Изучение взаимодействия кинетохоров хромосом с микротрубочками тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.02, кандидат физико-математических наук Ефремов, Артем Константинович

• Ефремов, Артем Константинович
• кандидат физико-математических наук
• 2008

Оглавление диссертации кандидат физико-математических наук Ефремов, Артем Константинович

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

1.1 Митоз.

1.2 Микротрубочки.

1.2.1 Структура микротрубочек.

1.2.2 Динамическая нестабильность.

1.3 Строение кинетохора.

1.4 Daml комплекс и ДАМ-кольцо in vitro.

1.4.1 Структурные данные.

1.4.2 Динамические характеристики.

1.5 Модели взаимодействия кинетохора и микротрубочки.

1.5.1 Механизм диффузии со смещением.

1.5.2 Механизм силового давления.

1.5.3 Электростатический механизм.

1.6 Постановка задачи.

ГЛАВА 2. МАТЕМАТИЧЕСКАЯ МОДЕЛЬ МИКРОТРУБОЧКИ И ДАМ

КОЛЫДА

2.1 Модель микротрубочки.

2.2 Модель ДАМ-кольца и его взаимодействия с микротрубочкой.

2.3 Выбор значений констант модели.

ГЛАВА 3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

3.1 Компьютерные алгоритмы.

3.1.1 Метод Метрополиса Монте-Карло.

3.1.2 Генератор случайных чисел.

3.2 Экспериментальные методы и материалы.

3.2.1 Приготовление тубулина и нуклеирующих центров.

3.2.2 Проточная камера.

3.2.3 Подготовка камеры к эксперименту.

3.2.4 Приготовление микрошариков, покрытых Daml комплексами.

3.2.5 Коррекция интенсивности флуоресценции при обработке результатов экспериментов.

3.2.6. Принцип действия лазерной ловушки.

3.2.7 Инструменты и сбор данных.

ГЛАВА 4. РЕЗУЛЬТАТЫ

4.1 Увеличение жесткости линкеров кольца ведет к уменьшению силы связывания кольца с микротрубочкой.

4.2 ДАМ-кольцо имеет устойчивое наклонное положение по отношению к оси микротрубочки.

4.3 Слабосвязывающееся с микротрубочкой ДАМ-кольцо движется по механизму диффузии со смещением.

4.4 Сильносвязывающееся с микротрубочкой ДАМ-кольцо двигается по механизму силового шагания.

4.5 Сильносвязывающееся с микротрубочкой ДАМ-кольцо обладает более лучшими динамическими характеристиками, чем слабосвязывающееся ДАМ-кольцо.

4.6 На закрепленных к покровному стеклу микротрубочках образуются как нормальные ДАМ-кольца, так и ДАМ-структуры в виде недостроенных ДАМ-колец.

4.7 Микрошарики, покрытые Daml комплексом, ускоряют разборку микротрубочек и обладают высокой процессивностью движения.

4.8 Уменьшение плотности покрытия Daml комплексом поверхности шариков ведет к уменьшению их скорости движения за деполиме-ризующимися концами микротрубочек.

4.9 Подтверждение существования ДАМ-колец между шариками и микротрубочкой в присутствии растворенного Daml в эксперименте с лазерной ловушкой.

4.10 ДАМ-кольца in vitro двигаются по механизму силового давления.

4.11 ДАМ-кольца С-мутанта Dami двигаются при разборке микротрубочки с большими, чем в случае нативного Daml, скоростя

4.12 ДАМ-кольцо, движущиеся за деполимеризующимся концом микротрубочки, совершает прецессивные колебания.

ГЛАВА 5. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

ГЛАВА 6. ВЫВОДЫ.

БЛАГОДАРНОСТИ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Изучение взаимодействия кинетохоров хромосом с микротрубочками»

Микротрубочки - биополимеры цитоскелета, играющие важную роль в жизни клетки. Они активно участвуют в поддержании формы клетки и транспортной системе. Но самая критически важная функция микротрубочек - распределение точных копий генетического материала по дочерним клеткам во время деления клетки - митоза. Для решения этой задачи природа в течение эволюции создала специальный белковый комплекс, собирающийся на центромерном участке каждой хроматиды, — кинетохор. За него во время митоза могут зацепляться микротрубочки, участвующие в транспорте хромосом. Раньше считалось, что за перемещение хромосом в митозе отвечают моторные белки на кинетохоре, а кинетохорные микротрубочки просто играют роль «рельсов» по которым идут эти белки. Однако недавно показано [Grish-chuk 2006, Huang 2006], что это не совсем верно, так как для транспорта хромосом во время митоза необходимо и достаточно только наличие динамической нестабильности микротрубочек. Явление динамической нестабильности микротрубочек состоит в том, что каждая микротрубочка может находиться в двух состояниях — быстрой разборки или медленного роста [Walker 1988]. Причем переход из одного состояния в другое является случайным процессом у свободных микротрубочек, который называется катастрофой при переходе от роста к разборке или спасением при обратном процессе. С окращающаяся микротрубочка, зацепленная за кинетохор, тянет за собой хромосому, в то время как растущая микротрубочка наоборот толкает хромосому. Поэтому благодаря динамической нестабильности кинетохорных микротрубочек наблюдаются характерные колебания хромосом во время прометафазы и метафазы во время митоза между полюсами веретена деления. То, что микротрубочки действительно могут создавать силы достаточные для движения хромосом во время митоза, было показано экспериментально [Grishchuk 2005]. Более того, именно эта сила, создаваемая разбирающимися кинетохорными микротрубочками, является наиболее важной для сегрегации хромосом [Grishchuk 2006]. Однако до сих пор ни одна из существующих моделей взаимодействия кинетохора и микротрубочки [Hill 1985, Jogle-kar 2002, Molodtsov 2005b, Jian Liu 2006], несмотря на их частичные успехи, не может полностью описать структурные данные и динамические характеристики кинетохорных белковых копмлексов [Miranda 2005, 2007, Westermann 2005, 2006, Wang 2007]. Кроме того ни одна из этих моделей не может объяснить как достигается высокая 5 эффективность движения кинетохора за разбирающимся концом микротрубочки при очень сильном связывании кинетохора с микротрубочкой [Westermann 2005, 2006].

Целью данной работы было создание модели взаимодействия кинетохора и микротрубочки, описывающей все известные на сегодняшний день экспериментальные данные об их структуре и динамическом поведении. С помощью этой модели предсказать, а затем и провести новые эксперименты для выяснения источников разногласий в уже существующих данных. Также выяснить с помощью теории и эксперимента механизм движения кинетохора при деполимеризации кинетохорной микротрубочки.

Задачи исследования:

1. Создать количественную модель микротрубочки, основываясь на последних данных о ее структуре и кинетики деполимеризации. При этом модель должна включать в себя тепловые флуктуации, которые не были учтены ни в одной предшествующей модели микротрубочки.

2. Создать и объединить с моделью микротрубочки модель кинетохорных белковых комплексов, взаимодействующих с микротрубочкой, основываясь на их структурных и динамических данных.

3. С помощью получившейся математической модели определить, какими свойствами должны обладать кинетохорные белки, взаимодействующие с микротрубочкой, для наиболее эффективного развития тянущей силы деполимери-зующейся кинетохорной микротрубочкой.

4. Понять, как удается кинетохорным белковым комплексам быть сильно связанными с микротрубочкой и при этом быстро передвигаться.

5. Экспериментально определить по какому из известных теоретических механизмов происходит движение кинетохора во время деления клетки.

Научная новизна:

Была разработана наиболее полная модель кинетохора и его взаимодействия с микротрубочкой, включающая в себя все известные на сегодняшний день структурные и динамические экспериментальные данные. В результате введения дополнительной гипотезы в модель о существовании подвижных белковых мостиков - линкеров у кинетохора, ответственных за связывание со стенкой микротрубочки, было показано, каким образом удается совместить высокую эффективность движения кинетохора вдоль микротрубочки с сильным связыванием кинетохора и микротрубочки. Этого свойства кинетохора до сих пор не могла объяснить ни одна существующая на сей день математическая модель. Не смотря на такое чисто теоретическое предположение, подобные линкеры были совсем недавно обнаружены на электронных фотографиях [Wang 2007], что свидетельствует в пользу созданной нами модели. Сравнение результатов модели с существующими экспериментальными данными по динамике кинетохорного белкового комплекса, ответственного за зацепление хромосомы к микротрубочкам, показало, что в природе реализуется силовой механизм движения (power stroke mechanism) кинетохора при разборке микротрубочки, а не механизм диффузии со смещением (biased diffusion mechanism). Этот результат также подтверждается проведенными мной экспериментальными исследованиями. Кроме того теоретические расчеты показали, что кинетохор движется наподобие моторных белков — его линкеры перешагивают из одного сайта взаимодействия на микротрубочке в другой, используя вместо энергии АТФ энергию упругих напряжений, запасенную в стенке микротрубочки. Подобный механизм движения до сих пор не был никем описан. Кроме того нами было экспериментально показано существование in vitro никем ранее не описанных структур, образуемых кинетохорными белковыми комплексами на микротрубочках. Эти структуры обладают кинетическими свойствами, сильно отличающимися от свойств ранее обнаруженных белковых комплексов.

Научно-практическое значение:

Исследование механизмов, участвующих в делении клеток, очень важно при изучении развития раковых заболеваний. Знание процессов, протекающих во время митоза и принципов их действия, может помочь в создании антираковых препаратов и методик лечения. Результатом данной работы является вклад в понимание механизма движения и взаимодействия кинетохора с микротрубочкой, а также выяснение механизма генерации сил, развиваемых кинетохорными микротрубочками во время деления клетки.

Положения, выносимые на защиту:

1. Создана оригинальная математическая модель взаимодействия микротрубочки и кинетохора, хорошо согласующаяся со всеми существующими экспериментальными данными.

2. С помощью полученной математической модели определены необходимые свойства кинетохорных белков, связывающихся с микротрубочкой, для обеспечения наиболее эффективного функционирования кинетохора.

3. Показано, каким образом можно совместить в кинетохоре два противоречивых свойства - сильное связывание с микротрубочкой и высокую подвижность.

4. Экспериментально определен механизм, по которому происходит движение кинетохора во время деления клетки.

5. Экспериментально показано существование ранее никем не описанных структур, образуемых кинетохорными белковыми комплексами на микротрубочках. Эти структуры обладают кинетическими свойствами, сильно отличающимися от свойств ранее обнаруженных белковых комплексов.

Заключение диссертации по теме «Биофизика», Ефремов, Артем Константинович

ГЛАВА 6. ВЫВОДЫ

1. На основе последних экспериментальных данных построена детальная моле-кулярно-механическая модель взаимодействия микротрубочки и ДАМ-кольца, включающая в себя гипотезу линкеров - белковых мостиков, соединяющих ДАМ-кольцо с микротрубочкой.

2. С помощью полученной математической модели показано, что кольцо с жесткими линкерами обладает малым КПД ~10%, в то время как линкеры с маленькой изгибной жесткостью позволяют кольцу эффективно преобразовывать энергию деполимеризации микротрубочки в полезную механическую работу с КПД ~ 50% даже при сильном связывании линкеров с поверхностью микротрубочки ~ 13 кТ.

3. Показано, что в модели существует два типа движения кольца при разборке микротрубочки — по механизму диффузии со смещением при слабом связывании линкеров с микротрубочкой и по механизму силового давления при сильном связывании. При этом во втором случае наблюдается перешагивание линкеров кольца с одного сайта связывания на микротрубочке в другой подобно движению кинезинов.

4. На основе экспериментальных измерений доказано, что ДАМ-кольца двигаются по механизму силового давления во время деполимеризации микротрубочек. Во время этого процесса наблюдается прецессия оси кольца вокруг оси микротрубочки.

5. Экспериментально показано существование ни кем ранее не описанных некольцевых ДАМ-стурктур, которые в отличие от ДАМ-колец имеют большой коэффициент диффузии вдоль микротрубочки.

6. При деполимеризации микротрубочек некольцевые ДАМ-патчи следуют за разбирающимся концами микротрубочек на подобии ДАМ-колец.

БЛАГОДАРНОСТИ

В заключении выражаю свою глубокую благодарность научному руководителю доктору биологических наук профессору Фазоилу Иноятовичу Атауллаханову и профессору Ричарду Макинтошу из университета штата Колорадо за плодотворные научные дискуссии и ценные замечания. Также хочу поблагодарить докторов физико-математических наук Кочикова Игоря Викторович, Трубецкого Михаил Кирилловича из Научно Исследовательского Вычислительного Центра при МГУ им. Ломоносова и директора Научно Исследовательского Вычислительного Центра при МГУ им. Ломоносова доктора физико-математических наук Тихонравова Александра Владимировича за интересные идеи и обсуждения при порграммировании математической модели. Неоценимую помощь при приготовлении белков и реагентов для проведения эксперимента оказали Максим Молодцов, Пола Гриссом и Томас Фидлер. Данная работа невозможна была бы без помощи Екатерины Грищук, которая обучила меня работе на микроскопе и помогла в проведении многих сложных экспериментов. Большое спасибо Илье Спиридонову, Володе Волкову и Кириллу Жуденкову за помощь в обработке и оформлении результатов. И, конечно же, огромное спасибо Да-ниелле Никастро за дружескую поддержку в трудные минуты.

Список литературы диссертационного исследования кандидат физико-математических наук Ефремов, Артем Константинович, 2008 год

1. Alberts В. 1989. Molecular biology of the cell. (Garland, New York)

2. Asbury C.L., Gestaut D.R., Powers A.F., Franck A.D., Davis T.N. 2006. The Daml kinetochore complex harnesses microtubule dynamics to produce force and movement. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:9873-8.

3. Ashkin A. 1970. Acceleration and trapping of particles by radiation pressure. Phys. Rev. Lett., 24:156-9.

4. Biggins S., Severin F.F., Bhalla N., Sassoon I., Hyman A.A., Murray A.W. 1999. The conserved protein kinase Ipll regulates microtubule binding to kinetochores in budding yeast. Genes Dev., 13:532-44.

5. Block S.M., Svoboda K. 1995. Analysis of high resolution recordings of motor movement. Biophys. J., 68:230S-241S.

6. Block S.M., Asbury C.L., Shaevitz J.W., Lang M.J. 2003. Probing the kinesin reaction cycle with a 2D optical force clamp. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100:2351-6.

7. Brouhard G.J., Schek H.T. 3rd, Hunt A.J. 2003. Advanced optical tweezers for the study of cellular and molecular biomechanics. IEEE Trans. Biomed. Eng., 50:1215.

8. Caplow M., Shanks J. 1990. Mechanism of the microtubule GTPase reaction. J. Biol. Chem., 265:8935-41.

9. Caplow M., Shanks J. 1996. Evidence that a single monolayer tubulin-GTP cap is both necessary and sufficient to stabilize microtubules. Mol. Biol. Cell, 7:663-75.

10. Carlier M.F., Pantaloni D. 1982. Assembly of microtubule protein: role of guano-sine di- and triphosphate nucleotides. Biochemistry, 21:1215-24.

11. Carmichael R.D. 1909-1910. Note on a new number theory function. Bull. Amer. Math. Soc., 16:232-8.

12. Chan C.S., Botstein D. 1993. Isolation and characterization of chromosome-gain and increase-in-ploidy mutants in yeast. Genetics, 135:677-91.

13. Cheeseman I.M., Drubin D.G., Barnes G. 2002a. Simple centromere, complex kinetochore: linking spindle microtubules and centromeric DNA in budding yeast. J. Cell Biol., 157:199-203.

14. Cheeseman I.M., Anderson S., Jwa M., Green E.M., Kang J., Yates J.R. 3rd, Chan C.S., Drubin D.G., Barnes G. 2002b. Phospho-regulation of kinetochore-microtubule attachments by the Aurora kinase Ipllp. Cell, 111:163-72.

15. Cheeseman I.M., Niessen S., Anderson S., Hyndman F., Yates J.R. 3rd, Oegema K., Desai A. 2004. A conserved protein network controls assembly of the outer kineto-chore and its ability to sustain tension. Genes Dev., 18:2255-68.

16. Cheeseman I.M., Chappie J.S., Wilson-Kubalek E.M., Desai A. 2006. The conserved KMN network constitutes the core microtubule-binding site of the kineto-chore. Cell, 127:983-97.

17. Chretien D., Fuller S.D., Karsenti E. 1995. Structure of growing microtubule ends: two-dimensional sheets close into tubes at variable rates. J. Cell Biol., 129:1311-28.

18. Chretien D., Flyvbjerg H., Fuller S.D. 1998. Limited flexibility of the inter-protofilament bonds in microtubules assembled from pure tubulin. Eur. Biophys. J., 27:490-500.

19. Cleveland D.W., Mao Y., Sullivan K.F. 2003. Centromeres and kinetochores: from epigenetics to mitotic checkpoint signaling. Cell, 112:407-21.

20. Coveyou R.R. 1960. Serial correlation in the generation of pseudorandom numbers. J.A.C.M., 7:72-74.

21. De Wulf P., McAinsh A.D., Sorger P.K. 2003. Hierarchical assembly of the budding yeast kinetochore from multiple subcomplexes. Genes Dev., 17:2902-21.

22. Desai A., Rybina S., Muller-Reichert Т., Shevchenko A., Hyman A., Oegema K. 2003. KNL-1 directs assembly of the microtubule-binding interface of the kinetochore in C. elegans. Genes Dev., 17:2421-35.

23. Downing K.H., Nogales E. 1998a. New insights into microtubule structure and function from the atomic model of tubulin. Eur. Biophys. J. 27:431-6.

24. Downing K.H., Nogales E. 1998b. Tubulin and microtubule structure. Curr. Opin. Cell Biol. 10:16-22.

25. Erickson H.P., O'Brien E.T. 1992. Microtubule dynamic instability and GTP hydrolysis. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct., 21:145-66.

26. Espelin C.W., Kaplan K.B., Sorger P.K. 1997. Probing the architecture of a simple kinetochore using DNA-protein crosslinking. J. Cell Biol., 139:1383-96.

27. Espelin C.W., Simons K.T., Harrison S.C., Sorger P.K. 2003. Binding of the essential Saccharomyces cerevisiae kinetochore protein NdclOp to CDEII. Mol. Biol. Cell, 14:4557-68.

28. Feigner H., Frank R., Schliwa M. 1996. Flexural rigidity of microtubules measured with the use of optical tweezers. J. Cell Sci., 109:509-16.

29. Fichthorn K.A., Weinberg W.H. 1991. Theoretical foundations of dynamical Monte Carlo simulations. J. Chem. Phys., 95:1090-6.

30. Francisco L., Chan C.S. 1994. Regulation of yeast chromosome segregation by Ipll protein kinase and type 1 protein phosphatase. Cell. Mol. Biol. Res., 40:207-13.

31. Fygenson D.K., Braun E., Libchaber A. 1994. Phase diagram of microtubules. Phys. Rev. E Stat. Phys. Plasmas Fluids Relat. Interdiscip. Topics, 50:1579-88.

32. Gigant В., Curmi P.A., Martin-Barbey C., Charbaut E., Lachkar S., Lebeau L., Sia-voshian S., Sobel A., Knossow M. 2000. The 4 A X-ray structure of a tubu-lin:stathmin-like domain complex. Cell, 102:809-16.

33. Gillett E.S., Espelin C.W., Sorger P.K. 2004. Spindle checkpoint proteins and chromosome-microtubule attachment in budding yeast. J. Cell Biol., 164:535-46.

34. Greenberger M. 1961. An A priori determination of serial correlation in computer generated random numbers. Math. Comput., 15:383-9.

35. Grishchuk E.L., Molodtsov M.I., Ataullakhanov F.I., Mcintosh J.R. 2005. Force production by disassembling microtubules. Nature, 438:384-8.

36. Grishchuk E.L., Mcintosh J.R. 2006. Microtubule depolymerization can drive poleward chromosome motion in fission yeast. EMBO J., 25:4888-96.

37. Gupta M.L.Jr., Carvalho P., Roof D.M., Pellman D. 2006. Plus end-specific de-polymerase activity of Kip3, a kinesin-8 protein, explains its role in positioning the yeast mitotic spindle. Nat. Cell Biol., 8:913-23.

38. He X., Rines D.R., Espelin C.W., Sorger P.K. 2001. Molecular analysis of kineto-chore-microtubule attachment in budding yeast. Cell, 106:195-206.

39. Heermann D.W. 1990. Computer Simulation Methods in Theoretical Physics. (Springer, New York).

40. Hill T.L. 1985. Theoretical problems related to the attachment of microtubules to kinetochores. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:4404-8.

41. Hofmann С., Cheeseman I.M., Goode B.L., McDonald K.L., Barnes G., Drubin D.G. 1998. Saccharomyces cerevisiae Duolp and Damlp, novel proteins involved in mitotic spindle function. J. Cell Biol., 143:1029-40.

42. Huang В., Huffaker T.C. 2006. Dynamic microtubules are essential for efficient chromosome capture and biorientation in S. cerevisiae. J. Cell Biol., 175:17-23.

43. Hyman A.A., Middleton K., Centola M., Mitchison T.J., Carbon J. 1992a. Micro-tubule-motor activity of a yeast centromere-binding protein complex. Nature, 359:533-6.

44. Hyman A.A., Salser S., Drechsel D.N., Unwin N. Mitchison T.J. 1992b. Role of GTP hydrolysis in microtubule dynamics: information from a slowly hydrolyzable analogue, GMPCPP. Mol. Biol. Cell, 3:1155-67.

45. Jian Liu, Onuchic J.N. 2006. A driving and coupling "Pac-Man" mechanism for chromosome poleward translocation in anaphase A. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:18432-7.

46. Jiang L., Gao Y., Mao F., Liu Z., Lai L. 2002. Potential of mean force for protein-protein interaction studies. Proteins, 46:190-6.

47. Joglekar A.P., Hunt A.J. 2002. A simple, mechanistic model for directional instability during mitotic chromosome movements. Biophys J., 83:42-58.

48. Joglekar A.P., Bouck D.C., Molk J.N., Bloom K.S., Salmon E.D. 2006. Molecular architecture of a kinetochore-microtubule attachment site. Nat. Cell Biol., 8:581-5.

49. Kikkawa M., Ishikawa Т., Nakata Т., Wakabayashi Т., and Hirokawa N. 1994. Direct visualization of the microtubule lattice seam both in vitro and in vivo. J. Cell Biol., 127:1965-71.

50. Kitagawa K., Hieter P. 2001. Evolutionary conservation between budding yeast and human kinetochores. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol., 2:678-87.

51. Koshland D.E., Mitchison T.J., Kirschner M.W. 1988. Polewards chromosome movement driven by microtubule depolymerization in vitro. Nature, 331:499-504.

52. Kwok B.H., Yang J.G., Kapoor T.M. 2004. The rate of bipolar spindle assembly depends on the microtubule-gliding velocity of the mitotic kinesin Eg5. Curr. Biol., 14:1783-8.

53. Lang M.J., Asbury C.L., Shaevitz J.W., Block S.M. 2002. An Automated Two-Dimensional Optical Force Clamp for Single Molecule Studies. Biophys. J., 83:491-501.

54. Lehninger A.L., Nelson D.L., Cox M.M. 1993. Principles of Biochemistry. (Worth, New York), 2nd Ed., p. 377.

55. Li Y., Bachant J., Alcasabas A.A., Wang Y., Qin J., Elledge S.J. 2002. The mitotic spindle is required for loading of the DASH complex onto the kinetochore. Genes Dev., 16:183-97.

56. Lombillo V.A., Stewart R.J., Mcintosh J.R. 1995. Minus-end-directed motion of ki-nesin-coated microspheres driven by microtubule depolymerization. Nature, 373: 161-4.

57. Mandelkow E.M., Mandelkow E. 1985. Unstained microtubules studied by cryo-electron microscopy. Substructure, supertwist and disassembly. J. Mol. Biol., 181:123-35.

58. Mandelkow E.M., Mandelkow E., Milligan R.A. 1991. Microtubule dynamics and microtubule caps: a time-resolved cryo-electron microscopy study. J. Cell Biol., 114:977-91.

59. McAinsh A.D., Tytell J.D., Sorger P.K. 2003. Structure, function, and regulation of budding yeast kinetochores. Annu. Rev. Cell Dev. Biol., 19:519-39.

60. Meluh P.B., Koshland D. 1995. Evidence that the MIF2 gene of Saccharomyces ce-revisiae encodes a centromere protein with homology to the mammalian centromere protein CENP-C. Mol. Biol. Cell, 6:793-807.

61. Meraldi P., McAinsh A.D., Rheinbay E., Sorger P.K. 2006. Phylogenetic and structural analysis of centromeric DNA and kinetochore proteins. Genome Biol., 7:R23.

62. Meurer-Grob P., Kasparian J., Wade R. H. 2001. Microtubule structure at improved resolution. Biochem. 40:8000-8.

63. Middleton К., Carbon J. 1994. KAR3-encoded kinesin is a minus-end-directed motor that functions with centromere binding proteins (CBF3) on an in vitro yeast ki-netochore. Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 91:7212-6.

64. Miranda J.J., De Wulf P., Sorger P.K., Harrison S.C. 2005. The yeast DASH complex forms closed rings on microtubules. Nat. Struct. Mol. Biol., 12:138-43.

65. Miranda J.J., King D.S., Harrison S.C. 2007. Protein arms in the kinetochore-microtubule interface of the yeast DASH complex. Mol. Biol. Cell, 18:2503-10.

66. Mitchison Т., Kirschner M. 1984. Dynamic instability of microtubule growth. Nature, 312:237-42.

67. Molodtsov M.I., Grishchuk E.L., Efremov A.K., Mcintosh J.R., Ataullakhanov F.I. 2005b. Force production by depolymerizing microtubules: a theoretical study. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 102:4353-8.

68. Munson K.M, Mulugeta P.G., Donhauser Z J. 2007. Enhanced Mechanical Stability of Microtubules Polymerized with a Slowly Hydrolyzable Nucleotide Analogue. J. Phys. Chem. B, 111:5053-7.

69. Nicholson W.V., Lee M., Downing K.H., Nogales E. 1999. Cryo-electron microscopy of GDP-tubulin rings. Cell Biochem. Biophys., 31:175-83.

70. Nicklas B. 1983. Measurements of the force produced by the mitotic spindle in anaphase. J. Cell. Biol., 97:542-8.

71. Nogales E., Whittaker M., Milligan R.A., Downing K.H. 1999. High-Resolution Model of the Microtubule. Cell. 96:79-88.

72. Ortiz J., Stemmann 0., Rank S., Lechner J. 1999. A putative protein complex consisting of Ctfl9, Mcm21, and Okpl represents a missing link in the budding yeast kinetochore. Genes Dev., 13:1140-55.

73. Perez F., Diamantopoulos G.S., Stalder R., Kreis Т.Е. 1999. CLIP-170 highlights growing microtubule ends in vivo. Cell, 96:517-27.

74. Peskin C.S., Oster G.F. 1995. Force production by depolymerizing microtubules: load-velocity curves and run-pause statistics. Biophys. J., 69:2268-76.

75. Pinsky B.A., Biggins S. 2005. The spindle checkpoint: tension versus attachment. Trends Cell Biol., 15:486-93.

76. Pinsky B.A., Kung C., Shokat K.M., Biggins S. 2006. The Ipll-Aurora protein kinase activates the spindle checkpoint by creating unattached kinetochores. Nat. Cell Biol., 8:78-83.

77. Rieder C.L., Salmon E.D. 1998. The vertebrate cell kinetochore and its roles during mitosis. Trends Cell Biol., 8:310-8.

78. Sanchez-Perez I., Renwick S.J., Crawley K., Karig I., Buck V., Meadows J.C., Franco-Sanchez A., Fleig U., Toda Т., Millar J.B. 2005. The DASH complex and Klp5/Klp6 kinesin coordinate bipolar chromosome attachment in fission yeast. EMBO J., 24:2931-43.

79. Sandall S., Severin F., McLeod I.X., Yates J.R. 3rd, Oegema K., Hyman A., Desai A. 2006. A Birl-Slil5 complex connects centromeres to microtubules and is required to sense kinetochore tension. Cell, 127:1179-91.

80. Sandblad L., Busch K.E., Tittmann P., Gross H., Brunner D., Hoenger A. 2006. The Schizosaccharomyces pombe EB1 homolog Mal3p binds and stabilizes the microtubule lattice seam. Cell, 127:1415-24.

81. Sheetz M.P. 1998. Laser tweezers in cell biology. Methods in cell biology, vol. 55 (Academic press, San Diego).

82. Smith M.M. 2002. Centromeres and variant histones: what, where, when and why? Curr. Opin. Cell Biol., 14:279-85.

83. Steinmetz M.O., Kammerer R.A., Jahnke W., Goldie K.N., Lustig A., van Oostrum J. 2000. Opl8/stathmin caps a kinked protofilament-like tubulin tetramer. EMBO J., 19:572-80.

84. Tanaka K., Mukae N., Dewar H., van Breugel M., James E.K., Prescott A.R., Antony C., Tanaka T.U. 2005. Molecular mechanisms of kinetochore capture by spindle microtubules. Nature, 434:987-94.

85. Tao Y.C., Peskin C.S. 1998. Simulating the role of microtubules in depolymeriza-tion driven transport: a Monte Carlo approach. Biophys. J., 75:1529-40.

86. Tytell J.D., Sorger P.K. 2006. Analysis of kinesin motor function at budding yeast kinetochores. J. Cell Biol., 172:861-74.

87. VanBuren V., Cassimeris L., Odde D.J. 2005. Mechanochemical model of microtubule structure and self-assembly kinetics. Biophys. J., 89:2911-26.

88. Varga V., Helenius J., Tanaka K., Hyman A.A., Tanaka T.U., Howard J. 2006. Yeast kinesin-8 depolymerizes microtubules in a length-dependent manner. Nat. Cell Biol., 8:957-62.

89. Visscher K., Block S.M. 1998. Versatile optical traps with feedback control. Methods Enzymol., 298:460-89.

90. Visscher K., Schnitzer M.J., Block S.M. 1999. Single kinesin molecules studied with a molecular force clamp. Nature, 400:184-9.

91. Visscher K., Schnitzer M.J., Block S.M. 1999. Single kinesin molecules studied with a molecular force clamp. Nature, 400:184-9.

92. Walker R.A., O'Brien Т., Pryer N.K., Soboeiro M.F., Voter W.A., Erickson H.P., Salmon D.E. 1988. Dynamic instability of individual microtubules analyzed by video light microscopy: rate constants and transition frequencies. J. Cell Biol., 107: 1437-48.

93. Wei R.R., Sorger P.K., Harrison S.C. 2005. Molecular organization of the Ndc80 complex, an essential kinetochore component. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 102:5363-7.

94. Weingarten M.D., Lockwood A.H., Hwo S.Y., M.W. Kirschner. 1975. A protein factor essential for microtubule assembly. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 72:1858-62.

95. Westermann S., Cheeseman I.M., Anderson S., Yates J.R. 3rd, Drubin D.G., Barnes G. 2003. Architecture of the budding yeast kinetochore reveals a conserved molecular core. J. Cell Biol., 163:215-22.

96. Westermann S., Avila-Sakar A., Wang H.W., Niederstrasser H., Wong J., Drubin D.G., Nogales E., Barnes G. 2005. Formation of a dynamic kinetochore-microtubule interface through assembly of the Daml ring complex. Mol. Cell, 17:277-90.

97. Westermann S., Wang H.W., Avila-Sakar A., Drubin D.G., Nogales E., Barnes G. 2006. The Daml kinetochore ring complex moves processively on de-polymerizing microtubule ends. Nature, 440:565-9.

98. Westermann S., Drubin D.G., Barnes G. 2007. Structures and functions of yeast kinetochore complexes. Annu. Rev. Biochem., 76:563-91.

99. Winey M., Mamay C.L., O'Toole E.T., Mastronarde D.N., Giddings Т.Н.Jr., McDonald K.L., Mcintosh J.R. 1995. Three-dimensional ultrastructural analysis of the Saccharomyces cerevisiae mitotic spindle. J. Cell Biol., 129:1601-15.