 1,26-бис(холест-5-ен-3ß-илоксикарбониламино)-7,11,16,20-тетраазагексакозана тетрагидрохлорид (2X3) [11-15]. 2Х3 представляет собой комбинацию двух структурных доменов - гидрофобного и гидрофильного поликатионного, которые соединяются спейсерными группами с помощью линкера карбаматного типа. За счет своего положительного заряда молекулы 2X3 способны образовывать комплексы с отрицательно заряженными НК. Данные средства доставки НК показали свою эффективность как в условиях in vitro, так и in vivo [12,13,16,17].

В состав катионных липосом часто добавляют липиды-хелперы, которые способствуют увеличению эффективности трансфекции и облегчают высвобождение НК в клетке. В частности, 1,2-диолеоил^п-глицеро-3-фосфоэтаноламин (1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, DOPE), цвиттерионный хелперный липид, способен формировать инвертированную гексагональную фазу при закислении эндосом, что увеличивает эффективность высвобождения в цитоплазму доставляемых молекул НК [18,19]. Показано, что эффективность трансфекции НК зависит от молярного соотношения различных катионных липидов с хелперным липидом DOPE в структуре разрабатываемых катионных липосом, при этом для разных типов НК (плазмидная ДНК (пДНК), мРНК, миРНК) такие соотношения оказываются различны [12,20-22]. В частности, было показано, что катионные липосомы на основе 2Х3 и DOPE демонстрируют максимальную эффективность трансфекции пДНК при молярном соотношении 2X3 и DOPE равном 2:1 и 2.5:1 (то есть количество 2Х3 в структуре катионных липосом было в два раза и более выше, чем липида-хелпера DOPE) [23]. При этом оптимальное молярное соотношение в структуре катионных липосом на основе 2X3 и DOPE для доставки мРНК и миРНК не исследовано. В нашей работе с целью создания эффективной липосомальной системы доставки терапевтических РНК мы впервые исследовали влияние композиции катионных липосом на основе катионного амфифила 2X3 и цвитерионного липида DOPE и количественного соотношения положительно заряженных атомов азота катионных липосом и отрицательно заряженных фосфатных групп НК (N/P соотношения) на физико-химические характеристики липоплексов, их морфологию и эффективность доставки мРНК и миРНК в эукариотические клетки.

На сегодняшний день липосомальные носители активно исследуются для доставки всех типов НК, в то время как для доставки коротких НК (например, миРНК) еще одним перспективным направлением является применение CPP [24], представляющих собой особый класс коротких пептидов, обладающих уникальным свойством - способностью к интернализации в эукариотические клетки. Несмотря на обширные исследования CPP качестве средств доставки НК, ни один препарат, содержащий CPP, не одобрен FDA [25] из-за отсутствия достаточных исследований и понимания механизмов интернализации комплексов CPP/НК и эффективности эндосомального высвобождения CPP на конкретной клеточной модели. В нашей работе мы

исследовали CPP - EB1, представляющий собой аналог пенетратина [26], в качестве средства доставки миРНК и провели сравнительное исследования эффективности внутриклеточной доставки миРНК с катионными липосомами на основе 2Х3 и DOPE.

Цель и задачи исследования

Целью данной работы являлась оценка возможности использования катионных липосом на основе катионного амфифила 2Х3 и хелперного липида DOPE, а также проникающего в клетку пептида EB1 в качестве средств доставки терапевтических РНК.

В соответствии с целью были поставлены следующие задачи:

1. Получить и охарактеризовать комплексы катионных липосом на основе катионного амфифила 2Х3 и хелперного липида DOPE (2X3-DOPE) в молярных соотношениях 1:1, 1:2 и 1:3 с модельными мРНК, кодирующими зеленый флуоресцентный белок (мРНК-eGFP) и люциферазу светлячка (мРНК-FLuc).

2. Исследовать влияние композиции катионных липосом 2X3-DOPE на эффективность внутриклеточной доставки модельных мРНК в клетки эукариот и in vivo.

3. Получить и охарактеризовать комплексы катионных липосом 2X3-DOPE или эндосомолитического проникающего в клетку пептида EB1 с модельной миРНК. Оценить эффективность доставки модельных миРНК, меченных флуоресцентной меткой, исследуемыми комплексами в клетки эукариот.

4. Установить механизм внутриклеточной доставки флуоресцентно меченой модельной миРНК в составе комплексов с катионными липосомами 2X3-DOPE и пептидом EB1.

5. Сравнить эффективность катионных липосом 2X3-DOPE и пептида EB1 в качестве средств доставки противоопухолевой bcr-abl миРНК, направленной на химерный онкоген BCR-ABL на in vitro модели хронического миелолейкоза (клеточной линии K-562).

Научная новизна

В рамках данной работы впервые показано влияние молярного соотношения 2X3 и DOPE в структуре катионных липосом на эффективность доставки молекул мРНК. Показано, что увеличение молярного соотношения хелперного липида DOPE по отношению к катионному липиду 2X3 в структуре катионных липосом 2X3-DOPE приводит к увлечению эффективности трансфекции мРНК. Катионные липосомы 2X3-DOPE с молярным соотношением 1:3 (2X3-DOPE 1:3), впервые полученные и исследованные для доставки НК, продемонстрировали максимальную эффективность трансфекции модельных мРНК в клетки эукариот, которая не уступала и даже превосходила эффективность коммерческого трансфекционного реагента.

Впервые было показано, что катионные липосомы 2X3-DOPE 1:3, модифицированные PEG2000, эффективно доставляют мРНК-FLuc in vivo.

В процессе выполнения исследования впервые продемонстрировано эффективное применение комплексов на основе оригинальных катионных липосом 2X3-DOPE-PEG и нековалентного нанокомплекса на основе проникающего в клетку пептида EB1 и bcr-abl миРНК для подавления экспрессии химерного онкогена BCR-ABL на in vitro модели хронического миелолейкоза (ХМЛ). Оба подхода обеспечивают эффективную внутриклеточную доставку миРНК. Было показано, что ПЭГ-модификация липосом 2X3-DOPE обеспечивает высокую эффективность трансфекции, выход миРНК из эндосом, сайленсинг таргетного гена BCR-ABL и противоопухолевый эффект.

Кроме того, было впервые обнаружено, что пегилирование липосом 2X3-DOPE, обычно используемое для повышения эффективности доставки НК липосомами in vivo, не только не снижает эффективность доставки in vitro, но и приводит к увеличению эффективности доставки противоопухолевых миРНК по сравнению с непегилированными липосомами в клетках K-562.

Теоретическая и практическая значимость работы

Исследованная в данной работе композиция катионного амфифила 2X3 и хелперного липида DOPE в молярном соотношении 1:3 показала свою эффективность для доставки модельных мРНК в клетки эукариот и in vivo, и может быть использована для разработки мРНК-вакцин против широкого спектра соматических и инфекционных заболеваний.

Продемонстрирована возможность успешного применения пегилированных катионных липосом 2X3-DOPE и пептида EB1 для доставки терапевтических миРНК, направленных на подавление экспрессии химерного онкогена BCR-ABL в опытах in vitro. Полученные результаты исследования противоопухолевого потенциала исследуемых комплексов могут быть в дальнейшем использованы для разработки фармакологической формы препарата на основе миРНК, предназначенного для лечения ХМЛ.

Показано, что в механизм интернализации комплексов EBl/миРНК в клетки K-562 вовлечены различные пути эндоцитоза, при этом пептид обладает клеточной специфичностью и концепция универсальности применения CPP для доставки терапевтических миРНК на любых моделях может быть не верна, что в свою очередь требует детального изучения механизмов на выбранной модели. Комплексы пегилированных катионных липосом 2Х3^ОРЕ/миРНК проникают в клетки K-562 путем динамин-зависимого эндоцитоза, они эффективно доставляли миРНК во все исследованные клеточные линии и являются более универсальными системами доставки.

Пегилирование катионных липосом 2X3-DOPE в молярном соотношении 1:3 приводит к увеличению эффективности доставки миРНК и снижению эффективности доставки мРНК in vitro. Полученные данные свидетельствуют о различии в механизмах комплексообразования между липосомами одинаковой структуры и разными типами молекул РНК.

Методология и методы исследования

В работе применяли стандартные культуральные, биохимические, биофизические и молекулярно-биологические методы. Для получения модельных мРНК использовали метод in vitro транскрипции (IVT). РНК олигонуклеотиды и проникающий в клетки пептид EB1 были химически синтезированы. Катионные липосомы на основе катионного амфифила 2Х3 и хелперного липида DOPE получали методом гидратации тонкой пленки. Полученные средства доставки и их комплексы с молекулами РНК были охарактеризованы с использованием методов динамического светорассеяния (ДСР), электронной микроскопии и атомно-силовой микроскопии. Эффективность доставки мРНК in vitro контролировали методами флуоресцентной микроскопии, проточной цитофлуориметрии и анализа биолюминисценции. Эффективность доставки модельной мРНК-Fluc in vivo оценивали с помощью системы визуализации биолюминисценции in vivo. Механизм доставки флуоресцентно-меченных миРНК при помощи липосом и пептида EB1 оценивали после трансфекции клеток К-562 в присутствии ингибиторов эндоцитоза методом проточной цитофлуориметрии. Эффективность эндосомального высвобождения миРНК после трансфекции клеток исследуемыми носителями оценивали методом иммунофлуоресценции с использованием белковых маркеров ранних эндосом (EEA1), поздних эндосом (RAB7) и лизосом (LAMP1) и конфокальной лазерной сканирующей микроскопии. Специфический эффект миРНК оценивали по подавлению экспрессии онкогена BCR-ABL методом ПЦР-РВ и по метаболической активности клеток K-562.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Катионные липосомы на основе 2X3-DOPE в молярных соотношениях 1:1, 1:2 и 1:3 эффективно доставляют модельные мРНК в клетки эукариот, при этом катионные липосомы 2X3-DOPE 1:3 продемонстрировали максимальную эффективность трансфекции в N/P соотношении с мРНК 10/1. Катионные липосомы 2X3-DOPE 1:3, модифицированные DSPE-PEG2000 (2% мол.), могут быть использованы для доставки мРНК при подкожном введении in vivo.

2. Катионные липосомы 2X3-DOPE 1:3 эффективно доставляют миРНК, меченную флуоресцентной меткой, в клетки К-562. Пегилирование липосом 2X3-DOPE 1:3 (2Х3-DOPE-PEG) приводит к повышению эффективности доставки миРНК.

3. Комплексы катионных липосом 2X3-DOPE-PEG с миРНК проникают в клетки эукариот в основном путем динамин-зависимого эндоцитоза и эффективны для трансфекции всех исследованных клеточных линий. Механизм интернализации комплексов EB1/миРНК представляет собой комбинацию различных путей эндоцитоза, при этом комплексы обладают клеточной специфичностью.

4. Комплексы катионных липосом 2X3-DOPE-PEG и пептид EB1 обеспечивают эффективную доставку миРНК, однако катионные липосомы приводят к более эффективной интернализации bcr-abl миРНК и её высвобождению из состава эндосом, а также сайленсингу гена BCR-ABL на in vitro модели хронического миелолейкоза (клеточной линии K-562).

Личный вклад автора состоит в самостоятельном планировании и выполнении всех основных экспериментов, анализе и статистической обработке полученных результатов. Автором проведен подбор параметров и характеристика комплексов мРНК и миРНК с исследуемыми носителями, сравнительное исследование эффективности доставки полученных комплексов in vitro, исследование механизма внутриклеточного проникновения комплексов РНК с носителями, определение активности комплексов миРНК с носителями. Совместно с сотрудниками отдела молекулярной биологии вирусов ФГБУ «НИИ гриппа им. А.А. Смородинцева» Минздрава России и центра доклинических и трансляционных исследований ФГБУ «НМИЦ им. В. А. Алмазова» Минздрава России проведены эксперименты по оценке эффективности доставки модельной мРНК in vivo. Обсуждение результатов работы и написание статьей проводилось совместно с научным руководителем, консультантом и соавторами.

Степень достоверности и апробация результатов

Статистическая значимость результатов исследований, проведённых автором, подтверждена статистическим анализом данных, полученных в ходе независимых экспериментов. Результаты всех экспериментов получены с использованием сертифицированного оборудования и современных молекулярно-биологических методов. Материалы диссертационной работы доложены на следующих научных конференциях: конгресс Европейского общества медицинской онкологии (European Society of Medical Oncology, ESMO, Париж, Франция, 2021 г.), IV Всероссийская конференция молодых ученых «Вирусные инфекции - от диагностики к клинике» (Санкт-Петербург, 2023 г.); 26-ая Пущинская школа-конференция молодых ученых с международным участием «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2023 г.); саммит разработчиков лекарственных препаратов «Сириус.Биотех» (федеральная территория Сириус, 2023 г.); X международная конференция молодых ученых: биоинформатиков,

биотехнологов, биофизиков, вирусологов и молекулярных биологов ОРЕКБЮ, (Новосибирск, 2023 г.), VII Петербургский медицинский инновационный форум (Санкт-Петербург, 2024 г.). XXIII Зимняя молодежная школа по биофизике и молекулярной биологии (Гатчина, 2024).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ, из них 4 научных статьи, индексируемые в международных базах данных, и 5 тезисов докладов на конференциях международного и всероссийского уровня.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 129 страницах, включая 8 таблиц и 34 рисунка. Работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, полученных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Список литературы содержит 234 источника на русском и английском языках.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1 РНК-терапия

РНК-терапия представляет собой новое направление медицины с использованием молекул РНК для лечения и профилактики широкого спектра заболеваний. Стремительное внедрение в клиническую практику нескольких РНК-вакцин против SARS-CoV-2 обострило интерес исследователей к возможностям РНК-терапии. В связи с этим разработка РНК-препаратов представляет собой быстроразвивающуюся область исследований за счет важных открытий в биологии РНК и накопленных в течение последних десятилетий результатов исследований в данной области. Одним из важнейших преимуществ РНК-терапии является возможность воздействовать на ранее не поддававшиеся медикаментозному лечению патологические процессы. Наибольших успехов в виде внедрения в клиническую практику достигла РНК-терапия, основанная на технологии на основе мРНК для создания вакцин и средств терапии, а также на подавлении экспрессии патологического гена с помощью коротких синтетических некодирующих РНК.

1.2 Терапевтические мРНК

Матричная РНК (мРНК) представляет собой одноцепочечную РНК, комплементарную антисмысловой цепи ДНК, которая выполняет жизненно важную роль в биосинтезе белка. мРНК образуется в процессе транскрипции. Предшественник мРНК синтезируется в эукариотических клетках при помощи РНК-полимеразы с образованием первичных транскриптов, как правило содержащих некодирующие последовательности интронов, которые удаляются в результате процессинга мРНК. Процессинг мРНК также включает в себя кэпирование и полиаденилирование. Кэп представляет собой развернутый 7-метилгуанозин, соединенный с остальной частью эукариотической мРНК через 5'-5'-трифосфатный мостик. Активно транслируемые мРНК в клетках млекопитающих содержат от 100 до 250 аденозинов на З'-конце [27]. При введении экзогенной мРНК происходит трансляция функционального белка, что быстро нашло терапевтическое применение. Для получения синтетической мРНК используется технология in vitro транскрипции (IVT) с ДНК-матрицы. Синтетическая мРНК, по аналогии с эндогенной клеточной мРНК включает в себя все необходимые структуры: кэп, 5'-нетранслируемую область (НТО), кодирующую область, З'-НТО и поли(А)-хвост, необходимые для ее эффективной трансляции. Инициация трансляции мРНК эукариот представляет собой тщательно регулируемый процесс. Кэп-зависимая трансляция начинается с распознавания кэпа эукариотическим фактором инициации трансляции 4F (eIF4F) и сборки 43S преинициаторного комплекса (PIC) на 5'-конце кэпированной мРНК. PIC образован 40S субъединицей рибосомы и эукариотическими факторами инициации трансляции, включая eIF1, eIF1A, eIF3 и eIF5. eIF4F

представляет собой комплекс, состоящий из eIF4A, eIF4E и eIF4G. eIF4E связывается с кэпом мРНК. eIF4G взаимодействует с eIF3 и поли(А)-связывающим белком (PABP), который связывается с 3'-поли(А)-хвостом мРНК. После присоединения мРНК 43S PIC сканирует 5'-НТО мРНК для поиска стартового кодона. За распознаванием стартового кодона просходит «раскручивание» вторичной структуры 5'-НТО с помощью геликазы eIF4A, высвобождаются eIF, и присоединяется 60S субъединица рибосомы, инициируя элонгацию трансляции с образованием 80S рибосомы. При элонгации трансляции рибосома активно движется по кодирующей области мРНК для синтеза полипептидов с помощью тРНК (Рисунок 1). Терминация трансляции происходит при достижении рибосомой стоп-кодона [28-30].

5' -m7G Cap РРР ORF ■ А А А А А 150-250

3' -100 25о ААААА РАРВ

Рисунок 1 — мРНК, полученная методом IVT и инициация трансляции. После проникновения в клетку трансляция мРНК может быть инициирована eIF4F-зависимым путем в ходе которого происходит сборка 43S преинициаторного комплекса (PIC) на 5'-конце кэпированной мРНК, состоящего из малой субъединицы рибосомы (40S) и eIF. eIF4F представляет собой комплекс, состоящий из eIF4A, eIF4E и eIF4G. eIF4E связывается с кэпом мРНК. eIF4G взаимодействует с eIF3 и PABP, который связывается с 3'-поли(А)-хвостом мРНК. Эти взаимодействия приводят к циркуляризации мРНК (мРНК приобретает замкнутую форму) и сборке 48S PIC. Субъединица

рибосомы 48S PIC сканирует и находит стартовый кодон. Затем высвобождаются eIF и присоединяется большая субъединица рибосомы (60S). В результате образуется рибосома 80S и

происходит элонгация. Адаптировано из [31]

Структурные элементы мРНК, необходимые для ее эффективной трансляции, также играют важную роль в процессах ее деградации, в частности -5'-кэп и поли (А)-хвост. Кэп защищает мРНК от 5'-3' экзонуклеаз [32]. Поли(А)-хвост защищает от деградации 3'-5' экзонуклеазами [33]. Учитывая роль функциональных элементов в мРНК, многочисленные исследования были сосредоточены на оптимизации ее структурных элементов для повышения стабильности таких молекул и увеличении эффективности трансляции экзогенных мРНК. Были разработаны аналоги кэпа, исследованы вариации длины поли(А)-хвоста, проведен скрининг эффективности различных HTO и введение различных функциональных пептидов или механизмов репликации вируса в открытые рамки считывания (ORFs) [34].

В процессе исследований в области мРНК-технологий было обнаружено, что длинные последовательности РНК при введении в клетки эукариот способны индуцировать иммунный ответ за счет активации Toll-подобных рецепторов (TLR), что приводило к снижению эффективности трансляции вводимой мРНК [35]. Этот эффект привел к замедлению терапевтического применения мРНК, пока Карико и Вайсман не решили проблему активации врожденного иммунного ответа путем замены в структуре молекулы нуклеотидов на их модифицированные аналоги, в частности на псевдоуридин (Нобелевская премия по физиологии и медицине в 2023 г) [36].

Последние достижения в области разработки терапевтических мРНК позволяют использовать эти молекулы для получения практически любого функционального белка/пептида в организме человека в более короткие сроки и с меньшими затратами по сравнению с традиционными подходами, что находит свое применение в разработке препаратов для лечения различных рефрактерных заболеваний, в том числе инфекционных, онкологических заболеваний, врожденных нарушений обмена веществ и других заболеваний (Таблица 1) [31]. Пандемия COVID-19 продемонстрировала преимущества технологии мРНК для вакцинации, поскольку из всех разрабатываемых вакцин против COVID-19 первые две, получившие разрешение FDA на экстренное применение в 2020 г (Spikevax (Elasomeran), Comirnaty (Tozinameran)), были основаны на технологии мРНК.

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Высочинская Вера Валерьевна, 2024 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Zhang C., Zhang B. RNA therapeutics: updates and future potential // Science China Life Sciences. Science Press (China), 2023. Vol. 66, № 1. P. 12-30.

2. Kim Y.K. RNA therapy: rich history, various applications and unlimited future prospects // Experimental and Molecular Medicine. Springer Nature, 2022. Vol. 54, № 4. P. 455-465.

3. Singh A., Trivedi P., Jain N.K. Advances in siRNA delivery in cancer therapy // Artificial Cells, Nanomedicine and Biotechnology. Taylor and Francis Ltd., 2018. Vol. 46, № 2. P. 274-283.

4. Hu B. et al. Therapeutic siRNA: state of the art // Signal Transduction and Targeted Therapy. Springer Nature, 2020. Vol. 5, № 1.

5. Paunovska K., Loughrey D., Dahlman J.E. Drug delivery systems for RNA therapeutics // Nature Reviews Genetics. Nature Research, 2022. Vol. 23, № 5. P. 265-280.

6. Webb C. et al. Current Status and Future Perspectives on MRNA Drug Manufacturing // Mol Pharm. American Chemical Society, 2022. Vol. 19, № 4. P. 1047-1058.

7. Paunovska K., Loughrey D., Dahlman J.E. Drug delivery systems for RNA therapeutics // Nature Reviews Genetics 2022 23:5. Nature Publishing Group, 2022. Vol. 23, № 5. P. 265-280.

8. Solomon S.D. et al. Effects of Patisiran, an RNA Interference Therapeutic, on Cardiac Parameters in Patients With Hereditary Transthyretin-Mediated Amyloidosis // Circulation. Lippincott Williams & Wilkins Hagerstown, MD , 2019. Vol. 139, № 4. P. 431-443.

9. Schoenmaker L. et al. mRNA-lipid nanoparticle COVID-19 vaccines: Structure and stability // International Journal of Pharmaceutics. 2021. Vol. 601.

10. Gaspar R., Coelho F., Silva B.F.B. Lipid-Nucleic Acid Complexes: Physicochemical Aspects and Prospects for Cancer Treatment // Molecules. Molecules, 2020. Vol. 25, № 21.

11. Petukhov I.A. et al. Synthesis of polycationic lipids based on cholesterol and spermine // Russian Chemical Bulletin. 2010. Vol. 59, № 1. P. 260-268.

12. Mikheev A.A. et al. Cationic liposomes as delivery systems for nucleic acids // Fine Chemical Technologies. MIREA - Russian Technological University, 2020. Vol. 15, № 1. P. 7-27.

13. Kabilova T. et al. Novel PEGylated Liposomes Enhance Immunostimulating Activity of isRNA // Molecules. Multidisciplinary Digital Publishing Institute (MDPI), 2018. Vol. 23, № 12.

14. Puchkov P.A., Maslov M.A. Lipophilic Polyamines as Promising Components of Liposomal Gene Delivery Systems // Pharmaceutics. Multidisciplinary Digital Publishing Institute (MDPI), 2021. Vol. 13, № 6.

15. Markov O.O. et al. Novel cationic liposomes provide highly efficient delivery of DNA and RNA into dendritic cell progenitors and their immature offsets // Journal of Controlled Release. 2012. Vol. 160, № 2. P. 200-210.

16

17

18

19

20

21

22

23

24

25

26

27

28

29

Shmendel E. et al. Effects of spacers within a series of novel folate-containing lipoconjugates on the targeted delivery of nucleic acids // J Drug Deliv Sci Technol. Editions de Sante, 2020. Vol. 57.

Maslov M.A. et al. Novel cholesterol spermine conjugates provide efficient cellular delivery of plasmid DNA and small interfering RNA // J Control Release. J Control Release, 2012. Vol. 160, № 2. P. 182-193.

Mochizuki S. et al. The role of the helper lipid dioleoylphosphatidylethanolamine (DOPE) for DNA transfection cooperating with a cationic lipid bearing ethylenediamine // Biochim Biophys Acta. Biochim Biophys Acta, 2013. Vol. 1828, № 2. P. 412-418.

Du Z. et al. The Role of the Helper Lipid on the DNA Transfection Efficiency of Lipopolyplex Formulations // Scientific Reports 2014 4:1. Nature Publishing Group, 2014. Vol. 4, № 1. P. 1-6. Akhter S. et al. mRNA Lipoplexes with Cationic and Ionizable a-Amino-lipophosphonates: Membrane Fusion, Transfection, mRNA Translation and Conformation // Pharmaceutics. Pharmaceutics, 2022. Vol. 14, № 3.

Farhood H., Serbina N., Huang L. The role of dioleoyl phosphatidylethanolamine in cationic liposome mediated gene transfer // Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. Elsevier, 1995. Vol. 1235, № 2. P. 289-295.

Zhang Y. et al. DC-Chol/DOPE cationic liposomes: a comparative study of the influence factors on plasmid pDNA and siRNA gene delivery // Int J Pharm. Int J Pharm, 2010. Vol. 390, № 2. P. 198-207.

Mikheev A.A. et al. Influence of Liposome Composition on Plasmid DNA Delivery to Eukaryotic Cells // Russ J Bioorg Chem. 2021. Vol. 47, № 5.

Guidotti G., Brambilla L., Rossi D. Cell-Penetrating Peptides: From Basic Research to Clinics //

Trends Pharmacol Sci. Elsevier Current Trends, 2017. Vol. 38, № 4. P. 406-424.

Khairkhah N., Namvar A., Bolhassani A. Application of Cell Penetrating Peptides as a Promising

Drug Carrier to Combat Viral Infections // Molecular Biotechnology. 2023. Vol. 65, № 9.

Lundberg P. et al. Delivery of short interfering RNA using endosomolytic cell-penetrating

peptides // The FASEB Journal. Wiley, 2007. Vol. 21, № 11. P. 2664-2671.

Desterro J., Bak-Gordon P., Carmo-Fonseca M. Targeting mRNA processing as an anticancer

strategy // Nature Reviews Drug Discovery. 2020. Vol. 19, № 2.

Jacobson A., Peltz S.W. Interrelationships of the pathways of mRNA decay and translation in eukaryotic cells // Annual Review of Biochemistry. 1996. Vol. 65.

Jackson R.J., Hellen C.U.T., Pestova T. V. The mechanism of eukaryotic translation initiation and principles of its regulation // Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2010. Vol. 11, № 2.

30

31

32

33

34

35

36

37

38

39

40

41

42

43

44

45

Hinnebusch A.G. Structural Insights into the Mechanism of Scanning and Start Codon Recognition in Eukaryotic Translation Initiation // Trends in Biochemical Sciences. 2017. Vol. 42, № 8.

Qin S. et al. mRNA-based therapeutics: powerful and versatile tools to combat diseases // Signal Transduction and Targeted Therapy. 2022. Vol. 7, № 1.

Coller J., Parker R. Eukaryotic mRNA decapping // Annual Review of Biochemistry. 2004. Vol. 73.

Wilusz C.J., Wormington M., Peltz S.W. The cap-to-tail guide to mRNA turnover // Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2001. Vol. 2, № 4. P. 237-246.

Leppek K. et al. Combinatorial optimization of mRNA structure, stability, and translation for RNA-based therapeutics // Nat Commun. 2021.

Dalpke A.H., Helm M. RNA mediated Toll-like receptor stimulation in health and disease // RNA Biology. 2012. Vol. 9, № 6.

Kariko K. et al. Suppression of RNA recognition by Toll-like receptors: The impact of nucleoside modification and the evolutionary origin of RNA // Immunity. 2005. Vol. 23, № 2. Dykxhoorn D.M., Novina C.D., Sharp P.A. Killing the messenger: short RNAs that silence gene expression // Nature Reviews Molecular Cell Biology 2003 4:6. Nature Publishing Group, 2003. Vol. 4, № 6. P. 457-467.

Fire A. et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans // Nature 1998 391:6669. Nature Publishing Group, 1998. Vol. 391, № 6669. P. 806-811. Krishnan P., Damaraju S. The Challenges and Opportunities in the Clinical Application of Noncoding RNAs: The Road Map for miRNAs and piRNAs in Cancer Diagnostics and Prognostics // Int J Genomics. Hindawi Limited, 2018. Vol. 2018.

Lam J.K.W. et al. siRNA Versus miRNA as Therapeutics for Gene Silencing // Mol Ther Nucleic Acids. American Society of Gene & Cell Therapy, 2015. Vol. 4, № 9. P. e252. Mittal V. Improving the efficiency of RNA interference in mammals // Nature Reviews Genetics 2004 5:5. Nature Publishing Group, 2004. Vol. 5, № 5. P. 355-365.

Davidson B.L., McCray P.B. Current prospects for RNA interference-based therapies // Nature Reviews Genetics 2011 12:5. Nature Publishing Group, 2011. Vol. 12, № 5. P. 329-340. Friedrich M., Aigner A. Therapeutic siRNA: State-of-the-Art and Future Perspectives // BioDrugs. 2022. Vol. 36, № 5.

Rowley J.D., Golomb H.M., Dougherty C. 15/17 translocation, a consistent chromosomal change in acute promyelocytic leukaemia // Lancet. Lancet, 1977. Vol. 1, № 8010. P. 549-550. Nowell P.C., Hungerford D.A. Chromosome Studies on Normal and Leukemic Human Leukocytes 1.

46. Klein A. De et al. A cellular oncogene is translocated to the Philadelphia chromosome in chronic myelocytic leukaemia // Nature 1982 300:5894. Nature Publishing Group, 1982. Vol. 300, № 5894. P. 765-767.

47. Heisterkamp N. et al. Localization of the c-abl oncogene adjacent to a translocation break point in chronic myelocytic leukaemia // Nature 1983 306:5940. Nature Publishing Group, 1983. Vol. 306, № 5940. P. 239-242.

48. Daley G.Q., Van Etten R.A., Baltimore D. Induction of chronic myelogenous leukemia in mice by the P210bcr/abl gene of the Philadelphia chromosome // Science. Science, 1990. Vol. 247, № 4944. P. 824-830.

49. Kurzrock R. et al. Philadelphia Chromosome-Positive Leukemias: From Basic Mechanisms to Molecular Therapeutics // Ann Intern Med. American College of Physicians, 2003. Vol. 138, № 10. P. 819-830.

50. Smith D.L., Burthem J., Whetton A.D. Molecular pathogenesis of chronic myeloid leukaemia // Expert Rev Mol Med. Cambridge University Press, 2003. Vol. 5, № 27. P. 1-27.

51. Chereda B., Melo J. V. Natural course and biology of CML // Ann Hematol. Springer Verlag, 2015. Vol. 94, № 2. P. 107-121.

52. Soverini S. et al. Chronic myeloid leukemia: the paradigm of targeting oncogenic tyrosine kinase signaling and counteracting resistance for successful cancer therapy // Mol Cancer. BMC, 2018. Vol. 17, № 1.

53. Melo J. V. The Diversity of BCR-ABL Fusion Proteins and Their Relationship to Leukemia Phenotype // The Journal of The American Society of Hematology. 1996. Vol. 88, № 7.

54. Quintas-Cardama A., Kantarjian H.M., Cortes J.E. Mechanisms of Primary and Secondary Resistance to Imatinib in Chronic Myeloid Leukemia // http://dx.doi.org/10.1177/107327480901600204. SAGE PublicationsSage CA: Los Angeles, CA, 2009. Vol. 16, № 2. P. 122-131.

55. Saglio G. et al. BCR/ABL transcripts and leukemia phenotype: an unsolved puzzle // Leuk Lymphoma. Leuk Lymphoma, 1997. Vol. 26, № 3-4. P. 281-286.

56. Wang J.Y.J. The Capable ABL: What Is Its Biological Function? // https://doi.org/10.1128/MCB.01454-13. Taylor & Francis, 2023. Vol. 34, № 7. P. 1188-1197.

57. Zhou T., Medeiros L.J., Hu S. Chronic Myeloid Leukemia: Beyond BCR-ABL1 // Curr Hematol Malig Rep. Curr Hematol Malig Rep, 2018. Vol. 13, № 6. P. 435-445.

58. Reckel S. et al. Differential signaling networks of Bcr-Abl p210 and p190 kinases in leukemia cells defined by functional proteomics // Leukemia. Nature Publishing Group, 2017. Vol. 31, № 7. P. 1502.

59. Melo J. V., Deininger M.W.N. Biology of chronic myelogenous leukemia—signaling pathways of initiation and transformation // Hematol Oncol Clin North Am. Elsevier, 2004. Vol. 18, № 3. P. 545-568.

60. Baccarani M. et al. European LeukemiaNet recommendations for the management of chronic myeloid leukemia: 2013 // Blood. The American Society of Hematology, 2013. Vol. 122, № 6. P. 872.

61. Druker B.J. et al. Effects of a selective inhibitor of the Abl tyrosine kinase on the growth of Bcr-Abl positive cells // Nature Medicine 1996 2:5. Nature Publishing Group, 1996. Vol. 2, № 5. P. 561-566.

62. Corbin A.S. et al. Several Bcr-Abl kinase domain mutants associated with imatinib mesylate resistance remain sensitive to imatinib // Blood. American Society of Hematology, 2003. Vol. 101, № 11. P. 4611-4614.

63. Barnes D.J. et al. Bcr-Abl Expression Levels Determine the Rate of Development of Resistance to Imatinib Mesylate in Chronic Myeloid Leukemia // Cancer Res. American Association for Cancer Research, 2005. Vol. 65, № 19. P. 8912-8919.

64. Rian B. et al. Activity of a Specific Inhibitor of the BCR-ABL Tyrosine Kinase in the Blast Crisis of Chronic Myeloid Leukemia and Acute Lymphoblastic Leukemia with the Philadelphia Chromosome // https://doi.org/10.1056/NEJM200104053441402. Massachusetts Medical Society , 2001. Vol. 344, № 14. P. 1038-1042.

65. Branford S. et al. Detection of BCR-ABL mutations in patients with CML treated with imatinib is virtually always accompanied by clinical resistance, and mutations in the ATP phosphate-binding loop (P-loop) are associated with a poor prognosis // Blood. American Society of Hematology, 2003. Vol. 102, № 1. P. 276-283.

66. Soverini S. et al. Advances in treatment of chronic myeloid leukemia with tyrosine kinase inhibitors: the evolving role of Bcr-Abl mutations and mutational analysis // http://dx.doi.org/10.2217/pgs.12.103. Future Medicine Ltd London, UK , 2012. Vol. 13, № 11. P. 1271-1284.

67. Hochhaus A. et al. Molecular and chromosomal mechanisms of resistance to imatinib (STI571) therapy // Leukemia 2002 16:11. Nature Publishing Group, 2002. Vol. 16, № 11. P. 2190-2196.

68. Mahon F.X. et al. MDR1 gene overexpression confers resistance to imatinib mesylate in leukemia cell line models // Blood. American Society of Hematology, 2003. Vol. 101, № 6. P. 2368-2373.

69. Wang L. et al. Expression of the Uptake Drug Transporter hOCT1 is an Important Clinical Determinant of the Response to Imatinib in Chronic Myeloid Leukemia // Clin Pharmacol Ther. John Wiley & Sons, Ltd, 2008. Vol. 83, № 2. P. 258-264.

70

71

72

73

74

75

76

77

78

79

80

81

82

83

Schmitt M.W. et al. Single-molecule sequencing reveals patterns of preexisting drug resistance that suggest treatment strategies in Philadelphia-positive leukemias // Clinical Cancer Research. American Association for Cancer Research Inc., 2018. Vol. 24, № 21. P. 5321-5334. García-Gutiérrez V., Hernández-Boluda J.C. Tyrosine Kinase Inhibitors Available for Chronic Myeloid Leukemia: Efficacy and Safety // Front Oncol. Frontiers Media S.A., 2019. Vol. 9. P. 464395.

Cortes J.E. et al. Ponatinib in Refractory Philadelphia Chromosome-Positive Leukemias // New England Journal of Medicine. Massachusetts Medical Society, 2012. Vol. 367, № 22. P. 20752088.

Chan O. et al. Side-effects profile and outcomes of ponatinib in the treatment of chronic myeloid leukemia // Blood Adv. The American Society of Hematology, 2020. Vol. 4, № 3. P. 530. Jabbour E., Kantarjian H. Chronic myeloid leukemia: 2018 update on diagnosis, therapy and monitoring // Am J Hematol. John Wiley & Sons, Ltd, 2018. Vol. 93, № 3. P. 442-459. Zhang J. et al. Targeting Bcr-Abl by combining allosteric with ATP-binding-site inhibitors // Nature 2010 463:7280. Nature Publishing Group, 2010. Vol. 463, № 7280. P. 501-506. Deeks E.D. Asciminib: First Approval // Drugs. Drugs, 2022. Vol. 82, № 2. P. 219-226. Garcia-Gutiérrez V. et al. Safety and efficacy of asciminib treatment in chronic myeloid leukemia patients in real-life clinical practice // Blood Cancer J. Nature Publishing Group, 2021. Vol. 11, № 2. P. 16.

Grebien F. et al. Targeting the SH2-kinase interface in Bcr-Abl inhibits leukemogenesis // Cell. Elsevier B.V., 2011. Vol. 147, № 2. P. 306-319.

Wojcik J. et al. Allosteric Inhibition of Bcr-Abl Kinase by High Affinity Monobody Inhibitors Directed to the Src Homology 2 (SH2)-Kinase Interface // J Biol Chem. American Society for Biochemistry and Molecular Biology, 2016. Vol. 291, № 16. P. 8836.

Jabbour E., Kantarjian H. Chronic myeloid leukemia: 2022 update on diagnosis, therapy, and monitoring // Am J Hematol. John Wiley and Sons Inc, 2022. Vol. 97, № 9. P. 1236-1256. Ohba H. et al. Inhibition of bcr-abl and/or c-abl gene expression by small interfering, double-stranded RNAs // Cancer. John Wiley & Sons, Ltd, 2004. Vol. 101, № 6. P. 1390-1403. Zhelev Z. et al. Suppression of bcr-abl synthesis by siRNAs or tyrosine kinase activity by Glivec alters different oncogenes, apoptotic/antiapoptotic genes and cell proliferation factors (microarray study) // FEBS Lett. John Wiley & Sons, Ltd, 2004. Vol. 570, № 1-3. P. 195-204. Baker B.E., Kestler D.P., Ichiki A.T. Effects of siRNAs in combination with Gleevec on K-562 cell proliferation and Bcr-Abl expression // J Biomed Sci. J Biomed Sci, 2006. Vol. 13, № 4. P. 499-507.

84. Scherr M. et al. Stable RNA interference (RNAi) as an option for anti-bcr-abl therapy // Gene Therapy 2005 12:1. Nature Publishing Group, 2004. Vol. 12, № 1. P. 12-21.

85. Merkerova M. et al. Targeting of gene expression by siRNA in CML primary cells // Mol Biol Rep. Springer, 2007. Vol. 34, № 1. P. 27-33.

86. Li M.J. et al. Specific Killing of Ph+ Chronic Myeloid Leukemia Cells by a Lentiviral Vector-Delivered Anti-bcr/abl Small Hairpin RNA // http://www.liebertpub.com/oli. Mary Ann Liebert, Inc. , 2004. Vol. 13, № 5. P. 401-409.

87. Arthanari Y. et al. Delivery of therapeutic shRNA and siRNA by Tat fusion peptide targeting bcr-abl fusion gene in Chronic Myeloid Leukemia cells // Journal of Controlled Release. Elsevier, 2010. Vol. 145, № 3. P. 272-280.

88. Freire J.M. et al. siRNA-cell-penetrating peptides complexes as a combinatorial therapy against chronic myeloid leukemia using BV173 cell line as model // Journal of Controlled Release. Elsevier, 2017. Vol. 245. P. 127-136.

89. Shinkai Y. et al. Silencing of BCR/ABL Chimeric Gene in Human Chronic Myelogenous Leukemia Cell Line K562 by siRNA-Nuclear Export Signal Peptide Conjugates // https://home.liebertpub.com/nat. Mary Ann Liebert, Inc. 140 Huguenot Street, 3rd Floor New Rochelle, NY 10801 USA , 2017. Vol. 27, № 3. P. 168-175.

90. Kc R. et al. BCR-Abl Silencing by siRNA: A Potent Approach to Sensitize Chronic Myeloid Leukemia Cells to Tyrosine Kinase Inhibitor Therapy // https://home.liebertpub.com/scd. Mary Ann Liebert, Inc., publishers 140 Huguenot Street, 3rd Floor New Rochelle, NY 10801 USA ,

2019. Vol. 28, № 11. P. 734-744.

91. Remant K.C. et al. Cholesterol grafted cationic lipopolymers: Potential siRNA carriers for selective chronic myeloid leukemia therapy // J Biomed Mater Res A. John Wiley & Sons, Ltd,

2020. Vol. 108, № 3. P. 565-580.

92. Valencia-Serna J. et al. siRNA/lipopolymer nanoparticles to arrest growth of chronic myeloid leukemia cells in vitro and in vivo // European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. Elsevier, 2018. Vol. 130. P. 66-70.

93. Valencia-Serna J. et al. siRNA-mediated BCR-ABL silencing in primary chronic myeloid leukemia cells using lipopolymers // Journal of Controlled Release. Elsevier, 2019. Vol. 310. P. 141-154.

94. Koldehoff M. et al. Small interfering RNA against BCR-ABL transcripts sensitize mutated T315I cells to nilotinib // Haematologica. 2010. Vol. 95, № 3. P. 388-397.

95. Scherr M. et al. Specific inhibition of bcr-abl gene expression by small interfering RNA // Blood. American Society of Hematology, 2003. Vol. 101, № 4. P. 1566-1569.

96. Elmaagacli A. et al. WT1 and BCR-ABL specific small interfering RNA have additive effects in the induction of apoptosis in leukemic cells. // Haematologica. 2005.

97. Koldehoff M. et al. Additive antileukemia effects by GFI1B- and BCR-ABL-specific siRNA in advanced phase chronic myeloid leukemic cells // Cancer Gene Therapy 2013 20:7. Nature Publishing Group, 2013. Vol. 20, № 7. P. 421-427.

98. Kaymaz B.T. et al. Repression of STAT3, STAT5A, and STAT5B expressions in chronic myelogenous leukemia cell line K-562 with unmodified or chemically modified siRNAs and induction of apoptosis // Ann Hematol. Springer, 2013. Vol. 92, № 2. P. 151-162.

99. Heidel F.H. et al. Genetic and Pharmacologic Inhibition of ß-Catenin Targets Imatinib Resistant Leukemia Stem Cells in CML // Cell Stem Cell. NIH Public Access, 2012. Vol. 10, № 4. P. 412.

100. Minami Y. et al. BCR-ABL-transformed GMP as myeloid leukemic stem cells // Proc Natl Acad Sci U S A. National Academy of Sciences, 2008. Vol. 105, № 46. P. 17967.

101. Zhang B. et al. Microenvironmental protection of CML stem and progenitor cells from tyrosine kinase inhibitors through N-cadherin and Wnt-ß-catenin signaling // Blood. American Society of Hematology, 2013. Vol. 121, № 10. P. 1824-1838.

102. Zhou H. et al. Combined inhibition of ß-catenin and Bcr-Abl synergistically targets tyrosine kinase inhibitor-resistant blast crisis chronic myeloid leukemia blasts and progenitors in vitro and in vivo // Leukemia 2017 31:10. Nature Publishing Group, 2017. Vol. 31, № 10. P. 2065-2074.

103. Yao R. et al. DUXAP10 regulates proliferation and apoptosis of chronic myeloid leukemia via PTEN pathway // Eur Rev Med Pharmacol Sci. Verduci Editore s.r.l, 2018. Vol. 22, № 15. P. 49344940.

104. Li L. et al. TRIM22 knockdown suppresses chronic myeloid leukemia via inhibiting PI3K/Akt/mTOR signaling pathway // Cell Biol Int. John Wiley & Sons, Ltd, 2018. Vol. 42, № 9. P. 1192-1199.

105. Koldehoff M., Elmaagacli A.H. Therapeutic targeting of gene expression by siRNAs directed against BCR-ABL transcripts in a patient with imatinib-resistant chronic myeloid leukemia. // Methods Mol Biol. Humana Press, 2009. Vol. 487. P. 451-466.

106. Jyotsana N. et al. Lipid nanoparticle-mediated siRNA delivery for safe targeting of human CML in vivo // Ann Hematol. Springer Verlag, 2019. Vol. 98, № 8. P. 1905-1918.

107. Xu C. fei, Wang J. Delivery systems for siRNA drug development in cancer therapy // Asian J Pharm Sci. Elsevier, 2015. Vol. 10, № 1. P. 1-12.

108. Houk B.E., Hochhaus G., Hughes J.A. Kinetic modeling of plasmid DNA degradation in rat plasma // AAPS PharmSci. Springer, 1999. Vol. 1, № 3. P. 15.

109. Ku S.H. et al. Chemical and structural modifications of RNAi therapeutics // Adv Drug Deliv Rev. Elsevier, 2016. Vol. 104. P. 16-28.

110.

111.

112.

113.

114.

115.

116.

117.

118.

119.

120

121

122

123

Sahin U., Kariko K., Tureci O. MRNA-based therapeutics-developing a new class of drugs // Nature Reviews Drug Discovery. Nature Publishing Group, 2014. Vol. 13, № 10. P. 759-780. Whitehead K.A., Langer R., Anderson D.G. Knocking down barriers: advances in siRNA delivery // Nature Reviews Drug Discovery 2009 8:2. Nature Publishing Group, 2009. Vol. 8, № 2. P. 129138.

Pack D.W. et al. Design and development of polymers for gene delivery // Nature Reviews Drug

Discovery 2005 4:7. Nature Publishing Group, 2005. Vol. 4, № 7. P. 581-593.

Gaspar R., Coelho F., Silva B.F.B. Lipid-nucleic acid complexes: physicochemical aspects and

prospects for cancer treatment // Molecules. MDPI AG, 2020. Vol. 25, № 21.

Simonis B. et al. Transport of cationic liposomes in a human blood brain barrier model: Role of

the stereochemistry of the gemini amphiphile on liposome biological features // J Colloid Interface

Sci. Academic Press Inc., 2022. Vol. 627. P. 283-298.

Van De Water F.M. et al. Intravenously administered short interfering RNA accumulates in the kidney and selectively suppresses gene function in renal proximal tubules // Drug Metab Dispos. Drug Metab Dispos, 2006. Vol. 34, № 8. P. 1393-1397.

Andersson S. et al. Drug metabolism and pharmacokinetic strategies for oligonucleotide- and mRNA-based drug development // Drug Discovery Today. 2018. Vol. 23, № 10. Kanasty R. et al. Delivery materials for siRNA therapeutics // Nat Mater. Nat Mater, 2013. Vol. 12, № 11. P. 967-977.

Durymanov M., Reineke J. Non-viral delivery of nucleic acids: Insight into mechanisms of overcoming intracellular barriers // Front Pharmacol. Frontiers Media S.A., 2018. Vol. 9, № AUG. P. 398662.

Neuberg P., Kichler A. Recent developments in nucleic acid delivery with polyethylenimines // Adv Genet. Adv Genet, 2014. Vol. 88. P. 263-288.

Bareford L.M., Swaan P.W. ENDOCYTIC MECHANISMS FOR TARGETED DRUG DELIVERY // Adv Drug Deliv Rev. NIH Public Access, 2007. Vol. 59, № 8. P. 748. Pasi K.J. et al. Multiyear Follow-up of AAV5-hFVIII-SQ Gene Therapy for Hemophilia A // N Engl J Med. N Engl J Med, 2020. Vol. 382, № 1. P. 29-40.

Esrick E.B. et al. Post-Transcriptional Genetic Silencing of BCL11A to Treat Sickle Cell Disease // N Engl J Med. NIH Public Access, 2021. Vol. 384, № 3. P. 205.

Aronson S.J. et al. Prevalence and Relevance of Pre-Existing Anti-Adeno-Associated Virus Immunity in the Context of Gene Therapy for Crigler-Najjar Syndrome // Hum Gene Ther. Mary Ann Liebert Inc., 2019. Vol. 30, № 10. P. 1297-1305.

124

125

126

127

128

129

130

131

132

133

134

135

136

137

Bryson T.E. et al. Focus: Genome Editing: Nuclease-Mediated Gene Therapies for Inherited Metabolic Diseases of the Liver // Yale J Biol Med. Yale Journal of Biology and Medicine, 2017. Vol. 90, № 4. P. 553.

Nguyen G.N. et al. A long-term study of AAV gene therapy in dogs with hemophilia A identifies clonal expansions of transduced liver cells // Nature Biotechnology 2020 39:1. Nature Publishing Group, 2020. Vol. 39, № 1. P. 47-55.

Leborgne C. et al. IgG-cleaving endopeptidase enables in vivo gene therapy in the presence of anti-AAV neutralizing antibodies // Nature Medicine 2020 26:7. Nature Publishing Group, 2020. Vol. 26, № 7. P. 1096-1101.

Mendes B.B. et al. Nanodelivery of nucleic acids // Nature Reviews Methods Primers 2022 2:1. Nature Publishing Group, 2022. Vol. 2, № 1. P. 1-21.

Rai R., Alwani S., Badea I. Polymeric Nanoparticles in Gene Therapy: New Avenues of Design

and Optimization for Delivery Applications // Polymers 2019, Vol. 11, Page 745.

Multidisciplinary Digital Publishing Institute, 2019. Vol. 11, № 4. P. 745.

Morille M. et al. Progress in developing cationic vectors for non-viral systemic gene therapy

against cancer // Biomaterials. Elsevier, 2008. Vol. 29, № 24-25. P. 3477-3496.

Kim W.J., Kim S.W. Efficient siRNA delivery with non-viral polymeric vehicles // Pharm Res.

Springer, 2009. Vol. 26, № 3. P. 657-666.

Huang P. et al. The roles of polymers in mRNA delivery // Matter. 2022. Vol. 5, № 6. Paunovska K., Loughrey D., Dahlman J.E. Drug delivery systems for RNA therapeutics // Nature Reviews Genetics 2022 23:5. Nature Publishing Group, 2022. Vol. 23, № 5. P. 265-280. Ke X. et al. Surface-Functionalized PEGylated Nanoparticles Deliver Messenger RNA to Pulmonary Immune Cells // ACS Appl Mater Interfaces. ACS Appl Mater Interfaces, 2020. Vol. 12, № 32. P. 35835-35844.

Tan L. et al. Optimization of an mRNA vaccine assisted with cyclodextrin-polyethyleneimine conjugates // Drug Deliv Transl Res. Springer, 2020. Vol. 10, № 3. P. 678-689. Xiang J.J. et al. IONP-PLL: a novel non-viral vector for efficient gene delivery // J Gene Med. John Wiley & Sons, Ltd, 2003. Vol. 5, № 9. P. 803-817.

Mastorakos P. et al. Highly compacted biodegradable DNA nanoparticles capable of overcoming the mucus barrier for inhaled lung gene therapy // Proc Natl Acad Sci U S A. National Academy of Sciences, 2015. Vol. 112, № 28. P. 8720-8725.

Kozielski K.L. et al. Cancer-selective nanoparticles for combinatorial siRNA delivery to primary human GBM in vitro and in vivo // Biomaterials. Biomaterials, 2019. Vol. 209. P. 79-87.

138

139

140

141

142

143

144

145

146

147

148

149

150

151

152

Blanchard E.L. et al. Treatment of influenza and SARS-CoV-2 infections via mRNA-encoded Cas13a in rodents // Nature Biotechnology 2021 39:6. Nature Publishing Group, 2021. Vol. 39, № 6. P. 717-726.

Zhou J. et al. Nanoparticle-Based Delivery of RNAi Therapeutics: Progress and Challenges // Pharmaceuticals. Multidisciplinary Digital Publishing Institute (MDPI), 2013. Vol. 6, № 1. P. 85. Waite C.L., Roth C.M. PAMAM-RGD conjugates enhance siRNA delivery through a multicellular spheroid model of malignant glioma // Bioconjug Chem. American Chemical Society, 2009. Vol. 20, № 10. P. 1908-1916.

Liu X. et al. Dendrimers-delivered short hairpin RNA targeting hTERT inhibits oral cancer cell growth in vitro and in vivo // Biochem Pharmacol. Elsevier, 2011. Vol. 82, № 1. P. 17-23. Chahal J.S. et al. Dendrimer-RNA nanoparticles generate protective immunity against lethal ebola, H1N1 influenza, and Toxoplasma gondii challenges with a single dose // Proc Natl Acad Sci U S A. National Academy of Sciences, 2016. Vol. 113, № 29. P. E4133-E4142. Ragelle H., Vandermeulen G., Preat V. Chitosan-based siRNA delivery systems // Journal of Controlled Release. Elsevier, 2013. Vol. 172, № 1. P. 207-218.

Mao S., Sun W., Kissel T. Chitosan-based formulations for delivery of DNA and siRNA // Adv Drug Deliv Rev. Elsevier, 2010. Vol. 62, № 1. P. 12-27.

Zhong H. et al. A Comprehensive Map of FDA-Approved Pharmaceutical Products // Pharmaceutics 2018, Vol. 10, Page 263. Multidisciplinary Digital Publishing Institute, 2018. Vol. 10, № 4. P. 263.

Xiao B. et al. Combination Therapy for Ulcerative Colitis: Orally Targeted Nanoparticles Prevent Mucosal Damage and Relieve Inflammation // Theranostics. Ivyspring International Publisher, 2016. Vol. 6, № 12. P. 2250-2266.

Rideau E. et al. Liposomes and polymersomes: a comparative review towards cell mimicking //

Chem Soc Rev. The Royal Society of Chemistry, 2018. Vol. 47, № 23. P. 8572-8610.

Tenchov R. et al. Lipid Nanoparticles from Liposomes to mRNA Vaccine Delivery, a Landscape

of Research Diversity and Advancement // ACS Nano. 2021. Vol. 15, № 11.

Deng Y. et al. Therapeutic potentials of gene silencing by RNA interference: principles,

challenges, and new strategies // Gene. Gene, 2014. Vol. 538, № 2. P. 217-227.

Zhang J., Li X., Huang L. Non-viral nanocarriers for siRNA delivery in breast cancer // J Control

Release. J Control Release, 2014. Vol. 190. P. 440-450.

Hou X. et al. Lipid nanoparticles for mRNA delivery // Nature Reviews Materials 2021 6:12. Nature Publishing Group, 2021. Vol. 6, № 12. P. 1078-1094.

Semple S.C. et al. Rational design of cationic lipids for siRNA delivery // Nat Biotechnol. Nat Biotechnol, 2010. Vol. 28, № 2. P. 172-176.

153. Schroeder A. et al. Lipid-based nanotherapeutics for siRNA delivery // J Intern Med. J Intern Med, 2010. Vol. 267, № 1. P. 9-21.

154. Cheng X., Lee R.J. The role of helper lipids in lipid nanoparticles (LNPs) designed for oligonucleotide delivery // Adv Drug Deliv Rev. Adv Drug Deliv Rev, 2016. Vol. 99, № Pt A. P. 129-137.

155. Kulkarni J.A., Cullis P.R., Van Der Meel R. Lipid Nanoparticles Enabling Gene Therapies: From Concepts to Clinical Utility // Nucleic Acid Ther. Nucleic Acid Ther, 2018. Vol. 28, № 3. P. 146157.

156. Lokugamage M.P. et al. Constrained Nanoparticles Deliver siRNA and sgRNA to T Cells In Vivo without Targeting Ligands // Adv Mater. Adv Mater, 2019. Vol. 31, № 41.

157. FDA Authorizes Pfizer-BioNTech COVID-19 Vaccine for Emergency Use in Children 5 through 11 Years of Age | FDA [Electronic resource]. URL: https://www.fda.gov/news-events/press-announcements/fda-authorizes-pfizer-biontech-covid-19-vaccine-emergency-use-children-5-through-11-years-age (accessed: 15.08.2023).

158. Patel S. et al. Naturally-occurring cholesterol analogues in lipid nanoparticles induce polymorphic shape and enhance intracellular delivery of mRNA // Nature Communications 2020 11:1. Nature Publishing Group, 2020. Vol. 11, № 1. P. 1-13.

159. Paunovska K. et al. Nanoparticles Containing Oxidized Cholesterol Deliver mRNA to the Liver Microenvironment at Clinically Relevant Doses // Adv Mater. Adv Mater, 2019. Vol. 31, № 14.

160. Hashizaki K. et al. Effects of poly(ethylene glycol) (PEG) concentration on the permeability of PEG-grafted liposomes // Chem Pharm Bull (Tokyo). Chem Pharm Bull (Tokyo), 2005. Vol. 53, № 1. P. 27-31.

161. Zhu X. et al. Surface De-PEGylation Controls Nanoparticle-Mediated siRNA Delivery In Vitro and In Vivo // Theranostics. Theranostics, 2017. Vol. 7, № 7. P. 1990-2002.

162. Ryals R.C. et al. The effects of PEGylation on LNP based mRNA delivery to the eye // PLoS One. Public Library of Science, 2020. Vol. 15, № 10. P. e0241006.

163. Lokugamage M.P. et al. Optimization of lipid nanoparticles for the delivery of nebulized therapeutic mRNA to the lungs // Nat Biomed Eng. Nat Biomed Eng, 2021. Vol. 5, № 9. P. 10591068.

164. Sago C.D. et al. High-throughput in vivo screen of functional mRNA delivery identifies nanoparticles for endothelial cell gene editing // Proc Natl Acad Sci U S A. National Academy of Sciences, 2018. Vol. 115, № 42. P. E9944-E9952.

165. Guo P. et al. Engineering RNA for Targeted siRNA Delivery and Medical Application // Adv Drug Deliv Rev. Elsevier, 2010. Vol. 62, № 6. P. 650.

166. Kranz L.M. et al. Systemic RNA delivery to dendritic cells exploits antiviral defence for cancer immunotherapy // Nature. Nature, 2016. Vol. 534, № 7607. P. 396-401.

167. Beam Therapeutics Announces Updated Preclinical Data Highlighting Optimized LNP Delivery Approaches for In Vivo Base Editing to the Liver and Other Tissues | Beam Therapeutics [Electronic resource]. URL: https://investors.beamtx.com/news-releases/news-release-details/beam-therapeutics-announces-updated-preclinical-data/ (accessed: 15.08.2023).

168. Intellia Therapeutics Presents Preclinical Proof of Concept for CRISPR-based In Vivo Editing of Bone Marrow at Keystone eSymposium - Intellia Therapeutics [Electronic resource]. URL: https://ir.intelliatx.com/news-releases/news-release-details/intellia-therapeutics-presents-preclinical-proof-concept-crispr (accessed: 15.08.2023).

169. Kabilova T.O. et al. Antitumor and Antimetastatic Effect of Small Immunostimulatory RNA against B16 Melanoma in Mice // PLoS One. Public Library of Science, 2016. Vol. 11, № 3. P. e0150751.

170. Shmendel E. et al. Effects of spacers within a series of novel folate-containing lipoconjugates on the targeted delivery of nucleic acids // J Drug Deliv Sci Technol. Editions de Sante, 2020. Vol. 57.

171. Zeng N. et al. Preparation and characterization of paclitaxel-loaded DSPE-PEG-liquid crystalline nanoparticles (LCNPs) for improved bioavailability // Int J Pharm. Int J Pharm, 2012. Vol. 424, № 1-2. P. 58-66.

172. Wilhelmy C. et al. Polysarcosine-Functionalized mRNA Lipid Nanoparticles Tailored for Immunotherapy // Pharmaceutics. Multidisciplinary Digital Publishing Institute (MDPI), 2023. Vol. 15, № 8.

173. Pooga M., Langel Ü. Classes of Cell-Penetrating Peptides // Methods Mol Biol. Methods Mol Biol, 2015. Vol. 1324. P. 3-28.

174. Boisguerin P. et al. Delivery of therapeutic oligonucleotides with cell penetrating peptides // Adv Drug Deliv Rev. Adv Drug Deliv Rev, 2015. Vol. 87. P. 52-67.

175. Frankel A.D., Pabo C.O. Cellular uptake of the tat protein from human immunodeficiency virus // Cell. Cell, 1988. Vol. 55, № 6. P. 1189-1193.

176. Fawell S. et al. Tat-mediated delivery of heterologous proteins into cells // Proc Natl Acad Sci U S A. Proc Natl Acad Sci U S A, 1994. Vol. 91, № 2. P. 664-668.

177. Green M., Ishino M., Loewenstein P.M. Mutational analysis of HIV-1 Tat minimal domain peptides: identification of trans-dominant mutants that suppress HIV-LTR-driven gene expression // Cell. Cell, 1989. Vol. 58, № 1. P. 215-223.

178. Derossi D. et al. Cell internalization of the third helix of the antennapedia homeodomain is receptor-independent // Journal of Biological Chemistry. 1996. Vol. 271, № 30. P. 18188-18193.

179. Hansen M., Kilk K., Langel Ü. Predicting cell-penetrating peptides // Adv Drug Deliv Rev. Adv Drug Deliv Rev, 2008. Vol. 60, № 4-5. P. 572-579.

180. Fei L. et al. Tumor targeting of a cell penetrating peptide by fusing with a pH-sensitive histidine-glutamate co-oligopeptide // Biomaterials. Biomaterials, 2014. Vol. 35, № 13. P. 4082-4087.

181. Tünnemann G. et al. Live-cell analysis of cell penetration ability and toxicity of oligo-arginines // J Pept Sci. J Pept Sci, 2008. Vol. 14, № 4. P. 469-476.

182. Mi Z. et al. Characterization of a class of cationic peptides able to facilitate efficient protein transduction in vitro and in vivo // Molecular Therapy. Academic Press Inc., 2000. Vol. 2, № 4. P. 339-347.

183. Mai J.C. et al. Efficiency of protein transduction is cell type-dependent and is enhanced by dextran sulfate. // J Biol Chem. Elsevier, 2002. Vol. 277, № 33. P. 30208-30218.

184. Oehlke J. et al. Cellular uptake of an a-helical amphipathic model peptide with the potential to deliver polar compounds into the cell interior non-endocytically // Biochim Biophys Acta Biomembr. 1998. Vol. 1414, № 1-2.

185. Guo Z. et al. Cell-penetrating peptides: Possible transduction mechanisms and therapeutic applications (review) // Biomedical Reports. 2016. Vol. 4, № 5.

186. Nakayama F. et al. Fibroblast growth factor-12 (FGF12) translocation into intestinal epithelial cells is dependent on a novel cell-penetrating peptide domain: involvement of internalization in the in vivo role of exogenous FGF12 // J Biol Chem. J Biol Chem, 2011. Vol. 286, № 29. P. 25823-25834.

187. Norkowski S. et al. Bacterial LPX motif-harboring virulence factors constitute a species-spanning family of cell-penetrating effectors // Cellular and Molecular Life Sciences. Birkhauser Verlag AG, 2018. Vol. 75, № 12. P. 2273-2289.

188. Raucher D., Ryu J.S. Cell-penetrating peptides: strategies for anticancer treatment // Trends Mol Med. Trends Mol Med, 2015. Vol. 21, № 9. P. 560-570.

189. Fretz M.M. et al. Temperature-, concentration- and cholesterol-dependent translocation of L- and D-octa-arginine across the plasma and nuclear membrane of CD34+ leukaemia cells // Biochemical Journal. Portland Press, 2007. Vol. 403, № 2. P. 335-342.

190. Kosuge M. et al. Cellular internalization and distribution of arginine-rich peptides as a function of extracellular peptide concentration, serum, and plasma membrane associated proteoglycans // Bioconjug Chem. Bioconjug Chem, 2008. Vol. 19, № 3. P. 656-664.

191. Trabulo S. et al. Cell-Penetrating Peptides-Mechanisms of Cellular Uptake and Generation of Delivery Systems // Pharmaceuticals (Basel). Pharmaceuticals (Basel), 2010. Vol. 3, № 4. P. 961993.

192

193

194

195

196

197

198

199

200

201

202

203

204

205

206

Silva S., Almeida A.J., Vale N. Combination of Cell-Penetrating Peptides with Nanoparticles for Therapeutic Application: A Review // Biomolecules 2019, Vol. 9, Page 22. Multidisciplinary Digital Publishing Institute, 2019. Vol. 9, № 1. P. 22.

Graslund A. et al. Mechanisms of cellular uptake of cell-penetrating peptides // Journal of Biophysics. 2011.

Cleal K. et al. Endocytosis, intracellular traffic and fate of cell penetrating peptide based conjugates and nanoparticles // Curr Pharm Des. Curr Pharm Des, 2013. Vol. 19, № 16. P. 28782894.

El-Sayed A., Harashima H. Endocytosis of gene delivery vectors: from clathrin-dependent to lipid raft-mediated endocytosis // Mol Ther. Mol Ther, 2013. Vol. 21, № 6. P. 1118-1130. Brock R. The uptake of arginine-rich cell-penetrating peptides: putting the puzzle together // Bioconjug Chem. Bioconjug Chem, 2014. Vol. 25, № 5. P. 863-868.

Guidotti G., Brambilla L., Rossi D. Cell-Penetrating Peptides: From Basic Research to Clinics // Trends Pharmacol Sci. Trends Pharmacol Sci, 2017. Vol. 38, № 4. P. 406-424. Jarver P. et al. Peptide-mediated Cell and In Vivo Delivery of Antisense Oligonucleotides and siRNA // Mol Ther Nucleic Acids. American Society of Gene & Cell Therapy, 2012. Vol. 1, № 6. P. e27.

Lehto T. et al. Peptides for nucleic acid delivery // Adv Drug Deliv Rev. Adv Drug Deliv Rev, 2016. Vol. 106, № Pt A. P. 172-182.

Deshayes S. et al. Delivery of proteins and nucleic acids using a non-covalent peptide-based strategy // Adv Drug Deliv Rev. Adv Drug Deliv Rev, 2008. Vol. 60, № 4-5. P. 537-547. Morris M.C. et al. A new peptide vector for efficient delivery of oligonucleotides into mammalian cells // Nucleic Acids Res. Nucleic Acids Res, 1997. Vol. 25, № 14. P. 2730-2736. Morris M.C. et al. A novel potent strategy for gene delivery using a single peptide vector as a carrier. // Nucleic Acids Res. Oxford University Press, 1999. Vol. 27, № 17. P. 3510. Simeoni F. et al. Insight into the mechanism of the peptide-based gene delivery system MPG: implications for delivery of siRNA into mammalian cells // Nucleic Acids Res. Oxford University Press, 2003. Vol. 31, № 11. P. 2717.

Morris M.C. et al. A non-covalent peptide-based carrier for in vivo delivery of DNA mimics // Nucleic Acids Res. 2007. Vol. 35, № 7. P. 49.

Crombez L. et al. A non-covalent peptide-based strategy for siRNA delivery // Biochem Soc Trans. Biochem Soc Trans, 2007. Vol. 35, № Pt 1. P. 44-46.

Crombez L. et al. A New Potent Secondary Amphipathic Cell-penetrating Peptide for siRNA Delivery Into Mammalian Cells // Molecular Therapy. Elsevier, 2009. Vol. 17, № 1. P. 95-103.

207. Konate K. et al. Insight into the cellular uptake mechanism of a secondary amphipathic cell-penetrating peptide for siRNA delivery // Biochemistry. Biochemistry, 2010. Vol. 49, № 16. P. 3393-3402.

208. Eguchi A. et al. Efficient siRNA delivery into primary cells by a peptide transduction domain-dsRNA binding domain fusion protein // Nat Biotechnol. Nat Biotechnol, 2009. Vol. 27, № 6. P. 567-571.

209. Perry H.A. et al. YOYO as a dye to track penetration of LK15 DNA complexes in spheroids: use and limits // J Fluoresc. J Fluoresc, 2008. Vol. 18, № 1. P. 155-161.

210. Saleh A.F. et al. Improved Tat-mediated plasmid DNA transfer by fusion to LK15 peptide // J Control Release. J Control Release, 2010. Vol. 143, № 2. P. 233-242.

211. Kim Y. et al. The Potential of Cell-Penetrating Peptides for mRNA Delivery to Cancer Cells // Pharmaceutics. 2022. Vol. 14, № 6.

212. Vlieghe P. et al. Synthetic therapeutic peptides: science and market // Drug Discovery Today. 2010. Vol. 15, № 1-2.

213. (15) (PDF) Absence of Na+,K+-ATPase regulation of endosomal acidification in K562 erythroleukemia cells [Electronic resource]. URL: https://www.researchgate.net/publication/21309358_Absence_of_NaK-

ATPase_regulation_of_endosomal_acidification_in_K562_erythroleukemia_cells (accessed: 15.08.2023).

214. Necas D., Klapetek P. Gwyddion: An open-source software for SPM data analysis // Central European Journal of Physics. De Gruyter Open Access, 2012. Vol. 10, № 1. P. 181-188.

215. Gabert J. et al. Standardization and quality control studies of "real-time" quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction of fusion gene transcripts for residual disease detection in leukemia - a Europe Against Cancer program // Leukemia. Leukemia, 2003. Vol. 17, № 12. P. 2318-2357.

216. Livak K.J., Schmittgen T.D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method // Methods. Methods, 2001. Vol. 25, № 4. P. 402-408.

217. Tilcock C P S. Lipid polymorphism // Chem Phys Lipids. Chem Phys Lipids, 1986. Vol. 40, № 24. P. 109-125.

218. Angelov B. et al. Structural analysis of nanoparticulate carriers for encapsulation of macromolecular drugs // J Mol Liq. Elsevier, 2017. Vol. 235. P. 83-89.

219. Ramezani M. et al. The influence of size, lipid composition and bilayer fluidity of cationic liposomes on the transfection efficiency of nanolipoplexes // Colloids Surf B Biointerfaces. Colloids Surf B Biointerfaces, 2009. Vol. 72, № 1. P. 1-5.

220. Buck J. et al. Lipid-Based DNA Therapeutics: Hallmarks of Non-Viral Gene Delivery // ACS Nano. ACS Nano, 2019. Vol. 13, № 4. P. 3754-3782.

221. Liu C. et al. Barriers and Strategies of Cationic Liposomes for Cancer Gene Therapy // Molecular Therapy Methods and Clinical Development. 2020. Vol. 18.

222. Simonis B. et al. Transport of cationic liposomes in a human blood brain barrier model: Role of the stereochemistry of the gemini amphiphile on liposome biological features // J Colloid Interface Sci. J Colloid Interface Sci, 2022. Vol. 627. P. 283-298.

223. Vysochinskaya V. et al. Influence of Lipid Composition of Cationic Liposomes 2X3-DOPE on mRNADelivery into Eukaryotic Cells // Pharmaceutics. MDPI, 2023. Vol. 15, № 1.

224. Gileva A.M. et al. Transfection efficacy and drug release depends upon the PEG derivative in cationic lipoplexes: Evaluation in 3D in vitro model and in vivo // J Biomed Mater Res B Appl Biomater. J Biomed Mater Res B Appl Biomater, 2023. Vol. 111, № 9. P. 1614-1628.

225. Gjetting T. et al. In vitro and in vivo effects of polyethylene glycol (PEG)-modified lipid in DOTAP/cholesterol-mediated gene transfection // Int J Nanomedicine. Int J Nanomedicine, 2010. Vol. 5, № 1. P. 371-383.

226. Svirina A. et al. Influence of electrostatic interactions on cell-penetrating peptide-small interfering RNA complex formation and intracellular delivery efficiency // J Phys Conf Ser. IOP Publishing, 2018. Vol. 1124, № 3. P. 031005.

227. Svirina A. et al. Influence of electrostatic interactions on cell-penetrating peptide-small interfering RNA complex formation and intracellular delivery efficiency // Journal of Physics: Conference Series. IOP Publishing Ltd, 2018. Vol. 1124, № 3.

228. Gilleron J. et al. Image-based analysis of lipid nanoparticle-mediated siRNA delivery, intracellular trafficking and endosomal escape // Nature Biotechnology 2013 31:7. Nature Publishing Group, 2013. Vol. 31, № 7. P. 638-646.

229. Ruseska I., Zimmer A. Internalization mechanisms of cell-penetrating peptides // Beilstein journal of nanotechnology. Beilstein J Nanotechnol, 2020. Vol. 11. P. 101-123.

230. Sousa De Almeida M. et al. Understanding nanoparticle endocytosis to improve targeting strategies in nanomedicine // Chem Soc Rev. The Royal Society of Chemistry, 2021. Vol. 50, № 9. P. 5397-5434.

231. MANDERS E.M.M., VERBEEK F.J., ATEN J.A. Measurement of co-localization of objects in dual-colour confocal images // J Microsc. John Wiley & Sons, Ltd, 1993. Vol. 169, № 3. P. 375382.

232. Cain C.C., Sipe D.M., Murphy R.F. Regulation of endocytic pH by the Na+,K+-ATPase in living cells // Proc Natl Acad Sci U S A. 1989. Vol. 86, № 2. P. 544-548.

233. Wetzler M. et al. Subcellular localization of Bcr, Abl, and Bcr-Abl proteins in normal and leukemic cells and correlation of expression with myeloid differentiation // Journal of Clinical Investigation. The American Society for Clinical Investigation, 1993. Vol. 92, № 4. P. 1925-1939.

234. Vysochinskaya V. et al. Cell-penetrating peptide and cationic liposomes mediated siRNA delivery to arrest growth of chronic myeloid leukemia cells in vitro // Biochimie. Elsevier B.V., 2024. Vol. 221. P. 1-12.

ПРИЛОЖЕНИЕ А. Благодарности

Автор выражает искреннюю и глубокую благодарность своему научному руководителю к.ф.-м.н. Забродской Яне Александровне за помощь и поддержку на всех этапах работы, а также д.б.н. Васину Андрею Владимировичу и академику РАН, д.м.н. Дубине Михаилу Владимировичу за всестороннюю помощь и поддержку при выполнении работы. Автор особо признателен д.х.н. Маслову Михаилу Александровичу за предоставленную возможность и неоценимую помощь в работе с катионными липосомами, оказанную в ходе выполнения диссертационного исследования. Автор выражает признательность коллегам: к.б.н. Горшкову Андрею Николаевичу, к.б.н. Шишлянникову Сергею Михайловичу, Довбыш Олесе Вячеславовне, к.б.н. Елпаевой Екатерине Александровне, к.б.н. Емельянову Антону Константиновичу, к.ф.-м.н. Тертерову Ивану Николаевичу.