Пигмент-белковые взаимодействия в фотосинтетическом реакционном центре пурпурных бактерий тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.04, кандидат наук Васильева, Людмила Григорьевна

• Васильева, Людмила Григорьевна
• кандидат наук
• 2015

Оглавление диссертации кандидат наук Васильева, Людмила Григорьевна

ОГЛАВЛЕНИЕ

Список условных сокращений

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Состав и структура бактериальных реакционных центров

1.2 Последовательность и скорости переноса электрона

1.3 Генетика фотосинтеза и модификации белка РЦ

1.3.1 Фотосинтетический генный кластер ири/-оперон

1.3.2 Системы для направленного мутагенеза РЦ

1.3.3 Экспрессионные вектора для пурпурных бактерий

1.3.4 Изменение состава и свойств кофакторов РЦ

1.3.4.1 Симметрия комплекса и мутации по ее восстановлению

1.3.4.2 Удаление кофакторов

1.3.4.3 Замещение кофакторов

1.3.4.4 Модификации белкового окружения димера БХл

1.3.4.5 Перенос электрона по В-цепи

1.3.4.6 Направленные мутации вблизи хинонов

1.3.4.7 Модификации участка взаимодействия РЦ с цитохромом с

1.3.4.8 Мутации, затрагивающие молекулы воды

1.3.4.9 Изучение эволюционной связи между РЦ и ФС 2

ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1 Микроорганизмы и культивирование

2.2 Генетические и молекулярно-биологические подходы

2.3 Биохимические и биофизичекие методы

2.4 Кристаллизация РЦ и рентгеноструктурный анализ

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

ГЛАВА 3. Генетические конструкции на основе ри/-оперона КУюйоЪасХег хрЬаегогйех

3.1 Плазмиды для направленного мутагенеза Ь- и М-субъединиц реакционного центра

3.2 Экспрессионный вектор для пурпурных бактерий на основе ри/-

промотора

ГЛАВА 4. Получение и характеристика рекомбинантных штаммов ЯЬа. хрИавгой^ез

4.1 Получение и фенотипы рекомбинантных штаммов

4.2 Тестирование экспрессионного вектора в периодических и непрерывных условиях культивирования ЯЬа. хркаегогйех

2

ГЛАВА 5. Влияние белкового окружения димера БХл на его свойства

5.1 Влияние аминокислотного замещения Пе-Шэ в симметричных позициях 1Л77 и М206

5.2 Изучение прочного связывания БХл с белком в РЦ 1(Ь177)Н

5.3 Пространственная структура РЦ 1(Ы77)Н

5.4 Исследование природы ковалентной связи БХл с белком в РЦ 1(Ы77)Н

5.5 Замена и смещение гистидиновых лигандов бактериохлорофиллов димера

5.6 Выяснение причин разных последствий одинаковых симметричных мутаций

ГЛАВА 6. Особенности лигандирования мономерных БХл Вд и Вв

6.1 Замена БХл Вв на БФео в результате мутации Н(М182)Ь

6.2 Перенос лиганда БХл Вв с а-стороны макроцикла на Р-сторону

6.3 Замещение гистидинового лиганда БХл Вд на цистеин, метионин, лейцин или

тирозин

ПРИЛОЖЕНИЕ

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК УСЛОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ

Ble. Blastochloris;

Е. coli Escherichia coli;

Phs. Phaeospirillum;

Rba. Rhodobacter;

Rps. Rhodopseudomonas;

Rsp. Rhodospirillum\

Rvi. Rubrivivax;

T. Thermosynechococcus;

Pa, ßß БХл-лы в сайтах связывания БФео На и Нв;

AG разность свободной энергии;

Фа, Фв БФео-ны в сайтах связывания мономерных БХл Вд и Вв;

Ет Р/Р+ равновесный окислительно-восстановительный потенциал

первичного донора электрона;

ФТИР инфракрасная спектроскопия с преобразованием Фурье;

К градус Кельвина;

LB среда Лурия-Бертани;

OD оптическая плотность;

Р димер БХл-ов, первичный донор электрона, специальная пара;

Р* димер БХл в возбужденном состоянии;

Р+ димер БХл в окисленном состоянии;

Ра, Рв БХл-лы, образующие первичный донор электрона;

PMSF фенилметилсульфонилфторид

Вд, Вв мономерные БХл-лы А- и B-цепи кофакторов переноса электрона;

Нд, Hb БФео-ны A-цепи и B-цепи цепи кофакторов переноса электрона;

Qa, Qb первичный и вторичный хинонные акцепторы электрона;

PDB Protein Data Bank, банк данных структур белков;

Sm стрептомицин;

Тс тетрациклин;

Km канамицин;

Amp ампициллин;

WT дикий тип;

(Б)Фео (бактерио)феофитин;

(Б)Хп (бактерио)хлорофилл;

ДЭАЭ целлюлоза диэтиламиноэтил целлюлоза;

ИК инфракрасный;

КД круговой дихроизм;

ЛДАО лаурилдиметиламиноксид;

ДСН додецилсульфат натрия;

ПЦР полимеразная цепная реакция;

РЦ реакционный центр;

ССК1 и ССК2 светособирающие комплексы коровой и периферической антенн;

п.о. пар оснований (нуклеотидов);

ТЪ буфер Трис-ЛДАО буфер;

ФГК фотосинтетический генный кластер;

ФС фотосистема;

фс фемтосекунда

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Пигмент-белковые взаимодействия в фотосинтетическом реакционном центре пурпурных бактерий»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы исследования

Фотосинтез является глобальным биологическим процессом превращения солнечной энергии в энергию химически устойчивых соединений и одним из основных факторов, ответственных за поддержание жизни на Земле. Процесс фотосинтеза в клетках растений, водорослей и фототрофных бактерий начинается с поглощения квантов света в светособирающих комплексах с последующей передачей энергии возбуждения на реакционные центры (РЦ). В результате серии сверх-быстрых реакций переноса электрона в РЦ происходит первичное преобразование световой энергии в энергию разделенных зарядов с квантовой эффективностью, близкой к 100%. Такая высочайшая эффективность улавливания и передачи световой энергии без разрушения молекул, включенных в этот процесс, и без нежелательных побочных реакций достигается путем тонкой регулировки свойств кофакторов через их взаимодействия друг с другом и с окружающим белком. В связи с этим исследование пигмент-белковых взаимодействий в бактериальных РЦ фотосинтеза является актуальным и находится в рамках фундаментальной задачи выяснения детальных механизмов первичного преобразования световой энергии.

РЦ пурпурных бактерий относительно просто организованы и стабильны, получена пространственной структура этих пигмент-белковых комплексов с высоким разрешением. Бактериальные РЦ многие годы служат моделью для исследования направления и скоростей первичного фотопереноса электрона, а также механизмов его отдельных стадий. В настоящее время особое внимание уделяется конформационным изменениям и колебаниям белка РЦ в процессе фотохимического разделения заряда, в значительной степени определяющим эффективность этого процесса. Перспективным подходом для изучения взаимодействий кофакторов РЦ с их белковым окружением является использование сайт - направленного мутагенеза в сочетании с современными биохимическими, спектральными и кристаллографическими методами. Определение структуры модифицированных РЦ имеет важное значение для корректной оценки изменений белкового окружения кофакторов, происходящих в результате аминокислотных замещений и оказывающих влияние на свойства и функциональную активность РЦ. Данная работа посвящена созданию системы для направленного мутагенеза РЦ пурпурной бактерии ТИюйоЪасХег (ЯЬа.) sphaeroid.es и изучению влияния отдельных аминокислотных остатков и участков полипептидов РЦ, находящихся в непосредственной близости от молекул бактериохлорофиллов, на оптические, фотохимические и другие свойства РЦ, их пигментный состав и пигмент-белковые

6

взаимодействия, а также получению кристаллов и расшифровке пространственной структуры природных и мутантных РЦ методом рентгеноструктурного анализа с высоким разрешением. Кроме того, в данной работе представлен новый вектор для гетерологической экспрессии генов, имеющий потенциал для использования в биотехнологии.

Цели и задачи исследования

Целью работы было создание генетической системы для мутагенеза и экспрессии реакционного центра Rba. sphaeroides in vivo, а также исследование влияния ближайшего белкового окружения бактериохлорофиллов РЦ на пигмент-белковые взаимодействия, на свойства и фотохимическую активность этого комплекса. В связи с поставленной целью были определены следующие задачи:

1. Провести сравнительный анализ последовательности ДНК рг^оперона из пурпурной бактерии Rba. sphaeroides штамм RV.

2. Создать серию плазмидных векторов для внесения направленных мутаций в L и М белковые субъединицы реакционного центра Rba. sphaeroides и дальнейшей экспрессии мутантных комплексов in vivo.

3. Сконструировать экспрессионный вектор для пурпурных бактерий на основе puf-промотора и протестировать его в периодических и непрерывных условиях культивирования Rba. sphaeroides.

4. Путем комбинации разных родительских штаммов Rba. sphaeroides и плазмид для комплементации получить рекомбинантные штаммы с фенотипами RC+LH1+LH2+, RC+ "LH1+ LH2" и RC+LH1"LH2".

5. Исследовать особенности координирования центрального атома магния мономерных бактериохлорофиллов со стороны белка с помощью аминокислотных замещений H(L153)L, H(L153)Y, H(L153)C, H(L153)M, H(M182)L, H(M182)L+ H(L153)Y, H(M 182)L+I(L 177)H.

6. Исследовать влияние белкового окружения димера БХл Р на свойства первичного донора электрона, пигмент-белковые взаимодействия и стабильность комплекса, используя широкий спектр подходов, включая кристаллизацию РЦ.

7. Исследовать возможность смещения гистидиновых лигандов каждого их бактериохлорофиллов димера на один виток a-спирали белка и влияние этого переноса на свойства первичного донора электрона.

Научная новизна

Впервые получены и охарактеризованы РЦ ЯЬа. ьркаегогйеъ с одиночными, и двойными аминокислотными замещениями в Ь- и М-субъединицах: 1(М206)Н, 1(1Л77)Н, Н(1Л73)Ы-1(Ы77)Н, Н(1Л73)Ь+1(Ы77)Т, 1(М206)Н+М202НЬ, Н(М182)Ь+1(Ь177)Н, Н(Ы53)М, Н(Ь153)У, а также с заменами фрагментов М-субъединицы вблизи димера БХл на симметричные им фрагменты из Ь-субъединицы. Получена новая информация о влиянии ряда консервативных аминокислотных остатков из белкового окружения бактериохлорофиллов на оптические свойства этих кофакторов, а также на пигментный состав, стабильность и фотохимическую активность РЦ.

Впервые показана возможность смещения гистидиновых лигандов бактериохлорофиллов специальной пары с позиций Ь173 (лиганд РА) и М202 (лиганд Рв) на позиции Ы77 и М206, соответственно. Показано, что в спектре поглощения РЦ Н(Ы73)Ь+1(1Л77)Н наблюдается беспрецедентный 46 нм коротковолновый сдвиг (^у полосы поглощения первичного донора электрона, свидетельствующий о значительном изменении экситонного взаимодействия внутри димера.

Проведено исследование свойств РЦ с аминокислотными замещениями изолейцинов на гистидины в симметричных позициях Ы77 и М206. Впервые установлено, что аминокислотное замещение 1(Ы77)Н влияет на координирование центрального атома магния двух ближайших бактериохлорофиллов: БХл Вв становится 6-координированным, а координирование БХл Рд со стороны белка значительно усиливается. Проведен анализ причин различного влияния этих замещений на свойства ближайших БХл и пигмент-белковые взаимодействия.

Получены экспериментальные доказательства того, что мутация 1(Ы77)Н приводит к прочному ковалентному связыванию БХл Рд с Ь -субъединицей. Исследована природа и проанализированы возможные причины нового вида взаимодействия БХл с белком. Впервые получена пространственная структура мутантного РЦ 1(Ы77)Н с разрешением 2.5 А. На основе рентгеноструктурных данных построена молекулярная модель, показывающая, что в мутантном РЦ возникает новая цепочка из координационной, водородной и ковалентной связей, соединяющих бактериохлорофиллы Вв и Рд. Обнаружено, что электронные плотности С2-метальной группы первого кольца БХл Рд и азота имидазольной группы объединены, что указывает на вовлеченность этих групп в образование ковалентной связи. Предложена химическая реакция, которая могла привести к ковалентной связи между белком и БХл.

Впервые установлено, что в РЦ с двойным замещением Н(М182)Ь+1(Ы77)Н координирование атома магния БХл Вв осуществляется с Р-стороны макроцикла. Модель

8

(^-координирования, построенная на основе кристаллической структуры РЦ 1(Ы77)Н предполагает участие в качестве лиганда кристаллографически определяемой молекулы воды, связанной водородной связью с остатком гистидина Ы77.

Впервые показано, что в мутантном РЦ Н(Ь153)У отсутствует мономерный бактериохлорофилл активной цепи переноса электрона. В этом РЦ наблюдается значительное замедление скорости переноса электрона и снижение квантового выхода образования состояния с разделенными зарядами Р+С?а до 7%.

Сконструирован новый экспрессионный вектор для пурпурных бактерий на основе сильного и хорошо регулируемого /»«/-промотора из ЯЬа. яркаего1с!е.^ ЫУ и показано, что использование непрерывного культивирования рекомбинантного штамма может многократно повысить выход экспрессируемого белка.

Научная и практическая значимость

Сконструирована генетическая система для направленного мутагенеза, позволяющая вносить направленные контролируемые аминокислотные замещения в Ь- и М-субъединицы реакционного центра ЯЬа. $рИаего1с1е8, а также в а- и [3-субъединицы корового светособирающего комплекса, ССК1. В рамках данной системы можно получать рекомбинантные штаммы ЯЬа. $ркаего1с1е.<> с разными сочетаниями фотосинтетических комплексов РЦ, ССК1 и ССК2. Штамм с фенотипом РЦ+ССКГССК2" позволяет исследовать свойства нестабильных мутантных РЦ без их выделения из мембран. В работе получено более 15 мутантных РЦ с аминокислотными замещениями вблизи бактериохлорофиллов. Получены новые данные о влиянии ряда консервативных аминокислотных остатков из белкового окружения бактериохлорофиллов на оптические и окислительно-восстановительные свойства этих кофакторов, а также на пигментный состав и фотохимическую активность РЦ. Получен мутантный РЦ Н(Ы73)Ь+1(Ы77)Н, в оптическом спектре которого наблюдается коротковолновый сдвиг С?у полосы поглощения первичного донора электрона на 46 нм, свидетельствующий об изменениях в экситонных взаимодействиях внутри димера БХл. Мутантные РЦ с замещениями в позициях Н(М202)Ь, Н(Ы73)Ь, Н(Ы73)Ь+1(Ы77)Н были использованы для получения приоритетной информации о ранних стадиях процессов преобразования световой энергии в энергию состояний с разделенными зарядами. Впервые показано, что в мутантном РЦ Н(Ы53)У отсутствует первичный акцептор электрона, мономерный бактериохлорофилл активной цепи. В этом РЦ наблюдается значительное замедление скорости переноса электрона и снижение на порядок квантового выхода образования состояния с разделенными зарядами Р+(}а . В РЦ с двойным замещением Н(1Л53)У+Н(М182)Ь наряду

9

с потерей БХл Вд происходит замена БХл Вв на БФео Фв, что приводит к переносу электрона с Р* в неактивную В-цепь на Фв и полному блокированию переноса электрона в А-цепь. Установлено, что одиночное замещение 1(Ы77)Н приводит к ковалентному связыванию БХл Рд с Ь -субъединицей. С помощью ряда биохимических подходов и анализа кристаллической структуры РЦ 1(Ы77)Н исследована природа и возможные причины возникновения нового взаимодействия, установлены боковые группы, участвовавшие в реакции. Предложен механизм химической реакции, в результате которой образовалась ковалентная связь БХл с белком. Исследованы участки РЦ, критичные для стабильного функционирования комплекса, что представляет интерес для практических задач использования РЦ как преобразователя солнечной энергии. Сконструирован и протестирован новый вектор для гетерологической экспрессии генов в пурпурных бактериях. Полученные экспериментальные данные имеют приоритетный характер и находятся в русле мировых исследований. Полученные результаты вносят существенный вклад в решение фундаментальных задач, связанных с исследованием механизмов преобразования световой энергии при фотосинтезе. Созданная в работе генетическая система для направленного мутагенеза пигмент-белковых комплексов пурпурных бактерий может найти применение при моделировании живых систем и создании преобразователей солнечной энергии. Вектор для гетерологической экспрессии имеет потенциал для использования в биотехнологии.

Основные положения, выносимые на защиту

1) На основе ри/-оперона ЯЬа. sphcieroid.es штамм IIV получена серия плазмидных векторов для внесения направленных мутаций в Ь и М белковые субъединицы реакционного центра и в а- и р-субъединицы светособирающего комплекса ССК1. Получены рекомбинантные штаммы КЬа. sphaeroides, экспрессирующие фотосинтетические комплексы в следующих сочетаниях: РЦ+ ССК1+ ССК2+, РЦ+ ССК1+ ССК2", РЦ+ ССКГ ССК2".

2) Сконструирован и протестирован экспрессионный вектор для пурпурных бактерий на основе ¿»«/-промотора. Максимальный 700-кратный уровень индукции ри промотора в новом экспрессионном векторе для КЬа. sphaeroides может быть достигнут при переходе из аэробных хемогетеротофных условий выращивания клеток к анаэробным фототрофным условиям. Время гетерологической экспрессии гена люциферазы под контролем /?«/-промотора многократно повышается при переходе от периодического к непрерывному культивированию рекомбинантного штамма.

Внесено более 15 направленных аминокислотных замещений в Ь- и М-субъединицы реакционного центра вблизи молекул БХл. С помощью направленных мутаций показано, что закономерности координирования центрального атома в бактериальном реакционном центре не являются

строгими. Ряд мутантных РЦ обладают уникальными свойствами и представляют интерес для исследования пигмент-белковых взаимодействий, а также механизмов первичных процессов фотосинтеза.

Гистидиновые лиганды бактериохлорофиллов специальной пары могут быть перемещены с позиций Ы73 (лиганд Рд) и М202 (лиганд Рв) на позиции Ы77 и М206, соответственно. Такое перемещение лигандов в РЦ Н(М202)ЫТ(М206)Н и Н(Ы73)Ь+1(Ы77)Н приводит к значительным коротковолновым сдвигам (¿у полосы поглощения первичного донора электрона, что свидетельствует об изменении экситонного взаимодействия внутри димера БХл.

Путем модификации белкового окружения мономерного БХл Вв возможно провести замещение этого БХл на БФео в РЦ Н(М182)Ь, получить альтернативное лигандирование БХл Вв с Р-стороны макроцикла в РЦ 1(Ы77)Н+Н(М182)Ь или его 6-координирование в РЦ 1(Ы77)Н. В случае с мономерным БХл активной цепи Вд возможна лишь замена лиганда с гистидина на цистеин или метионин. При замещении гистидина Ы53 на лейцин происходит значительная дестабилизация РЦ, а в случае замещения его на тирозин в РЦ Н(Ы53)У не происходит встраивания БХл Вд в комплекс РЦ.

Одиночное аминокислотное замещение 1(1Л77)Н приводит к 6-координированию БХл Вв и ковалентной связи между БХл Рд и Ь-субъединицей РЦ. Согласно кристаллической структуре РЦ 1(Ы77)Н, полученной с разрешением 2.5 А, в мутантном РЦ образуется цепочка новых связей, соединяющих атом магния БХл Вв, молекулу воды с Р-стороны БХл Вв и имидазольное кольцо гистидина Ы77. Благодаря этой цепочке связей обеспечивается шестое координирование атома магния Вв- В структуре РЦ 1(Ы77)Н электронные плотности имидазольного кольца гистидина Ы77 и метальной группы первого кольца БХл Рд объединены, что согласуется с образованием ковалентной связи между ними. По аналогии с гистидил-флавинами, предложена реакция ковалентного взаимодействия этих групп с участием молекулы кислорода и образованием гистидил-БХл.

Апробация результатов

Материалы диссертации были представлены на Ежегодной конференции японского биотехнологического общества (Япония, 1998), 10-м Международном симпозиуме по фотосинтезирующим прокариотам (Испания, 2000), Международной научной конференции «Биологические ресурсы и устойчивое развитие» (Пущино, 2001), XVII Пущинских чтениях по фотосинтезу (Пущино, 2002), Международной конференции "Фотосинтез и урожай" (Киев, 2002), 11-м Международном симпозиуме по фотосинтезирующим прокариотам (Япония, 2003), 6-й Международной конференции по морской биотехнологии (Япония, 2003), Международной конференции по первичным процессам фотосинтеза (Пущино, 2004), 29-м Конгрессе ФЭБС (Польша, 2004), 13-м Международном конгрессе по фотосинтезу (Канада, 2004), 3-м съезде биофизиков России (Воронеж, 2004), XVIII Пущинских чтениях по фотосинтезу "Преобразование энергии света при фотосинтезе" (2005), на Международном биофизическом конгрессе (Франция, 2005), XVIII Пущинских чтениях по фотосинтезу и Всероссийской конференции «Преобразование энергии света при фотосинтезе (Пущино, 2005), На международной конференции «Фотосинтез в постгеномную эру» (Пущино, 2006), Международном конгрессе по биохимии и молекулярной биологии (Япония, 2006), Международном симпозиуме по фотосинтетическим прокариотам (Франция, 2006), Международной конференции по тетрапиррольным фоторецепторам фотосинтетических организмов (Япония, 2007), Европейской биоэнергетической конференции (Ирландия, 2008), Международной конференции «Преобразование энергии света при фотосинтезе» (Пущино, 2008), на чтениях по фотосинтезу имени Гордона (США, 2008), на конференции «Фотохимия хлорофилла в модельных и природных системах» (Пущино, 2009), и на XIII Европейской конференции по спектроскопии биологических молекул (Италия, 2009), 15-м Международном конгрессе по фотосинтезу (Китай, 2010), Международной конференции "Исследование фотосинтеза для устойчивого развития" (Азербайджан, 2011 и Пущино, 2014), VI и VII съездах Российского фотобиологического общества (Шепси, 2011 и 2014), Международной конференции по тетрапиррольным фоторецепторам фотосинтетических организмов (Китай, 2013).

Публикации

По теме диссертации опубликовано более 40 работ (17 статей в реферируемых журналах, 2 обзора, 5 глав в книгах и сборниках и более 17 тезисов докладов).

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Состав и структура бактериальных реакционных центров

Первым мембранным пигмент-белковым комплексом, для которого была получена трехмерная структура, был РЦ из пурпурной бактерии Blastochloris (Blc.) viridis (Рис. 1 А) [Deisenhofer et al., 1984, 1985]. Позже были также получены структуры Rhodobacter (Rba.) sphaeroides (Рис. 1 Б) [Allen et al., 1986, 1987a] и Thermochromatium tepidum [Nogi et al., 2000]. РЦ Rba. sphaeroides состоит из трех полипептидов, L, М и Н, и десяти кофакторов -4-х молекул БХл а, 2-х молекул БФео а, 2-х молекул убихинона, иона негемового железа

9+ •

Fe и молекулы каротиноида (Рис.1 Б) [Camara-Artigas et al., 2002а]. В состав РЦ Blc. viridis входит четвертая цитохромная С-субъединица, расположенная на периплазматической стороне комплекса (Рис. 1 А).

Рисунок 1.1 Структура РЦ: А - Blc. viridis [PDB 1PRC, Deisenhofer and Michel, 1989] и Б -Rba. sphaeroides [PDB 1M3X, Camara-Artigas et al., 2002a].

L- и М-субъединицы РЦ содержат по пять трансмембранных а-спиралей [Deisenhofer et al., 1985; Deisenhofer and Michel, 1989; Allen et al., 1988], расположенных псевдо-симметрично друг другу относительно оси двусторонней симметрии. С а-спиралями нековалентно связаны кофакторы РЦ, организованные в две цепи переноса электрона, активную (A-цепь) и неактивную (B-цепь) [Feher et al., 1989]. На периплазматической стороне мембраны два БХл, Рд и Рв, формируют специальную пару

Личный вклад автора

Автору принадлежит ведущая роль в выборе стратегии исследований, разработке подходов к решению экспериментальных задач, в обсуждении и обобщении полученных результатов и написании публикаций совместно с соавторами. Результаты, обсуждаемые в работе, были получены либо лично автором, либо руководимыми им аспирантами. Благодарности

Автор выражает глубокую благодарность научному консультанту Шувалову В.А. и коллегам, участвовавшим в проведении исследований и/или обсуждении результатов: Фуфиной Т.Ю., Леоновой М.М., Хмельницкой Т.И., Хатыпову P.A., Хмельницкому А.Ю., Шкуропатову А.Я., Забелину A.A., Каминской О.П., Шкуропатовой В.А., Христину A.M., Цыганкову A.A., Яковлеву А.Г., Габдулхакову А.Г. (ИБ РАН), Проскурякову И.И., Хреновой М.Г. (Химический факультет МГУ им. М.В. Ломоносова), а также Волщуковой Т.С., помогавшей в проведении исследований. Работа финансировалась Российским фондом фундаментальных исследований, грантами Президента РФ, Программой Президиума РАН МКБ, государственными контрактами с Минобрнауки.

Р, перекрываясь на уровне первых колец тетрапирролов. Макроциклы БХл димера Р практически параллельны друг другу и перпендикулярны поверхности мембраны. Расстояние между плоскостями макроциклов Р составляет 3.4 Â. В результате такого сближения электронные плотности пары БХл обобществляются [Norris et al., 1971, 1975; Feher et al., 1975], что приводит к изменению свойств тетрапирролов. В частности, спектральные и окислительно-восстановительные свойства димера Р отличаются от свойств других бактериохлоринов РЦ. Остальные кофакторы - мономерные БХл Вд и Вв, БФео Ид и Нв, убихиноны QA и Qb, формируют две псевдо-симметричные ветви или цепи переноса электрона, А и В, идущие от димера БХл Р до иона Fe на цитоплазматической стороне мембраны. Единственный каротиноид сфероиден находится в окружении М-субъединицы в непосредственной близости от БХл Вв. Ось симметрии РЦ проходит перпендикулярно плоскости мембраны через центр димера БХл Р и атом негемового железа. Н-субъединица имеет одну трансмембранную а-спираль и большой цитоплазматический домен, отделяющий сайты связывания хинонов от водной фазы. В структуру РЦ включено большое количество молекул воды [Deisenhofer and Michel, 1989; Ermler et al., 1994; Camara-Artigas et al., 2002a], часть которых играет важную роль в функционировании комплекса [Fritzsch et al., 1998; Potter et al., 2005; Yakovlev et al., 2005]. Кроме того, во многих известных к настоящему времени структурах РЦ Rba. sphaeroides на поверхности комплекса кристаллографически определяется одна и более молекул липидов, которые, по-видимому, участвуют в стабилизации структуры [Jones, 2007]. Наряду с кардиолипином, встречаются фосфатидилхолин и гликолипид. Возможно, часть липидов теряется при очистке РЦ из мембран, поэтому нередко в структурах РЦ в потенциальных сайтах связывания липидов обнаруживаются молекулы детергентов.

1.2 Последовательность и скорости переноса электрона

В РЦ пурпурных бактерий из двух ветвей переноса электрона функционально активна только А-ветвь (Рис. 2). Под действием света в РЦ Rba. sphaeroides происходит трансмембранный перенос электрона. Он начинается с перехода димера БХл Р в возбужденное состояние Р*, и затем электрон передается с Р* на БХл ВА за ~3 пс (при комнатной температуре).

Важным этапом исследования первичного разделения зарядов между Р* и Вд стало обнаружение образования волновых ядерных пакетов по измерению стимулированного возбуждения [Vos et al., 1994] и по осцилляциям в продукте реакции Р+Вд~ [Yakovlev et al., 2000; Yakovlev et al., 2002; Yakovlev et al., 2003; Yakovlev et al., 2005]. Эти факты были интерпретированы как указание на перенос волновых пакетов из состояния Р* на продукт

15

Рисунок 1.2 Схема переноса электрона в реакционном центре Rba. sphaeroides. На схеме черным цветом показаны рассчитанные уровни свободной энергии всех возможных ион-радикальных пар, которые могут образоваться в РЦ дикого типа. Перенос электрона идет по А-ветви от первичного донора электрона, возбужденного димера бактериохлорофиллов (БХл), Р* на вторичный хинонный акцептор убихинон Qb через последовательное образование ряда промежуточных состояний с разделенными зарядами: Р+ВА", Р+НА", P+Qa", где ВА - первичный акцептор электрона, мономер БХл; НА - вторичный акцептор электрона, бактериофеофитин (БФео); QA - первичный хинонный акцептор электрона, молекула убихинона. Процесс сопровождается понижением уровней свободной энергии последующих состояний с разделенными зарядами [Arata and Parson, 1981; Gunner, 1991; Arlt et al., 1993; Nowak et al., 1998; Okamura et al., 2000; Parson and Warshel, 2009]. Серым цветом показаны рассчитанные уровни свободной энергии состояний Р+Фд" и Р+/?/ в мутантных РЦ H(M182)L [Katilius et al., 2002] и L(M214)H [Heller et al., 1995a; Яковлев и др, 2010], где Фв - молекула БФео, расположенная в сайте связывания мономерного БХл Вв неактивной, B-ветви; ß4 - молекула БХл, расположенная в сайте связывания БФео НА.

реакции Р+ВА", с преимущественной селекцией колебания около 32 см"1 и ее гармоник. В дальнейших исследованиях было сделано предположение, что это колебание отражает вращение молекулы воды, находящейся между Р и ВА [Yakovlev et al., 2005].

Далее электрон передается от БХл ВА" на БФео НА за -0,9 пс, и время рекомбинации состояния Р+НА" составляет 15 не при 293 К [Shuvalov and Parson, 1981; Arlt et al., 1993]. Все указанные процессы ускоряются в 2-3 раза при понижении температуры

ниже 77 К. Перенос электрона с НА" на убихинон Qa происходит за 200 пс при 293 К и 100 пс при 5 К. Состояние с разделенными зарядами Р+Нд" рекомбинирует в основное состояние за 120 мс при 293 К и за 30 мс при температуре ниже 77 К. Прямые и обратные скорости переноса электрона определяются разницей свободных энергий состояний с разделенными зарядами - AG [Schmidt et al., 1994, 1995]. Скачок энергии при переходе основного состояния димера Р в возбужденное Р* в Blc. viridis составляет 1240 мэВ, а в Rba. sphaeroides - 1380 мэВ (Рис. 2) [Gunner, 1991]. Далее перенос электрона идет с постепенным понижением уровней энергии [Шувалов, 1990 и 2000; Arata and Parson, 1981; Du et al., 1992; Lancaster and Michel, 2001; Parson and Warshel, 2009]. При образовании состояния P* наблюдается выцветание полос Р при 870 и 600 нм, а также возникает стимулированная флуоресценция в области 920 нм. По мере переноса электрона с Р* на Вд стимулированное излучение уменьшается, что сопровождается выцветанием полосы Вд при 800 нм и образованием полосы Вд" при 1020 нм [Kennis et al., 1997; Шувалов, 2000; Yakovlev et al., 2002]. Дальнейший перенос электрона от первичного хинона Qa до вторичного хинона Qb с образованием убисемихинона происходит в диапазоне десятков микросекунд и резко замедляется с понижением температуры. Время рекомбинации этого состояния составляет более 1 секунды [Шувалов, 2000, Lancaster, Michel, 2001]. Следующий светоиндуцированный перенос электрона от Р* приводит к полному восстановлению и двойному протонированию убисемихинона Qb, в результате чего формируется убихинол и забираются два протона из цитоплазмы. Восстановленный убихинол покидает РЦ, его заменяет молекула хинона из внутримембранного пула. Окисленный димер восстанавливается либо экзогенным цитохромом с-типа (как в Rba. sphaeroides) [Axelord et al., 2009], либо цитохромом интегральной С-субъединицы (как в Blc. viridis) [Lancaster and Michel, 2001], на который передаются электроны от убихинола через цитохромный bel комплекс. При этом на периплазматической стороне мембраны высвобождаются протоны, принятые со стороны цитоплазмы, и таким образом генерируется протонный градиент, используемый клеткой для синтеза восстановительных эквивалентов.

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Васильева, Людмила Григорьевна, 2015 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Забелин, А.А., Фуфина, Т.Ю., Васильева, Л.Г., Шкуропатова, В.А., Зверева, М.Г., Шкуропатов, А.Я., Шувалов, В.А. (2009) Мутантные реакционные центры Rhodobacter sphaeroides I(L177)H с прочно связанным бактериохлорофиллом а: структурные свойства и пигмент-белковые взаимодействия. Биохимия, 74, 86-94.

2. Зинченко, В.В. (1988) Генная инженерия пурпурных бактерий. В сб.«Фототрофные микроорганизмы», Наука Пущино, 36—43.

3. Зинченко, В.В., Коптева, А.В., Фролова, В.Д., Шестаков, С.В. (1988) Исследование экспрессии NIF и NTR генов Klebsiella pneumoniae в клетках Rhodobacter sphaeroides, Генетика, 24, № 6, 998-1007.

4. Леонова, М.М. (2013) Свойства реакционных центров пурпурной бактерии Rhodobacter sphaeroides с измененным белковым окружением бактериохлорофилла Вд, Диссертация на соискание уч. степени канд. биол. наук, Пущино.

5. Нолдинг, Б. (2005) Новейшие методы исследования биосистем, Техносфера, Москва.

6. Финкелыптейн, А.В., Птицын, О.Б. (2005) Физика белка, Изд-во Книжный Дом Университет, Москва, 456 с.

7. Фуфина, Т.Ю. (2011) Влияние аминокислотных замещений вблизи молекул бактериохлорофиллов РА и Вв на свойства реакционного центра Rhodobacter sphaeroides, Диссертация на соискание уч. степени канд. биол. наук., Пущино.

8. Шувалов, В.А. (1990) Первичное преобразование световой энергии при фотосинтезе. Москва, Наука, 209 с.

9. Шувалов, В.А. (2000) Преобразование солнечной энергии в первичном акте разделения зарядов в реакционных центрах фотосинтеза. Москва, Наука, 50 с.

10. Яковлев, А.Г., Васильева, Л.Г., Шкуропатов, А.Я., Шувалов, В.А. (2009) Первичные процессы разделения зарядов в реакционных центрах мутантов YM210L/FM197Y и YM210L Rhodobacter sphaeroides. Биохимия, 74, 1479-1487.

11. Яковлев, А.Г., Шкуропатова, Т.А., Шкуропатова, В.А., Шувалов, В.А. (2010) Фемтосекундный перенос электрона в реакционных центрах тройного мутанта SL178K/GM203D/LM214Н Rhodobacter sphaeroides. Биохимия, 75, 501-513.

12. Abresch, Е.С., Paddock, M.L., Villalobos, M., Chang, С., and Okamura, M.Y. (2008) Interaction between cytochrome and the photosynthetic reaction center from

Rhodobacter sphaeroides: role of interprotein hydrogen bonds in binding and electron transfer. Biochemistry, 47, 13318-13325.

13. Abresch, E.C., Gong, X.-M., Paddock, M.L., and Okamura M.Y. (2009) Electron transfer from cytochrome c? to reaction center: A transition state model for ionic strength effects due to neutral mutations. Biochemistry, 48, 11390-11398.

14. Albouy, D., Kuhn, M., Williams, J.C., Allen, J.P., Lubitz, W., Mattioli, T.A. (1997) Fourier transform Raman investigation of the electronic structure and charge localization in a bacteriochlorophyll-bacteriopheophytin dimer of reaction centers from Rhodobacter sphaeroides. Biochim. Biophys. Acta Bioenerg., 1321, 137-148.

15. Alden, R.G., Parson, W.W., Chu, Z.T., and Warshel, A. (1996) Orientation of the OH dipole of tyrosine (M)210 and its effect on electrostatic energies in photosynthetic bacterial reaction centers. J. Phys. Chem., 100, 16761-16770.

16. Allen, J.P., Feher, G., Yeates, T.O., Rees, D.C., Deisenhofer, J., Michel, H., and Huber, R. (1986) Structural homology of reaction centers from Rhodopseudomonas sphaeroides and Rhodopseudomonas viridis as determined by x-ray diffraction. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83,8589-8593.

17. Allen, J.P., Feher, G., Yeates, T.O., Komiya, H., and Rees, D.S. (1987 a) Structure of the reaction center from Rhodobacter sphaeroides R-26: the cofactors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 5730-5734.

18. Allen, F.H., Kennard, O., Watson, D.G., Brammer, L., Orpen, A.G., Taylor, R. (19876) Tables of bond lengths determined by X-Ray and neutron diffraction. Part I. Bond lengths in organic compounds, J. Chem. Soc. Perkin Trans., II, SI-SI9.

19. Allen, J.P., Feher, G., Yeates, T.O., Komiya, H., and Rees, D.C. (1988) Structure of the reaction center from Rhodobacter sphaeroides R-26: Protein-cofactor (quinones and Fe2+) interactions. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85(22), 8487-8491.

20. Allen, J.P. (1994) Crystallization of the reaction center from Rhodobacter sphaeroides in a new tetragonal form. Proteins: structure, function and genetics, 20, 283-286.

21. Allen, J.P., Artz, K., Lin, X., Williams, J.C., Ivancich, A., Albouy, D., Mattioli, T.A., Fetsch, A., Kuhn, M., and Lubitz, W. (1996) Effects of hydrogen bonding to a bacteriochlorophyll-bacteriopheophytin dimer in reaction centers from Rhodobacter sphaeroides. Biochemistry, 35, 6612-6619.

22. Allen, J.P., and Williams, J.C. (2011) The evolutionary pathway from anoxygenic to oxygenic photosynthesis examined by comparison of the properties of photosystem II and bacterial reaction centers. Photosynth. Res., 107, 59-69.

23. Arata, H. and Parson, W.W. (1981) Delayed fluorescence from Rhodopseudomonas sphaeroides reaction centers, enthalpy and free energy changes accompanying electron transfer from P-870 to quinones. Biochim. Biophys. Acta, 638, 201-209.

24. Arlt, T., Schmidt, S., Kaiser, W., Lauterwasser, C., Meyer, M., Scheer, H., and Zinth, W. (1993) The accessory bacteriochlorophyll: A real electron carrier in primary photosynthesis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 11757-11761.

25. Arlt, T., Dohse, B., Schmidt, S., Wachtveitl, J., Laussermair, E., Zinth, W., and Oesterhelt, D. (1996) Electron transfer dynamics of Rhodopseudomonas viridis reaction centers with a modifi ed binding site for the accessory bacteriochlorophyll. Biochemistry, 35, 9235-9244.

26. Axelrod, H.L., Abresch, E.C., Okamura, M.Y., Yeh, A.P., Rees, D.C., and Feher, G. (2002) X-ray structure determination of the cytochrome C2 reaction center electron transfer complex from Rhodobacter sphaeroides. J. Mol. Biol., 319, 501-515.

27. Axelrod, H.L., Miyashita, O., and Okamura, M.Y. (2009) Structure and function of the cytochrome ci'- Reaction center complex from Rhodobacter sphaeroides. In The Purple Phototrophic Bacteria. Advances in Photosynthesis and Respiration, vol. 28 (Hunter, C.N., Daldal, F., Thurnauer, M.C., and Beatty, J.T., eds.), Springer Science + Business Media B.V., pp. 323-336.

28. Balaban, T.S., Fromme, P., Holzwarth, A.R., Krauss, N., Prokhorenko, V.I. (2002) Relevance of the diastereotopic ligation of magnesium atoms of chlorophylls in Photosystem I, Biochim. Biophys. Acta, 1556, 197-207.

29. Bauer, C.E., Young, D.A., Marrs, B.L. (1988) Analysis of the Rhodobacter capsulatus puf-operon. Location of the oxygen-regulated promoter region and the identification of an additional /»«/-encoded gene. J. Biol. Chem., 263 (10), 4820^827.

30. Bauer, C.E. (1995) Regulation of photosynthesis gene expression. In Anoxygenic Photosynthetic Bacteria (Blankenship, R.E., Madigan, M.T., and Bauer, C.E., eds.), Kluwer, Dordrecht, The Netherlands, pp. 1221-1234.

31. Beekman, L.M.P., van Stokkum, I.H.M., Monshouwer, R., Rijnders, A.J., McGlynn, P., Visschers, R.W., Jones, M.R., and van Grondelle, R. (1996) Primary electron transfer in

membrane-bound reaction centers with mutations at the M210 position. J. Phys. Chem., 100, 7256-7268.

32. Belasco, J.G., Beatty, J.T., Adams, C.W. von Gabain, A., and Cohen, S.N. (1985) Differential expression of photosynthesis genes in R. capsulata results from segmental differences in stability within the polycistronic rxcA transcript. Cell, 40,171-181.

33. Breton, J. and Nabedryk, E. (1998) Proton uptake upon quinone reduction in bacterial reaction centers: IR signature and possible participation of a highly polarizable hydrogen bond network. Photosynth. Res., 55, 301-307.

34. Bylina, E.J., and Youvan, D.C. (1988) Directed mutations affecting spectroscopic and electron-transfer properties of the primary donor in the photosynthetic reaction center. Proc. Nail. Acad. Sci. USA, 85, 7226-7230.

35. Bylina, E.J., and Youvan, D.C. (1990) Mutagenesis of reaction center histidine LI 73 yields an L-side heterodimer. In Current Research in Photosynthesis, vol. I (Baltscheffsky, M., ed.), Kluwer Academic, The Netherlands, pp. 53-59.

36. Bylina, E.J., Ismail, S., and Youvan, D.C. (1986) Plasmid pU29, a vehicle for mutagenesis of the photosynthetic puf operon in Rhodopseudomonas capsúlate. Plasmid, 16, 175-181.

37. Bylina, E.J., Kolaczowski, S.V., Norris, S.V., and Youvan, C.Y. (1990) EPR characterization of genetically modified reaction centers of Rhodobacter capsulatus. Biochemistry, 29, 6203-6210.

38. Caffrey, M.S., Bartsch, R.G., and Cusanovich, M.A. (1992) Study of the cytochrome C2-reaction center interaction by site-directed mutagenesis. J. Biol. Chem., 267, 6317-6321.

39. Callahan, P., and Cotton, T. (1987) Assignment of bacteriochlorophyll a ligation state from absorption and resonans Raman spectra. J. Am. Chem. Soc., 109, 7001-7007.

40. Camara-Artigas, A., Bruñe, D., and Allen, J.P. (2002a) Interactions between lipids and bacterial reaction centers determined by protein crystallography. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99(17), 11055-11060.

41. Camara-Artigas A., Magee C., Goetsch A. and Allen J.P. (2002b) The structure of the heterodimer reaction center from Rhodobacter sphaeroides at 2.55 Á resolution Photosynth. Res., 74, 87-93.

42. Carter, B., Boxer, S.G., Holten, D., Kirmaier, C. (2009) Trapping the P+B(L)" initial intermediate state of charge separation in photosynthetic reaction centers from Rhodobacter capsulatus. Biochemistry, 48(12), 2571-2573.

43. Carter, B., Boxer, S.G., Holten, D., and Kirmaier, C. (2012) Photochemistry of a bacterial photosynthetic reaction center missing the initial bacteriochlorophyll electron acceptor. J. Phys. Chem. B, 116(33), 9971-9982.

44. Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W.W., and Prasher, D.C. (1994) Green fluorescent protein as a marker for gene expression, Science, 263, 802-805.

45. Chen, M., Schliep, M., Willows, R.D., Cai, Z.-L., Neilan, B. A., Scheer H. (2010) A Red-Shifted Chlorophyll, Science, 329, 1318-1319.

46. Chirino A.J., Lous E.J., Huber M., Allen J.P., Schenck C.C., Paddock M.L., Feher G., and Rees D.C. (1994) Crystallographic analyses of site-directed mutants of the photosynthetic reaction center from Rhodobacter sphaeroides. Biochemistry, 33, 4584-4593.

47. Chuang, J.I., Boxer, S.G., Holten, D., and Kirmaier, C. (2008) Temperature dependence of electron transfer to the M-Side bacteriopheophytin in Rhodobacter capsulatus reaction centers. J. Phys. Chem. B, 112, 5487-5499.

48. Coleman, W.J., and Youvan, D.C. (1990) Spectroscopic analysis of genetically modified photosynthetic reaction centers. Annu. Rev. Biophys. Biophys. Chem., 19, 333-367.

49. Coleman, W.J., and Youvan, D.C. (1993) Atavistic reaction center. Nature, 366, 517-518.

50. Columbus, L., Lipfert, J., Klock, H., Millett, I., Doniach, S. and Lesley, S.A. (2006) Expression, purification, and characterization of Thermotoga maritima membrane proteins for structure determination. Protein Sci., 15, 961-975.

51. Coomber, S.A., Chaudri, M., Connor, A., Britton, G., and Hunter, C.N. (1990) Localized transposon Tn5 mutagenesis of the photosynthetic gene cluster of Rhodobacter sphaeroides. Mol. Microbiol, 4, 977-989.

52. Deisenhofer, J., Michel, H. (1989) Nobel lecture. The photosynthetic reaction centre from the purple bacterium Rhodopseudomonas viridis. The EMBO J., 8, 2149-2170.

53. Deisenhofer, J.O., Epp, K., Miki, K., Huber, R., and Michel, H. (1984) X-ray structure analysis of a membrane protein complex. Electron density maps at 3 A resolution and a model of the chromophores of the photosynthetic reaction center from Rhodopseudomonas viridis. J. Mol. Biol, 180, 385-398.

54. Deisenhofer, J., Epp, K., Miki, K., Huber, R., and Michel, H. (1985) Structure of the protein subunits in the photosynthetic reaction center of Rhodopseudomonas viridis at 3 A resolutions. Nature, 318, 618-624.

55. Deisenhofer, J., Epp, O., Sinning, I., and Michel, H. (1995) Crystallographic refinement at 2.3 A resolution and refined model of the photosynthetic reaction centre from Rhodopseudomonas viridis. J. Mol. Biol., 246, 429—457.

56. DeHoff, B.S., Lee, J.K., Donohue, T.J., Gumport, R.I. and Kaplan, S. (1988) In vivo analysis of puf operon expression in Rhodobacter sphaeroides after deletion of a putative intercistronic transcription terminator, J.Bacteriol., 170, 4681-4692.

57. DeLano, W.L. (2002) The PyMOL Molecular Graphics System, DeLano Scientifi c, San Carlos, http://pymo1. sour cefor Re.net/

58. Deshmukh, S.S., Williams, J.C., Allen, J.P., and Kalman, L. (2011) Light-Induced Conformational Changes in Photosynthetic Reaction Centers: Dielectric Relaxation in the Vicinity of the Dimer. Biochemistry, 50, 340-348.

59. De Smet, L., Kostanjevecki, V., Guisez, Y., and van Beeumen, J. (2001) A novel system for heterologous expression of fl avocytochrome c in phototrophic bacteria using the Allochromatium vinosum rbcA promoter. Arch Microbiol, 176, 19-28.

60. Di Magno, T.J., Laible, P.D., Reddy, N.R., Small, G.J., Norris, J.R., Schiffer, M., Hanson, D.K. (1998) Protein-chromophore interactions: Spectral shifts report the consequences of mutations in the bacterial photosynthetic reaction center. Spectrochimica Acta, Part A, 54, 1247-1267.

61. Donohue, T.J., Kiley, P.J., and Kaplan, S. (1988) The puf-operon region of Rhodobacter sphaeroides. Photosynth. Res., 19, 39-61.

62. Dracheva, S.M., Drachev, L.A., Konstantinov, A.A., Semenov, A.Y., Skulachev, V.P., Arutjunjan, A.M., Shuvalov, V.A., and Zaberezhnaya, S.M. (1988) Electrogenic steps in the redox reactions catalyzed by photosynthetic reaction-centre complex from Rhodopseudomonas viridis. Eur. J. Biochem., 171, 253-264.

63. Du, M., Rosenthal, S.J., Xie, X., DiMagno, T.J., Schmidt, M., Hanson, D.K., Schiffer, M., Norris, J.R., and Fleming, G.R. (1992) Femtosecond spontaneous-emission studies of reaction centers from photosynthetic bacteria. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 8517-8521.

64. Duport, C., Meyer, C., Naud, I., and Jouanneau, Y. (1994) A new gene expression system based on a fructose-dependent promoter from Rhodobacter capsulatus. Gene, 145, 103108.

65. El-Kabbani, O., Chang, C.H., Tiede, D., Norris, J., Schiffer, M. (1991) Comparison of reaction centers from Rhodobacter sphaeroides and Rhodopseudomonas viridis: overall architecture and protein-pigment interactions. Biochemistry, 30, 5361-5369.

66. Ermler, U., Fritzsch, G., Buchanan, S.K., Michel, H. (1994) Structure of the photosynthetic reaction centre from Rhodobacter sphaeroides at 2.65 A resolution: cofactors and protein-cofactor interactions. Structure, 2, 925-936.

67. Fajer, J.; Borg, D.C., Forman, A., Dolphin, D., Felton, R.H. (1973) Anion radical of bacteriochlorophyll. J. Am. Chem. Soc., 95, 2739-2741.

68. Fajer, J., Brune, D.C., Davis, M.S., Forman, A., Spaulding, L.D. (1975) Primary charge separation in bacterial photosynthesis: Oxidized chlorophylls and reduced pheophytin. Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 72(12), 4956-4960.

69. Farchaus, J.W., and Oesterhelt, D.A. (1989) Rhodobacter sphaeroides puf L, M and X deletion mutant and its complementation in trans with a 5.3 kbpuf operon shuttle fragment. The EMBO J., 8, 47-54.

70. Feher, G., Hoff, A.J., Isaacson, R.A., and Ackerson, L.C. (1975) ENDOR experiments on chlorophyll and bacteriochlorophyll in vitro and in the photosynthetic unit. Ann. NY Acad. Sci. USA, 244, 239-259.

71. Feher G., Allen J.P., Okamura M.Y., and Rees D.C. (1989) Structure and function of bacterial photosynthetic reaction centres. Nature, 339, 111-116.

72. Fedor, L. (2006) Hexacoordination of bacteriochlorophyll in photosynthetic antenna LH1 Biochemistry, 45, 1910-1918.

73. Fodor, B.D., Kovacs, A.T., Csaki, R., Hunyadi-Gulyas, E., Klement, E., Maroti, G., Meszaros, L.S., Medzihradszky, K.F., Rakhely, G., Kovacs, K.S. (2004) Modular broad-host-range expression vectors for single-protein and protein complex purification. Appl. Environ. Microbiol., 70, 712-721.

74. Fritzsch, G., Kampmann, L., Kapaun, G., and Michel, H. (1998) Water clusters in the reaction centre of Rhodobacter sphaeroides. Photosynth. Res., 55, 127-132.

75. Frolov, D., Marsh, M., Crouch, L.I., Fyfe, P.K., Robert, B., van Grondelle, R., Hadfield, A., and Jones, M.R. (2010) Structural and spectroscopic consequences of hexacoordination of a bacteriochlorophyll cofactor in the Rhodobacter sphaeroides reaction center. Biochemistry, 49, 1882-1892.

76. Gallivan, J.P., Dougherty, D.A. (1999) Cation-pi interactions in structural biology. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 9459-9464.

77. Goldsmith, J.O., King, B., and Boxer, S.G. (1996) Mg coordination by amino acid side chains is not required for assembly and function of the special pair in bacterial photosynthetic reaction centers. Biochemistry, 35, 2421-2428.

78. Gong, X., Paddock, M., and Okamura, M. (2003) Interactions between cytochrome C2 and photosynthetic reaction center from Rhodobacter sphaeroides: Changes in binding affinity and electron transfer rate due to mutation of interfacial hydrophobic residues are strongly correlated. Biochemistry, 42, 14492-14500.

79. Grafton, A.K., and Wheeler, R.A. (1999) Amino acid protonation states determine binding sites of the secondary ubiquinone and its anion in the Rhodobacter sphaeroides photosynthetic reaction center. J. Phys. Chem. B., 103, 5380-5387.

80. Graichen, M.E., Jones, L.H., Sharma, B.V., van Spanning, R.J., Hosier, J.P., and Davidson, V.L. (1999) Heterologous expression of correctly assembled methylamine dehydrogenase in Rhodobacter sphaeroides. J. Bacteriol, 181, 4216—4222.

81. Graige, M.S., Feher, G., Okamura, M.Y. (1998) Conformational gating of the electron transfer reaction QA- QB—>QA QB- in bacterial reaction centers of Rhodobacter sphaeroides determined by a driving force assay. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 1167911684.

82. Gunner, M.R. (1991) The reaction center protein from purple bacteria: structure and function. Curr. Topics Bioenerg., 16, 319-367.

83. Haffa, A.L.M., Lin, S., Katilius, E., Williams, J.C., Taguchi, A.K.W., Allen, J.P., and Woodbury, N.W. (2002) The dependence of the initial electron-transfer rate on driving force in Rhodobacter sphaeroides reaction centers. J. Phys. Chem., 106, 7376-7384.

84. Heimdal, J., Jensen, K.P., Devarajan, A., Ryde, U. (2007) The role of axial ligands for the structure and function of chlorophylls. J Biol Inorg Chem., 12, 49-61.

85. Hamm, P., Gray, K.A., Oesterhelt, D., Feik, R., Scheer, H., and Zinth, W. (1993) Subpicosecond emission studies of bacterial reaction centers. Biochim. Biophys. Acta, 1142, 90-105.

86. Heller, B.A., Holten, D., and Kirmaier, C. (1995a) Control of electron-transfer between the L-side and M-side of photosynthetic reaction centers. Science, 269, 940-945.

87. Heller, B.A., Holten, D., and Kirmaier, C. (1995b) Characterization of bacterial reaction centers having mutations of aromatic residues in the binding-site of the bacteriopheophytin intermediary electron carrier. Biochemistry, 34, 5294-5302.

88. Holden-Dye, K., Crouch, L.I., Jones, M.R. (2008) Structure, function and interactions of the PufX protein. Biochim Biophys Acta., Ylll, 613-630.

89. Holden-Dye, K., Crouch, L.I., Williams, C.M., Bone, R.A., Cheng J., Bohles F., Heathcote, P., Jones, M.R. (2011) Opposing structural changes in two symmetrical polypeptides bring about opposing changes to the thermal stability of a complex integral membrane protein. Archives of Biochemistry and Biophysics, 505, 160-170.

90. Hoober, J.K., Eggink, L.L., Chen, M. (2007) Chlorophylls, ligands and assembly of lightharvesting complexes in chloroplasts, Photosynth. Res., 94, 387—400.

91. Hunter, C.N., McGlynn, P., Ashby, M.K., Burgess, J.G., and Olsen, J.D. (1991) DNA sequencing and complementation/deletion analysis of the bch A-puf operon region of Rhodobacter sphaeroides: in vivo mapping of the oxygen-regulated puf promoter. Mol. Microbiol., 5, 2649-2661.

92. Imhoff, J.F. (1995) Taxonomy and physiology of phototrophic purple bacteria and green sulfur bacteria. In Anoxygenic Photosynthetic Bacteria. Advances in Photosynthesis and Respiration, vol. 2 (Blankenship, R.E., Madigan, M.T., and Bauer, C.E., eds), Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, pp. 1-15.

93. Ivancich, A., Kobayashi, M., Drepper, F., Fathir, I., Saito, T., Nozawa, T., and Mattioli, T.A. (1996) Hydrogen-bond interactions of the primary donor of the photosynthetic purple sulfur bacterium Chromatium tepidum. Biochemistry, 35, 10529-10538.

94. Iwata, T., Paddock, M.L., Okamura, M.Y., Kandori H. (2009) Identification of FTIR bands due to internal water molecules around the quinone binding sites in the reaction center from Rhodobacter sphaeroides. Biochemistry, 48, 1220-1229.

95. Jackson, J.A., Lin, S., Taguchi, A.K.W., Williams, J.C., Allen, J.P., and Woodbury, N.W. (1997) Energy transfer in Rhodobacter sphaeroides reaction centers with the initial electron donor oxidized or missing. J. Phys. Chem. B, 101, 5747-5754.

96. Jaschke, P.R., Beatty, J.T. (2007) The photosystem of Rhodobacter sphaeroides assembles with zinc bacteriochlorophyll in a bchD (Magnesium chelatase) mutant. Biochemistry, 46, 12491-12500.

97. Jia, Y., DiMagno, T.J., Chan, C.-K., Wang, Z., Du, M., Hanson, D.K., Schiffer, M., Norris, J.R., Fleming, G.R., and Popov, M.S. (1993) Primary charge separation in mutant reaction centers of Rhodobacter capsulatus. J. Phys. Chem., 97, 13180-13191.

98. Johnson, E.T., and Parson, W.W. (2002) Electrostatic interactions in an integral membrane protein. Biochemistry, 41, 6483-6494.

99. Johnson, E.T., Muh, F., Nabedryk, E., Williams, J.C., Allen, J.P., Lubitz, W., Breton, J., and Parson, W.W. (2002) Electronic and vibronic coupling of the special pair of bacteriochlorophylls in photosynthetic reaction centers from wild-type and mutant strains of Rhodobacter sphaeroides. J. Phys. Chem. B, 106, 11859-11869.

100. Johnson, J.A., Wong, W.K.R., Beatty, J.T. (1986) Expression of cellulase genes in Rhodobacter capsulatus by use of plasmid expression vectors. J. Bacteriol., 167, 604610.

101. Jones, M.R. (2007) Lipids in photosynthetic reaction centres: Structural roles and functional holes. Progress in Lipid Research, 46, 56-87.

102. Jones, M.R. (2009) Structural plasticity of reaction centers from purple bacteria. In The Purple Phototrophic Bacteria. Advances in Photosynthesis and Respiration, vol. 28 (Hunter, C.N., Daldal, F., Thurnauer, M.C., and Beatty, J.T., eds.), Springer Science + Business Media B.V., pp. 295-321.

103. Jones, M.R., Visschers, R.W., van Grondelle, R., Hunter, C.N. (1992a) Construction and characterization of a mutant strain of Rhodobacter sphaeroides with the reaction center as the sole pigment-protein complex. Biochemistry, 31, 4458—4465.

104. Jones, M.R., Fowler, G.J.C., Gibson, L.C.D., Grief, G.G, Olsen, J.D., Crielaard, W., and Hunter, C.N. (1992b) Mutants of Rhodobacter sphaeroides lacking one or more pigmentprotein complexes and complementation with reaction-centre, LH1, and LH2 genes. Mol. Microbiol., 6(9), 1173-1184.

105. Kalman, L., LoBrutto, R., Allen, J.P., Williams, J.C. (1999) Modified reaction centres oxidize tyrosine in reactions that mirror photosystem II. Nature, 402, 696-699.

106. Kalman, L., LoBrutto, R., Narvaez, A.J., Williams, J.C., and Allen, J.P. (2003a) Correlation of proton release and electrochromic shifts of the optical spectrum due to oxidation of tyrosine in reaction centers from Rhodobacter sphaeroides. Biochemistry, 42, 1328013286.

107. Kalman, L., Williams, J.C., Allen, J.P. (20036) Proton release upon oxidation of tyrosine in reaction centers from Rhodobacter sphaeroides. FEBSLett., 545, 193-198.

108. Kamran, M., Friebe, V. M., Delgado, J. D., Aartsma, T. J., Frese, R. N. and Jones, M. R. (2015) Demonstration of asymmetric electron conduction in pseudosymmetrical photosynthetic reaction centre proteins in an electrical circuit. Nature commun. DOI: 10.103 8/ncomms7530.

109. Kaplan, S. (2002) Photosynthesis genes and their expression in Rhodobacter sphaeroides 2.4.1: A tribute of my students and associates. Photosynth. Res., 73, 95-108.

110. Kaplan, S., and Donohue, T.J. (1993) Genetic analysis of photosynthetic membrane biogenesis in Rhodobacter sphaeroides. In The Photosynthetic reaction center, vol. 2 (Deisenhofer, J., and Norris, J.P., eds.), Academic Press JNC, pp. 101-131.

111. Katilius, E., Turanchik, T., Lin, S., Taguchi, A.K.W., and Woodbury, N.W. (1999) B-side electron transfer in a Rhodobacter sphaeroides reaction center mutant in which the B-side monomer bacteriochlorophylls is replaced with bacteriopheophytin. J. Phys. Chem. B, 103, 7386-7389.

112. Katilius, E., Katiliene, Z., Lin, S., Taguchi, A.K.W., Woodbury, N.W. (2002) B side electron transfer in a Rhodobacter sphaeroides reaction center mutant in which the B side monomer bacteriochlorophyll is replaced with bacteriopheotypin: Low-temperature study and energetics of charge-separated states, J. Phys. Chem. B, 106, 1471-1475.

113. Katilius, E., Babendure, J.L., Katiliene, Z., Lin, S., Taguchi, A.K.W., and Woodbury, N.W. (2003) Manipulations of the B-side chargeseparated states' energetics in the Rhodobacter sphaeroides reaction center. J. Phys. Chem. B, 107, 12029-12034.

114. Katilius, E., Babendure, J.L, Lin, S., and Woodbury, N.W. (2004) Electron transfer dynamics in Rhodobacter sphaeroides reaction center mutants with a modified ligand for the monomer bacteriochlorophyll on the active side. Photosynth. Res., 81, 165-180.

115. Katona, G., Snijder, A., Gourdon, P., Andreasson, U., Hansson, O., Andreasson, L.E., Neutze, R. (2005) Conformational regulation of charge recombination reactions in a photosynthetic bacterial reaction center. Nat. Struct. Mol. Biol., 12, 630-631.

116. Kee, H.L., Laible, P.D., Bautista, J.A., Hanson, D.K., Holten, D., and Kirmaier, C. (2006) Determination of the rate and yield of B-side quinone reduction in Rhodobacter capsulatus reaction centers. Biochemistry, 45, 7314-7322.

117. Keen, N.T., Tamaki, S., Kobayashi, D., and Trollinger, D. (1988) Improved broad-host-range plasmids for DNA cloning in gram-negative bacteria. Gene, 70, 191-197.

118. Kennis, J.T., Shkuropatov, A.Y., Van Stokkum, I.H.M., Gast, P., Hoff, A.J., Shuvalov, V.A., and Aartsma, T.J. (1997) Formation of a long-lived P+BA~ state in plant pheophytin-exchanged reaction centers of Rhodobacter sphaeroides R26 at low temperature. Biochemistry, 36, 16231-16238.

119. King, B.A., de Winter, A., McAnaney, T.B., and Boxer, S.G. (2001) Excited state energy transfer pathways in photosynthetic reaction centers. 4. Asymmetric energy transfer in the heterodimer mutant. J. Phys. Chem. B, 105, 1856-1862.

120. Kirmaier, C., and Holten, D. (2009) Low-temperature studies of electron transfer to the M side of YFH reaction centers from Rhodobacter capsulatus. J. Phys. Chem. B, 113(4), 1132-1142.

121. Kirmaier, C., Holten, D., Bylina, E.J., Youvan, D.C. (1988) Electron transfer in a genetically modified bacterial reaction center containing a heterodimer. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 85, 7562-7566.

122. Kirmaier, C., Gaul, D., DeBey, R., Holten, D., and Schenck, C.C. (1991) Charge separation in a reaction center incorporating bacteriochlorophyll for photoactive bacteriopheophytin. Science, 251, 922-927.

123. Kirmaier, C., Weems, D., and Holten, D. (1999) M-side electron transfer in reaction center mutants with a lysine near the nonphotoactive bacteriochlorophyll. Biochemistry, 38, 11516-11530.

124. Kirmaier, C., Laible, P.D., Czarnecki, K., Hata, A.N., Hanson, D.K., Bocian, D.F., and Holten. D. (2002) Comparison of M-side electron transfer in Rb. sphaeroides and Rb. capsulatus reaction centers. J. Phys. Chem. B, 106, 1799-1808.

125. Kirmaier, C., Bautista, J.A., Laible, P.D., Hanson, D.K., and Holten, D. (2005) Probing the contribution of electronic coupling to the directionality of electron transfer in photosynthetic reaction centers. J. Phys. Chem. B, 109, 24160-24172.

126. Kramer, B., Kramer, W., Fritz, H.J. (1984) Different base/base mismatches are corrected with different efficiencies by the methyl-directed DNA mismatch-repair system of E. coli. Cell, 38(3), 879-887.

127 Krammer, E-M , Sebban, P, and Matthias, G (2009) Ullmann profile hidden Markov models for analyzing similarities and dissimilarities in the bacterial reaction center and photosystem II Biochemistry, 48(6), 1230-1243

128 Kuglstatter, A , Hell wig, P , Fritzsch, G , Wachtveitl, J , Oesterhelt, D , Mantele. W , and Michel, H (1999) Identification of a hydrogen bond in the phe Ml 97 -> tyr mutant reaction center of the photosynthetic purple bacterium Rhodobacter sphaeroides by X-ray crystallography and FTIR spectroscopy FEBS Lett, 463, 169-174

129 Laible, PD, Mielke, DL, and Hanson, DK (2009) Foreign gene expression in photosynthetic bacteria In The Purple Phototrophic Bacteria Advances in Photosynthesis and Respiration, vol 28 (Hunter, C N , Daldal, F , Thurnauer, M C , and Beatty, J T , eds ), Springer Science + Business Media B V , pp 839-860

130 Lancaster, CRD, and Michel, H (2001) Photosynthetic reaction centers of purple bacteria In Handbook oj Metalloproteins (Messerschmidt, A , Huber, R , Poulos, T , and Wieghardt, K , eds ), John Wiley &Sons, Ltd, Chichester pp 119-135

131 Lang, F S , and Oesterhelt, D (1989) Gene transfer system for Rhodopseudomonas viridis J Bacteriol, 171, 4425-4435

132 Laporte, LL, Palaniappan, V, Davis, DG, Kirmaier, C, Schenck, CC. Holten, D, Bocian, DF (1996) Influence of electronic asymmetry on the spectroscopic and photodynamic properties of the primary electron donor in the photosynthetic reaction center J Phys Chem , 100, 17696-17707

133 Lee, JK, Kiley PJ, and Kaplan S (1989) Posttranscriptional control of puc operon expression of B800-850 light-harvesting complex formation in Rhodobacter sphaeroides J Bacteriol ,171, 3391-3405

134 Liao, S M , Du, Q S , Meng, J Z , Pang, Z W , Huang, R B (2013) The multiple roles of histidine in protein interactions Chem Cent J, 7, 44-55

135 Lin, S , Jaschke. P R . Wang, H . Paddock, M . Tufts. A , Allen. I P . Rosell F I . Mauk, A G, Woodbury, N W, and Beatty J T (2009) Electron transfer in the Rhodobacter sphaeioides reaction center assembled with zinc bacteriochlorophyll Proc Natl Acad Sci USA, 106(21), 8537-8542

136 Lin, X . Murchison. H A Nagarajan, V . Parson,W W , Allen, J P . and Williams, J C (1994) Specific alteration of the oxidation potential of the electron donor in reaction centers from Rhodobaclei sphaeroides Proc Natl Acad Sci USA, 91, 10265-10269

137. Makrides, S.C. (1996) Strategies for achieving high-level expression of genes in Escherichia coli. Microbiol. Rev., 60, 512-538.

138. Marcus, R.A., (1992) Electron transfer reactions in chemistry: theory and experiment. Nobel Lecture, December 8.

139. Marcus, R.A., and Sutin, N. (1985). Electron transfers in chemistry and biology. Biochim. Biophys. Acta Reviews on Bioenergetics, 811(3), 265-322.

140. Maroti, P., Kirmaier, C., Wraight, C., Holten, D., and Pearlstein, R.M. (1985) Photochemistry and electron transfer in borohydride-treated photosynthetic reaction centers, Biochim. Biophys. Acta, 810, 132-139.

141. Mattioli, T.A., Williams, J.C., Allen, J.P., and Robert, B. (1994) Changes in primary donor hydrogen-bonding interactions in mutant reaction centers from Rhodobacter sphaeroides: Identification of the vibrational frequencies of all the conjugated carbonyl groups. Biochemistry, 33, 1636-1643.

142. Mattioli, T.A., Lin, X., Allen, J.P., and Williams, J.C. (1995) Correlation between multiple hydrogen-bonding and alteration of the oxidation potential of the bacteriochlorophyll dimer of reaction centers from Rhodobacter sphaeroides. Biochemistry, 34, 6142-6152.

143. McAuley-Hecht, K.E., Fyfe, P.K., Ridge, J.P., Prince, S.M., Hunter, C.N., Isaacs, N.W., Cogdell, R.J., and Jones, M.R. (1998) Structural studies of wild-type and mutant reaction centers from an antenna-deficient strain of Rhodobacter sphaeroides: monitoring the optical properties of the complex from bacterial cell to crystal. Biochemistry, 37, 4740-4750.

144. McAuley, K.E., Fyfe, P.K., Ridge, J.P., Cogdell, R.J., Isaacs, N.W., and Jones, M.R. (2000) Ubiquinone binding, ubiquinone exclusion, and detailed cofactor conformation in a mutant bacterial reaction center. Biochemistry, 39, 15032-15043.

145. McDowell, L.M., Gaul, D., Kirmaier, C., Holten, D., and Schenck, C.C. (1991) Investigation into the source of electron transfer asymmetry in bacterial reaction centers. Biochemistry, 30, 8315-8322.

146. Mewies, M., Mclntire, W.S., Scrutton, N.S. (1998) Covalent attachment of flavin adenine dinucleotide (FAD) and flavin mononucleotide (FMN) to enzymes: The current state of affairs. Protein Science, 7, 7-20.

147. Michel, H., and Deisenhofer, J. (1988) Relevance of the photosynthetic reaction center from purple bacteria to the structure of Photosystem II. Biochemistry, 27, 1-7.

148. Miyake, J., Mao, X.-Y., and Kawamura, S. (1984) Photoproduction of hydrogen from glucose by a co-culture of a photosynthetic bacterium and Clostridium butyricum. J. Ferment. Technol., 62, 531-535.

149. Moore, L., and Boxer, S.G. (1998) Inter-chromophore interactions in pigment-modified and dimer-less bacterial photosynthetic reaction centers. Photosynth. Res., 55, 173-180.

150. Moore, L.J., Zhou, H.L., and Boxer, S.G. (1999) Excited-state electronic asymmetry of the special pair in photosynthetic reaction center mutants: Absorption and stark spectroscopy. Biochemistry, 38, 11949-11960.

151. Morris, Z.S., Hanson, D.K., Pokkuluri, P.R., Mets, D.G., Hata, A.N., Poluektov, O.G., Thurnauer, M.C., Schiffer, M., Laible, P.D. (2003) Lysine substitutions near photoactive cofactors in the bacterial photosynthetic reaction center have opposite effects on the rate of triplet energy transfer, Chem. Phys., 294, 329-346.

152. Moser, C.C., Keske, J.M., Warncke, K., Farid, R.S., and Dutton, P.L. (1992) Nature of biological electron transfer. Nature, 355(6363), 796-802.

153. Miih, F., Lendzian, F., Roy, M., Williams, J.C., Allen, J.P., Lubitz, W. (2002) Pigmentprotein interactions in bacterial reaction centers and their influence on oxidation potential and spin density distribution of the primary donor. J. Phys. Chem. B, 106, 3226-3236.

154. Murchison, H.A., Alden, R.G., Allen, J.P., Peloquin, J.M., Taguchi, A.K.W., Woodbury, N.W., and Williams, J.C. (1993) Mutations designed to modify the environment of the primary electron donor of the reaction center from Rhodobacter sphaeroides: phenylalanine to leucine at LI 67 and histidine to phenylalanine at LI 68. Biochemistry, 32, 3498-3505.

155. Nabedryk, E., Allen, J.P., Taguchi, A.K.W., Williams, J.C., Woodbury, N.W., and Breton, J. (1993) Fourier transform infrared study of the primary electron donor in chromatophores of Rhodobacter sphaeroides with reaction centers genetically modified of residues Ml60 and L131. Biochemistry, 32, 13879-13885.

156. Nabedryk, E., Schulz, C., Muh, F., Lubitz, W., and Breton, J. (2000) Heterodimeric versus homodimeric structure of the primary electron donor in Rhodobacter sphaeroides reaction centers genetically modified at position M202. Photochem. Photobiol., 71, 582-588.

157. Nabedryk, E., and Breton, J. (2008) Coupling of electron transfer to proton uptake a the QB site of the bacterial reaction center: A perspective from FTIR spectroscopy. Biochim. Biophys. Acta, 1777, 1229-1248.

158. Nagamine, Y., Kawasugi, T., Miyake, M., Asada, Y. and Miyake, J. (1996) Characterization of photosynthetic bacterium Rhodobacter sphaeroides RV for hydrogen production, J. Mar. Biotechnol. 4, 34-37.

159. Nagarajan, V., Parson, W.W., Davis D., and Schenck C.C. (1993) Kinetics and free energy gaps of electron-transfer reactions in Rhodobacter sphaeroides reaction centers. Biochemistry, 32, 12324-12336.

160. Nagashima, K., Matsuura, N., Wakam, A., Hiraishi, K., Shimada, K. (1997) Nucleotide sequences of genes coding for photosynthetic reaction centers and light-harvesting proteins of Acidiphilium rubrum and related aerobic acidophilic bacteria. Plant Cell Physiol., 38, 1249-1258.

161. Narvaez, A.J., LoBrutto, R., Allen, J.P., and Williams, J.C. (2004) Trapped tyrosyl radical populations in modified reaction centers from Rhodobacter sphaeroides. Biochemistry, 43, 14379-14384.

162. Niederman, R.A., Mallon, D.E., and Langan, J.J. (1976) Membranes of Rhodopseudomonas sphaeroides. IV. Assembly of chromatophores in low-aeration cell suspensions. Biochim. Biophys. Acta, 440, 429-447.

163. Nogi, T., Fathir, I., Kobayashi, M., Nozawa, T., and Miki, K. (2000) Crystal structures of photosynthetic reaction center and highpotential iron-sulfur protein from Thermochromatium tepidum: Thermostability and electron transfer. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 13561-13566.

164. Norris, J.R., Uphaus, R.A., Crespi, H.L., and Katz, J.J. (1971) Electron Spin Resonance of Chlorophyll and the Origin of Signal I in Photosynthesis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 68, 625-628.

165. Norris, J.R., Scheer, H., and Katz, J.J. (1975) Models for antenna and reaction center chlorophylls. Ann. NY Acad. Sci. USA, 244, 260-280.

166. Nowak, F.R., Kennis, J.T.M., Franken, E.M., Shkurupatov, A.Ya., Yakovlev, A.G., Gast, P., Hoff, A.J., Aartsma, T.J., and Shuvalov, V.A. (1998) The energy level of P+BA" in plant pheophytin-exchanged bacterial reaction centers probed by the temperature dependence of delayed fluorescence. In Photosynthesis: Mechanisms and Effects, vol. 2 (Garab, G., ed.), Kluwer Academic Publishers, the Netherlands, pp. 783-786.

167. Oba, T., Tamiaki, H. (2002) Which side of the pi-macrocycle plane of (bacterio)chlorophylls is favored for binding of the fifth ligand? Photosynth. Res., 74, 1-10.

168. Okamura, M.Y., Steiner, L.A., Feher, G. (1974) Characterization of reaction centers from photosynthetic bacteria. 1. Subunit structure of the protein mediating the primary photochemistry in Rhodopseudomonas sphaeroides R-26. Biochemistry, 13, 1394—1403.

169. Okamura, M.Y., Paddock, M.L., Graige, M.S., and Feher, G. (2000) Proton and electron transfer in bacterial reaction centers. Biochim. Biophys. Acta Bioenerg., 1458,148-163.

170. O'Reilly, J.E. (1973) Oxidation-reduction potential of the ferro-ferricyanide system in buffer solutions, Biochim. Biophys. Acta, 292, 509-515.

171. Paddock, M.L., Rongey, S.H., Feher, G., and Okamura, M.Y. (1989) Pathway of proton transfer in bacterial reaction centers: Replacement of glutamatic acid 212 in the L subunit by glutamine inhibits quinine (secondary acceptor) turnover. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 6602-6606.

172. Paddock, M.L., Chang, C., Xu, Q., Abresch, E.C., Axelrod, H.L., Feher, G., and Okamura, M.Y. (2005) Quinone (QB) reduction by B-branch electron transfer in mutant bacterial reaction centers from Rhodobacter sphaeroides: Quantum efficiency and X-ray structure. Biochemistry, 44, 6920-6928.

173. Paddock, M.L., Flores, M., Isaacson, R.A., Chang, C., Abresch, E.C., Selvaduray, P., Okamura, M.Y. (2006) Trapped conformational states of semiquinone (D+QB~ ) formed by B branch electron transfer at low temperature in Rhodobacter sphaeroides reaction centers. Biochemistry, 46, 14032-14042.

174. Parson, W.W., Warshel, A. (1987) Spectroscopic properties of photosynthetic reaction centers: 2. Application of the theory to Rhodopseudomonas viridis. J. Am. Chem. Soc., 109, 6152-6163.

175. Parson, W.W., and Warshel, A. (2009) Mechanism of charge separation in purple bacterial reaction centers. In: The Purple Phototrophic Bacteria, vol. 28 (Hunter, C.N., Daldal, F., Thurnauer, M.C., and Beatty, J.T., eds.). Springer, Dordrecht, The Netherlands, pp. 337353.

176. Parson, W.W., Chu, Z.-T., and Warshel, A. (1990) Electrostatic control of charge separation in bacterial photosynthesis. Biochim. Biophys. Acta, 1017, 251-272.

177. Potter, J.A., Fyfe, P.K., Frolov, D., Wakeham, M.C., van Grondelle, R., Robert, B., Jones M.R. (2005) Strong effects of an individual water molecule on the rate of primary charge separation in the Rhodobacter sphaeroides reaction centre. J. Biol. Chem., 280, 2715527164.

178. Rappaport, F., and Diner, B.A. (2008) Primary photochemistry and energetics leading to the oxidation of the (Mn)4Ca cluster and to the evolution of molecular oxygen in Photosystem II, Coordination Chemistry Reviews, 252, 259-272.

179. Ridge, J.P., van Brederode, M.E., Goodwin, M.G., van Grondelle, R., and Jones, M.R. (1999) Mutations that modify or exclude binding of the Qa ubiquinone and carotenoid in the reaction center from Rhodobacter sphaeroides. Photosynth. Res., 59, 9-26.

180. Roberts, J.A., Holten, D., and Kirmaier, C. (2001) Primary events in photosynthetic reaction centers with multiple mutations near the photoactive electron carriers. J. Phys. Chem. B, 105, 5575-5584.

181. Robles, S.J., Breton, J., and Youvan, D.C. (1990) Partial symmetrization of the photosynthetic reaction center. Science, 248, 1402-1405.

182. Roszak, A.W., Howard, T.D., Southall, J., Gardiner, A.T., Law, C.J., Isaacs, N.W., and Cogdell, R.J. (2003) Crystal structure of the RC-LH1 core complex from Rhodopseudomonas palustris. Science, 302, 1969-1972.

183. Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T. (1989) Molecular cloning: A laboratory manual. 2nd Ed. (Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T., ads.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor NY, 1626 p.

184. Sandberg, L., and Edholm, O. (2001) Calculated solvation free energies of amino acids in a dipolar approximation. J. Phys. Chem., 105, 273-281.

185. Schmidt, S., Arlt, T., Hamm, P., Huber, H., Nagele, T., Wachtveitl, J., Meyer, M., Scheer, H., and Zinth, W. (1994) Energetics of the primary electron-transfer reaction revealed by ultrafast spectroscopy on modified bacterial reaction centers. Chem. Phys. Lett., 223, 116— 120.

186. Schmidt, S., Arlt, T., Hamm, P., Huber, H., Nagele, T., Wachtveitl, J., Zinth, W., Meyer, M., and Scheer, H. (1995) Primary electron-transfer dynamics in modified bacterial reaction centers containing pheophytin a instead of bacteriopheophytin a. Spectrochim. Acta A, 51, 1565-1578.

187. Scheer, H., Struck, A. (1993) Bacterial reaction centers with modified tetrapyrrole chromophores. In: The Photosynthetic Reaction Center, Vol. 1 (Deisenhofer, J., and Norris, J.R., eds.), Academic Press, San Diego, pp. 157-192.

188. Shochat, S., Arlt, T., Francke, C., Gast, P., van Noort, P.I., Otte, S.C., Schelvis, H.P.M., Schmidt, S., Vijgenboom, E., Vrieze, J., Zinth, W., and Hoff, A.J. (1994) Spectroscopic

characterization of reaction centers of the (M)Y210W mutant of the photosynthetic bacterium Rhodobacter sphaeroides. Photosynth. Res., 40, 55-66.

189. Shuvalov, V.A., and Parson, W.W. (1981) Energies and kinetics of radical pairs involving bacteriochlorophyll and bacteriopheophytin in bacterial reaction centers. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 957-961.

190. Shuvalov, V.A., Shkuropatov, A.Ya., Kulacova, S.M., Ismailov, M.A., Shkuropatova, V.A. (1986) Photoreactions of bacteriopheophytins and bacteriochlorophylls in reaction center of Rhodopseudomonas sphaeroides and Chloroflexus aurantiacus. Biochim. Biophys. Acta., 849, 337-346.

191. Simon, R., Priefer, U., Puhler, A. (1983) A broad host range mobilization system for in vivo genetic engineering: transposon mutagenesis in Gram negative bacteria. Biotechnology, 1(9), 784-791.

192. Spiedel, D., Jones, M.R., and Robert, B. (2002) Tuning of the redox potential of the primary electron donor in reaction centres of purple bacteria: Effects of amino acid polarity and position. FEBSLett., 527, 171-175.

193. Stilz, H.U., Finkele, U., Holzapfel, W., Lauterwasser, C., Zinth, W., and Oesterhelt, D. (1994) Influence of M-subunit Thr222 and Trp252 on quinone binding and electron-transfer in Rhodobacter sphaeroides reaction centers. Eur. J. Biochem., 223, 233-242.

194. Stacker, J.W., Taguchi, A.K.W., Murchison, H.A., Woodbury, N.W., and Boxer, S.G. (1992) Spectroscopic and redox properties of Syml and (M)F195H - Rhodobacter capsulatus reaction center symmetry mutants which affect the initial electron-donor. Biochemistry, 31, 10356-10362.

195. Stowell, M.H.B., McPhillips, T.M., Rees, D.C., Soltis, S.M., Abresch, E., Feher, G. (1997) Light-induced structural changes in photosynthetic reaction center: Implications for mechanism of electron-proton transfer. Science, 276, 812-816.

196. Straley, S.C., Parson, W.W., Mauzerall, D.C., Clayton, R.K. (1973) Pigment content and molar extinction coefficients of photochemical reaction centers from Rhodopseudomonas spheroids. Biochim. Biophys. Acta, 305(3), 597-609.

197. Suzuki, T., Tsygankov, A., Miyake, J., Tokiwa, Y., and Asada, Y. (1995) Accumulation of poly-(hydroxybutyrate) by a non-sulfur photosynthetic bacterium Rhodobacter sphaeroides RV at different pH. Biotechnol. Lett., 17, 395-400.

198. Swingley, W.D., Blankenship, R.E., and Raymond, J. (2009) Evolutionary relationships among purple photosynthetic bacteria and the origin of proteobacterial photosynthetic systems. In The Purple Phototrophic Bacteria. Advances in Photosynthesis and Respiration, vol. 28 (Hunter, C.N., Daldal, F., Thurnauer, M.C., and Beatty, J.T., eds.), Springer Science + Business Media B.V., pp. 17-29.

199. Taguchi, A.K.W., Stocker, J.W., Alden, R.G., Causgrove, T.P., Peloquin, J.M., Boxer, S.G., and Woodbury, N.W. (1992) Biochemical characterization and electron transfer reactions of Syml, a Rhodobacter capsulatus reaction center symmetry mutant which affects the initial electron donor. Biochemistry, 31,10345-10355.

200. Taguchi, A.K.W., Eastman, J.E., Gallo, D.M., Sheagley, E., Xiao, W.Z., and Woodbury, N.W. (1996) Asymmetry requirements in the photosynthetic reaction center of Rhodobacter capsulatus. Biochemistry, 35, 3175-3186.

201. Tetreault, M., Rongey, S.H., Feher, G., and Okamura, M. (2001) Interaction between cytochrome c-i and the photosynthetic reaction center from Rhodobacter sphaeroides: Effects of charge-modifying mutations on binding and electron transfer. Biochemistry, 40, 8452-8462.

202. Thielges, M., Uyeda, G., Camara-Artigas, A., Kalman, L., Williams, J.C., and Allen, J.P. (2005) Design of a redox-linked active metal site: Manganese bound to bacterial reaction centers at a site resembling that of Photosystem II. Biochemistry, 44, 7389-7394.

203. Tsukatani, Y., Matsuura, K., Masuda, S., Shimada, K., Hiraishi, A., Nagashima, K.V.P. (2004) Phylogenetic distribution of unusual triheme to tetraheme cytochrome subunit in the reaction center complex of purple photosynthetic bacteria. Photosynth. Res., 79, 83-91.

204. Ullmann, G.M., Kloppmann, E., Essigke, T., Krammer, E.M., Klingen, A.R., Becker, T., and Bombarda, E. (2008) Investigating the mechansims of photosynthetic proteins using continuum electrostatics. Photosynth. Res., 97, 33-53.

205. Umena, Y., Kawakami, K., Shen, J.-R., and Kamiya, N. (2011) Crystal structure of oxygen-evolving photosystem II at a resolution of 1.9A. Nature, 473, 55-61.

206. Van der Rest, M., Gingras, G. (1974) The pigment complement of the photosynthetic reaction center isolated from Rhodospirillum rubrum. J. Biol. Chem., 249, 6446-6453.

207. Vermeglio, A., and Joliot, P. (1999) The photosynthetic apparatus of Rhodobacter sphaeroides. Trends in Microbiology, 7(11), 435-440.

208. Vos, M.H., Lambry, J.C., Robles, S.J., Youvan, D.C., Breton, J., and Martin, J.L. (1991) Direct observation of vibrational coherence in bacterial reaction centers using femtosecond absorption spectroscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 8885-8889.

209. Vos, M.H., Rappaport, F., Lambry, J.C., Breton, J., and Martin, J.L. (1993) Visualization of coherent nuclear motion in a membrane-protein by femtosecond spectroscopy. Nature, 363, 320-325.

210. Vos, M.H., Jones, M.R., McGlynn, P., Hunter, C.N., Breton, J., and Martin, J.L. (1994) Influence of the membrane environment on vibrational motions in reaction centers of Rhodobacter sphaeroides. Biochim. Biophys. Acta, 1186, 117-122.

211. Vos, M.H., Jones, M.R., Breton, J., Lambry, J.C., and Martin, J.-L. (1996) Vibrational dephasing of long- and short-lived primary donor excited states in mutant reaction centers of Rhodobacter sphaeroides. Biochemistry, 35, 2687-2692.

212. Wachtveitl, J., Farchaus, J.W., Das, R., Lutz, M., Robert, B., and Mattioli, T.A. (1993) Structure, spectroscopic and redox properties of Rhodobacter sphaeroides reaction centers bearing point mutations near the primary electron donor. Biochemistry, 32, 12875-12886.

213. Wakeham, M.C., Goodwin, M.G., McKibbin, C., and Jones, M.R. (2003) Photoaccumulation of the P+QB radical pair state in purple bacterial reaction centres that lack the Qa ubiquinone. FEBS Letts., 540, 234-240.

214. Wakeham, M.C., Breton, J., Nabedryk, E., and Jones, M.R. (2004) Formation of a semiquinone at the Qb site by A-branch or B-branch electron transfer in the reaction centre from Rhodobacter sphaeroides. Biochemistry, 43, 4755^4763.

215. Walden, S.E. and Wheeler, R.A. (2002) Protein conformational gate controlling binding site preference and migration for ubiquinone-B in the photosynthetic reaction center of Rhodobacter sphaeroides, J. Phys. Chem. B., 106, 3001-3006.

216. Wang, H., Lin, S., Allen, J.P., Williams, J.C., Blankert, S., Laser, C., Woodbury, N.W. (2007). Protein dynamics control the kinetics of initial electron transfer in photosynthesis. Science, 316, 747-750.

217. Watson, A.J., Fyfe, P.K., Frolov, D., Wakeham, M.C., Nabedryk, E., van Grondelle, R., Breton, J., and Jones, M.R. (2005) Replacement or exclusion of the B-branch bacteriopheophytin in the purple bacterial reaction centre: the HB cofactor is not required for assembly or core function of the Rhodobacter sphaeroides complex. Biochim. Biophys. Acta Bioenerg., 1710, 34^46.

218. Wellington, C.L., Taggart, A.K.P., and Beatty, J.T. (1991) Functional significance of overlapping transcripts of crtEF, bchCA, and puf photosynthesis gene operons in Rhodobacter capsulatus. J. Bacteriol., 173, 2954-2961.

219. Wellington, C.L., Bauer, C.E., Beatty, J.T. (1992) Photosynthesis gene superoperons in purple nonsulfur bacteria: the tip of the ice berg? Can. J. Micribiol., 38, 20-27.

220. Williams, J.C., Alden, R.G., Murchison, H.A., Peloquin, J.M., Woodbury, N.W., Allen, J.P. (1992) Effect of mutations near the bacteriochlorophylls in reaction centers from Rhodobacter sphaeroides, Biochemistry, 31, 11029-11037.

221. Williams, J.C., and Taguchi, A.K.W. (1995) Genetics manipulation of purple photosynthetic bacteria. In Anoxygenic Photosynthetic Bacteria, vol. 2. (Blankenship, R.E., Madigan, M.T., and Bauer, C.E., eds.), Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, The Netherlands, pp. 1029-1065.

222. Williams, J.C., Steiner, L.A., Feher, G., and Simon, M.I. (1984) Primary structure of the L subunit of the reaction center from Rhodopseudomonas sphaeroides. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 7303-7307.

223. Williams, J.C., Alden, R.G., Murchison, H.A., Peloquin, J.M., Woodbury, N.W., and Allen, J.P. (1992) Effects of mutations near the bacteriochlorophylls in reaction centers from Rhodobacter sphaeroides. Biochemistry, 31, 11029-11037.

224. Williams, J.C., Haffa, A.L.M., McCulley, J.L., Woodbury, N.W., and Allen, J.P. (2001) Electrostatic interactions between charged amino acid residues and the bacteriochlorophyll dimer in reaction centers from Rb. sphaeroides. Biochemistry, 40, 15403—15407.

225. Williams, J.C., and Allen, J.P. (2009) Directed modification of reaction centers from purple bacteria, In: The Purple Phototrophic Bacteria, Advances in Photosynthesis and Respiration, vol. 28 (Hunter, C.N., Daldal, F., Thurnauer, M.C., and Beatty, J.T., eds.), Springer, Dordrecht, The Netherlands, pp. 337-353.

226. Woodbury, N.W., and Allen, J.P. (1995) The pathway, kinetics and thermodynamics of electron transfer in wild type and mutant reaction centers of purple nonsulfur bacteria. In Anoxygenic Photosynthetic Bacteria, Advances in Photosynthesis and Respiration, vol. 2 (Blankenship, R.E., Madigan, M.T., and Bauer, C.E., eds.), Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, The Netherlands, pp. 527-557.

227. Wraight, C.A., and Gunner, M.R., (2009) The acceptor quinones of purple photosynthetic bacteria - structure and spectroscopy. In: The Purple Phototrophic Bacteria, Advances in

Photosynthesis and Respiration, vol. 28 (Hunter, C.N., Daldal, F., Thurnauer, M.C., and Beatty, J.T., eds.), Springer, Dordrecht, the Netherlands, pp. 379-405.

228. Yakovlev, A.G., Shkuropatov, A.Y., and Shuvalov, V.A. (2000) Nuclear wavepacket motion producing a reversible charge separation in bacterial reaction centers. FEBS Lett., 466, 209-212.

229. Yakovlev, A.G., Shkuropatov, A.Ya., and Shuvalov, V.A. (2002) Nuclear wavepacket motion between P* and P+Ba" potential surfaces with subsequent electron transfer to Ha in bacterial reaction centers. 1. Room temperature. Biochemistry, 41, 2667-2674.

230. Yakovlev, A.G., Vasilieva, L.G., Shkuropatov, A.Ya., Bolgarina, T.I., Shkuropatova, V.A., and Shuvalov, V.A. (2003) Mechanism of charge separation and stabilization of separated charges in reaction centers of Chloroflexus aurantiacus and of YM210W(L) mutants of Rhodobacter sphaeroides excited by 20 fs pulses at 90 K. J. Phys. Chem. A, 107, 83308338.

231. Yakovlev, A.G., Jones, M.R., Potter, J.A., Fyfe, P.K., Vasilieva, L.G., Shkuropatov, A.Ya., Shuvalov, V.A. (2005) Primary charge separation between P* and Ba: Electron-transfer pathways in native and mutant GM203L bacterial reaction centers. Chem. Phys., 319, 297307.

232. Yanisch-Perron, C., Vieira, J., Messing, J. (1992) Improved M13 phage cloning vectors and host strains: Nucleotide sequences of the M13mpl8 and pUC19 vectors. Gene, 114(1), 8183.

233. Yeates, T.O., Komiya, H., Chirino, A., Rees, D.C., Allen, J.P., Feher, G. (1988) Structure of the reaction center from Rhodobacter sphaeroides R-26 and 2.4.1-protein-cofactor (bacteriochlorophyll, bacteriopheophytin, and carotenoid) interactions. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 7993-7997.

234. Youvan, D.C., and Marrs, B.L. (1984) Molecular genetics and the light reactions of photosynthesis. Cell, 39, 1-3.

235. Youvan, D.C., Bylina, E.J., Alberti, M., Begusch, H., Hearst, J.E.(1984) Nucleotide and deduced polypeptide sequences of the photosynthetic reaction-center, B870 antenna, and flanking polypeptides from R. capsulata. Cell, 37(3), 949-957.

236. Youvan, D.C., Ismail, S., Bylina, E.J. (1985) Chromosomal deletion and plasmid complementation of the photosynthetic reaction center and light-harvesting genes from Rhodopseudomonas capsulate. Gene, 38, 19-30.