Синтез и изучение свойств димерных поликатионных амфифилов для генной терапии тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 02.00.10, кандидат наук Пучков Павел Анатольевич

• Пучков Павел Анатольевич
• кандидат наук
• 2020

Оглавление диссертации кандидат наук Пучков Павел Анатольевич

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

1. ВВЕДЕНИЕ

2. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

2.1. Введение

2.2. Катионные амфифилы на основе полиаминов и аминокислот

2.2.1. Амфифилы на основе линейных полиаминов

2.2.2. Амфифилы на основе циклических полиаминов

2.3. Амфифилы на основе аминокислот

2.4. Дисульфидные катионные амфифилы

2.5. Влияние структурных компонентов катионных амфифилов на эффективность доставки нуклеиновых кислот

3. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

3.1. Синтез новых димерных поликатионных амфифилов

3.1.1. Синтез димерных поликатионных амфифилов на основе триэтилентетрамина

3.1.2. Синтез димерных поликатионных амфифилов на основе спермина со спейсерными группами различного типа и длины

3.1.3. Синтез димерных поликатионных амфифилов на основе спермина с дисульфидными группами

3.2. Физико-химические характеристики и биологическая активность катионных липосом на основе димерных поликатионных амфифилов

3.2.1. Физико-химические характеристики катионных липосом и их комплексов с НК

3.2.2. Цитотоксичность катионных липосом

3.2.3. Трансфицирующая активность катионных липосом

3.2.3.1. Доставка нуклеиновых кислот катионными липосомами на основе ТЭТА

3.2.3.2. Доставка нуклеиновых кислот катионными липосомами на основе амфифилов с различными спейсерными группами

3.2.3.3. Доставка нуклеиновых кислот катионными липосомами, сформированными амфифилами с дисульфидной группой

4. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

4.1. Основные методы

4.2. Синтез ДПКА на основе ТЭТА

4.3. Синтез ДПКА на основе спермина с различными спейсерными группами

4.4. Синтез дисульфидных ДПКА на основе спермина

4.5. Физико-химические и биологические методы

5. ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

Д11KA - димерный поликатионный амфифил

ИП - индекс полидисперсности

KA - катионный амфифил

KЛ - катионные липосомы

HK - нуклеиновая кислота

пДHK - плазмидная ,3HK

siPHK - малая интерферирующая PHK

9-BBN - 9-борабициклононан

Chol - холестерин

DC-Chol - ^)-[#-(^,^"-диметиламиноэтил)карбамоил]холестерин

DCM - дихлорметан

DIEA - диизопропилэтиламин

DMF - диметилформамид

DMTMM - 4-(4,6-диметокси-1,3,5-триазин-2-ил)-4-метилморфолиний хлорид DOPC - 1,2-диолеоилфосфатидилхолин DOPE - 1,2-диолеоилфосфатидилэтаноламин

DOTAP - 1,2-диолеоилокси-3-(#,#,#-триметиламино)пропан хлорид

DPPC - 1,2-дипальмитоилфосфатидилхолин

DSPC - 1,2-дистеароилфосфатидилхолин

EEDQ - 2-этокси-1-этоксикарбонил-1,2-дигидрохинолин

EGFP - усиленный зеленый флуоресцентный белок

FBS - телячья сыворотка крови

HBV - вирус гепатита Б

NMM - #-метилморфолин

PAT - переносчик полиаминов

PEG - полиэтиленгликоль

PEG4600-Chol - холестерилоксикарбонилполиэтиленгликоль4600

SSAT - спермин/спермидин V-ацетилтрансфераза

TBAB - тетрабутиламмоний бромид

TETA - триэтилентетрамин

THF - тетрагидрофуран

1. ВВЕДЕНИЕ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Синтез и изучение свойств димерных поликатионных амфифилов для генной терапии»

Актуальность работы

В настоящее время для лечения наследственных и ряда других заболеваний, для которых определены генетические причины их возникновения, разрабатываются методы генной терапии, основанные на доставке в клетки организма коротких (антисмысловые или антигенные олигонуклеотиды, малые интерферирующие РНК, микроРНК) и протяженных (ДНК, мРНК) терапевтических нуклеиновых кислот (НК). Поскольку транспорт в эукариотические клетки незащищенных НК является затруднительным, то для их доставки используют вирусы, которые обладают высокой эффективностью, но при этом имеют ряд серьезных недостатков, прежде всего связанных с индукцией воспалительных и иммунных реакций в организме. В качестве альтернативы разрабатываются невирусные средства доставки, основанные на использовании полимерных носителей, мицелл, а также липосом, сформированных на основе синтетических катионных амфифилов. Недостатком данных носителей является низкая эффективность, которая обусловлена наличием внеклеточных и внутриклеточных биологических барьеров, препятствующих проникновению транспортной системы с заключенной в нее НК в эукариотическую клетку и проявлению НК терапевтического действия.

Катионные липосомы (КЛ) - это невирусные средства доставки, которые широко используются для транспорта НК. Обязательным компонентом липосом является катионный амфифил (КА), связывающий и компактизирующий молекулы НК с образованием нуклеолипидных комплексов (липоплексы). Структура КА представляет собой комбинацию гидрофобного и катионного доменов, разнесенных в пространстве при помощи спейсерных групп. Направленная модификация химической структуры КА является одним из способов повышения эффективности доставки НК, поскольку именно в структуре закладывается способность молекулы к образованию липидных агрегатов, формированию определенной липидной фазы, а также «отклику» на различные внутриклеточные факторы.

Ранее было показано, что поликатионные амфифилы на основе природных полиаминов обеспечивают более эффективный транспорт НК в клетки, по сравнению с монокатионными аналогами, за счет формирования системы распределенных зарядов в полиаминной матрице и способности облегчать высвобождение НК из эндосом. Введение в молекулу классического КА (мономерный амфифил «голова-хвост») дополнительного гидрофобного домена позволило создать класс димерных амфифилов (гемини-амфифилов), которые доставляли НК в эукариотические клетки в присутствии сыворотки

крови эффективнее мономерных аналогов. Введение в структуру КА стимул-чувствительных групп различной природы (кислото-, термо-, фотолабильные, редокс-чувствительные), способных разрушаться под действием внутриклеточных стимулов, может увеличить количество высвобождающейся из липоплекса НК, тем самым, усилив ее биологический/терапевтический эффект. Таким образом, разработка новых димерных поликатионных амфифилов и создание на их основе катионных липосом является актуальной задачей для повышения эффективности генной терапии.

Цель работы и задачи

Целью работы является синтез новых димерных поликатионных амфифилов для генной терапии, исследование физико-химических характеристик и биологических свойств катионных липосом на их основе.

В рамках указанной цели было необходимо решить следующие задачи:

1. Получить ряд новых ДИКА, в которых варьируется структура катионного домена и спейсерных групп.

2. Разработать подходы к синтезу стимул-чувствительных ДИКА с дисульфидными группами, расположенными в разных частях молекулы.

3. Получить на основе синтезированных ДИКА катионные липосомы и изучить их физико-химические характеристики и биологические свойства.

Научная новизна

В результате работы получены семь новых ДИКА, в которых варьируется строение катионного домена и спейсерных групп. Разработан новый подход к введению дисульфидных групп в молекулу ДИКА, и проведена оптимизация синтеза дисульфидных ДИКА на основе холестерина и спермина. Используя синтезированные амфифилы, были получены новые катионные липосомы и их комплексы с пДНК и siPH^ для которых определены физико-химические характеристики: размер, Z-потенциал и полнота связывания с НК. Для дисульфидных амфифилов впервые показана различная чувствительность липоплексов к действию восстанавливающих агентов, которая зависит от положения дисульфидной связи в молекуле ДИКА.

Биологические исследования in vitro позволили оценить влияние структуры ДИКА на эффективность доставки НК и выявить наиболее перспективные катионные липосомы для дальнейших биологических исследований. Наиболее важные модификации, усиливающие трансфицирующую активность ДИКА, связаны с использованием в качестве катионного домена полиамина спермина и его природной способностью

упаковывать молекулы НК, а также с увеличением длины спейсеров димерных поликатионных амфифилов с 6 до 8 атомов. Катионные липосомы на основе ДПКА с дисульфидной группой в структуре спейсера показали высокую эффективность доставки siPHK, приводящую к подавлению биосинтеза белка на 90%.

Практическая значимость

В ходе работы нами был оптимизирован синтез ДПКА, что позволяет разработать лабораторную и в дальнейшем промышленную технологию их получения. На основе ДПКА получены новые катионные липосомы, которые могут быть использованы для эффективной доставки коротких и протяженных НК в различные типы эукариотических клеток, что расширяет имеющийся арсенал трансфицирующих агентов. Для внесения новых или восстановления утраченных клетками функций в ходе доставки пДНК наиболее перспективными являются липосомы на основе ДПКА с этоксиэтоксиэтильным спейсером. Катионные липосомы на основе ДПКА с дисульфидной группой обеспечивают эффективный транспорт siPH^ специфически подавляющих эксперессию генов-мишеней. Данные композиции могут быть использованы в качестве альтернативы зарубежному коммерческому препарату Липофектамин 2000, а также и разработанным ранее в нашей лаборатории липосомам на основе ДПКА 2Х3. Запатентован способ получения стимул-чувствительных катионных липосом на основе дисульфидного ДПКА (Патент РФ № 2610271, 2017 г.).

Основные положения, выносимые на защиту

1. Синтез новых димерных поликатионных амфифилов, содержащих различные структурные компоненты, для получения катионных липосом для генной терапии.

2. Исследование физико-химических характеристик, цитотоксичности и трансфицирующей активности катионных липосом, сформированных на основе синтезированных амфифилов.

Публикации по теме работы

По материалам диссертации опубликовано 17 печатных работ, включая 5 статей в научных журналах, входящих в Перечень ВАК и в международные базы цитирования Scopus и Web of Science, 11 тезисов докладов, получен 1 патент РФ.

Апробация работы и достоверность результатов

Достоверность полученных результатов и выводов основывается на применении совокупности современных физико-химических методов анализа и подходов к обработке данных, воспроизводимости полученных результатов.

Основные результаты диссертации были представлены на V молодежной научно-технической конференции «Наукоемкие химические технологии - 2013» (Москва, 2013), XV Международной научно-технической конференции «Наукоемкие химические технологии - 2014» (Звенигород, 2014), Втором междисциплинарном симпозиуме по медицинской, органической и биологической химии (Новый Свет, 2015), XXVIII зимней молодежной научной школе «Иерспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2016), Кластере конференций по органической химии «0ргХим-2016», (Санкт - Иетербург (пос. Репино), 2016), IX Международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2017), Третьем междисциплинарном симпозиуме по медицинской, органической и биологической химии и фармацевтике 2017 (Севастополь, 2017), International workshop «Targeting RNA world» (Saint-Petersburg, 2018), Всероссийской мультиконференции с международным участием «Биотехнология - медицине будущего» (Новосибирск, 2019).

Личный вклад автора

Диссертантом выполнен весь объем синтетической части работы, получены катионные липосомы, проведены физико-химические исследования, проанализированы данные биологических испытаний. Автор участвовал в формулировке задач и выводов работы, а также в подготовке научных публикаций по теме диссертации.

Объем и структура работы

Диссертационная работа изложена на 92 страницах печатного текста и состоит из введения, литературного обзора, обсуждения полученных результатов, экспериментальной части, выводов и списка цитируемой литературы (119 ссылок). Работа проиллюстрирована 18 рисунками и содержит 7 схем и 3 таблицы.

2. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

2.1. Введение

Генная терапия является современным и перспективным методом лечения тяжелых наследственных и приобретенных заболеваний, в том числе рака, посредством введения терапевтических нуклеиновых кислот (НК), которые могут заменить поврежденный ген (пДНК) или блокировать экспрессию нежелательного (антисмысловые олигонуклеотиды, siPHK) белка [1,2]. Непосредственное введение терапевтических НК представляет собой малоэффективный процесс ввиду наличия большого количества внешних и внутренних лимитирующих факторов [3]. Под внешними факторами подразумевают нестабильность НК в биологических жидкостях (деградация под действием нуклеаз, взаимодействие с альбумином, липопротеинами низкой плотности, приводящее к агрегации и быстрому клиренсу НК), а также низкую степень взаимодействия с целевыми клетками-мишенями. Внутренние факторы определяются наличием мембранных барьеров (плазматической, эндосомальной и ядерной мембраны), которые необходимо преодолеть НК для проникновения в цитозоль и ядро [4].

Для преодоления указанных факторов требуется разработка специальных средств доставки. Таковыми являются вирусы [5,6], которые обладают высокой эффективностью, но при этом имеют ряд серьезных недостатков, прежде всего связанных с индукцией воспалительных и иммунных реакций в организме. В качестве альтернативы разрабатываются невирусные средства доставки, такие как катионные липосомы (КЛ) на основе катионных амфифилов (КА) [6-9]. Структура КА представляет собой комбинацию гидрофобного и катионного доменов, разнесенных в пространстве при помощи спейсерных групп. Положительный заряд КА позволяет «упаковывать» НК за счет электростатических взаимодействий с образованием липоплексов (комплексы НК с липосомами).

Помимо КА в состав липосом могут включаться липиды-хелперы (например, DOPE - 1,2-диолеоилфосфатидилэтаноламин) [10-12], способствующие формированию определенной липидной фазы и обеспечивающие эффективную трансфекцию клеток. Также липосомы могут содержать дополнительные липофильные молекулы, придающие липосомам адресную функцию к определенным клеткам-мишеням [13] или увеличивающие время циркуляции в кровотоке (например, липофильные производные полиэтиленгликоля, PEG) [14].

Структура КА оказывает ключевое влияние на эффективность доставки НК в эукариотические клетки. За последние годы было получено большое число

монокатионных амфифилов, на основе которых созданы липосомы, способные опосредовать транспорт НК. В данном обзоре будут рассмотрены поликатионные амфифилы, которые обеспечивают более эффективный транспорт НК в клетки, по сравнению с монокатионными аналогами, за счет формирования системы распределенных зарядов в полиаминной матрице и способности облегчать высвобождение НК из эндосом.

2.2.Катионные амфифилы на основе полиаминов и аминокислот

2.2.1. Амфифилы на основе линейных полиаминов

Природные полиамины, такие как спермин и спермидин, способны эффективно связывать ДНК, что позволяет их использовать для создания катионных амфифилов. На поверхности клеток находятся сайты узнавания полиаминов, например, РАТ - переносчик полиаминов, которые обеспечивают селективный транспорт как самих полиаминов, так и их производных. С другой стороны, известно, что раковые клетки несут на своей поверхности гораздо больше подобных сайтов, а значит амфифилы на основе полиаминов могут более эффективно трансфицировать раковые клетки. Одну из ведущих ролей в доставке нуклеиновых кислот (НК) играет число и распределение положительных зарядов в молекуле полиамина. Было показано, что эффективность трансфекции увеличивается с увеличением количества аминогрупп в структуре полиамина. Среди синтезированных амфифилов 1a-g наибольшей эффективностью трансфекции обладало соединение 1e [15]. Предполагается, что данное соединение может задействовать PAT, а также конкурировать с другими полиаминами, например, спермином, за связывание с определенными сайтами узнавания на поверхности клетки (в частности, с тем же РАТ). Аналогичный по структуре липополиамин 1g с амидным линкером обладал высокой цитотоксичностью, что не дало возможности изучить его трансфицирующую активность.

Еще одним фактором, влияющим на эффективность трансфекции, является гидрофобность амфифильной молекулы. Исследование соединений 2, 3a-d, содержащих в качестве гидрофобного домена стеролы (кортизол и его производные), выявило, что при прочих равных условиях с увеличением гидрофобности молекулы увеличивается трансфицирующая активность амфифила [16]. Было показано, что липосомы с соединением 3d практически не активны, что может быть связано с меньшей гидрофобностью амфифила 3d и неэффективным образованием липоплексов. В то же время соединения 3b и 3c обладали наибольшей эффективностью трансфекции. Однако следует заметить, что вклад гидрофобности в эффективность доставки НК зависит и от других параметров, прежде всего соотношения КА/липид-хелпер (например, с увеличением количества DOPE в липосомах увеличивается эффективность трансфекции) и от соотношения N/P (отношение числа аминогрупп КА к числу фосфатных групп НК).

В более поздних исследованиях было показано [17], что наиболее эффективно трансфицировали клетки соединения 4b и 4c, содержащие двойную связь в полициклическом гидрофобном домене. Липосомы, сформированные из соединения 4d, его димерного аналога 4e и DOPE доставляли плазмидную ДНК (пДНК) эффективнее, чем липосомы 4e/DOPE.

4а, [Ч1 =

4Ь, ^ =

4с, К1 =

ЧЧ' Н

Н

н

лон

4с1, R1 =

Н2 = Н 4е, R1 = =

ОН

В большинстве случаев в структуре КА гидрофобные заместители присоединяются к полиамину по первичным аминогруппам. Иной подход к синтезу КА был предложен группой исследователей во главе с I. Blagbrough [18-21]. Они получили ^,Л^-дизамещенные производные спермина 5а-] с ацильными или алкильными остатками различной длины и степени ненасыщенности. Все липоплексы, полученные из ацилзамещенных полиаминов 5а-И, обладали высокой эффективностью трансфекции за исключением амфифилов 5Ь и 5Г Однако только соединения 5Г и 5g с остатками стеариновой и олеиновой кислот обладали низкой токсичностью в отношении клеток FEK4 и ШТА. Следует отметить, что увеличение степени ненасыщенности углеводородных цепей увеличивало как эффективность трансфекции, так и цитотоксичность соединений. Алкильные производные спермина 51 и 5] обладали сопоставимой или несколько более высокой эффективностью трансфекции, но были гораздо токсичнее своих ацильных аналогов [19].

H,N

5a, R1 = 5b, R1 : 5c, R1 = 5d, R1: 5e, R1: 5f, R1 = 5g, R1: 5h, R1: 5i, R1 = 5j, R1 =

= R2 = C9H19C(0) = R2 = С-|-|Н2зС(0) : R2 = C13H27C(0) = R2 = (9Z)-C13H25C(0) = R2 = C15H31C(0) R2 = C17H35C(0) = R2 = (9Z)-C17H33C(0) = R2 = (9Z,12Z)-C17H33C(0) R2 = Ci8H37 R2 = (9Z)-C18H35

6a, R1 = CgHigC(O), R2 = (9Z)-C17H33C(0) 6b, R1 = CgHigC(O), R2 = C17H35C(0)

6c, R1 = (9Z)-C13H25C(0), R = C13H27C(0) 6d, R1 = (9Z)-C17H33C(0), R2 = C17H35C(0)

6e, R1 =

6f, R1 =

R^=(9Z)-C17H33C(0)

R2=(9Z)-C17H33C(0)

Дальнейшим развитием исследований данного класса соединений стало получение асимметричных аналогов 6a-f [22]. Наибольшую эффективность доставки siРНК в клетки FEK4 и HtTA, сопоставимую с эффективностью коммерческого препарата TransIT-TKO (Mirus Bio, США), показали Л^-миристолеоил-Л^-миристоилспермин (6c) и Л^-олеоил-Л9-стеароилспермин (6d). Амфифил 6f с остатком литохолевой кислоты эффективно доставлял НК, но вызывал гибель клеток. Наименее эффективным оказался Л^-холестерил-Л^-олеоилспермин (6е).

1 12

Были синтезированы и изучены N ,N -замещенные производные спермина 7a-d, которые являются структурными изомерами амфифилов 5c, 5d, 5f, 5g [23]. Было показано, что при доставке пДНК эффективность трансфекции клеток FEK4 и HtTA комплексами с амфифилами 7a-d была ниже, а токсичность выше по сравнению с амфифилом 5g. Транспорт siРНК в присутствии соединений 7a и 7c был сопоставим по своей эффективности с амфифилом 5g.

н н

.ISL Ж

7а, R1 = R2 = (9Z)-C17H33C(0) 7b, R1 = R2 = С17Н35С(0) 7c, R1 = R2 = (9Z)-C13H25C(0) 7d, R1 = R2 = C13H27C(0)

4N' H

4N' H

8a, R1 = (9Z)-C17H33C(0), R2 = H

8b, R1 = (9Z),(12Z)-C17H31C(0), R2 = H

8c, R1 = (9Z),(12Z),(15Z)-C17H29C(0), R2 = H

8d, R1 = C15H31C(0), R2 = H

8e, R1 = C9H19C(0), R2 = H

8f, R1 = C3H7C(0), R2 = H

8g, R1 = CH3C(0), R2 = H

Ряд монозамещенных производных полиаминов 8a-g был получен путем модификации спермина остатками жирных кислот различной длины и степени ненасыщенности [24], что позволило оценить влияние гидрофобного домена на эффективность трансфекции. Увеличение длины остатка высшей жирной кислоты приводило к увеличению токсичности, а с другой стороны положительно сказывалось на проникновении комплексов через клеточную мембрану in vitro. Эксперименты in vivo показали, что эффективность доставки НК #-бутаноилспермином (8f) была выше, чем #-деканоилспермином (8e).

Было получено и исследовано семейство моно- и дизамещенных поликатионных амфифилов на основе спермина [25-27], содержащих в качестве гидрофобных доменов остатки холестерина или 1,2-ди-О-тетрадецилглицерина. Также в структуре КА варьировалась длина спейсера и тип линкерной группы. Среди монозамещенных амфифилов 9a-c наибольшую эффективность трансфекции показало соединение 9b. Введение дисульфидной группы в молекулу КА (соединения 10a-c) приводило к увеличению экспрессии репортерного белка по сравнению с КА 9a-c. Димерные поликатионные амфифилы 11a-c, трансфицируя тот же процент клеток, что и их мономерные аналоги 9a-c, обеспечивали лучшую экспрессию зеленого флуоресцентного белка. Наибольшей эффективностью трансфекции обладали липосомы на основе амфифила 11c, которые превосходили по эффективности коммерческий препарат Lipofectamine 2000 (Thermo Fisher Scientific, США) для любого типа переносимой НК [26,27]. Адресные липосомы на основе КА 11c также были успешно использованы в экспериментах in vivo [28-30].

■Vх™1

Н 4 HCl

9а, X = С(О), п = 4 9b, X = C(0)NH, п = 4 9с, X = C(0)NH, п = 6

9а-11с, R =

п

4 HCl

10а, X = Y = С(О), п = 1 10b, X = Y = С(О), п = 2 Юс, X = C(Q)NH, Y = CH2C(0)NH, n = 2

OCi4H2g —ОС14Н29

11d, R =

4 HCl H H

.N^X___R

11a, X = C(O), n = 4 11b, X = C(0)NH, n = 4 11c,d, X = C(Q)NH, n = 6

U O'

Обширный скрининг КА был проведен В. Yingyongnarongkul с сотрудниками [31]. В структуре соединений 12a-j - 29a-j изменялись как полиаминная матрица, так и гидрофобные составляющие. Для КЛ, сформированных из амфифилов 12a-j - 29a-j и DOPE (1:2 масс.), что эффективная трансфекция клеток НЕК293 достигается только липосомами с амфифилами 12a-j - 20a-j, содержащими ацильный заместитель при терминальной аминогруппе. Причем только восемь соединений (12c, 12e, 13d, 14c, 16d, 16g, 17h, 17j) превосходили по эффективности коммерческий препарат Effectene (Qiagen, Германия). Расширенные исследования по трансфекции клеток HEK293, COLO 205, D17, HeLa, PC3 показали, что данные соединения активнее опосредовали транспорт НК по сравнению с коммерческими трансфектантами Effectene, DOTAP, и DC-Chol, при этом их токсичность была ниже токсичности коммерческих препаратов.

н ° V

12a-20j

12a-j, n = 2, m = 2; 13a-j, n = 2, m = 3; 14a-j, n = 2, m = 5; 15a-j, n = 3, m = 2; 16a-j, n = 3, m = 3; 17a-j, n = 3, m = 5; 18a-j, n = 5, m = 2; 19a-j, n = 5, m = 3; 20a-j, n = 5, m = 5;

H,N

-hTN

21a-j, n = 2, m = 2; 22a-j, n = 2, m = 3; 23a-j, n = 2, m = 5; 24a-j, n = 3, m = 2; 25a-j, n = 3, m = 3; 26a-j, n = 3, m = 5; 27a-j, n = 5, m = 2; 28a-j, n = 5, m = 3; 29a-j, n = 5, m = 5;

21a-29j

a, R = C10H2iC(O)

b, R = 0^4230(0)

c, R = С-|2Н25С(0)

d, R = Ci3H27C(0)

e, R = C14H29C(0)

f, R = C15H31C(0)

g, R = (9Z)-C17H33C(0)

h, R = C17H35C(0)

i, R = C18H37C(0) j, R = C19H39C(0)

Ряд поликатионных амфифилов 30-33, чувствительных к изменению рН, был получен последовательным присоединением аминокислот (Ь-гистидин, L-цистеин) и жирных кислот (лауриновая, олеиновая, стеариновая) к полиаминам [32,33]. Размер комплексов амфифилов с siРНК составлял 160-210 нм, а максимальная эффективность трансфекции клеток и87 достигалась с помощью амфифилов 30Ь-33Ь с остатками олеиновой кислоты, а эффективность трансфекции уменьшалась в ряду 30Ь > 32Ь > 31Ь > 33Ь. Также была установлена корреляция между эффективностью трансфекции и способностью соединений вызывать нарушение целостности мембран эритроцитов. Соединение-лидер 30Ь на основе этилендиамина обладало наибольшей гемолитической активностью при значении рН 5.4, которое соответствует началу эндосомального

закисления. Поэтому при использовании данного амфифила можно ожидать эффективного высвобождения НК внутри клеток за счет разрушения мембран эндосом.

нм^м

О, у—\ >—N4 НМ^ N14 НМ—^ }—( О Ъ О ^БН

^-м

11п23

Ь, И2 = (92)-С17Н33

не—ч

)— N14

нмЧ

О о

\ // N

Ъ о нм—х'

у—N4

М—г( 34с

N Н

О. НМ

У-мн о нм—^

/—( ° ° МН ^—\

4-\ о оч к1

о нм—^

34с1 у—мн 34е

нэ^

у—МН

о о

НЭ—ч

V- мн НМН

о о

о. нм

о оч нм—^ ^—к2 )—мн

НЭ—'

не—\ У-мн

Н,МЧ У*2

о о

о. нм

не

^у—МН

V- мн

о нм—^ ъ—^ ,о >—< о о нм-

R1 )

и

.о о.

34М

нм

N

н

нэ

г/н

N

н

н

,мч

,мн2

н2 =

Позднее было получено второе поколение кислоточувствительных амфифилов 34a-h на основе спермина. Биологические испытания, проведенные на клетках HeLa и U87 показали, что наличие в структуре соединений остатка L-гистидина не улучшает эффективность трансфекции. Также не было выявлено никакой зависимости между эффективностью КА и расстоянием между гидрофобными доменами. Наибольшую активность при доставке пДНК показало соединение 34e [34], а при доставке siPHK -амфифил 34f [35,36]. Авторы также отмечают, что при создании комплексов амфифилов с НК они не использовали липиды-хелперы, так как синтезированные соединения были способны самостоятельно инициировать рН-зависимый фазовый переход, который приводит к дестабилизации комплексов и высвобождению НК.

Т. Asai с сотрудниками был получен ряд фосфамидных производных, содержащих длинноцепные алкильные заместители (додециловые, тетрадециловые и гексадециловые) в качестве гидрофобных фрагментов [37]. Результаты трансфекции клеток COS-1 липоплексами, сформированными пДНК и мицеллами или липосомами на основе амфифилов 35a-d, показали, что комплексы на основе мицелл в два раза менее эффективны, чем комплексы на основе липосом КА/липид-хелпер/Chol (1:1:1 мольн.). В качестве липида-хелпера использовали DOPE или дипальмитоилфосфатидилхолин (DPPC), однако липосомы с DPPC оказались неэффективным средством доставки. Эффективность трансфекции клеток LLC и B16BL6 увеличивалась с ростом длины алкильных цепей и количества аминогрупп в полиамине. При этом для клеток LLC наилучшим было соединение 35f на основе спермина, а в случае клеток B16BL6 -амфифил 35с на основе спермидина.

N

н

В дальнейшем был получен аналог соединений 35с и 35f на основе синтетического полиамина - тетраэтиленпентамина (35g) [38]. Липосомы 35g/DOPE/DPPC/Chol (0.25:1:0.75:1 мольн.) эффективно доставляли антисмысловые олигонуклеотиды в эукариотические клетки. При этом введение липофильных производных полиэтиленгликоля (PEG) и циклического аналога пептида RGD обеспечивало активное нацеливание липосом на клетки-мишени и увеличивало эффективность доставки НК [39,40].

Новые амфифилы 37a-d, в которых полиамин связан с гидрофобным доменом через карбамоильный или амидный линкеры, формировали липосомы с DOPE или соединением 36 (1:1 мольн.) и были использованы для доставки пДНК [41]. Протонирование имидазолиевого кольца амфифила 36 при эндосомальном закислении может способствовать разрыву мембраны эндосомы увеличению количества высвобождающейся НК [42,43]. Трансфекция клеток OVCAR-3, IGROV-1 и HeLa комплексами, сформированными при различных соотношениях N/P (4:1 - 12:1), показала, что липосомы 37c/DOPE обеспечивают высокую эффективность доставки пДНК и превосходят коммерческий препарат Lipofectamine 2000. Сравнительная трансфицирующая активность уменьшалась в ряду 37c > 37b > 37a >> 37d. Также следует отметить, что использование амфифила 36 в качестве липида-хелпера не приводило к увеличению эффективности трансфекции, но увеличивало цитотоксичность липоплексов.

Доставка пДНК in vivo липосомами 37c/DOPE/PEG4600-Chol (43:43:14 мольн.) в соотношении с пДНК 4:1 (масс.) приводила к 33-кратному увеличению экспрессии белка по сравнению с незащищенной ДНК [44].

Новые КА 38а-с, в структуре которых катионный домен связан с остатком холестерина с помощью простой эфирной связи [45] способны формировать с DOPE липосомы размером 142, 162 и 80 нм, соответственно. Трансфекция клеток AGS и Huh-7

17

показала, что липосомы 38a/DOPE эффективнее доставляют пДНК в клетки AGS, а липосомы 38b/DOPE - в клетки Huh-7, при этом их активность превышает активность коммерческих трансфектантов [46]. Липосомы с димерным гемини-амфифилом 38с также превзошли коммерческие агенты при трансфекции клеток COS-7 и Huh-7 [47].

38а, R= HN 38b, R= N"^-^NN2

На основе КА 39a,b, различающихся расположением аминогрупп, были получены липосомы, которые способствовали транспорту siРНК в клетки MB49 и К562, при этом амфифил 39a превосходил амфифил 39b [48].

н

(9Z)-C17H33^N.

о

H

4N'

(9Z)-C17H33^N

„nh2 о

(9Z)-C17H33^N^ (9Z)-C17H33^N

О о

39a 39b

NH,

NH,

При сравнении трансфицирующей активности КА 40а^ на основе различных полиаминов установлено [49], что только липосомы на основе соединений 40d-g, имеющих спермин в своей структуре, способны доставлять пДНК в клетки ИеЬа, при этом эффективность доставки уменьшается с ростом длины цепи ацильных заместителей.

a, R1 = С13Н27С(0), R2 =

b, R1 = С13Н27С(0), R2 =

R1

^О с, R1 = С13Н27С(0), R2 =

R vON^ d'R1 = C11H23C(0)'R2 =

О ^ R2 H H

40a-g e, R1 = C13H27C(0), R2 =

f, R1 = C15H31C(0), R2 =

1 , H

g, R1 = C19H39C(0), R2 =

n v nh2 H

N ^ NH2 H

n ^ nh2 H

С целью исследования влияния центрального звена на эффективность трансфекции был получен ряд аналогов соединений 40^Г на основе спермина (соединения 41а-с, 42а-с, 43а-с) [50]. Эффективность доставки пДНК липосомами на основе амфифилов 41Ь, 42с, и 43а была выше или сопоставима с эффективностью Lipofectamine 2000. Исследование влияния гидрофобных доменов на трансфекцию позволило установить, что предпочтительно использовать миристиновую кислоту.

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Пучков Павел Анатольевич, 2020 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Raty J.K., Pikkarainen J.T., Wirth T., Yla-Herttuala S. Gene therapy: the first approved gene-based medicines, molecular mechanisms and clinical indications. // Curr. Mol. Pharmacol., 2008, 1, 13-23.

2. Behr J.P. Synthetic gene transfer vectors II: Back to the future. // Acc. Chem. Res., 2012, 45, 980-984.

3. Wiethoff C.M., Middaugh C.R. Barriers to nonviral gene delivery // Journal of Pharmaceutical Sciences, 2003, 92, 203-217.

4. Gottfried L.F., Dean D.A. Extracellular and Intracellular Barriers to Non-Viral Gene Transfer // Novel Gene Therapy Approaches / ed. Wei M., 2013, 75.

5. Konishi M., Kawamoto K., Izumikawa M., Kuriyama H., Yamashita T. Gene transfer into guinea pig cochlea using adeno-associated virus vectors. // J. Gene Med., 2008, 10, 610618.

6. Zhao Y., Huang L. Lipid nanoparticles for gene delivery // Advances in Genetics / ed. Huang L., Liu D., Wagner E., 2014, 88, 13-36.

7. Pahle J., Walther W. Vectors and strategies for nonviral cancer gene therapy. // Expert Opin. Biol. Ther., 2016, 16, 443-461.

8. Junquera E., Aicart E. Recent progress in gene therapy to deliver nucleic acids with multivalent cationic vectors // Advances in Colloid and Interface Science, 2016, 233, 161175.

9. Nordling-David M.M., Golomb G. Gene delivery by liposomes // Isr. J. Chem., 2013, 53, 737-747.

10. Mochizuki S., Kanegae N., Nishina K., Kamikawa Y., Koiwai K., Masunaga H., Sakurai K. The role of the helper lipid dioleoylphosphatidylethanolamine (DOPE) for DNA transfection cooperating with a cationic lipid bearing ethylenediamine // Biochim. Biophys. Acta - Biomembr., 2013, 1828, 412-418.

11. Cheng X., Lee R.J. The role of helper lipids in lipid nanoparticles (LNPs) designed for oligonucleotide delivery // Adv. Drug Deliv. Rev., 2016, 99, 129-137.

12. Zidovska A., Evans H.M., Ahmad A., Ewert K.K., Safinya C.R. The role of cholesterol and structurally related molecules in enhancing transfection of cationic liposome-DNA complexes. // J. Phys. Chem. B, 2009, 113, 5208-5216.

13. Schaffer D. V., Lauffenburger D.A. Targeted synthetic gene delivery vectors // Curr. Opin. Mol. Ther., 2000, 2, 155-161.

14. Amoozgar Z., Yeo Y. Recent advances in stealth coating of nanoparticle drug delivery

systems // Wiley Interdiscip. Rev. Nanomedicine Nanobiotechnology, 2012, 4, 219-233.

15. Gardner R.A., Belting M., Svensson K., Phanstiel O., Iv O.P. Synthesis and Transfection Efficiencies of New Lipophilic Polyamines // J. Med. Chem., 2007, 50, 308-318.

16. Gruneich J.A., Diamond S.L. Synthesis and structure-activity relationships of a series of increasingly hydrophobic cationic steroid lipofection reagents // J. Gene Med., 2007, 9, 381-391.

17. Randazzo R.A.S., Bucki R., Janmey P.A., Diamond S.L. A series of cationic sterol lipids with gene transfer and bactericidal activity // Bioorganic Med. Chem., 2009, 17, 32573265.

18. Ahmed O.A.A., Adjimatera N., Pourzand C., Blagbrough I.S. N4,N9-dioleoyl spermine is a novel nonviral lipopolyamine vector for plasmid DNA formulation // Pharm. Res., 2005, 22, 972-980.

19. Ghonaim H.M., Ahmed O.A.A., Pourzand C., Blagbrough I.S. Varying the chain length in N4, N9-diacyl spermines: Non-viral lipopolyamine vectors for efficient plasmid DNA formulation // Mol. Pharm., 2008, 5, 1111-1121.

20. Ahmed O. a a, Pourzand C., Blagbrough I.S. Varying the unsaturation in N4,N9-dioctadecanoyl spermines: nonviral lipopolyamine vectors for more efficient plasmid DNA formulation. // Pharm. Res., 2006, 23, 31-40.

21. Soltan M.K., Ghonaim H.M., El Sadek M., Kull M.A., El-Aziz L.A., Blagbrough I.S. Design and synthesis of N 4,N 9-disubstituted spermines for non-viral siRNA delivery -Structure-activity relationship studies of sifection efficiency versus toxicity // Pharm. Res.,

2009, 26, 286-295.

22. Blagbrough I.S., Metwally A. a., Ghonaim H.M. Asymmetrical N 4, N 9-diacyl spermines: SAR studies of nonviral lipopolyamine vectors for efficient siRNA delivery with silencing of EGFP reporter gene // Mol. Pharm., 2012, 9, 1853-1861.

23. Ghonaim H.M., Li S., Blagbrough I.S. N1,N12-diacyl spermines: SAR studies on non-viral lipopolyamine vectors for plasmid DNA and siRNA formulation // Pharm. Res.,

2010, 27, 17-29.

24. Viola J.R. et al. Fatty acid-spermine conjugates as DNA carriers for nonviral in vivo gene delivery // Gene Ther., 2009, 16, 1429-1440.

25. Петухов И.А., Маслов М.А., Морозова Н.Г., Серебренникова Г.А. Синтез поликатионных липидов на основе холестерина и спермина // Известия Академии наук. Серия химическая, 2010, 254-261.

26. Maslov M.A., Kabilova T.O., Petukhov I.A., Morozova N.G., Serebrennikova G.A., Vlassov V. V., Zenkova M.A. Novel cholesterol spermine conjugates provide efficient

cellular delivery of plasmid DNA and small interfering RNA // J. Control. Release, 2012, 160, 182-193.

27. Markov O.O., Mironova N.L., Maslov M.A., Petukhov I.A., Morozova N.G., Vlassov V. V., Zenkova M.A. Novel cationic liposomes provide highly efficient delivery of DNA and RNA into dendritic cell progenitors and their immature offsets // J. Control. Release, 2012, 160, 200-210.

28. Kabilova T.O., Sen'kova A. V., Nikolin V.P., Popova N.A., Zenkova M.A., Vlassov V. V., Chernolovskaya E.L. Antitumor and Antimetastatic Effect of Small Immunostimulatory RNA against B16 Melanoma in Mice // PLoS One / ed. Mattei F., 2016, 11, e0150751.

29. Markov O. V., Mironova N.L., Shmendel E. V., Maslov M.A., Zenkova M.A. Systemic delivery of complexes of melanoma RNA with mannosylated liposomes activates highly efficient murine melanoma-specific cytotoxic T cells in vivo // Mol. Biol., 2017, 51, 102107.

30. Markov O. V., Mironova N.L., Shmendel E. V., Serikov R.N., Morozova N.G., Maslov M.A., Vlassov V. V., Zenkova M.A. Multicomponent mannose-containing liposomes efficiently deliver RNA in murine immature dendritic cells and provide productive anti-tumour response in murine melanoma model // J. Control. Release, 2015, 213, 45-56.

31. Radchatawedchakoon W., Krajarng A., Niyomtham N., Watanapokasin R., Yingyongnarongkul B. High transfection efficiency of cationic lipids with asymmetric acyl-Cholesteryl hydrophobic tails // Chem. - A Eur. J., 2011, 17, 3287-3295.

32. Wang X.L., Ramusovic S., Nguyen T., Lu Z.R. Novel polymerizable surfactants with pH-sensitive amphiphilicity and cell membrane disruption for efficient siRNA delivery // Bioconjug. Chem., 2007, 18, 2169-2177.

33. Wang X.L., Nguyen T., Gillespie D., Jensen R., Lu Z.R. A multifunctional and reversibly polymerizable carrier for efficient siRNA delivery // Biomaterials, 2008, 29, 15-22.

34. Xu R., Lu Z.R. Design, synthesis and evaluation of spermine-based pH-sensitive amphiphilic gene delivery systems: Multifunctional non-viral gene carriers // Sci. China Chem., 2011, 54, 359-368.

35. Xu R.Z., Wang X.L., Lu Z.R. Intracellular siRNA delivery with novel spermine based surfactants // Chinese Sci. Bull., 2012, 57, 3979-3984.

36. Malamas A.S., Gujrati M., Kummitha C.M., Xu R., Lu Z.R. Design and evaluation of new pH-sensitive amphiphilic cationic lipids for siRNA delivery // J. Control. Release, 2013, 171, 296-307.

37. Dewa T. et al. Liposomal polyamine-dialkyl phosphate conjugates as effective gene

carriers: Chemical structure, morphology, and gene transfer activity // Bioconjug. Chem., 2010, 21, 844-852.

38. Asai T. et al. Dicetyl phosphate-tetraethylenepentamine-based liposomes for systemic siRNA delivery // Bioconjug. Chem., 2011, 22, 429-435.

39. Yonenaga N., Kenjo E., Asai T., Tsuruta A., Shimizu K., Dewa T., Nango M., Oku N. RGD-based active targeting of novel polycation liposomes bearing siRNA for cancer treatment // J. Control. Release, 2012, 160, 177-181.

40. Kenjo E. et al. Systemic delivery of small interfering RNA by use of targeted polycation liposomes for cancer therapy. // Biol. Pharm. Bull., 2013, 36, 287-291.

41. Mével M. et al. DODAG; a versatile new cationic lipid that mediates efficient delivery of pDNA and siRNA // J. Control. Release, 2010, 143, 222-232.

42. Mével M., Breuzard G., Yaouanc J.J., Clément J.C., Lehn P., Pichon C., Jaffrès P.A., Midoux P. Synthesis and transfection activity of new cationic phosphoramidate lipids: High efficiency of an imidazolium derivative // ChemBioChem, 2008, 9, 1462-1471.

43. Mével M., Neveu C., Gonçalves C., Yaouanc J.-J., Pichon C., Jaffrès P.-A., Midoux P. Novel neutral imidazole-lipophosphoramides for transfection assays. // Chem. Commun. (Camb)., 2008, 3124-3126.

44. Aissaoui A., Chami M., Hussein M., Miller A.D. Efficient topical delivery of plasmid DNA to lung in vivo mediated by putative triggered, PEGylated pDNA nanoparticles // J. Control. Release, 2011, 154, 275-284.

45. Kim B., Doh K., Hyeung J., Kang H., Park J., Moon I., Seu Y. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters Synthesis of novel cholesterol-based cationic lipids for gene delivery // Bioorg. Med. Chem. Lett., 2009, 19, 2986-2989.

46. Kim B.K., Seu Y.B., Bae Y.U., Kwak T.W., Kang H., Moon I.J., Hwang G.B., Park S.Y., Doh K.O. Efficient delivery of plasmid DNA using cholesterol-based cationic lipids containing polyamines and ether linkages // Int. J. Mol. Sci., 2014, 15, 7293-7312.

47. Kim B.K., Doh K.O., Bae Y.U., Seu Y.B. Synthesis and optimization of cholesterol-based diquaternary ammonium gemini surfactant (Chol-GS) as a new gene delivery vector // J. Microbiol. Biotechnol., 2011, 21, 93-99.

48. Sparks J. et al. Versatile cationic lipids for siRNA delivery // J. Control. Release, 2012, 158, 269-276.

49. Paecharoenchai O., Niyomtham N., Apirakaramwong A., Ngawhirunpat T., Rojanarata T., Yingyongnarongkul B., Opanasopit P. Structure Relationship of Cationic Lipids on Gene Transfection Mediated by Cationic Liposomes // AAPS PharmSciTech, 2012, 13, 13021308.

50. Niyomtham N., Apiratikul N., Suksen K., Opanasopit P., Yingyongnarongkul B. Synthesis and in vitro transfection efficiency of spermine-based cationic lipids with different central core structures and lipophilic tails // Bioorg. Med. Chem. Lett., 2015, 25, 496-503.

51. Akinc A. et al. A combinatorial library of lipid-like materials for delivery of RNAi therapeutics // Nat. Biotechnol., 2008, 26, 561-569.

52. Mahon K.P., Love K.T., Whitehead K.A., Qin J., Akinc A., Leshchiner E., Leshchiner I., Langer R., Anderson D.G. Combinatorial approach to determine functional group effects on lipidoid-mediated siRNA delivery // Bioconjug. Chem., 2010, 21, 1448-1454.

53. Park H.-J. et al. Galactosylated Lipidoid Nanoparticles for Delivery of Small Interfering RNA to Inhibit Hepatitis C Viral Replication In Vivo // Adv. Healthc. Mater., 2016, 1-11.

54. Huang Q.D., Ou W.J., Chen H., Feng Z.H., Wang J.Y., Zhang J., Zhu W., Yu X.Q. Novel cationic lipids possessing protonated cyclen and imidazolium salt for gene delivery // Eur. J. Pharm. Biopharm., 2011, 78, 326-335.

55. Huang Q.-D., Ren J., Chen H., Ou W.-J., Zhang J., Fu Y., Zhu W., Yu X.-Q. Cyclen-Based Cationic Lipids Containing Carbamate Linkages as Efficient Gene Delivery Vectors with Low Toxicity // Chempluschem, 2012, 77, 584-591.

56. Liu J.L., Ma Q.P., Huang Q.D., Yang W.H., Zhang J., Wang J.Y., Zhu W., Yu X.Q. Cationic lipids containing protonated cyclen and different hydrophobic groups linked by uracil-PNA monomer: Synthesis and application for gene delivery // Eur. J. Med. Chem., 2011, 46, 4133-4141.

57. Liu Q., Jiang Q.-Q., Yi W.-J., Zhang J., Zhang X.-C., Wu M.-B., Zhang Y.-M., Zhu W., Yu X.-Q. Novel imidazole-functionalized cyclen cationic lipids: Synthesis and application as non-viral gene vectors // Bioorg. Med. Chem., 2013, 21, 3105-3113.

58. Chang D.-C., Zhang Y.-M., Zhang J., Liu Y.-H., Yu X.-Q. Cationic lipids with a cyclen headgroup: synthesis and structure-activity relationship studies as non-viral gene vectors // RSC Adv., 2017, 7, 18681-18689.

59. Li L., Song H., Luo K., He B., Nie Y., Yang Y., Wu Y., Gu Z. Gene transfer efficacies of serum-resistant amino acids-based cationic lipids: Dependence on headgroup, lipoplex stability and cellular uptake // Int. J. Pharm., 2011, 408, 183-190.

60. Sheng R., Luo T., Li H., Sun J., Wang Z., Cao A. Cholesterol-based cationic lipids for gene delivery: Contribution of molecular structure factors to physico-chemical and biological properties // Colloids Surfaces B Biointerfaces, 2014, 116, 32-40.

61. Ju J., Huan M L., Wan N., Qiu H., Zhou S.Y., Zhang B. Le. Novel cholesterol-based cationic lipids as transfecting agents of DNA for efficient gene delivery // Int. J. Mol. Sci.,

2015, 16, 5666-5681.

62. Sheng R., Wang Z., Luo T., Cao A., Sun J., Kinsella J. Skeleton-Controlled pDNA Delivery of Renewable Steroid-Based Cationic Lipids, the Endocytosis Pathway Analysis and Intracellular Localization // Int. J. Mol. Sci., 2018, 19, 369.

63. Obata Y., Suzuki D., Takeoka S. Evaluation of cationic assemblies constructed with amino acid based lipids for plasmid DNA delivery // Bioconjug. Chem., 2008, 19, 10551063.

64. Jiang Q., Yue D., Nie Y., Xu X., He Y., Zhang S., Wagner E., Gu Z. Specially-Made Lipid-Based Assemblies for Improving Transmembrane Gene Delivery: Comparison of Basic Amino Acid Residue Rich Periphery // Mol. Pharm., 2016, 13, 1809-1821.

65. Choi J.S., Lee E.J., Jang H.S., Park J.S. New Cationic Liposomes for Gene Transfer into Mammalian Cells with High Efficiency and Low Toxicity // Bioconjug. Chem., 2001, 12, 108-113.

66. Sarker S.R., Arai S., Murate M., Takahashi H., Takata M., Kobayashi T., Takeoka S. Evaluation of the influence of ionization states and spacers in the thermotropic phase behaviour of amino acid-based cationic lipids and the transfection efficiency of their assemblies // Int. J. Pharm., 2012, 422, 364-373.

67. Sarker S.R., Aoshima Y., Hokama R., Inoue T., Sou K., Takeoka S. Arginine-based cationic liposomes for efficient in vitro plasmid DNA delivery with low cytotoxicity // Int. J. Nanomedicine, 2013, 8, 1361-1375.

68. Radchatawedchakoon W., Thongbamrer C., Konbamrung W., Khattawee P., Sakee U., Roobsoong W., Sattabongkot J., Opanasopit P., Yingyongnarongkul B.E. The effect of polar headgroups and spacer length on the DNA transfection of cholesterol-based cationic lipids // RSC Med. Chem., 2020, 11, 212-224.

69. Yi W.J., Zheng L.T., Su R.C., Liu Q., Zhao Z.G. Amino Acid-Based Cationic Lipids with a-Tocopherol Hydrophobic Tail for Efficient Gene Delivery // Chem. Biol. Drug Des., 2015, 86, 1192-1202.

70. Ewert K., Ahmad A., Evans H.M., Schmidt H.W., Safinya C.R. Efficient synthesis and cell-transfection properties of a new multivalent cationic lipid for nonviral gene delivery // J. Med. Chem., 2002, 45, 5023-5029.

71. Ahmad A., Evans H.M., Ewert K., George C.X., Samuel C.E., Safinya C.R. New multivalent cationic lipids reveal bell curve for transfection efficiency versus membrane charge density: Lipid - DNA complexes for gene delivery // J. Gene Med., 2005, 7, 739748.

72. Bouxsein N.F., McAllister C.S., Ewert K.K., Samuel C.E., Safinya C.R. Structure and

gene silencing activities of monovalent and pentavalent cationic lipid vectors complexed with siRNA // Biochemistry, 2007, 46, 4785-4792.

73. Martínez-Negro M., Blanco-Fernández L., Tentori P.M., Pérez L., Pinazo A., de Ilarduya C.T., Aicart E., Junquera E. A gemini cationic lipid with histidine residues as a novel lipid-based gene nanocarrier: A biophysical and biochemical study // Nanomaterials, 2018, 8, 17-20.

74. Pinazo A., Pons R., Bustelo M., Manresa M.Á., Morán C., Raluy M., Pérez L. Gemini histidine based surfactants: Characterization; surface properties and biological activity // J. Mol. Liq., 2019, 289.

75. Ostergaard H., Tachibana C., Winther J.R. Monitoring disulfide bond formation in the eukaryotic cytosol // J. Cell Biol., 2004, 166, 337-345.

76. Chen X., Yang J., Liang H., Jiang Q., Ke B., Nie Y. Disulfide modified self-assembly of lipopeptides with arginine-rich periphery achieve excellent gene transfection efficiency at relatively low nitrogen to phosphorus ratios // J. Mater. Chem. B, 2017, 5, 1482-1497.

77. Dauty E., Remy J.S., Blessing T., Behr J.P. Dimerizable cationic detergents with a low cmc condense plasmid DNA into nanometric particles and transfect cells in culture // J. Am. Chem. Soc., 2001, 123, 9227-9234.

78. Zheng L.-T., Yi W.-J., Su R.-C., Liu Q., Zhao Z.-G. Reducible amino acid based cationic lipids as highly efficient and serum-tolerant gene vectors // Chempluschem, 2016, 81, 125-134.

79. Shirazi R.S., Ewert K.K., Leal C., Majzoub R.N., Bouxsein N.F., Safinya C.R. Synthesis and characterization of degradable multivalent cationic lipids with disulfide-bond spacers for gene delivery // Biochim. Biophys. Acta - Biomembr., 2011, 1808, 2156-2166.

80. Sheng R., Luo T., Zhu Y., Li H., Sun J., Chen S., Sun W., Cao A. The intracellular plasmid DNA localization of cationic reducible cholesterol-disulfide lipids // Biomaterials, 2011, 32, 3507-3519.

81. Bajaj A., Kondaiah P., Bhattacharya S. Effect of the nature of the spacer on gene transfer efficacies of novel thiocholesterol derived gemini lipids in different cell lines: a structure-activity investigation. // J. Med. Chem., 2008, 51, 2533-2540.

82. Sanchez A., Pensado A. Current strategies for DNA therapy based on lipid nanocarriers // Expert Opin. Drug Deliv., 2014, 11, 1721-1731.

83. Godbey W.T., Mikos A.G. Recent progress in gene delivery using non-viral transfer complexes // J. Control. Release, 2001, 72, 115-125.

84. Kirby A.J. et al. Gemini surfactants: New synthetic vectors for gene transfection // Angew. Chemie - Int. Ed., 2003, 42, 1448-1457.

85. Boomer J.A., Thompson D.H., Sullivan S.M. Formation of plasmid-based transfection complexes with an acid-labile cationic lipid: Characterization of in vitro and in vivo gene transfer // Pharm. Res., 2002, 19, 1292-1301.

86. Zellmer S., Cevc G. Tumor targeting in vivo by means of thermolabile fusogenic liposomes // J. Drug Target., 1996, 4, 19-29.

87. Jaeger D.A., Reddy V.B., Bohle D.S. Cleavable double-chain surfactant Co(III) complexes // Tetrahedron Lett., 1999, 40, 649-652.

88. Zheng Y., Guo Y., Li Y., Wu Y., Zhang L., Yang Z. A novel gemini-like cationic lipid for the efficient delivery of siRNA // New J. Chem., 2014, 38, 4952-4962.

89. Luciani P., Bombelli C., Colone M., Giansanti L., Ryhänen S.J., Säily V.M.J., Mancini G., Kinnunen P.K.J. Influence of the spacer of cationic gemini amphiphiles on the hydration of lipoplexes // Biomacromolecules, 2007, 8, 1999-2003.

90. Munoz-Ubeda M. et al. How does the spacer length of cationic gemini lipids influence the lipoplex formation with plasmid DNA? physicochemical and biochemical characterizations and their relevance in gene therapy // Biomacromolecules, 2012, 13, 3926-3937.

91. Ghosh Y.K., Visweswariah S.S., Bhattacharya S. Nature of linkage between the cationic headgroup and cholesteryl skeleton controls gene transfection efficiency. // FEBS Lett., 2000, 473, 341-344.

92. Obata Y., Saito S., Takeda N., Takeoka S. Plasmid DNA-encapsulating liposomes: Effect of a spacer between the cationic head group and hydrophobic moieties of the lipids on gene expression efficiency // Biochim. Biophys. Acta - Biomembr., 2009, 1788, 11481158.

93. Thomas T.J., Tajmir-Riahi H.A., Thomas T. Polyamine-DNA interactions and development of gene delivery vehicles // Amino Acids, 2016, 48, 2423-2431.

94. Fukuyama T., Jow C.K., Cheung M. 2- and 4-Nitrobenzenesulfonamides: Exceptionally versatile means for preparation of secondary amines and protection of amines // Tetrahedron Lett., 1995, 36, 6373-6374.

95. Xia L., Tong S., Jiang Y., Jia Y., Wang J. Interfacial chemistry behavior of phase transfer catalysis for hydroxide ion initiated reactions // Colloids Surfaces A Physicochem. Eng. Asp., 2008, 317, 747-750.

96. Bracher F., Litz T. 9-Borabicyclo[3.3.1]nonane (9-BBN) in organic synthesis // J. fur Prakt. Chemie/Chemiker-Zeitung, 1996, 338, 386-389.

97. Medvedeva D.A., Maslov M.A., Serikov R.N., Morozova N.G., Serebrenikova G.A., Sheglov D. V., Latyshev A. V., Vlassov V. V., Zenkova M.A. Novel cholesterol-based

cationic lipids for gene delivery // J. Med. Chem., 2009, 52, 6558-6568.

98. Nagy P. Kinetics and Mechanisms of Thiol-Disulfide Exchange Covering Direct Substitution and Thiol Oxidation-Mediated Pathways // Antioxid. Redox Signal., 2013, 18, 1623-1641.

99. Futaki S., Kitagawa K. Peptide-unit assembling using disulfide cross-linking: A new approach for construction of protein models // Tetrahedron Lett., 1994, 35, 1267-1270.

100. Kunishima M., Kawachi C., Iwasaki F., Terao K., Tani S. Synthesis and characterization of 4-(4,6-dimethoxy-1,3,5-triazin-2-yl)-4-methylmorpholinium chloride // Tetrahedron Lett., 1999, 40, 5327-5330.

101. Kunishima M., Kawachi C., Morita J., Terao K., Iwasaki F., Tani S. 4-(4,6-Dimethoxy-1,3,5-triazin-2-yl)-4-methylmorpholinium chloride: An efficient condensing agent leading to the formation of amides and esters // Tetrahedron, 1999, 55, 13159-13170.

102. Meure L.A., Foster N.R., Dehghani F. Conventional and dense gas techniques for the production of liposomes: A review // AAPS PharmSciTech, 2008, 9, 798-809.

103. Aljaberi A., Spelios M., Kearns M., Selvi B., Savva M. Physicochemical properties affecting lipofection potency of a new series of 1,2-dialkoylamidopropane-based cationic lipids // Colloids Surfaces B Biointerfaces, 2007, 57, 108-117.

104. Zhang X.X., McIntosh T.J., Grinstaff M.W. Functional lipids and lipoplexes for improved gene delivery // Biochimie, 2012, 94, 42-58.

105. Rao N.M., Gopal V. Cell biological and biophysical aspects of lipid-mediated gene delivery // Bioscience Reports, 2006, 26, 301-324.

106. DeGraff W.G., Mitchell J.B. Evaluation of a Tetrazolium-based Semiautomated Colorimetric Assay: Assessment of Chemosensitivity Testing // Cancer Res., 1987, 47, 936-942.

107. Ke N., Wang X., Xu X., Abassi Y.A. The xCELLigence system for real-time and labelfree monitoring of cell viability. // Methods Mol. Biol. / ed. Clifton N.J., 2011, 740, 3343.

108. Fire A., Xu S., Montgomery M.K., Kostas S.A., Driver S.E., Mello C.C. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans // Nature, 1998, 391, 806-811.

109. Saily V.M.J., Ryhanen S.J., Lankinen H., Luciani P., Mancini G., Parry M.J., Kinnunen P.K.J. Impact of reductive cleavage of an intramolecular disulfide bond containing cationic gemini surfactant in monolayers and bilayers // Langmuir, 2006, 22, 956-962.

110. Cheng R., Feng F., Meng F., Deng C., Feijen J., Zhong Z. Glutathione-responsive nano-vehicles as a promising platform for targeted intracellular drug and gene delivery // J.

Control. Release, 2011, 152, 2-12.

111. Byk G., Wetzer B., Frederic M., Dubertret C., Pitard B., Jaslin G., Scherman D. Reduction-sensitive lipopolyamines as a novel nonviral gene delivery system for modulated release of DNA with improved transgene expression // J. Med. Chem., 2000, 43, 4377-4387.

112. Hermanson G.T. Functional Targets for Bioconjugation // Bioconjugate Techniques, 2013, 127-228.

113. Even-Chen S., Cohen R., Barenholz Y. Factors affecting DNA binding and stability of association to cationic liposomes // Chem. Phys. Lipids, 2012, 165, 414-423.

114. Smoluk G.D., Fahey R.C., Ward J.F. Interaction of glutathione and other low-molecular-weight thiols with DNA: evidence for counterion condensation and coion depletion near DNA. // Radiat. Res., 1988, 114, 3-10.

115. Li R.Q., Hu Y., Yu B.R., Zhao N.N., Xu F.J. Bioreducible Comb-Shaped Conjugates Composed of Secondary Amine and Hydroxyl Group-Containing Backbones and Disulfide- Linked Side Chains with Tertiary Amine Groups for Facilitating Gene Delivery // Bioconjug. Chem., 2014, 25, 155-164.

116. Kritchevsky D., Kirk M.R. Detection of steroids in paper chromatography // Arch. Biochem. Biophys., 1952, 35, 346-351.

117. Wall P.E. Thin-layer Chromatography - A Modern Practical Approach // Science, Cambridge: The Royal Society of Chemistry, 2005, 184 p.

118. Petukhov I.A., Maslov M.A., Morozova N.G., Serebrennikova G.A. Synthesis of polycationic lipids based on cholesterol and spermine // Russ. Chem. Bull., 2010, 59, 260268.

119. Ui-Tei K., Naito Y., Takahashi F., Haraguchi T., Ohki-Hamazaki H., Juni A., Ueda R., Saigo K. Guidelines for the selection of highly effective siRNA sequences for mammalian and chick RNA interference. // Nucleic Acids Res., 2004, 32, 936-948.