Изучение молекулярно-механических свойств микротрубочек и развиваемых ими сил тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.02, кандидат биологических наук Молодцов, Максим Игоревич

• Молодцов, Максим Игоревич
• кандидат биологических наук
• 2007

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Молодцов, Максим Игоревич

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 Деление клетки и движение хромосом.

1.2 Современные представления о структуре и динамике микротрубочек.

1.2.1 Структура микротрубочки.

1.2.2 Динамика микротрубочки.

1.2.3 Структурная основа динамической нестабильности.

1.3 Математические модели динамики и механики микротрубочек.

1.3.1 Кинетические модели.

1.3.2 Ста, развиваемая микротрубочкой.

1.3.3 Термодинамические оценки.

1.3.4 Модели сопряжения микротрубочки с кинетохором.

1.4 Экспериментальные исследования сил, развиваемых микротрубочками.

1.5 Измерение малых сил с помощью оптической ловушки.

1.6 Постановка задачи.

ГЛАВА 2. МАТЕМАТИЧЕСКАЯ МОДЕЛЬ.

2.1 Описание модели.

2.2 Описание потенциалов продольных взаимодействий.

2.3 Описание латеральных взаимодействий.

2.4 Полная потенциальная энергия МТ.

2.6 Расчет равновесной силы, развиваемой микротрубочкой.

2.7 Оценка жесткостей продольных и поперечных связей.

2.8 Модель, используемая в эксперименте.

ГЛАВА 3. МЕТОДЫ.

3.1 Численный метод.

3.2 Линеаризация уравнений основной модели.

3.2.1 Микротрубочка без спиральности.

3.2.2 Переход к другим переменным.

3.2.3 Модель одного протофиламента.

3.2.4 Линеаризация уравнений равновесия.

3.3 Экспериментальные методы и материалы исследования.

3.3.1 Описание установки.

3.3.2 Схема эксперимента.

3.3.3 Приготовление тубулина и нуклиирующих ifeumpoe.

3.3.4 Проточная камера.

3.3.5 Подготовка камеры к эксперименту.

3.3.6 Обработка экспериментальных данных.

ГЛАВА 4. РЕЗУЛЬТАТЫ.

4.1 Стабильность МТ с Т-шапкой и без.

4.2 Баланс изгибающих сил в стенке микротрубочки.

4.3 Локальность взаимодействий внутри стенки МТ.

4.4 Форма кончика микротрубочки.

4.5 Характеристика стабильности МТ.

4.6 Параметры, влияющие на стабильность.

4.7 Разница между плюс и минус концами.

4.8 Микротрубочка 133 немного менее стабильна, чем 130.

4.9 Независимость главных выводов от параметров, описывающих силы

4.10 Катастрофа при наличии удерживающего кольца.

4.11 Развитие силы протофиламентом.

4.12 Влияние латеральных потенциалов на развитие сил.

4.13 Оценка максимальной силы, развиваемой микротрубочкой.

ГЛАВА 5. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

5.1 Обсуждение теоретической части работы.

5.2 Обсуждение экспериментальной части работы.

ГЛАВА 6. ВЫВОДЫ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Изучение молекулярно-механических свойств микротрубочек и развиваемых ими сил»

Микротрубочки являются важнейшими компонентами цитоскелета эукариотических клеток. Они участвуют в поддержании клеточной формы, движении, а так же перемещении органелл, включая митотические хромосомы. Микротрубочки не только взаимодействуют с моторными белками, выполняющими работу по перемещению, но и сами способны совершать работу. Хромосомы расходятся по дочерним клеткам во время митоза, взаимодействуя с микротрубочками митотического веретена. Плюс концы микротрубочек связывают кинетохоры - специальные образования на хромосомах, соответствующие центромерному участку. Во время прометафазы хромосомы связанные с микротрубочками перемещаются в сторону к полюсу или прочь, а затем во время метафазы выстраиваются в метафазную пластинку. Сестринские хроматиды расщепляются во время анафазы и хромосомы движутся к полюсам. Во время всех этих перемещений связанные с кинетохорами микротрубочки изменяют свою длину, добавляя или теряя субъединицы на их плюс конце, в месте соединения с кинетохором, в том же самом месте, где кинетохор скользит по поверхности микротрубочки. Хотя в последние годы был сделан существенный прогресс, и многие белки входящие в состав кинетохоров известны, понимание молекулярных основ генерации сил в митозе по-прежнему отсутствует. Каким образом развиваются силы, которые перемещают хромосомы на молекулярном уровне - старейший вопрос исследователей митоза по-прежнему не имеет однозначного ответа. Полимеризующиеся и деполимеризующиеся микротрубочки можно рассматривать как молекулярные машины, которые выполняют работу, толкая или таща за собой объекты, благодаря энергии гидролиза ГТФ выделяемой во время полимеризации. По сравнению с полимеризацией, где теоретические представление весьма хорошо разработаны, механизм, в результате которого развивается тянущая сила при деполимеризации остается по большей части не ясным. Отчасти это связано с принципиальной трудностью представления устройства, которое бы позволило объекту следовать за концом деполимеризующейся микротрубочки, не теряя механического контакта. Существует две принципиальных модели описывающих подобное сочленение, но у обоих отсутствует количественное описание. Что касается величин развиваемых сил, то существующие оценки, основанные на энергии ГТФ гидоролиза или константах скорости полимеризации-деполимеризации тубулина, чрезвычайно грубы. Из-за такой неопределенности вклад динамики микротрубочек в движения хромосом до сих пор был не ясен.

Целью данной работы было теоретическое и экспериментальное исследование сил, развиваемых микротрубочкой во время деполимеризации. Мы хотели создать наиболее полную модель, которая бы позволила количественно определять силы, которые микротрубочки могут развивать, основываясь на описаниях потенциалов взаимодействия между молекулами тубулина, а так же рассчитывать уже существующие не количественные модели. Второй целью работы явилось сравнение теории и эксперимента -прямое измерение развиваемой силы.

Цель работы: Разработка модели микротрубочки позволяющей рассчитывать силу, развиваемую в процессе деполимеризации микротрубочки и ее экспериментальная проверка.

Задачи исследования:

1. Создать количественную модель микротрубочки, основываясь на последних данных о ее структуре, кинетики деполимеризации и свойствах составляющих мономеров.

2. С помощью модели определить силу, развиваемую микротрубочкой в процессе деполимеризации

3. Проанализировать свойства сопрягающего устройства, необходимого для наиболее эффективного развития силы

4. Экспериментально измерить силу, и сравнить с теорией

Научная новизна:

Мы разработали молекулярно-механическую математическую модель микротрубочки. Мы показали, что концы микротрубочек слегка изогнуты, не достаточно, чтобы это можно было увидеть при помощи электронной микроскопии, но достаточно для того, чтобы их могли узнавать специализированные белки. Мы показали, что баланс продольных взаимодействий в протофиламентах ответственен за стабильность основной части микротрубочки, а не наличие поперечных связей. Мы проанализировали размер ГТФ шапки и нашли, что двух слоев ГТФ тубулина достаточно, чтобы стабилизировать микротрубочку любой длины в большинстве случаев.

Усовершенствованная модель, которая описывает взаимодействие с сопрягающим устройством, позволила рассчитать максимальную силу, которую может развивать микротрубочка. Мы показали, что вся энергия, выделяемая в результате гидролиза молекул ГТФ во время полимеризации, может быть запасена в стенке микротрубочки и использована для генерации сил. Максимальное использование запасенной энергии достигается при развитии силы по механизму удара (power-stroke mechanism). Максимальная сила составляет 75 пН для полной микротрубочки. Эта сила достигается только при полной диссоциации латеральных связей димеров развивающих усилие. Если сопряжение достигается посредством кольца, то в диаметре оно должно быть на 10 нм больше внешнего диаметра микротрубочки, для того, чтобы развиваемое усилие было максимально.

Мы разработали и построили оптическую ловушку для того, чтобы непосредственно впервые измерить величину силы развиваемой микротрубочкой во время деполимеризации. Мы получили спектр развиваемых сил, разной величины. Максимальная развиваемая сила оказалась в точности равной рассчитанной теоретически. Механо-химический механизм развития силы оказался уникальным: молекулы тубулина, из которых состоят стенки микротрубочек, при полимеризации присоединяются к растущей трубочке в «выпрямленной» конформации, и в связанном с ГТФ состоянии. После полимеризации происходит расщепление ГТФ и выделившаяся энергия запасается в «напряженном» состоянии тубулина. При этом каждая молекула тубулина стремиться выгнуться наружу из стенки трубочки. Это напряжение, высвобождаясь в процессе деполимеризации микротрубочки, может развивать значительные силы и совершать работу по движению хромосом, если разбирающийся конец микротрубочки соединен с хромосомой соответствующим устройством сопряжения. Измеренная нами сила велика и составляет примерно десять сил, развиваемых единичным моторным белком. Из этого следует, что данный механизм может быть основным в движении хромосом во время митоза. Мы промоделировали эксперимент, модернизировав разработанную нами модель и нашли, что спектр различных амплитуд сил, наблюдаемых в эксперименте соответствует различным сценариям разрушения связей между протофиламентами во время деполимеризации. Трещины между протофиламентами могут распространяться, оставляя 2 или 3 или другое число протофиламентов в отдельной связке, которая развалится позже, определяя амплитуду развиваемой силы. Этот результат означает, что развитие силы на не симметричном устройстве, как это было у нас в эксперименте, может быть случайным образом снижено из-за асинхронности разборки микротрубочки. В некоторых из наших экспериментов в результате наличия натяжения продольные связи в протофиламентах существую дольше, чем обычно при разборке микротрубочек, стабилизируемые натяжением. Это может означать наличие специального механизма, который бы позволял сохранять соединение кинетохора с микротрубочкой в то время, когда сила, приложенная к хромосоме в стороны противоположенного полюса велика.

Научно-практическое значение:

Исследование механизмов деления клеток имеет принципиально важное значение для исследования развития раковых заболеваний. Понимание процессов протекающих во время митоза и их механизмов может помочь в создании анти-раковых препаратов и методик лечения. Результатом данной работы является вклад в понимание важности и существенности динамики микротрубочек в движение хромосом во время деления.

Положения, выносимые на защиту:

1. Построена оригинальная молекулярно-механическая модель микротрубочки.

2. С помощью модели рассчитана сила, развиваемая микротрубочкой в процессе деполимеризации. Рассмотрены различные механизмы сопряжения с передающим устройством.

3. Сила, развиваемая микротрубочкой, измерена экспериментально. Ее величина составила 60 пН, что находится в прекрасном согласии с теорией.

4. Механизм развития силы уникален и являет собой новый тип биомеханического движителя.

Заключение диссертации по теме «Биофизика», Молодцов, Максим Игоревич

ГЛАВА 6. ВЫВОДЫ

1. Разработана молекулярно-механическая модель микротрубочки, которая позволила проанализировать стабильность и форму микротрубочки и понять, какие механические силы могут развиваться при ее деполимеризации.

2. Рассчитана максимальная сила, развиваемая микротрубочкой. Она составила 75 пН. Показано, что вся запасенная в стенке микротрубочки энергия гидролиза ГТФ может быть использована для генерации сил, т.е. микротрубочка может действовать, как молекулярная машина с КПД близким к 100%.

3. Экспериментально измерена сила, развиваемая при деполимеризации одиночной микротрубочки. Ее величина составляет 30 - 60 пН, что в 10 раз больше силы, развиваемой моторным белком кинезином, и, следовательно, деполимеризация микротрубочек может служить основной силой, движущей хромосомы в митозе.

4. Обнаружено, что приложенное к микротрубочке натяжение стабилизирует ее от деполимеризации.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Молодцов, Максим Игоревич, 2007 год

1. Алов И.А. Цитофизиология и патология митоза. 1972. «Медицина». Москва.

2. Abbondanzieri, Е.А., Greenleaf W.J., Shaevitz J.W., Landick R., and S.M. Block. 2004. Direct observation of base-pair stepping by RNA polymerase. Nature. 438(7067):460-465.

3. Alberts, В., A. Johnson, J. Lewis, M. Ra, K. Roberts, and P. Walter. 2002. Molecular Biology of The Cell. Garland Publishing, New York, 4th edition.

4. Ashkin, A. 1970. Acceleration and trapping of particles by radiation pressure. Phys.Rev. Lett. 24:156-159.

5. Bayley, P., M. Schilstra, and S. Martin. 1989. A lateral cap model of microtubule dynamic instability. FEBS Lett. 259:181-184.

6. Caplow M., and J. Shanks. 1990. Mechanism of the microtubule GTPase reaction. J Biol Chem, 265:8935-8941.

7. Caplow, M., and J. Shanks. 1996. Evidence that a single monolayer tubulin-GTP cap is both necessary and sufficient to stabilize microtubules. Mol. Biol. Cell 7:663-675.

8. Chen, Y.D., and T.L. Hill. 1985. Monte Carlo study of the GTP cap in a five-start helix model of a microtubule. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82:1131-1135.

9. Chretien, D., H. Flyvbjerg, and S.D. Fuller. 1998. Limited flexibility of the inter-protofilament bonds in microtubules assembled from pure tubulin. Eur. Biophys. J. 27:490-500.

10. Chretien, D., S.D. Fuller, and E. Karsenti. 1995. Structure of growing microtubule ends: two-dimensional sheets close into tubes at variable rates. J. Cell Biol. 129:1311-1328.

11. Coue, M., Lombillo, V. A. & Mcintosh, J. R. 1991. Microtubule depolymerization promotes particle and chromosome movement in vitro. J Cell Biol 112,1165-75.

12. Desai, A., and T.J. Mitchison. 1997. Microtubule polymerization dynamics. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 13:83-117.

13. Dogterom M., and Yurke B. 1997. Measurement of the force-velocity relation for growing microtubules. Science. 278:856-860.

14. Erickson, H.P., and E.T. O'Brien. 1992. Microtubule dynamic instability and GTP hydrolysis. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 21:145-166.

15. Fygenson, D.K., E. Braun, and A. Libchaber. 1994. Phase diagram of microtubules. Phys Rev E. 50:1579-1588.

16. Gelles, J., B.J. Schnapp, and M.P. Sheetz. 1988. Tracking kinesin-driven movements with nanometre-scale precision. Nature. 331(6155):450-453.

17. Gildersleeve, R.F., A.R. Cross, K.E. Cullen, A.P. Fagen, and R.C. Williams Jr. 1992. Microtubules grow and shorten at intrinsically variable rates. J. Biol. Chem. 267:7995-8006.

18. Grishchuk E.L., Molodtsov M.I., Mcintosh J.R., and Ataullakhanov F.I. Force production by disassembling microtubules. 2005. Nature. 438:384-388.

19. Hirose, K., J. Fan, and L.A. Amos. 1995. Re-examination of the polarity of microtubules and sheets decorated with kinesin motor domain. J Mol Biol. 251:329-333.

20. Hill, T. 1985. Theoretical problems related to the attachment of microtubules to kinetochores. Proc. Natl. Acad. Sci. 82,4404-4408.

21. Hill, T.L., and M.W. Kirschner. 1982. Bioenergetics and kinetics of microtubule and actin filament assembly-disassembly. Int. Rev. Cytol. 78:1125.

22. Hill, T.L., and Y. Chen. 1984. Phase changes at the end of a microtubule with a GTP cap. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 81:5772-5776.

23. Horio Т., and Hotani H. 1986. Visualization of the dynamic instability of individual microtubules by dark-field microscopy. Nature. 321:605-607.

24. Howard, J. 2001. Mechanics of motor proteins and the cytoskeleton. Sinauer Associates.

25. Hunt, A.J. and J.R. Mcintosh. 1998. The dynamic behavior of individual microtubules associated with chromosomes in vitro. Mol. Biol. Cell. 9:28572871.

26. Hyman A.A., and Mitchison T.J. , 1991. Two different microtubule-based motor activities with opposite polarities in kinetochores. Nature. 351(6323):206-211.

27. Hyman, A.A., S. Salser, D.N. Drechsel, N. Unwin, and T.J. Mitchison. 1992. Role of GTP hydrolysis in microtubule dynamics: information from a slowly hydrolyzable analogue, GMPCPP. Mol. Biol. Cell 3:1155-1167.

28. Hyman, A.A., D. Chretien, I. Arnal, R.H. Wade. 1995. Structural changes accompanying GTP hydrolysis in microtubules: information from a slowly hydrolyzable analogue guanylyl-(alpha,beta)-methylene-diphosphonate.J Cell Biol. 128:117-125.

29. Inoue S., Fuseler J., Salmon E.D., and Ellis G.W. 1975. Functional organization of mitotic microtubules. Physical chemistry of the in vivo equilibrium system. Biophys J. 15:725-744.

30. Inoue S., and Salmon E.D. 1995. Force generation by microtubule assembly/disassembly in mitosis and related movements. Mol Biol Cell. 6:1619-1640.

31. Janosi, I.M., D. Chretien, and H. Flyvbjerg. 1998. Modeling elastic properties of microtubule tips and walls. Eur. Biophys. J. 27:501-513.

32. Janosi, I.M., D. Chretien, and H. Flyvbjerg. 2002. Structural microtubule cap: stability, catastrophe, rescue, and third state. Biophys. J. 83:1317-1330.

33. Janson M.E, and Dogterom M. 2004a. Scaling of microtubule force-velocity curves obtained at different tubulin concentrations. Phys Rev Lett. 92:248101.

34. Janson M.E, and Dogterom M. 2004b. A bending mode analysis for growing microtubules: evidence for velocity-dependent rigidity. Biophys. J. 87:27232736.

35. Jiang, L., Y. Gao, F. Mao, Z. Liu, and L. Lai. 2002. Potential of mean force for protein-protein interaction studies. Proteins. 46:190-196.

36. Joglekar, A.P. and A.J. Hunt. 2002. A simple, mechanistic model for directional instability during mitotic chromosome movements. Biophys. J. 83:42-58.

37. Johnson, K.A., and G.G. Borisy. 1979. Thermodynamic analysis of microtubule self-assembly in vitro. J. Mol. Biol. 133:199-216.

38. Kikkawa M., Ishikawa Т., Nakata Т., Wakabayashi Т., and Hirokawa N. 1994. Direct visualization of the microtubule lattice seam both in vitro and in vivo. J Cell Biol. 127:1965-1971.

39. Koshland D. E., Mitchison, T. J. and Kirschner M. W. 1988. Polewards chromosome movement driven by microtubule depolymerization in vitro. Nature. 331:499-504.

40. Lehninger, A. L., Nelson, D. L. and Cox, M. M. 1993. Principles of Biochemistry (NY:Worth. 2nd ed.), p.377.

41. Li, H., D.J. DeRosier, W.V. Nicholson, E. Nogales, and K.H. Downing. 2002. Microtubule structure at 8 A resolution. Structure (Camb). 10:1317-1328 .

42. Lombillo, V. A., Stewart, R. J. and Mcintosh, J. R. 1995. Minus-end-directed motion of kinesin-coated microspheres driven by microtubule depolymerization. Nature 373,161-164.

43. Mandelkow, E.M., and E. Mandelkow. 1985. Unstained microtubules studied by cryo-electron microscopy. Substructure, supertwist and disassembly. J. Mol. Biol. 181:123-135.

44. Mandelkow, E.M., E. Mandelkow, and R.A. Milligan. 1991. Microtubule dynamics and microtubule caps: a time-resolved cryo-electron microscopy study. J. Cell Biol. 114:977-991.

45. Martin, S.R., M.J. Schilstra, and P.M. Bayley. 1993. Dynamic instability of microtubules: Monte Carlo simulation and application to different types of microtubule lattice. Biophys. J. 65:578-596.

46. Mcintosh J.R., Grishchuk E.L., and West R.R. 2002. Chromosome-microtubule interactions during mitosis. Annu Rev Cell Dev Biol.l8:193-219.

47. Mehta A.D., Pullen K.A., and J.A. Spudich. 1998. Single molecule biochemistry using optical tweezers. FEBS Lett. 430:23-27.

48. Meurer-Grob, P., J. Kasparian, and R.H. Wade. 2001. Microtubule structure at improved resolution. Biochemistry. 40:8000-8008.

49. Mitchison T.J., Evans L., Schulze E., and Kirschner M. 1986. Sites of microtubule assembly and disassembly in the mitotic spindle. Cell. 45:515527.

50. Mitchison T.J. 1989. Polewards microtubule flux in the mitotic spindle: evidence from photoactivation of fluorescence. J. Cell Biol. 109:637-652.

51. Mitchison T.J. 1993. Localization of an exchangeable GTP binding site at the plus end of microtubules. Science. 261:1044-1047.

52. Mitchison, Т., and M. Kirschner. 1984. Dynamic instability of microtubule growth Nature. 312:237-242.

53. Mogilner, A. and Oster, G. 2003. Polymer motors: pushing out the front and pulling up the back. Curr. Biol. 13:R721-R733.

54. Nicklas, B. 1983. Measurements of the force produced by the mitotic spindle in anaphase. J. Cell. Biol. 97:542-548.

55. Nogales, E., M. Whittaker, R.A. Milligan, and K.H. Downing. 1999. High-resolution model of the microtubule. Cell. 96:79-88.

56. O'Brien, E. Т., E.D. Salmon, R.A. Walker, and H.P. Erickson. 1990. Effects of magnesium on the dynamic instability of individual microtubules. Biochemistry 29:6648-6656.

57. Odde, D.J., L. Cassimeris, and H.M. Buettner. 1995. Kinetics of microtubule catastrophe assessed by probabilistic analysis. Biophys. J. 69:796-802.

58. Panda, D., H.P. Miller, and L. Wilson. 2002. Determination of the size and chemical nature of the stabilizing "cap" at microtubule ends using modulators of polymerization dynamics. Biochemistry. 41(5):1609-1617.

59. Pedigo, S., and R.C. Williams Jr. 2002. Concentration dependence of variability in growth rates of microtubules. Biophys. J. 83:1809-1819.

60. Pfarr C.M., Coue M., Grissom P.M., Hays T.S., Porter M.E., and Mcintosh J.R. 1990. Cytoplasmic dynein is localized to kinetochores during mitosis. Nature. 345(6272):263-265.

61. Press, W.H., S.A. Teukolsky, W.T. Vetterling, and B.P. Flannery. 1992. Numerical recipes in C. 2nd edition Cambridge University Press, Cambridge

62. Sept, D., N.A. Baker, and J.A. McCammon. 2003. The physical basis of microtubule structure and stability. Protein Sci. 12:2257-2261.

63. Simon, J.R., and E.D. Salmon. 1990. The structure of microtubule ends during the elongation and shortening phases of dynamic instability examined by negative-stain electron microscopy. J. Cell Sci. 96:571-582.

64. Sheetz, M. 1998. Laser tweezers in cell biology. Vol. 55. San Diego: Academic Press.

65. Svoboda, K. and S.M. Block. 1994. Force and velocity measured for single kinesin molecules. Cell. 77:773-784.

66. Tao, Y. C. and Peskin, C. S. 1998. Simulating the role of microtubules in depolymerization-driven transport: a Monte Carlo approach. Biophys J. 75:1529-1540.

67. Tran, P.T., P. Joshi, and E.D. Salmon. 1997a. How tubulin subunits are lost from the shortening ends of microtubules. J. Struct. Biol. 118:107-118.

68. Tran, P.T., R.A. Walker, and E.D. Salmon. 1997b. A metastable intermediate state of microtubule dynamic instability that differs significantly between plus and minus ends. J. Cell Biol. 138:105-117.

69. VanBuren, V., D.J. Odde, and L. Cassimeris. 2002. Estimates of lateral and longitudinal bond energies within the microtubule lattice. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99:6035-6040.

70. VanBuren, V., L. Cassimeris, and D.J. Odde. 2005. Mechanochemical model of microtubule structure and self-assembly kinetics. Biophys J. 89(5):2911-2926.

71. Visscher, K., and S.M. Block. 1998. Versatile optical traps with feedback control. Methods Enzymol. 298:460-89.

72. Voter, W.A., E.T. O'Brien, and H.P. Erickson. 1991. Dilution-induced disassembly of microtubules: relation to dynamic instability and the GTP cap. Cell Motil. Cytoskeleton. 18:55-62.

73. Walker, R.A., S. Inoue, and E.D. Salmon. 1989. Asymmetric behavior of severed microtubule ends after ultraviolet-microbeam irradiation of individual microtubules in vitro. J Cell Biol. 108(3):931-937.

74. Walker, R.A., N.K. Pryer, and E.D. Salmon. 1991. Dilution of individual microtubules observed in real time in vitro: evidence that cap size is small and independent of elongation rate. J. Cell Biol. 114:73-81.

75. Wang, M.D., Yin H., Landick R., Gelles J., and S.M. Block. 1997. Stretching DNA with optical tweezers. Biophys J. 72(3):1335-1346.

76. Weingarten M.D., Lockwood A.H., Hwo S.Y., and M.W. Kirschner. 1975. A protein factor essential for microtubule assembly. Proc Natl Acad Sci USA. 72:1858-1862.

77. Weisenberg, R.C. 1972. Microtubule formation in vitro in solutions containing low calcium concentrations. Science. 177:1104-1105.