Изучение свойств реакционных центров пурпурной бактерии Rhodobacter sphaeroides с измененным белковым окружением мономерного бактериохлорофилла BA тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.04, кандидат биологических наук Леонова, Мария Михайловна

• Леонова, Мария Михайловна
• кандидат биологических наук
• 2013

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Леонова, Мария Михайловна

Список условных сокращений.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 Краткая характеристика аноксигенных пурпурных бактерий.

1.2 Структура и функции фотосинтетического аппарата пурпурных бактерий.

1.2.1 Компоненты фотосинтетической мембраны.

1.2.2 Светособирающие комплексы.

1.2.3 Структура реакционного центра.

1.2.4 Перенос электрона в реакционном центре.

1.3 Фотосинтетический генный кластер и системы для направленного мутагенеза.

1.4 Генетические модификации белка.

1.4.1 Исследование симметрии комплекса реакционного центра.

1.4.2 Удаление кофакторов.

1.4.3 Замещение кофакторов.

1.4.4 Изменение окислительно-восстановительного потенциала димера бактериохлорофиллов.

1.4.5 Исследование прочного взаимодействия между молекулой БХл и белком в мутантных РЦ.

1.4.6 Модификация участка взаимодействия РЦцитохромом

1.4.7 Мутации, затрагивающие молекулы воды.

ГЛАВА 2 ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1 Штаммы и плазмиды.

2.2 Среды и буферы.

2.3 Методы генной инженерии.

2.3.1 Мутагенез.

Мутагенез с помощью полимеразной цепной реакции.

Получение олигонуклеотидов для направленного мутагенеза.

Мутагенез с помощью «GeneEditor in vitro Site-Directed Mutagenesis

System».

2.3.2 Выделение и очистка плазмидной ДНК из культуры Е. coli.

2.3.3 Выделение суммарной ДНК из культуры Rba. sphaeroides.

2.3.4 Количественное определение ДНК в образце.

2.3.5 Расщепление плазмидной ДНК рестриктазами.

2.3.6 Горизонтальный электрофорез в агарозном геле.

2.3.7 Препаративное выделение ДНК из геля.

2.3.8 Лигирование вектора и фрагментов ДНК.

2.3.9 Получение электрокомпетентных клеток.

2.3.10 Трансформация клеток Е. coli плазмидной ДНК.

2.3.11 Конъюгативный перенос плазмид из Е. coli в Rba. sphaeroides.

2.4 Микробиологические и биохимические методы.

2.4.1 Культивирование бактериальных штаммов.

2.4.2 Выделение хроматофоров.

2.4.3 Выделение и очистка реакционных центров.

2.4.4 Пигментный анализ РЦ и хроматофоров.

2.5 Биофизические методы.

2.5.1 Оптическая спектроскопия в видимой, ближней ИК и УФ области.

2.5.2 Измерение спектров флуоресценции и возбуждения флуоресценции.

2.5.3 Измерение спектров действия фотохимической активности.

2.5.4 Измерение спектров кругового дихроизма.

2.5.5 Оптическая спектроскопия высокого временного разрешения.

ГЛАВА 3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1 Внесение направленных аминокислотных замещений в РЦ Rba. sphaeroides.

3.1.1 Получение мутантных штаммов Rba. sphaeroides с аминокислотными замещениями в положении L153 и LI28.

3.1.2 Получение мутантных штаммов Rba. sphaeroides с аминокислотными замещениями H(M182)L и H(L153)Y+H(M182)L в РЦ.

3.2 Исследование изолированных мутантных реакционных центров H(L153)M, H(L153)C.

3.2.1 Спектры поглощения реакционных центров дикого типа и с аминокислотными заменами H(L153)M и H(L153)C.

3.2.2 Дифференциальные фотоиндуцированные спектры поглощения реакционных центров дикого типа и с аминокислотными заменами

H(L153)M и H(L153)C.

3.2.3 Пигментный состав реакционных центров дикого типа и с аминокислотными заменами H(L153)M и H(L153)C.

3.3 Исследование мембраносвязанных мутантных реакционных центров H(L153)L, H(L153)Y и H(L153)Y+H(M182)L.

3.3.1 Спектры поглощения хроматофоров Н(Ы53)М, Н(Ы53)Ь, Н(Ы53)У и Н(Ъ153)У+Н(М182)Ь и РЦ Н(М182)Ь.

3.3.2 Измерение спектров кругового дихроизма мембраносвязанных РЦ дикого типа и мутанта Н(Ы 53)У+Н(М182)Ь.

3.3.3 Исследование фотохимической активности мембраносвязанных РЦ.

3.3.4 Пигментный анализ мембраносвязанных РЦ Н(Ы53)У.

3.3.5 Фемтосекундные исследования безантенных хроматофоров дикого типа и мутанта Н(Ь153)У.

3.3.6 Фемтосекундные исследования безантенных хроматофоров Н

3.3.7 Возможное значение аминокислотного остатка гистидина Ы53 для стабильности комплекса РЦ.

3.4 Исследование свойств реакционных центров У(Ы28)Н.

3.4.1 Спектры поглощения мутантных РЦ У(Ь128)Н.

3.4.2 Фотохимическия активность мутантных РЦ У(Ь128)Н.

3.4.3 Фемтосекундные исследования мутантных РЦ У(Ь128)Н.

ВЫВОДЫ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Изучение свойств реакционных центров пурпурной бактерии Rhodobacter sphaeroides с измененным белковым окружением мономерного бактериохлорофилла BA»

Актуальность темы исследования.

Фотосинтез является уникальным биосферным процессом, в ходе которого происходит превращение и запасание энергии света в энергию химических связей органических соединений, необходимых для жизнедеятельности большинства организмов Земли. Первичное преобразование поглощенной фотосинтетическими пигментами световой энергии в энергию разделенных зарядов протекает в мембранных белках - реакционных центрах (РЦ) фототрофных организмов, где происходит первичный перенос электрона между кофакторами с образованием трансмембранного потенциала. Квантовая эффективность начальных этапов фотосинтеза, составляющая почти 100%, очевидно, достигается путем тонкой регулировки свойств кофакторов за счет их взаимодействий друг с другом и с окружающим белком.

Исследования РЦ пурпурных аноксигенных бактерий имеют большое значение для понимания принципов и механизмов преобразования энергии при фотосинтезе. Аминокислотная последовательность белков и кристаллографическая структура бактериальных реакционных центров известна с середины 80-х годов XX века [Deisenhofer et al., 1984; Youvan et al., 1984a; Michel et al., 1985; 1986а]. Хорошо охарактеризованные бактериальные РЦ многие годы служат структурной и функциональной моделью для исследования более сложно организованной фотосистемы 2 зеленых растений и водорослей. РЦ пурпурных бактерий обладают рядом свойств, делающих их удобным объектом исследований. Среди них можно отметить сравнительную фото- и термостабильность, относительно простую организацию, спектральное разрешение полос поглощения отдельных кофакторов, наличие разработанных методов генетической и химической модификации, позволяющих манипулировать составом и свойствами кофакторов.

Фотосинтетический РЦ пурпурной бактерии Rhodobacter (Rba.) sphaeroides представляет собой трансмембранный пигмент-белковый комплекс, состоящий из трех субъединиц белка и 10 кофакторов, образующих две структурно-функциональные ветви. Каждая ветвь начинается с димера бактериохлорофиллов (БХл) Р, проходит через молекулы мономерного БХл, бактериофеофитина (БФео), и убихинона. Димер БХл выполняет функцию первичного донора электрона. Перенос электрона в нативных РЦ осуществляется по одной, так называемой А-ветви.

Детальный молекулярный механизм начальной стадии разделения зарядов в бактериальных РЦ остается объектом пристального внимания. До последнего времени активно 7 обсуждалась роль мономерного бактериохлорофилла активной ветви переноса электрона Вд и факторов, определяющих направленность электронного транспорта. Ранее были предложены две гипотезы переноса электрона от первичного донора Р на бактериофеофи-тин Нд - по механизму супер-обмена, без непосредственного участия БХл Ва [Martin et al, 1986; Bixon et al., 1989], и двустадийный последовательный перенос с образованием промежуточной радикальной пары Р+Вд [Shuvalov et al., 1978]. В процессе исследования на-тивных и феофитин-замещенных РЦ Rba. sphaeroides методом фемтосекундной спектроскопии была зарегистрирована полоса при 1020 нм, соответствующая поглощению анион-радикала ВА~, что свидетельствует в пользу второй гипотезы [Arlt et al., 1993; Kennis et al., 1997].

Использование сайт-направленного мутагенеза, позволяющего селективно замещать отдельные аминокислотные остатки в сайтах связывания хромофоров, дает уникальные возможности для исследования начальных стадий фотопереноса электрона в РЦ и роли отдельных пигментных кофакторов и аминокислотных остатков в этом процессе.

Цели и задачи исследования

Целью работы являлось исследование влияния ближайшего белкового окружения первичного акцептора электрона бактериохлорофилла Вд на его спектральные свойства и процессы разделения зарядов в реакционных центрах пурпурной бактерии Rhodobacter sphaeroides.

Были поставлены следующие задачи:

1. Внесение сайт-направленных мутаций и получение штаммов Rba. sphaeroides с аминокислотными замещениями в L-субъединице реакционного центра: H(L153)C, H(L153)L, H(L153)M, H(L153)Y и Y(L128)H; в М-субъединице: H(M182)L, а также с двойным замещением H(L153)Y+H(M182)L.

2. Выделение стабильных генетически-модифицированных реакционных центров, исследование их спектральных свойств и функциональной активности.

3. Исследование нестабильных мутантных РЦ в составе фотосинтетических мембран. Изучение их пигментного состава и фотохимической активности.

Научная новизна и практическая значимость работы

Впервые получены мутантные штаммы Rba. sphaeroides, содержащие реакционные центры с одиночными аминокислотными замещениями гистидина в позиции L153 на ци-стеин и метионин, а также с двойным замещением, гистидина L153 на тирозин и гистидина Ml 82 на лейцин.

Впервые показано, что замещение гистидина L153 на тирозин в реакционном центре Rba. sphaeroides приводит к потере мономерного БХл активной цепи кофакторов переноса электрона, сопровождающейся уменьшением стабильности пигмент-белкового комплекса. Впервые исследован процесс переноса электрона в мембрановстроенных му-тантных реакционных центрах без первичного акцептора электрона. Методом лазерной спектроскопии с фемтосекундным временным разрешением установлено, что переноса электрона в РЦ H(L153)Y с восстановленным хиноном QA не происходит, наблюдается лишь релаксация возбужденного состояния специальной пары Р* в основное состояние. Показано значительное замедление скорости электронного транспорта в мутантном РЦ и десятикатное снижение квантового выхода образования состояния с разделенными зарядами P+Qa~. Выявлено, что такой квантовой эффективности недостаточно для фотосинтетического роста бактерии.

Показано, что дополнительная к H(L153)Y замена гистидина Ml 82 на лейцин, приводящая к замещению бактериохлорофилла Вв молекулой бактериофеофитина Фв, инициирует быстрый перенос электрона с Р* на молекулу Фв за —3,5 пс с последующей рекомбинацией в основное состояние за 180 пс. Наблюдалось полное подавление переноса электрона в А-цепь в РЦ двойного мутанта.

В исследованиях реакционных центров с замещением тирозина L128 на гистидин, которое приводит к образованию водородной связи между аминокислотным остатком и БХл ВА, методом спектроскопии с фемтосекундным временным разрешением впервые наблюдался сдвиг полосы поглощения 1020 нм до 1035 нм, подтверждающий, что данная полоса принадлежит анион-радикалу первичного акцептора электрона Вд~.

Полученные данные о значимости первичного акцептора электрона и его ближайшего окружения для фотосинтетического электронного транспорта в бактериальных реакционных центрах важны с точки зрения разработки высокоэффективных искусственных систем для преобразования солнечной энергии.

Апробация работы

Основные положения работы изложены на: International Meeting "Photosynthesis in the post-genomic era: structure and function of photosystems" (Пущино, 2006), 5-м Съезде Российского фотобиологического сообщества и Международной конференции «Преобразование света при фотосинтезе» (Пущино, 2008), 15th European Bioenergetics Conference (Дублин, 2008), XIX Пущинских чтениях по фотосинтезу и Всероссийской конференции «Фотохимия хлорофилла в модельных и природных системах» (Пущино, 2009), 15th International Congress of Photosynthesis (Пекин, 2010), XXII Симпозиуме «Современная химическая физика» (п. Шепси, 2010), International Meeting "Photosynthesis Research for Sustain-ability" (Баку, 2011), VI Съезде Российского фотобиологического общества (п. Шепси, 2011), Школе-конференции молодых учёных «Биосистема: от теории к практике», (Пущино, 2012) и ряде других конференций молодых ученых.

Публикации

По теме диссертационной работы опубликовано 24 печатных работы, из которых четыре - в реферируемых журналах из списка ВАК РФ, в том числе одна - в иностранном.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Леонова, Мария Михайловна, 2013 год

1. Abresch, E.C., Gong, X.-M., Paddock, M.L., and Okamura M.Y. (2009) Electron transfer from cytochrome C2 to reaction center: A transition state model for ionic strength effects due to neutral mutations. Biochemistry, 48, 11390-11398.

2. Alden, R.G., Parson, W.W., Chu, Z.T., and Warshel, A. (1996) Orientation of the OH dipole of tyrosine (M)210 and its effect on electrostatic energies in photosynthetic bacterial reaction centers. J. Phys. Chem., 100, 16761-16770.

3. Allen, J.P., and Williams, J.C. (1998) Photosynthetic reaction centers. FEBS Lett., 438, 5-9.

4. Allen, J.P., Feher, G., Yeates, T.O., Komiya, H., and Rees, D.C. (1987) Structure of the reaction center from Rhodobacter sphaeroides R-26: the cofactors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA,84,5730-5734.

5. Allen, J.P., Feher, G., Yeates, T.O., Komiya, H., and Rees, D.C. (1988) Structure of the reaction center from Rhodobacter sphaeroides R-26: Protein-cofactor (quinones and Fe2+) interactions. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85(22), 8487-8491.

6. Arlt, T., Schmidt, S., Kaiser, W., Lauterwasser, C., Meyer, M., Scheer, H., and Zinth, W. (1993) The accessory bacteriochlorophyll: A real electron carrier in primary photosynthesis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 11757-11761.

7. Axelrod, H.L., Abresch, E.C., Okamura, M.Y., Yeh, A.P., Rees, D.C., and Feher, G. (2002) X-ray structure determination of the cytochrome C2:reaction center electron transfer complex from Rhodobacter sphaeroides. J. Mol. Biol., 319, 501-515.