Изучение РНК-белковых взаимодействий в аналогах 3ОS-инициаторного комплекса рибосом Е. coli тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.04, кандидат химических наук Наргизян, Маги Гегамовна

• Наргизян, Маги Гегамовна
• кандидат химических наук
• 1984

Оглавление диссертации кандидат химических наук Наргизян, Маги Гегамовна

ВВЕДЕНИЕ.

Глава I. 30S СУБЧАСТИЦА. РИБОСОМ E.coli

Обзор литературы).

1.1. Функции 30S субчастицы в процессе инициации трансляции

1.2. Структура 30В субчастицы.

1.2.1. Пространственная структура I6S РНК.

1.2.2. Белки 30S субчастицы.

1.2.3. Модели 30S субчастицы

1.2.4. Расположение рибосомных белков в составе 303 суб частицы.

1.2.5. Расположение I6S РНК в составе 30$ суб частицы.

1.2.6. Участки связывания лигандов на суб частице.

1.3. Конформационные изменения 30S субчастицы.

Глава II. ИЗУЧЕНИЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ I6S РНК И тРНК С РИБОСОМНЫМИ БЕЛКАМИ МЕТОДОМ УФ-ИНДУ-ЦИРОВАННЫХ РНК-БЕЛКОВЫХ СШИВОК. (Обсуждение результатов).

2.1. Метод УФ-индуцированных полинуклеотид-белковых сшивок.

2.1.1. Принцип метода.

2.1.2. Применение метода УФ-индуцированных сшивок.

2.1.3. Двухкомпонентные нуклеопротеидные комплексы.

2.1.4. Многокомпонентные нуклеопротеиды.

2.2. РНК-белковые контакты в аналогах 30£-инициаторного комплекса.

2.2.1. Введение.

2.2.2. Получение и характеристика тройных комплексов.

2.2.3. Условия облучения и характеристика облученных тройных комплексов.

2.2.4. Определение белков 30S субчастицы рибосом Е.coli пришивающихся к I6S

РНК в составе комплексов 1,11,111.

2.2.5. Определение рибосомных белков, пришивающихся к тРНК в составе комплексов

1,11, III.

2.3. Получение и свойства мономеркурированп ной тЖС.

2.3.1. Меркурирование тИЖ.

2.3.2. Демеркурирование полимеркурированной тШК в неденатурирующих и денатурирующих условиях.

2.3.3. Свойства мономеркурированной тРНК

2.3.4. Взаимодействие с белками немодифицирован-ной и мономеркурированной HAcPhe-тШК в комплексе с поли(U)-заряженными 30S субчастицами рибосом X.colL.

Глава III. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

ВЬЕВОДЫ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Изучение РНК-белковых взаимодействий в аналогах 3ОS-инициаторного комплекса рибосом Е. coli»

Центральную роль в процессе биосинтеза белка играет рибосома - сложный нуклеопротеид, формирование которого определяется нековалентными взаимодействиями разных типов между белками и рибосомными РНК. Функционирование такого нуклеопротеида включает последовательное взаимопревращение нескольких состояний, а переход из одного состояния в другое обусловлен и/или сопровождается изменением межмолекулярных взаимодействий. В настоящее время известно несколько дискретных функциональных состояний рибосомы, последовательно возникающих в процессе трансляции. С другой стороны, применение ряда методов позволило создать пространственную модель рибосомы, локализовать большинство белков в составе субчастиц. Известны первичные структуры рибосомных РНК и белков.

Однако, неизвестно, тонкое строение рибосомы, т.е. какие фрагменты белков и РНК взаимодействуют друг с другом в различных функциональных состояниях рибосомного комплекса. Поскольку метод УФ-индуцированных полинуклеотид-белковых сшивок даёт возможность изучить как РНК-белковые контакты, существующие в неком статическом состоянии рибосомы, так и изменение этих контактов при изменении функционального состояния рибосомы, то мы применили этот метод для исследования конформационных изменений 30S субчастицы при формировании тройного комплекса 305- матричный полинуклеотид-тРНК, а также изменения конформации 30S субчастиц р зависимости от состояния тРНК, входящей в состав комплекса — ацетиламиноацил-, аминоацил- и деацилированной.

Глава I. 30S СУБЧАСТИЦА РИБОСОМ E.CoIl

Обзор литературы)

Бактериальная рибосома имеет коэффициент седиментации около р.

70 единиц Сведберга и мол.вес порядка 3-10 /I/. Нативная струк + +• тура рибосомы поддерживается ионами Мд , К , NH^, полиаминов.

При понижении концентрации ионов Мд в растворе 70S рибосома обратимо диссоциирует на две субчастицы с коэффициентами седиментации 50S и 30S :

7DS=»50S +30 S

I.I. Функции 30S субчастицы в процессе инициации трансляции. 30S субчастица, являясь составной частью 70S рибосомы, функционирует в её составе на всём протяжении процесса трансляции. Однако, на первом этапе трансляции;— стадии инициации, она функционирует как отдельная, самостоятельно существующая субчастица. В данном обзоре мы рассмотрим функции 30S субчастицы только при инициации.

Важнейшей функцией 30S субчастицы при инициации является избирательное узнавание на мРНК истинных мест инициации и корректное её связывание. Впервые Лодиш /2/ показал, что именно 30S субчастица играет основную роль в этом процессе. В дальнейшем ряд экспериментов /3-5/ подтвердил гипотезу об основной роли 30S субчастицы в избирательном связывании мРНК. Показано, что 305 субчастица протектирует от нуклеазного гидролиза тот же фрагмент мРНК, что и 70S рибосома /б/. Таким образом, представление об основной роли 30S субчастицы в декодировании является общепринятым на сегодняшний день. Вклад

50S субчастицы в точность инициации заключается в фиксировании, "замораживании" комплекса малой субчастицы с мРНК /7/. Так как 30S субчастица функционирует как отдельная субчастица при инициации, мы остановимся подробнее на основных событиях, происходящих на этой стадии.

После терминации трансляции очередной молекулы мРНК, 70S рибосомы отделяются от полисом и в растворе диссоциируют на субчастицы. Диссоциация 70S рибосом стимулируется действием двух факторов IF-I и 1Г-3 /8-10/:

70S&50S +30S gf^ 508 + 30S-IF-3

Далее происходит образование ЗОБ-инициаторного комплекса, в котором участвует еще один фактор инициации IF-2. Фактор

IT-2 способен катализировать AUG -зависимое связывание Met f Met -TffiKj с 30S субчастицей в отсутствии остальных факторов /II/. Было выдвинуто предположение, что 1Г-2 функционирует аналогично фактору элонгации EF~Tu ,т.е. образует

Met тройной комплекс 1Г-2-GTP-fMet-tphkf , который затем связывается с 30S субчастицей /12/. Однако, в дальнейшем было показано /13,14/, что in vitro образуется двойной комплекс

Met

IP -2 -fMet-TPHK| , он нестабилен и его образование не зависит от 6ТР.Кроме того, неясно, образуется ли этот комплекс in Vivo, т.е. является ли он действительным промежуточным комплексом в процессе инициации. Таким образом, возможно как связывание комплекса на 30S субчастице, так и независимое

Met связывание IF-2, GTP и -fMet-TfflKj на поверхности 30S субчастицы /7/.

Существует гипотеза об образовании 30$-инициаторного комплекса через промежуточное образование комплекса 30S • IF-I* IF -2 • IF -3 /15/, к которому далее присоединяются мРНК, Met fMet-TPHKj и GTP :

30S-IF -I-IF -2-IF -3 + мРНК + GTP +f Met-TPHK^et-— [30S-IP -I'lF -2-MPM-6TP-fMet-TPHK^et]+ IF -3.

Такой ЗОЗ-инициаторный комплекс может быть выделен как стабильный промежуточный комплекс.

В какой очередности связываются с 30 S суб частицей мРНК и Met f Met-tphkf . Только одна работа /16/ предлагает механизм случайного, Независимого связывания мРНК и тЕНК с 30S субчастицей. Джей и Кемпфер /17,18/ в серии работ пришли к выводу,

Met что 30S субчастица связывает вначале iMet-тРНК^ , а затем мРНК. И, наконец, ряд работ /19-22/ предлагает альтернативный порядок связывания мРНК и тРНК - через промежуточное образование комплекса 30S*mPHK. В работе /19/ показано, что фактор

Met

IF-3 и комплекс IF -2- fMet-TPHKj не могут быть одновременно связаны с 30S субчастицей. Из этого факта выводится следующая последовательность событий при инициации: если считать установленным, что для диссоциации 70S рибосомы и связывания мРНК необходимо связывание 30S субчастицы с IF -3, а комплекс

Met

IF -2-Ше1-тРНК| остается связанным с 30S субчастицей до её ассоциации с 50$ субчастицей /15/, то IF -3 может связаться с 30S рибосомой и диссоциировать с неё только до связывания

Met комплекса IF -2*f Met-TFHKj , и таким образом, связывание мРНК тоже может происходить только до этого.

Такой порядок связывания мРНК и тРНК подтверждается также серией работ Ван-Душа с сотр. /20-22/.

Суммируя эти данные, можно сказать, что вопрос о порядке связывания мРНК и тРНК на 30S субчастице остается невыясненным.

GTP в этой реакции является стерическим эффектором, стабилизирующим ассоциацию 1Г -2 с 30$ субчастицей при сравнительно низкой концентрации 1Г -2 в клетке /15/, на этом этапе он не гидролизуется и остается связанным с 30 S субчастицей, так же как и IP -2 /II/ и IP -I /23/.

Таким образом, хотя все факторы требуются для максимального , Met связывания Ще1~тРНК{ с 305 субчастицей, но IP-2 играет центральную роль в этом связывании и в отличие от других факторов, абсолютно необходим. Роль фактора IP -I на этом этапе заключается в стабилизации связывания IP -2 с ЗОЗ-инициаторным комплексом /24/. Фактор IP -3 участвует в селективном связывании 30S субчастицы с матричной FHK /25/.

На этом этапе осуществляется также избирательное связывание 30S субчастицы с мРНК, которое мы обсудим несколько позже.

Завершающим этапом инициации является образование полного г Hei

70$-инициаторного комплекса, в котором irlet-TFHKf активна в образовании пептидной связи, т.е. расположена в Р-сайте.

Met .

30S • мРНК- IP -2 • IP -I- fMet-TPHKf • GTP] + 50$ —-[мРНК• 70S • fMet-TPHK*f+ IP-2 +GDP + Pi + IP -I.

Гидролиз GTP нужен для превращения одного стерического эффектора -GTPb другой (6DP) с низким сродством к рибосомному комплексу. Диссоциация GDP с рибосомы приводит к IP «I стимулируемому выбросу IP -2 с рибосомного комплекса /24/. Только после этого возможно образование активного 703-инициаторного комплекса /26/.

Вернемся теперь к вопросу о селекции 30S субчастицей сайта инициации на мРНК. Целью образования инициаторного комплекса является размещение в Р-участке рибосомы истинного инициаторного кодона. В прокариотах в подавляющем большинстве случаев инициаторным является кодон AU6,гораздо реже инициация начинается с GUG , еще реже с UUG и только в одном случае с AUU /7/.

Второй доказанной на сегодняшний день областью связывания mFHK с рибосомой является так называемая последовательность Шайн-Дальгарно. В 1974 г. Шайн и Дальгарно постулировали возможность образования при инициации спаренного участка, включающего полипуриновый участок, находящийся с б'-конца мРНК недалеко от инициаторного кодона, и полипиримидиновый участок, расположенный недалеко от 3'-конца I6S РНК /27/. Стейц и Джейке /28/ получили первое экспериментальное подтверждение этой гипотезы: инициаторный комплекс, образованный in vitro рибосомой E.coli и меченным фрагментом начала цистрона А-белка РНК-колифага R 17, обрабатывали колицином ЕЗ (эта нуклеаза делает I разрыв, отсекая от з'-конца I6S РНК фрагмент в 49 нуклеотидов). з'-концевой фрагмент I6S РНК освобождался в виде стабильного комплекса с [^р]-меченным фрагментом мРНК. В дальнейшем был получен ряд экспериментальных данных, также подтверждающих эту гипотезу /29-31/.

Эффективность взаимодействия Шайн-Дальгарно определяется 3-мя параметрами: длиной спаренного участка, расстоянием между спаренным участком и инициаторным кодоном и вторичной структурой фрагмента мРНК, содержащего этот участок. Каталог известных инициаторных областей мРНК у прокариот (участки мРНК, протектируемые от нуклеазного гидролиза в комплексе с 3OS субчастицей

Met или 70S рибосомой и iMet-TEHKf ) показывает, что длина спаренного участка - от 3-х до 9 нуклеотидов /32/.

Расстояние между спаренным участком и инициаторным кодоном величина критическая, оптимальное расстояние 7+2 нуклеотида /33/.

В мутантах с расстоянием более 9 /34/ или менее 5 /30/ нуклео-тидов подавлена трансляция.

И наконец, III параметр, влияющий на эффективность взаимодействия Шайн-Дальгарно, это степень экспонированности этой последовательности и инициаторного кодона во вторичной структуре мРНК. Ясно, что, чем более экспонированы на поверхности мРНК последовательность Шайн-Дальгарно и инициаторный кодон, тем эффективнее инициация, и это показано в ряде работ /напр.,35/. Однако, есть и исключения из этого правила, когда и инициаторный кодон, и последовательность Шайн-Дальгарно спарены /36/, участок либо инициаторный составляет структуру в виде петли /37/, а инициация тем не менее происходит. Это может объясняться динамичной конформацией мРНК: рибосома связывается с мРНК, когда последняя находится в более открытой конформации.

Достаточно ли рибосоме для выбора правильного места связывания экспонированного инициаторного кодона и расположенной на оптимальном расстоянии от него экспонированной последовательности Шайн-Дальгарно? Такой вывод можно сделать из работ, в которых получены мутанты с делециями целых блоков нуклеоти-дов в области, расположенной сразу перед последовательностью Шайн-Дальгарно, что не сказалось на их способности к трансляции /38,34/. Альтернативной точки зрения придерживается Голд с сотр. /39/, которые считают, что на мРНК существуют дополнительные детерминанты узнавания. Они основывают своё мнение на отсутствии корреляции между эффективностью трансляции и силой взаимодействия Шайн-Дальгарно. Однако, авторы игнорируют роль конформации мРНК в регуляции доступности для рибосомы потенциальных сайтов инициации.

Две группы авторов сделали компьютерный статистический анализ известных инициаторных последовательностей. Шерер и др. /40/ сконструировали среднюю наиболее часто встречающуюся нуклео-тидную последовательность вокруг кодона инициации - область от -25 до +15 (нуклеотид А в инициаторном кодоне AU6 считается +1, кодон AUG от +1 до +3) и наблюдали общие структурные элементы на участках слева и справа от кодона инициации. Стормо и др. /33,41/ в аналогичной работе, но используя более обширную библиотеку инициаторных последовательностей, также показали неслучайное расположение нуклеотидов в пределах области. Авторы предположили, что некоторые, если не все, из этих неслучайных нуклеотидов могут участвовать в процессе узнавания рибосомой мНЖ. Такой статистический анализ имеет ряд ограничений: не учитывается роль высшей структуры мРНК инициаторных областей, а также данные об относительной эффективности трансляции в разных инициаторных областях, т.к. таких данных вообще очень мало.

И в заключение, остановимся на связывании инициаторной тРНК в ЗОб-инициаторном комплексе. До того, как мы перейдем к этому вопросу, напомним, что общепринятой в настоящее время является двухсайтовая модель функционирования рибосомы Уотсона /42/, по которой на рибосоме одновременно существует два участка связывания тРНК: А-сайт - участок связывания аминоацил-тРНК в претранслокационном состоянии рибосомы и Р-сайт - участок связывания тРНК в посттранслокационном состоянии рибосомы. Это функциональные определения А- и Р-сайтов. Сайт в физическом, структурном понимании - это совокупность участков или фрагментов компонентов рибосом, сближенных, контактирующих, т.е. связанных нековалент-ными взаимодействиями с тРНК и мРНК. В этом смысле А- и Р-сайты -это наборы фрагментов рибосомных РНК и рибосомных белков, контактирующих с амшоацил-, пептидил- и деацилированной тРНК, находящихся в функциональных А- и Р- сайтах.

Как было сказано выше, при ассоциации 30£-инициаторного ком

Wet плекса с 50S субчастицей, fMet-TPHKj оказывается в Р-сайте и способна образовать пептидную связь с аминоацильным остатком аминоацил-тРНК, находящейся в А-сайте. Возникает вопрос, по какому сайту связывается fMet-TPHKf в 30$-инициаторном комплексе, часть ли это Р-сайта, располагающаяся на 30S субчастице, или какой-то другой сайт. Существует гипотеза о том, что сайт IP-2м . ^ Me t зависимого связывания fMet-TPHKf может не совпадать с

Р~сайтом, этот гипотетический сайт называют 1-сайтом /43/.

Как известно, часто в качестве модели ЗОЗ-инициаторного ком

Phe плекса используют комплекс 30S с поли(и) и NAcPhe-тРНК Группа ленинградских авторов /44/ показала, что активные 30S суб частицы связывают 2 молекулы тРНК (NAcPhe-,Phe~H деацили-рованной). Антибиотик тетрациклин в низкой концентрации, при которой он шшибирует только связывание по А-сайту, понижает число связавшихся молекул тРНК до I. Авторы считают, что эта одна молекула связывается по части Р-сайта, расположенного на 30S субчастице, при добавлении 50S субчастицы она количественно реагирует с пуромицином. Вторая молекула связывается по части А-сайта, и таким образом, на 30S субчастице находится два функционально активных сайта, проявляющих свойства А- и Р-сай-тов. Еще одним доказательством этого является то, что если к

Phe комплексу 30S субчастицы с поли(и) и двумя молекулами Phe-тРНК добавить 50S субчастицы, то количественно и быстро образуется дифенилаланш /44/. А- и Р-сайты характеризуются разным сродством тРНК к ним: константа ассоциации тРНК на Р-сайте примерно на порядок выше, чем на А-сайте для всех видов тРНК:NAcPhe -, Phe- и деацилированной, т.е. А-сайт реализуется только после заполнения Р-сайта. Кроме того, константа ассоциации по Р-сайту различна для всех 3-х тРНК: при 10 мМ Мд *0°С, HP для тРНК№е 7-Ю"7 М"1, для Phe-TPHKPtie -1,5• IO8 IT1, для NAcPhe-тРНКPhe 9 *I07 1Г1 /44,45/.

Винтермейер и Галлерзи /46/ недавно исследовали кинетику изменений флуоресценции при образовании тройного комплекса

Phe

ЗОБ-полиСи)-NAcPhe-тРНК в присутствии 3-х факторов инициаpfte ции IP -I, IP -2 и IP -3 ( NAcPhe-тРНК несет в антикодоновой петле флуоресцентную метку - профлавин). По их данным образование тройного комплекса можно разделить на 2 реакции: быструю реакцию второго порядка и медленный этап изменения расположения тРНК в комплексе. Авторы предлагают механизм образования тройного комплекса через, по крайней мере, два преобразования исходного образующегося комплекса. При этом ускоряющий эффект факторов IP -2 и IP -3 рассматривается как аллостерическое действие этих факторов на 30S субчастицу, a IP -I действует не прямо, а влияя на 2 других фактора.

Таким образом, на стадии инициации происходит образование комплекса 30S рибосомы с мРНК и инициаторной тРНК (305-ини-циаторный комплекс), который при взаимодействии с 505 субчастицей образует полный инициаторный комплекс 70S-mPHK-hhh-циаторная тШК, где инициаторная тРНК расположена в Р-сайте. Такой комплекс способен к связыванию аминоацил-тРНК по А-сай-ту, образованию пептидной связи и далее, элонгации полипептидной цепи.

1.2. Структура 30S субчастицы рибосомB.coli 3OS субчастица содержит одну молекулу 16$ РНК с молекулярной массой 560000 дальтон /47-49/ и по одной копии 21 разных белков со средней массой примерно 18000 дальтон. Исключение составляет белок SI, имеющий массу 65000 дальтон. /1,50/.

1,2.1. Пространственная структура I6S ШК

Совокупность данных, известных на сегодняшний день о I6S РНК, а также высокая степень консервативности первичной и, особенно вторичной структуры I6S РНК /51,52/ свидетельствует о том, что I6S ШК является не просто структурным каркасом рибосомы, но и непосредственно участвует в её функционировании.

I6S РНК участвует в ряде функций рибосомы: 1)как было сказано выше, по гипотезе Шайна и Дальгарно /27/ комплекс 30S субчастицы с мРНК образуется за счёт спаривания полипуринового участка мРНК, расположенного перед инициирующим кодоном, с полипиримиди-новым участком на 3'-конце I6S РНК; 2) ряд данных /53,54/ дгказывает на то, что ассоциация 30S и 50S субчастиц в 70S рибосому происходит за счёт взаимодействий I6S РНК с белками 50S субчастицы; 3) I6S FHK участвует в связывании белковых факторов инициации, например, 1Г-3 /55,56/; 4) на I6S РНК направлено действие бактериальных антибиотиков-колицина ЕЗ и клоацина DII3 /57,58/; 5) 16$ РНК участвует в образовании тРНК-связывающего участка, 5'-основание антикодона тРНК было пришито УФ-светом к цитидину в положении 1400 /59/.

16$ РНК E.coli состоит из 1542 нуклеотидов, содержит 9 метилированных нуклеотидов, которые точно локализованы в её структуре, - большинство их расположено в з'-концевой четверти молекулы РНК /48/. Первичная структура I6S РНК была установлена благодаря применению современных методов быстрого сиквенса ДНК и РНК. В лаборатории Эбеля /48/ была определена первичная структура I6S РНК, почти одновременно Брозиус с сотр. /49/ определили последовательность одного из генов I6S> FHK.

Развитие представлений о вторичной структуре 16S РНК потребовало применения ряда методов: а)химическая модификация РНК /54/ реагентами, специфичными к определенным основаниям (реагенты: кетоксаль, глиоксаль, бисульфит, ш -хлорпербензоат), б)обработка нуклеазами /60,61/, специфичными к одно- или дву-цепочечным участкам, или расщепляющими цепь после определенного основания, в)образование сшивок между разными областями РНК х

62-64/, г)выделение и сиквенс двуцепочечных областей после обработки нуклеазой SI /65/ и д)сравнение последовательностей рРНК из разных организмов /66-69/.

На основании одного или нескольких из этих методов, было предложено несколько моделей вторичной структуры I6S РНК. Бримакомб с сотр. /67,68/ использовали результаты, полученные при межмолекулярном сшивании РНК и при анализе спаренных участков, полученных после обработки I6S РНК специфичной к одноцепочечным участкам нуклеазой SI или TI. Авторы также сравнили структуру РНК из 30S субчастицы Е.coli , из хлороплас-тов Zecx mays ,из человеческих и мышиных митохондрий, из дрожжей, из цитоплазмы Xenopus laevis

Ноллер и Возе /66/ предложили модель (Рис.4), основанную, главным образом, на экспериментах по химической модификации, а также на филогенетическом сравнении набора олигонуклеотидов из ранных бактерий. Особенно информативным оказалось сравнение структуры 16$ рнк изЕ.сок и В. brevis

Стиглер с сотр. /69/ выводят свою модель из экспериментов по расщеплению I6S РНК специфичными к одно- и двуцепочечным участкам нуклеазами, а также из сравнения первичных структур, в частности, I6S РНК Proteus vulgaris и E.coli.

И наконец, модель, предложенная Богдановым и Скрипкиным /70/, основывается на данных по доступности РНК для гидролиза нуклеа-зами, по выделению взаимодействующих фрагментов из I6S РНК, по сшиванию РНК с помощью псораленов, а также опубликованных данных по химической модификации.

Модели в главных чертах сходны друг с другом. Некоторые различия касаются з'-концевой области I6S РНК.

Кантор и сотр. /62/ для установления вторичной структуры I6S РНК использовали межмолекулярные сшивки РНК производными псора-лена, которые затем идентифицировали методом электронной микроскопии сшитой денатурированной РНК. В этих работах обнаружено существование ряда удаленных в первичной структуре взаимодействующих участков I6S РНК, не существующих во всех выше описанных моделях.

Вторичная структура I6S РНК имеет ряд особенностей: сближены расположенные далеко друг от друта в первичной структуре участки РНК; нет длинных двуспиральных участков, наибольшие содержат 10 пар нуклеотидов, однако такие короткие участки располагаются один за другим в ряд и разделяются маленькими неспаренными петлями - это придает дополнительную гибкость молекуле I6S РНК, необходимую для более компактной укладки молекулы в процессе сборки. Кроме того, каждая из нескольких областей РНК способна спариться с более чем одной другой областью цепи I6S РНК. Эти множественные взаимодействия могут быть каким-либо образом вовлечены в конформационные изменения 16£> РНК в разных функциональных состояниях рибосомы в процессе белкового синтеза.

Все модели предусматривают разделение I6S РНК на 3 области: 5'-концевая область (230-550), средняя область (550-900) и З'-концевая область (900-1560).

Для средней б'-концевой области все модели предполагают практически сходные структуры - ряд "шпилечных" участков и сильно развитая вторичная структура. В 5'-концевой области, по модели Скрипкина и Богданова /70/, есть два дополнительных двуспиральных участка, включающих фрагменты з'-концевой области. Основные различия касаются з'-концевой области I6S РНК. 3'-концевой участок очень доступен для модифицирующих агентов и нуклеаз и поэтому в модели Богданова и Скрипкина /70/ он представлен в виде однотяжевых структур, сюда же входит "шпилька" на 3'-конце. В остальных моделях на этом участке находится ещё одна "шпилька" I405-I49I. Учитывая, что среднее расстояе ние между нуклеотидами 3 А, размеры структуры I6S РНК на Рис.4 о равны примерно 300-450 А. Т.к. средние размеры 305 субчастицы, определенные методом малоутлового рассеяния рентгеновских лучей, равны 55х 220х 220 /I/, и эти же размеры по данным электронной микроскопии 80 х 190 х 250 /71,72/, то такая структура должна быть сложена ещё примерно вдвое для того, чтобы соответствовать размерам 30S субчастицы. 0 существовании третичной структуры I6S РНК свидетельствует также тот факт, что количество спаренных участков по модели 50%, в то время как физические методы дают величину 60-70%, Васильев с сотр., используя электронную микроскопию комплексов I6S РНК с рибосомными белками, а также чистой I6S РНК, пришел к выводу, что чистая I6S РНК, нрк и 16Я. РПК в комплексе с белками, имеет специфическую Y-образную форму и по размерам и форме может быть легко вписана в морфологию 30S субчастицы /73,74/.

1.2.2. Белки 30S субчастицы

30S субчастица E.coli содержит по одной копии каждого из 21 разных белков. Первичная структура всех белков установлена (см.напр., 75,76). Большинство рибосомных белков богаты основными аминокислотами и содержат незначительное количество ароматических аминокислот (напр., менее 2 моль процентов в SI0 и SI3 /52/). В 3-х белках обнаружены модифицированные аминокислоты: ацетилирован N -конец в белках S5 и 518 и метилирован белок 511.

Для исследования вторичной структуры рибосомных белков были использованы 2 разных подхода: предсказание вторичной структуры на основе известной первичной структуры белка и измерение кругового дихроизма (КД) индивидуальных белков в растворе. Первый метод был применен к белкам S4 /77/,и 515 /78/, однако неизвестно насколько применим этот метод к белкам в составе рибосом учитывая их взаимодействие не только друг с другом, но и с молекулой РНК. Методом КД были изучены почти все белки 305 субчастицы /52/, и найдено, что большинство белков малой субчастицы содержит большое количество -спиралей и незначительное количество р -структур.

Третичная структура рибосомных белков из 30S субчастицы была изучена рядом физических методов: ЯМР, флюоресцентная спектроскопия, микрокалориметрия /напр., 79,80/.

Совокупность данных, полученных этими методами, позволяет предположить, что большинство белков 305 субчастицы имеет хорошо развитую третичную структуру.

Перейдем к вопросу о том, какова роль рибосомных белков в функционировании рибосомы. После того, как была открыта возможность реконструкции 30S субчастицы из I6SPHK и рибосомных белков in vitro /81/, казалось, что выяснить роль рибосомных белков достаточно просто с помощью экспериментов по реконструкции 305 субчастицы с недостающим одним белком и последующего анализа её функциональных свойств. Такого рода эксперименты были сделаны /82/ и было показано, что во многих случаях, отсутствие белка приводит к потере одной или более функций. Однако, этот подход имеет тот недостаток, что отсутствие одного белка в смеси для реконструкции может приводить к неправильной сборке частицы, т.к. процесс сборки зависит от кооперативных взаимодействий между составляющими субчастицу молекулами. Поэтому, потеря функции может непрямым образом коррелировать с функциональной ролью отсутствующего бежа. Те же возражения можно привести по поводу экспериментов по реконструкции рибосомы с модифицированным белком — сборка рибосомы с модифицированным белком также может идти по-другому. И, наконец, если рибосомная функция зависит от кооперативных взаимодействий более чем одного белка или бежа и РНК, то эти методы вообще не применимы.

Одним из наиболее прямых методов исследования функции того или иного бежа является исследование рибосом из мутантов с измененной чувствительностью к антибиотикам. В первых работах в этой области было показано, что стрептомицин-зависимые мутанты E.coll имеют измененный белок SI2 /83/. Реконструкция 30S субчастиц с белком SI2 из стрептомицин-зависимого мутанта и остальными бежами из стрептомицин-чувствительных рибосом, приводила к стрептомицин-зависимости в бесклеточной системе. Белок S 12 влиял также на частоту трансляционных ошибок („misreading" ) /84/.

Реверсия от стрептомицин-зависимости к стрептомицин-устойчивости приводит к ревертантам с измененными бежами S4 или S5 /85-88/. В 1976 году Даббс и сотр. /89/ описали мутант VT из штамма AI9, который проявлял новый тип стрептомицин-зависимости и кроме измененного бежа S 12, содержал также измененный S8. Стрептомицин-устойчивые ревертанты из этого штамма содержали 13 измененных белков из малой субчастицы и 15 из большой. Позднее те же авторы /90/ с тем же мутантом YT используя спонтанный мутагенез в сочетании с химическим, а также варьируя температуры инкубирования, получили набор мутантов с изменениями практически во всех рибосомных белках: в 20 белках 30S - и в 30 белках 50S -субчастицы. Таким образом, мутации могут быть по всем рибосомным белкам, и такие мутанты выживают. Такой вывод несколько расходится с более ранними работами /87/, где считалось, что преимущественное нахождение мутантов с измененными SI2, S4 и S5 обусловлено тем, что только такие мутации не приводят к летальному исходу, организмы же с измененными другими рибосомными белками просто не выживают. Более того, в работе /89/ показано, что многие ревертанты имеют несколько измененных белков, например, YT 157 имеет б измененных белков S4, S5, S7, L4, L5 и L6 в добавлении к мутантным белкам S8 и SI2, которые присутствовали в исходном мутанте Этот мутант с 8 измененными белками имеет время генерации при 37° 70 мин., т.е. организм со многими изменениями в рибосомных белках, тем не менее растет нормально.

Были исследованы также мутанты, зависимые от ряда других антибиотиков, например, касутамицина /91/, спектиномицина /92/.

Другая группа авторов /93/ исследовала температурочувстви-тельные мутанты из E.coll, полученные после мутагенеза с помощью нитрозогуанидина. Мутанты содержали 22 измененныхрибосомных белка, из них 9 из малой субчастицы. В белее поздней работе /94/ было показано, что один из мутантов не содержал белка S20, что приводило лишь к увеличению времени генерации бактерии.

Недавно Даббс с сотр. /95,96/ выделили и охарактеризовали мутанты из E.coil дефицитные по рибосомному белку, причём получены мутанты по 15 из 50 рибосомных белков. В основном, в результате мутации происходит 2-7 кратное увеличение времени генерации бактерии. Правда, авторами не получено мутантов, в которых не содержатся,например, такие важные белки как S4, так что этот вывод по отношению ко всем рибосомным белкам применять нельзя.

Таким образом, мы подошли к вопросу о том, каковы функции белков в рибосоме. Некоторые авторы /97/ считают, что рибосомные белки имеют вторичную функциональную роль по отношению к рибо-сомной РНК, основываясь на высокой степени консервативности первичной, и особенно, вторичной структуры I6S РНК с одной стороны и экспериментах на мутантах, описанных нами выше, с другой стороны. Одна из ролей рибосомных белков может заключаться в избирательном связывании с одной из групп структурно сходных конформеров РНК, тем самым проявляя эффект "настраивания" РНК. С белками могут быть связаны и более драматические эффекты, как-то сворачивание и разворачивание РНК, открытие или закрытие двойных спиралей. Такие белок-индуцированные изменения конформации РНК могут иметь принципиальное значение в функционировании рибосомы.

В то же время, все описанные выше эксперименты на мутантах не исключают возможности участия в той или иной функции рибосом группы взаимодействующих белков, т.е. кооперативное функционирование белков. Из всех белков 30S субчастицы прямо показано участие 2-х белков Si и S2I в связывании рибосомой мРНК. Как известно, при связывании мРНК с рибосомой, происходит образование дуплекса между полипуриновым участком с 5'-конца мРНК и полипиримидиновым участком, находящимся недалеко от 3'-конца I6S РНК /27/. Ван Дуин с сотр. /98/ в ряде экспериментов с использованием комплементарного полипиримидиновому участку I6S РНК дезокси ктануклеотида, показал, что этот участок не доступен в свободной I6S РНК, и в 30S субчастице, не содержащей S2I. В присутствии S2I этот участок становится та доступным для дезоксиокнуклеотида, и снова становится недоступным при связывании мРНК. При инкубировании 30S субчастиц с антителами против S2I или при сборке 30S субчастиц в отсутствии S21, субчастицы неактивны в трансляции мРНК MS2 и мРНК из Б.coli. . Этот эффект наблюдается из-за неспособности рибосомы связывать мРНК /99/.

Каким образом белок S2I "открывает" пиримидиновую последовательность по з'-конце I6S РНК, неясно: это может быть прямое взаимодействие с полипиримидиновой последовательностью, с комплементарным ей участком I6S РНК, либо непрямое воздействие через влияние на структуру рибосомы.

Бело|г SI также участвует в связывании мРНК с рибосомой. Существовало предположение о том, что белок SI прямо связывается с 3'-концом I6S РНК /100/, однако, это предположение не подтвердилось /101/. Присутствие или отсутствие SI не влияет на доступность полипиримидинового участка. Взаимодействие 30S субчастицы с антителами и SI приводит к неспособности её связывать мРНК, тот же эффект наблюдается при взаимодействии эдеина и ауринтрикарбоновой кислоты, которые ингибируют РНК-белковые взаимодействия /22/. Присутствие SI необходимо только для трансляции нативных неденатурированных мРНК. Возможное объяснение роли SI состоит в следующем: S 1реорганизует мРНК и открывает полипуриновую последовательность на 5'-конце мНЖ для спаривания с ©соответствующей последовательностью I6S РНК /97/. Это объяснение подтверждается тем фактом, что белок $1 отсутствует в Bacullus stearothermophilus а также, возможно, в других термофильных бактериях /102/, где высокая температура, при которой растут бактерии, может быть достаточна для открытия этой области в I6S РНК.

Таким образом, белки SI, S2I и область с 3'-конца I6S РНК образуют функциональную единицу в составе рибосомы, обеспечивающую эффективную и быструю инициацию трансляции. Возможно, что остальные белки также образуют функциональные группы, т.е. несколько белков, действуя кооперативно, обеспечивают ту или иную функцию рибосомы.

1.2.3. Модели 30S субчастицы рибосом Е.colt

2 метода - иммуноэлектронной микроскопии и нейтронного рассеяния - позволили нескольким группам авторов предложить модель четвертичной структуры рибосомной 30S субчастицы. Впервые Васильев /ЮЗ/ после анализа микрофотографий лиофильно высушенных и оттененных образцов, предложил ассиметричную трехмерную модель морфологии рибосомных 30S субчастиц. Морфологически 30S субчастица делилась на "головку", "тело" и боковую "выпуклость", причём "тело" делилось еще на"верхнюю" и "нижнюю" половины (Рис. 1а). Несколько позже Лейк на основании электронной микроскопии негативно контрастированных частиц предложил похожую ассиметричную модель морфологии 30S субчастицы, но более сплюснутую и с более выраженной боковой "платформой" /71/. 30S субчастица по Лейку состоит из "тела" (нижняя 2/3), "головки" верхняя 1/3) и "платформы", отделенной от "головки" впадиной £ яс1еН ) (Рис. 1в). И, наконец, модель Штоффлера /104/ состояi

08 9

Вис Л. Модели 30S субчастицы рибосом E.coll а)модель Васильева /133/, б) и б') модели Штоффлера /104,105/, в)модель Лейка /71/. ла из "головки" и "тела", 2 боковые стороны "тела" удлинены и выдаются с двух сторон. (Рис. 1,6). Между "головкой" ж "телом" впадина, которая при ассоциации субчастиц образует тоннель. Модель Штоффлера называлась также симметричной моделью, однако, в более поздних работах авторы /105/ приняли асимметричную модель, очень похожую на первые две (Рис. 1,6').

Недавно Корн и др. /106/ используя технику иммуноэлектрон о ной микроскопии высокого разрешения (~15А) подтвердили модель Васильева. Принятой на сегодняшний день является модель Лейка, хотя как мы уже сказали, все три модели очень похожи.

Каждая из первых трех групп авторов определяла белки, находящиеся на поверхности субчастицы с помощью специфических антител (IgG) к рибосомным белкам: IgG образует димер — субчастица - IgG - субчастица, который облегчает локализацию бежа. Кроме того, прямые данные о локализации бежов дает метод нейтронного рассеяния. И, наконец, при локализации бежов в составе рибосомы используются также данные, полученные другими методами: сшивки соседних бежов бифункциональными реагентами, "афинное мечение" функциональных сайтов и перенос энергии между флуоресцентно меченными бежа ми.

1.2.4. Расположение рибосомных бежов в составе 30S субчастицы.

Мы привели обобщенную модель расположения бежов в 30S субчастице, основанную на данных всех трех групп с использованием метода иммуноэлектронной микроскопии (Рис. 2), предложенную Гареттом /107/.

Метод нейтроннвго рассеяния показывает относительное расположение центров масс бежов. Модель расположения 15 бежов

-2'6

Рис.2. Обобщенная модель 30S субчастицы /107/ а)внешняя по~ верхность, б)межеубчастичная поверхность» Окружности обозначают места расположения белков и РНК на двумерной проекции каждой субчастичной поверхности. Сплошные и'пунктирные окружности указывают на большую или меньшую точность локализации бежа, соответственно. Скобки показывают область локализации белка. 1йШ -место входа и выхода и№К{, Рш -пуромицин. к г

I I

1 I

1 I i"

Рис.3. Модель расположения белков в 30S субчастице, полученная методом нейтронного рассеяния. Белкж указаны в окружностях, соответствующих их относительным объемам: SI2 находится за S5 /108/. малофуб частицы, полученная Муром с сотр. /108/ с помощью этого метода, показана на Рис.3. Как видно, результаты, полученные двумя разными методами, почти полностью совпадают. Таким образом, на модели расположены 13 рибосомных белков малой субчастицы, для трех SI, SI8 и519 определены области их нахождения (Рис.2).

Для расположения белков внутри 30S субчастицы принципиальное значение имеет вопрос о том, вытянута или компактна форма рибосомных белков. Для ряда рибосомных белков показано, что они глобулярны. Так из 12 исследованных методом нейтронного рассеяния белков, 10 были глобулярны, исключение составили только белки S4 и Si /109,110/. Однако, Спирин с сотр. исследуя некоторые рибосомные белки малой субчастицы, считающиеся в литературе удлиненными, физическими методами (КД, ЯМР, нейтронное рассеяние), нашел, что все они глобулярны, в частности белок S4 /III/. Более того, сравнение размеров бежа S4 в растворе и в составе комплекса с 5'-концевым фрагментом I6S РНК методом нейтронного рассеяния показало, что они одинаковы /III/, что дает возможность авторам утверждать, что большие конформационные изменения белка S4 при взаимодействии с I6S РНК маловероятны. Причина расхождения данных группы Спирина с данными других авторов по конформации рибосомных белков, непонятна.

Обобщенная модель расположения белков 30S субчастицы /107/ довольно хорошо согласуется с данными, полученными другими методами. Так, 4 пары белков, SI3-SI9, S5-S8, S6-SI8, S7-S9 были сшиты с помощью химических реагентов в ряде лабораторий /напр., 112/, на модели они также находятся вблизи друг друта (из этих белков S 18 и SI9 локализованы только на уровне большой области 30S субчастицы).

Недавно появились данные о том, что белки S4 и S8 вообще не имеют антигенных детерминант на поверхности 30S субчастицы /ИЗ, 105/.

1.2.5. Расположение I6S РЖ в составе 3QS субчастицы.

Расположение отдельных областей I6S РНК в составе 30S субчастицы определяли, используя антитела к гаптенам , ковалентно связанным с одним из концов I6S РНК, либо к модифицированным нуклеотидам в её цепи. Используя этот подход 3 группы авторов локализовали 3'-конец I6S РНК примерно в одном и том же месте -в верхней части платформы /114-116/ (Рис.2). Несколько позже Богданов с сотр. /117/ локализовали б'-конец I6S РНК, используя аналогичный подход, т.е. иммуноэлектронную микроскопию 30S субчастиц! реконструированных I6S РНК, несущей 2,4-динитрофениловый гаптен на 5'-концевой фосфатной группе. 5/-конец I6S РНК был локализован на нижней 1/3 части "тела" малой субчастицы, на стороне, противоположной "платформе" /117/. Таким образом, между 5'о и 3 -концом I6S РНК оказалось расстояние больше ЮОА, что предполагает большие конформационные перестройки 17S РНК предшественника, концы которого сближены.

При помощи антител к двум N6N6 -диметиладенозиновым остаткам в цепи РНК, расположенным через 25 остатков от 3'-конца I6S РНК, эта область была локализована в нижней части "платформы" /118/, что полностью согласуется с локализацией 3'-конца. Другой минорный нуклеотид 7-метилгуанозин (пГб ), находящийся в положении 526 первичной последовательности I6S РНК, локализован между "телом" и "головой" /119/.

Поскольку прямая информация о расположении определенных участков РНК в субчастице этим ограничивается, для представления о распределении других районов РНК приходится прибегать к косвенному анализу — рассмотрению мест связывания индиви

Рис.4.Схематическая диаграмма 16$ РНК E.coli Римские цифры указывают домен РНК, номера показывают белки 30S субчастицы, протектирующие указанные участки от нуклеазного гидролиза, или пришивающиеся к этим участкам (показано стрелками) под действием УФ-облученда.тШипоследовательностъ Шайн-ДальгарноД RNA -*место пришивки к антик,одону тРНК. Вторичная структура I6S РНК по Ноллеру и Возе /66/. дуальных рибосомных белков на РНК и сопоставлению этих данных с имеющимися представлениями о расположении бежов в субчастице.

На основании такого рода данных, можно выделить 3 РНК-белковых домена, которые в целом соответствуют доменам в структуре I6S РНК: I)5'-конец I6S РНК с белками S4, S17 и S20 находится видимо в "голове" 30S субчастицы, 2) "средний" участок с белками S6, $8, SI5 и 518 - в левой части верхней половины "тела" на внешней поверхности 305 и 3) 3'-конец с белками S7, S9, SI3 и SI9 - тоже в "голове" (Рис.4).

1.2.6. Участки связывания лигандов на 30S субчастице.

В недавней работе Траут с сотр. /120/ обработали комплекс 30S субчастицы с факторами инициации IP -I, IP -2 и IP -3 бифункциональным агентом - 2- иминотиоланом. После соответствующего анализа были идентифицированы следующие пары сшитых белков: IP-I-SI2, IP-1-518, IP -2 - S13, IP-3-S7, IP-3 -SII, IP -3 - SI3 и IP -3 - SI9, а также IP -I - IP -2, IP -3 -IP -2. Эти данные позволили авторам расположить факторы инициации на модели Лэйка следующим образом (Рис.5).

Как видно из Рис.5, факторы располагаются на "головке" и "платформе" 305 субчастицы со стороны интерфейса и таким образом конкурируют с 505 субчастицей за место связывания на 305 субчастице. Такое расположение факторов инициации вполне согласуется с их функцией: как мы говорили ранее, факторы IP -I и IP -3 способствуют диссоциации 70S рибосом. Фактор IP -3, кроме этого, стимулирует связывание мРНК с 30S субчастицей. Выше указывалось, что одним из важнейших событий при селекции 305 субчастицей инициаторного кодона AUG является образование дуплекса Шайн-Дальгарно. з'-конец 165 РНК находится на "платформе"

Рыс.5. Сшивки между факторами инициации и 30S-рибосомными белками /120/.

Рис.2). Т.к. декодирующий сайт расположен через несколько нуклеотидов от дуплекса Шайн-Дальгарно, то и декодирующий сайт должен находится в районе "платформы".

Это подтверждается также работой Офенганда с сотр. /59/, в которой 5/-основание антикодона тРНК, находящейся в Р-сайте, было пришито к цитозину 1400 16$ РНК. C-I400 можно примерно локализовать в области между "платформой" и "головкой" 30S субчастицы. Причём интересен факт, что примерно 10 нуклеотидов с каждой стороны от цитозина 1400 составляют чрезвычайно консервативную в процессе эволюции область.

Для идентификации компонентов декодирующего сайта интенсивно применялся метод афинного мечения. Так, Понгс с сотр. синтезировали ряд аналогов инициаторного кодона AUG с бромацетильной группой на 5'-конце /121/, на 3'-конце /122/, Br UGA /123/. Люрман с сотр. использовали в качестве матрицы GUUUI где с 3'-конца находилась йодацетильная группа /124/. Тоубин и Эльсон синтезировали фотореактивируемые азидные аналоги олиго-аденилатов, длиной от 6 до 8 остатков /125/. Кюхлер с сотр. пришили к рибосомам поли(и) и полижи) /126, 127/, Прямым методом Уф-индуцированных сшивок были определены рибосомные белки, пришивающиеся к мРНК в комплексе 30$»мШК фага MS2 в присутствии и отсутствии фактора IP -3 /128/.

Ряд других методов был применен для определения рибосомных белков, взаимодействующих с мРНК: реконструкция способной связывать мРНК 30$ субчастицы после инактивации розовым бенгальским, малеиновым ангидридом, 2-метокси-5-нитропропоном, протекция 30S субчастицы поли(11) от окисления розовым бенгальским, от триптического гидролиза и т.д. Результаты, полученные этими методами после их критического рассмотрения, позволяют очертить

-3,4круг рибосомных бежов, участие которых в связывании мРНК можно считать установленным, это белки Si, S3, 54, 55, 57, 59, SI8 и S2I.

Вагнер с сотр. /129/, используя в качестве мРНК аналог UUU-nhr2/U (г = - СО-СбН^-СО-СНО) обнаружил мечение фрагмента 462-474 I6S РНК. Известно, что к этой области 165 РНК пришивается белок S4. На объединенной модели 305 субчастицы Гаррета белок S4 вместе с S5 иб12 находятся между "головкой" и платформой" /107/. Эти же 3 бежа важны для точности трансляции, и 2 из них 54 и 55 участвуют в связывании мРНК, как это было сказано выше. Таким образом, бежи, играющие роль в точности трансляции, находятся вблизи декодирующего сайта и возможно, прямо взаимодействуют с мРНК.

Совокупность всех этих данных позволяет нам расположить декодирующий сайт в области "платформы" и верхней части "тела", как это показано на объединенной модели Гаретта (Рис.2).

Антибиотик пуромицин является аналогом 3/-конца аминоацил--тРНК, таким образом, локализация сайта связывания пуромицина является также локализацией участка связывания с рибосомой аминоацильного конца тРНК. Куперман с сотр. /130/ в одной из ранних работ показал, что фотоиндуцированное включение пуромицина в рибосому приводит к преимущественному мечению бежа 123, но при этом также слабо метится белок 5 14. В присутствие хлорамфеникола (о котором известно, что это также ингибитор пептидилтрансферазного центра, и более того, существовало мнение, что он связывается по тому же участку, что и пуромицин) в наибольшей степени метился белок SI4 /131/. В недавних работах группы Купермана /132,133/ было показано, что фотоиндуцированное включение в рибосому аналога пуромицина - азидопуромицина приводило к мечению 30£-рибосомных белков SI4 и SI8, а также в меньшей степени 5 7. Добавление £ -меркаптоэтанола, гасящего неспецифическое связывание, приводило к преимущественному мечению белка S7 и в малой степени SI. Белок 57 метился в наибольшей степени в присутствии другого ингибитора связывания аминоацил-тРНК на рибосоме - тетрациклина /134/.

Гиршович и др. /135/ показали, что аналог ЫАсРЬв-тРНК^е несущий фотореактивируемую группу на N -конце аминоацильного остатка, при связывании с полиСЮ-заряженной 30$ субчастицей и облучении этого комплекса, метил белки 514, S7 и S3.

Таким образом, белки S 7 и S14 можно считать белками, находящимися в области связывания з'-конца аминоацил-тРНК.

Олсон и др. /136/, сочетая метод афинного мечения с иммуно-электронной микросввпией, локализовал сайт связывания пуроми-цина в присутствие хлорамфеникола в "головке" 30S субчастицы, в области нахождения бежа 514 (см. Рис.2).

Т.З.Конформационные изменения 305 субчастицы.

Изменение конформации 30S субчастиц наблюдается уже на этапе самосборки. Как известно, добавление к I6S РНК полной смеси белков 30S субчастицы рибосом Е. coll при 0-10° С приводит к образованию И-частиц - комплекса I6S FHK с неполным набором бежов (отсутствуют бежи 31, 52, 510, 514 и 521). Для завершения самосборки необходимо инкубирование SI-частиц при 40°С.

При этом происходит превращение KI-частиц в И -частицы, что делает возможным присоединение недостающих белков и образование функционально активных 30S субчастиц /81/. Было показано, что переход SI в KI* сопровождается изменением конформации 16$ РНК , а такде изменением контактов I6S РНК с рибосомными бежами /137/.

При исследовании биологической активности свободных рибосомных субчастиц Замир и др. в ряде работ /138,139/ показали, что субчастицы могут существовать в активном и неактивном состоянии, и эти состояния взаимопревращаемы. Факторы, приводящие к таким переходам, это температура, концентрация одновалентных катионов, концентрация Mq++. Так, в случае ЗОВ субчастиц, при понижении концентрации ионов M(f+ от физиологического уровня (~ 5цМ) до 1мМ и менее, многие активности 30S субчастицы теряются. При возвращении таких субчастиц в среду, содержащую 5иМ Мд++ при температуре 0°С, суб частицы остаются в неактивном состоянии, так, они не ассоциируют с 50S субчастицами и не активны в матрично-зависимом связывании тРНК. Только после инкубирования таких субчастиц при высокой концентрации Мд++и 40°С активность субчастиц восстанавливается и проявляется также и при 0°С /138/.

Активные и неактивные субчастицы не различаются по составу, их различие только в конформации - авторы /139/ делают этот вывод на основе следующих исследований: а)активные и неактивные 30S субчастицы по-разному подвергаются окислению сульфгид-рильных групп, б)активные 30S субчастицы седиментируют быстрее, чем неактивные, в)при обработке N -этилмалеимидом получают разные наборы меченных белков для активных и неактивных 30S субчастиц.

Несколько позднее Нолль и сотр. /140/ показали, что по способности ассоциировать с 50S суб частицей 30£> суб частицы делятся на 3 группы: "а" - группа содержит 30S субчастицы, способные ассоциировать с 503 субчастицей, "б" - 303 субчастицы, не способные ассоциировать с 503 субчастицами, но после процедуры активации, превращаются в субчастицы "а"-класса, и "с" - группа содержит необратимо неактивные субчастицы. Все 3 группы субчастиц оказались различными по конформации, как это было показано по их реакционноспособности по отношению к N -этилмалеими-ду.

Ряд работ посвящен исследованию различной конформации I6S РНК в активной и неактивной 30S субчастице. Так, была исследована реакционноспособность 163 РНК в активной и неактивной 30S субчастице (по Замир) к кетоксалю, реагенту, модифицирующему гуаниловые остатки в одноцепочечных участках РНК /141/. Было показано, что 1)большинство модифицируемых в активных 30S субчастицах остатков примерно в 13 раз эффективнее реагирует в неактивной частице. После активации эти субчастицы модифицируются аналогично активным. 2)Количество модифицируемых кетоксалем сайтов в неактивной субчастице ~ вдвое больше, чем в активной. 3)Сайты модификации в неактивной субчастице примерно равномерно распределены по всей цепи I6S РНК, в то время как в активной они располагаются конкретными кластерами. Таким образом, активные и неактивные 30S субчастицы различаются по конформации I6S РНК. Несколько позднее Таммана и Кантор /142/ с помощью фото-индуцированных сшивок внутри молекулы I6JS РНК гидросиметил-триметилпсораленом показали конформационные изменения З'-кон-ца 16S РНК при переходе от активной к неактивной форме субчастиц (они же несколько ранее показали /143/, что последовательность ш|А находящаяся недалеко от З7-конца I6S РНК, экспонирована на поверхности неактивной 30S субчастицы, и не реагирует с антителами к этой последовательности после активирования) . Далее, было показано, /98/, что дезоксиоктануклеотид 5'd(AAGGA66T), комплементарный к 3'-концу I6S РНК, не связывается с неактивной 30S субчастицей и связывается с ней после процедуры активации, что также говорит о разных конформациях З'-конца в активной и неактивной форме.

В недавней работе Кэрни и Мура /144/ активные и неактивные рибосомные субчастицы были исследованы физическим методом -методом рассеяния рентгеновских лучей. Авторы пришли к выводу, что структурные различия между субчастицами, видимо, малы и невыходят за пределы разрешения используемого метода, т.к. своим методом они этих различий не зарегистрировали.

Перейдем к вопросу об изменении конформации 30S субчастицы при ассоциации её с 50S субчастицей. Ряд работ с использованием доступности к разным химическим реагентам свободной 3OS субчас-тицыИв составе 70S рибосомы показал, что конформация 30S субчастицы в составе 70S рибосомы и в свободном виде неодинакова. Так, 30S субчастицы и 70S рибосомы обрабатывали красителем флюоресцеинизотиоцианатом /145/. Один из белков 30S субчастицы был более реакционноспособен в составе 70S рибосомы, чем в свободной 30S субчастице. Аналогичным методом, но используя N -этилмалеимид, было показано изменение конформации 30S субчастицы в составе 70S рибосомы /146/. Гинзбург и Замир /147,148/ с тем же реагентом показали, что белки SI, SI8 и S2I становятся более реакционноспособными к его действию в составе 70S по рибосомы и предложили, что конформация неактивной 30 S субчастицы приближается к конформации 30S субчастицы в составе 70S рибосомы.

В лаборатории Ноллера /54/ было показано, что при обработке кетоксалем 30S и 70S рибосом один сайт, отстоящий примерно на 550 нуклеотидов от 3'-конца I6S РНК, становится более доступным в составе 70S, чем в свободной 30S субчастице.

В работе /149/ было применено катализируемое лактопероксидазой йодирование активных, обратимо неактивных 30S субчастиц, а также 70S рибосом. Неактивные 30S субчастицы были более доступны энзиматическому йодированию, чем активны--, а именно, 7 белков в них S5, S2I, S4, S7, SIO, S13 и S16 йодировались в большей степени, чем в активных, что говорит о более открытой конформации неактивных субчастиц по сравнению с активными. 30S субчастица в составе 70S рибосомы тоже имела более открытую конформацию, чем активная свободная 30S субчастица, но при этом увеличивалось включение в другие белки: S3, 36, S9 и SI8. Это позволило авторам утверждать, что хотя и неактивные 30S субчастицы, и 30S субчастицы ассоциированные с 50S субчастицами имеют более открытую по сравнению с активными 30S субчастицами конформацию, однако это разные конформационные изменения. Методом УФ-сшивок было прямо показано /150/ изменение конформации 30S субчастицы при ассоциации субчастиц.

В ряде работ авторы не нашли различий конформаций между свободной и ассоциированной 30S субчастицей. Так, Траут и др. /151/, с помощью метода образования белок-белковых сшивок под действием бифункционального реагента - 2-иминотиолана - показал, что и в свободных 30S субчастицах, и в 30S субчастицах в составе 70S рибосом образуются те же сшитые пары белков. Использование метода нейтронного рассеяния также не выявило больших структурных различий между этими двумя состояниями 30S суб частицы /152/. Авторы этих работ считают, что если конформационные изменения и есть, то они небольшие и находятся за пределом разрешения используемых ими методов. Как было сказано выше, образование комплекса 30S субчастицы рибосом E.colL с фактором 1Г -3 является необходимым этапом при инициации белкового синтеза на природной мРНК. Существует ряд данных, полученных Галлерзи с сотр., о том, что образование комплекса 30S • IP -3 сопровождается конформационными изменениями. Так, было показано /153,154/, что образование комплекса приводит к изменению спектров кругового дихроизма (КД), коэффициентов седиментации и параметров малоуглового рассеяния рентгеновских лучей, реакционноспособности многих рибосомных белков к модифицирующим агентам. Методом УФ-сшивок было показано, что образование комплекса 305 • 1Г -3 сопровождается значительным изменением РНК-белковых контактов, что говорит о существенных кон-формационных изменениях 30S субчастицы /56/. Однако, некоторые физические методы, такие как лазерное светорассеяние /155/ и малоугловое нейтронное рассеяние /156/, не показывают структурных различий между свободной 30S и 30S в комплексе с IP -3.

В литературе нет данных относительно изменения конформации 30S субчастицы при образовании комплекса с мРНК и тРНК.

Таким образом, из вышесказанного видно, что только чувствительные к локальным изменениям конформации методы улавливают те небольшие конформационные изменения, которые претерпевает рибосома в процессе функционирования. Одним из таких методов, является метод УФ-индуцированных полинуклеотид-белковых сшивок. Поэтому мы применили его для исследования РНК-белковых взаимодействий в комплексах 30S субчастицы с мРНК и аналогом инициа-торной тРНК, т.е. в комплексе, моделирующем основной промежуточный этап при инициации — образование ЗОБ-инициаторного комплекса .

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Наргизян, Маги Гегамовна

ВЫВОДЫ

1. Показано, что переход от свободной 30S субчастицы к аналогу

ЗОЗ-инициаторного комплекса - комплексу 30S • поли(и)

Phe

- NAcPhe-тРНК приводит к заметному изменению набора контактов I6S РНК с рибосомными белками, что свидетельствует об изменении конформации ЗОЙ субчастицы.

2. Замена NAc Phe ~тШК^е на phe-TPHK^e в комплексах с поли(и) -заряженной 30S субчастицей (комплексы I и II) не влияет на контакты 16 S РНК с б ежами, но переход к комплексу, содержащему деацилированную тРНК^6 (комплекс III), сопровождается изменением I6S РНК-белковых контактов, что свидетельствует о локальных изменениях конформации 305 субчастицы.

3. Переход от комплекса I к комплексу II сопровождается незначительным изменением, а переход к комплексу III - существенным изменением тРНК-белковых контактов. Белки S4, S5, 59,11 являются общими для всех 3-х комплексов.

Phe

Контакты NAc Phe -тРНК с белками I очень близки к

Met таковым для f Met -тРНК { в природном прединициаторном комплексе. Это является первым структурным доказательством одинакового расположения тРНК в этих комплексах.

4. Таким образом, комплексы I и II не различаются по I6S РНК-белковым контактам, но имеют небольшие различия тРНК-бежовых контактов, т.е. различаются по конформации тРНК и/или её расположению на 30S субчастице.

Комплекс III, содержащий деацилированную тРНК, достоверно отличается от комплексов I и II не только тРНК-белковыми контактами, но и I6S РНК-белковыми контактами. Это может быть следствием изменения конформации тРНК и/или её расположения на 30S субчастице, а также изменения конформации самой 305 субчастицы,

5. Разработан метод получения мономеркурированной тРНК, атом ртути в которой устойчив к действию меркаптоэтанола и к УФ--облучению. Мономеркурированная тРНК может быть специфически отделена от других полинуклеотидов связыванием на SH-еорбентах.

6. Мономеркурированная тРНК не отличается от исходного препарата по функциональным свойствам в системе трансляции, её контакты с рибосомными белками в комплексе I аналогичны таковым для немеркурированной тРНК в этом комплексе.

Список литературы диссертационного исследования кандидат химических наук Наргизян, Маги Гегамовна, 1984 год

1.Van Holde K.E., Hill W.E. General physical properties of ribosomes. - 1.: Ribosomes (M.Nomura, A.Tissieres,

2. P.Lengyel, eds.), Cold Sprihg Harbor Lab., 1 974,p.53-91.

3. Lodish H.3?. Specificity in bacterial protein synthesis: role of initiation factors and ribosomal subunits. Nature, 1970, v.226, N5247, p.705-707.

4. Held 1<V.A., Gette W.R., Nomura M. Hole of 16S ribosomal ribonucleic acid and the 30S ribosomal protein S12 in the initiation of natural messenger RNA translation. Biochemi stry, 1974, v.1 3, N10, p.2115-2122.

5. Goldberg M.L., Steitz J.A. Cistron specificity of 30S ribosomes heterologously reconstituted with components from Escherichia coli and Bacillus stearothermophilus. -biochemistry, 1974, v.13, N10, p.2123-2129.

6. Blumberg В.м., Nalramoto Т., Kezdy P.J. Kinetics of initiation of bacterial protein synthesis. Proc. Natl. Acad. Sci., 1979, v.76, N1, p.251-255.

7. Legon S., Model P., Robertson H.D. Interaction of rabbit reticulocyte ribosomes with bacteriophage f1 mRNA andof Escherichia coli ribosomes with rabbit globin mRNA. -Proc. Natl. Acad. Sci., 1977, v.74, N7, p.2692-2696.

8. Kozak M. Comparison of initiation of protein synthesis in procariotes, eucariotes and organelles. Microbiol. Rev., 1983, v.47, N1, p.1-45.

9. Kaempfer R. Initiation factor I3?3: a specific inhibitor of ribosomal subunit association. J.Mol.Biol., 1972, v.71, N3, p. 583-598.

10. Chaires J.В., Pande C., Wishnia A. The effect of initiation factor 13? 3 on Escherichia coli ribosomal subunit association kinetics. J.Biol.Chem., 1981, v.256, N13,p.6600-6607.

11. Dottavio-Martin D., Suttle D.P., Ravel J.M. The effects of initiation factor 13?3 on the dissociation of Escherichia coli 70S ribosomes. EEBS Lett., 1979, v.87, N1, p. 105-1Ю.

12. H.Dubnoff J.S., bockwood A.H., Maitra U. Studies on the role of guanosine triphosphate in polypeptide chain initiation in Escherichia coli. J.Biol.Chem., 1972, v.247, N9, p.2884-2894.

13. Rudland P.S., Whybrow W.A., Clark B.E.C. Recognition of bacterial initiator tRNA by an initiation factor. Nature New.Biol., 1977, v.231, N20, p.76-78.

14. Van der Hofstad G.A.J.M., Eoekens J.A., Bosch L., Woorma H.O. The involvement of a complex between formylmethionyl tRNA and initiation factor TF2 in procariotic initiation. - Eur J.Biochem., 1977, v.77, N1, p.69-75.

15. Petersen H., Roll I., Grunberg-Manago M., Clark B.E.C.

16. Specific interaction of initiation factor IF2 of E.coli1. Metwith fomylmethionyl tffl'TA^ . - Biochem.Biophys. Res. Commun., 1979, v.91, 13, p. 1068-1074.

17. Maitra U., Stringer E.A., Chaudhuri A. Initiation factors in protein biosynthesis. Ann.Rev.Biochem., 1982, v.51, p. 869-900.

18. Gualerzi C., Risuleo G., Pon C. Initial rate kinetic analysis of the mechanism of initiation complex formationand the roleof initiation factor IF3. Biochemistry, 1977, v.16, N8, p. 1684-1689.

19. Jay G., Kaempfer R. Sequence of events in initiation of translation: a role for initiator transfer RNA in the recognition of messenger RNA. Proc.Natl.Acad.Sci., 1974, v.71, N8, 3199-3203.

20. Backendorf C., Overbeek G.P., van Boom J.H.,,van der Marel G., Veeneman G., van Duin J. Role of 16S RNA in ribosome messenger recognition. Eur.J.Biochem., 1980, v.110, N2, p.599-604.

21. Hershey J.W.B., Dewey K.P., Trach Я.Е. Purification and properties of initiation factor f1. Nature, 1969, v.222, N5197, p.944-947.

22. Stringer E.A., Sarkar P., Maitra TJ. Function of initiation factor 1 in the binding and release of initiation factor 2 from ribosomal initiation complexes in E.coli. J.Biol. Chem., 1977, v.252, N5, p.1739-1744.

23. Steitz J.A., Sprague K.U., Steege D.A., Yuan E.G., Xaughrea M. RNA«RNA and protein.RNA interaction during initiation of protein synthesis. — In: Nucleic Acid-protein recognition (H.J. Vogel ed.) Academic Press, New York, 1977, p.491-508.

24. Trach S.S., Trach R.E., Translocation of messenger RNA and "accomodation" of fMet-tRNA. Proc.Natl.Acad.Sci., 1971, v.68, N8, p.1791-1795.i

25. Shine J., Dalgarno 1. The 3-terminal sequence of E.coli 16S ribosomal RNA: complementarity to nonsense triplets and ribosome binding sites. Proc.Natl.Acad.Sci., 1974, v.71, N4, p.1342-1346.

26. Steitz J.A., Jakes K. How ribosomes select initiator regions in mRNA: base pair formation between the 3 terminus of 16S rRNA and the mRNA during initiation of protein synthesis in Escherichia coli. Proc.Natl.Acad.Sci., 1975> v.72, N12, p.4734-4738.

27. Taniquchi Т., Weissmarm. C. Inhibition of Q RNA 70S ribosome initiation complex formation by an oligonucleotide complementary to the 3'terminal region of E.coli 16S ribosomal RNA. Nature, 1978, v.275, N5682, p.770-772.

28. Singer B.S.,Gold X., Shinedling S.T., Colkitt M., Hunter b., Pribnow D., Nelson M. Analysis in vivo of translational mutants of the rllB cistron of bacteriophage T4. J.Mol. Biol., 1981, v.149, N3, p.405-432.

29. Chapon С. Expression of mal T, the regulator gene of the maltose regulation in Escherichia coli, is limited both at transcription and translation. EMBO J., 1982, v.1 , N3, p.369-374.

30. Steitz J.А. RNA-RNA interactions during polypeptide chain iniation. In Ribosomes: structure, function and genetics (G.Chambliss, G.R.Craven, J.Davies, K.Davis, b.Kahan, M.Nomura, eds.), University Park Press, Baltimore, 1980, p.479--495.

31. Stormo G., Schneider Т., Gold b. Characterization of trans-lational initiation sites in E.coli. Nucl.Acids Res., 1982, v.10, N9, p.2971-2996.

32. Stroynowski I., van Cleemput M., Yanofsky C. Superattenua-tion in the tryptophanoperon of Serratia marcescens. Nature, 1982, v.298, N5869, p.38-41.

33. Sellcer E., Yanofsky C. Nucleotide sequence of the trpC-trpB intercistronic region from Salmonella tjrphimirium. J.Mol. Biol., 1979, v.130, N2, p.135-143.

34. Rosa M.D. Structure analysis of three T7 late mRNA ribosome binding sites. J.Mol.Biol., 1981, v.147, N1, p.55-71.

35. Min Jou W., Haegeman G., Isebaert M., Eiers W. Nucleotide sequence of the gene coding for the bacteriophage MS2 coat protein. Nature, 1972, v.237, N5349, p.82-88.

36. Muller U.R., Wells R.D. Intercistronic regions in X174 DNA. II. Biochemical and biological analysis of mutants with altered intercistronic regions between genes J and E. -- J.Mol.Biol., 1980, v.141, N1, p.25-41.

37. Gold.b., Pribnow D., Schneider T.,Shinedling S., Singer B.S., Stormo G. Translational initiation in procaryotes.

38. Ann.Rev.Microbiol., 1981, v.35, p.365-403.

39. Scherer G.E.E., Walkinshaw M.D., Arnott S., Moore D.J. The ribosome binding sites recognized by E.coli ribosomes have regions with signal character in both the leader and protein coding segments. Nucl.Acids Res., 1980, v.8, N17, p.3895-3907.

40. Кириллов С.В. Механизм кодон-антикодонового взаимодейетаия в рибосомах. — В кн. Структура и функция рибосом. Итоги науки и техники, серия "Биологическая химия", Москва, 1983, т.18, с.5-98.

41. Wintermeyer W., Gualerzi С. Effect of Escherichia coli1. Pheinitiation factors on the kinetics of UAcPhe-tRNA binding to 30S ribosomal subunits. A fluorescence stopped-flov? study. Biochemistry, 1983, v.22, N3, p.690-694.

42. Kurland C.G. Molecular characterization of ribonucleic acid from Escherichia coli ribosomes. I. Isolation and molecular weight. J.Mol.Biol., 1960, v.2, N2,p.83-91.

43. Carbon P., Ehresmann C., Ehresmann В., Ebel J.P. The sequence of Escherichia coli ribosomal 16S RNA determined by new rapid gel methods. EEBS Lett., 1978, v.94, HI, p.152-156.

44. Brosius J., Palmer M.L., Kennedy Р.Ь., loller H.E. Complete nucleotide sequence of a 16S ribosomal ША gene from Escherichia coli. Proc.Natl.Acad.Sci., 1978, v.75, N10, p.4801-4805.

45. Dzionara M., Kaltschmidt Б., Wittmann H.G. Ribosomal proteins. XIII. Molecular weights of isolated riboso-mal proteins of Escherichia coli. Proc.Natl.Acad.Sci.,1970, v.67, N4, p.1909-1913.

46. Brimacombe R. Conservation of structure in ribosomal REA. TIBS, 1984, v.9, Кб, p.273-277.

47. Herr ¥., Chapman 1T.M., Roller H.J1. Mechanism of ribosomal subunit association: discrimination of specific sites in 16S RM essential for a association activity. J.Mol.Biol. 1979, v.130, 14, p.433-449.

48. Senjor B.W., Holand J.В. Effect of Colicin E3 upon the 30S ribosomal subunit of Escherichia coli. Proc.latl.Acad.Sci.,1971, v.68, Ж5, p.959-963.

49. Baan R.A., Duijfjes J. J., van beerdam E., van Knippenberg P.H, Bosch b. Specific in situ cleavage of 16S ribosomal RITA of Escherichia coli interferes with the function of initiation factor IF1 . Proc.latl.Acad.Sci., 1976, v.73, N3, p.702-706.

50. Prince J.В., Taylor B.H., Thurlow D.L., Ofengand J., Zimmermann R.A. Covalent cros si inking of tENA^3"*" to 16S RNA at the ribosomal P site: identification of crosslinked residues. Proc.Natl.Acad.Sci., 1982, v.79, N18, p.5450-5454.

51. Muller R., Garett R.A., Holler H.F. The structure of the ЕЖА binding site of ribosomal proteins S8 and S15. -J.Biol.Chem., 1979, v.254, N10, p.3873-3878.

52. Ehresmann С., Stiegler P., Ungewichell E., Garett R.A. The topography of the 5' and of 16S RNA in the presence and absence of ribosomal proteins S4 and S20. Eur. J.

53. Biochem., 1970, v.103, N3, p.439-446.

54. Cantor C.R., Wollenzien P.L., Hearst J.E. Structure and topology of 16S ribosomal RNA. An analysis of the pattern of psoralen crosslinking. Nucl.Acids Res., 1980, v.8, N8, p.1855-1872.

55. Thompson J.P., Hearst J.E. Structure of E.coli 16S RNA elucidated by psoralen crosslinking. Cell, 1982, v.32, N4, p.1355-1365.

56. Zwieb C., Brimacombe R. Localisation of a series of intra-RNA cross-links in 16S RNA, induced by ultraviolet irradiation of Escherichia coli 30S ribosomal subunits. -Nucl.Acids Res., 1980, v.8, N11, p.2397-2411.

57. Ross A., Brimacombe R. Experimental determination of interacting sequences in ribosomal RNA. Nature, 1979,v.281, N5729, p.271-276.

58. Noller H.F., Woese C.R. Secondary structure of 16S ribosomal RNA. Science, 1981, v.212, N4493, p.403-411.

59. Zwieb C., Glotz C., Brimacombe R. Secondary structure comparisons between small subunit ribosomal RNA molecules from six different species. Nucl.Acids Res., 1981, v.9, N15, p.3621-3640.

60. Maly P., Brimacombe R. Refined secondary structure models for the 16S and 23S ribosomal RNA of Escherichia coli. -Nucl.Acids Res., 1983, v.11, N21, p.7263-7286.

61. Stiegler P., Carbon P., Zuker M., Ebel J.P., Ehresmann C. Structural organisation of the 16S ribosomal RNA from E.coli. Topography and•secondary structure. Nucl. Acids Res., 1981, v.9, N9, p.2153-2172.

62. Skripkin E.A., Bogdanov A.A. In: Subcellular Biochemistry.

63. D.Roodyn ed.) Plenum Press, New York, London, 1980, v.7, p.105-108.71.bake J.A. Ribosome structure determined by electron microscopy of Escherichia coli small subunits, large subunits and monomeric ribosomas. J.Mol.Biol., 1976, v.105, N1, p.131-159.

64. Stoffler,Bald R., Kastner В., ЬШхгтапп, Stoffler-Meilicke M. In: Ribosomes: structure, function and genetics (G.Chambliss, G.R. Craven, J.Davies, K.Davis, b.Kahan, M.Nomura, eds.) University Park Press, Baltimore, 1980, p.171-206.

65. Vasiliev V.D., Koteliansky У.Е., Shatsky I.M., Rezapkin G.V. Structure of the ribosomal 16S RNA-protein S4 complex as revealed by electron microscopy. FEBS bett., 1977, v.84, N1, p.43-46.

66. Vasiliev Y.D., Selivanova O.M., Koteliansky Y.E. Specific self-packing of the ribosomal 16S RNA. FEBS Lett., 1978, v.95, N2, p.273-275.

67. Wittmann H.G., bittlechild J., Wittmann-biebold B. Structure of ribosomal proteins. In Ribosomes: structure, function and genetics (G. Chambliss, G.R.Craven, J.Davies, K.Davies, b.Kahan, M.Nomura, eds.), University Park Press, Baltimore, 1980, p.51-88.

68. Kamp., Wittmann-Liebold B. Primary structure of protein S11 from Escherichia coli ribosomes. FEBS Lett., 1980, v.121, N1, p.117-122.

69. Allen S.H., Wong K.P. Conformational prediction and circular dichroism studies on ribosomal protein S4 from Escherichia coli. Biophys. J., 1978, v.23, N3, p.359-373.

70. Gogia Z.V., Venyaminov S.Y., Bushuev V.N., Serdyuk Y.N., Mm V.Y., Spirin A.S. Compact globular structure of protein S15 from Escherichia coli ribosomes. FEBS Lett., 1979, v.105, N1, p.63-69.

71. Chu Y.G., Cantor C.R. Segmental flexibility in Escherichia coli ribosomal protein S1 as studied by fluorescence polarization. Nucl.Acids Res., 1979, v.6, N6, p.2363-2379.

72. Khechinashvili N.N., Koteliansky V.E., Gogia Z.Y., bittlechild J., Dijk J. A heat denaturation study of several ribosomal proteins from Escherichia coli by scanning microcalorimetry. FEBS bett., 1978, v.95, N2, p.270-272.

73. Iraub P., Nomura M. Structure and function of E.coli ribosomes. VI. Mechanism of assembly of 30S ribosomes studied in vitro. J.Mol.Biol., 1969, v.40, N3, p.391-413.

74. Nomura M., Mizushima S., Ozaki M., Traub P., lawry C.V. Structure and function of ribosomes and their molecular components. Cold.Spr.Harb.Symp.Quant.Biol., 1969,v.34, p.49-61.

75. Birge E.A., Kurland C.G. Altered ribosomal protein in streptomycin dependent Escherichia coli. Science, 1969, v.166, N3910, p.1282-1284.

76. Ozaki M., Mizushima S., Nomura M. Identification and functional characterization of the protein controlled by the streptomycin-resistant locus in Escherichia coli. -Nature, 1969, v.222, N5201, p.333-335.

77. Deusser E., Stoffler G., Wittmann H.G., Apirion D. Ribosomal proteins. XVI. Altered S4 proteins in Escherichia coli revertans from streptomycin dependence to independence. Mol.Gen.Genet., 1970, v.109, N3, p.298-302.

78. Birge E.A., Kurland C.G. Reversion of a streptomycin dependent strain of Escherichia coli. Mol.Gen.Genet., 1970, v.109, N3, p.356-358.

79. Stoffler G., Deusser E., Wittmann H.G., Apirion D. Robo-somal proteins. XIX. Altered S5 ribosomal proteins in an Escherichia coli revertant from streptomycin dependence to independence. Mol.Gen.Genet., 1971, v.111, N4, p.334-341.

80. Hasenbank R., Guthrie C., Stoffler G., Wittmann H.G., Rosen Ъ., Apirion D. Electrophoretic and immunological studies on ribosomal proteins of 100 Escherichia coli revertans from streptomycin dependence. Mol.Gen.Genet., 1973, v.127, N1 , p.1-18.

81. Dabbs E.R., Wittmann H.G. A strain of Escherichia coli wich gives rise to mutations in a large number of ribosomal proteins. Mol.Gen.Genet., 1976, v.149, N3,p.303-309.

82. Dabbs E.R., Mutational alterations in 50 proteins of the Escherichia coli ribosome. Mol.Gen.Genet., 1978, v.165, N1, p.73-78.

83. Dabbs E.R. Kasugamycin-dependent mutants of Escherichia coli. J.Bacterid., 1978, т. 136, ИЗ, p.994-1001.

84. Isono S., Isono K., Hirota I. Mutations affecting thestructural genes and the genes coding for modifying enzymes for ribosomal -nroteins in Escherichia coli. Mol.Gen.Genet., 1978, v.165, N1, p.15-20.

85. Dabbs E.R. Selection for Escherichia coli mutants with proteins missing from the ribosome. J.Bacteriol., 1979, v.140, 12, p.734-737.

86. Subramanian A.R., Dabbs E.R. Functional studies on ribosomes lacking protein Ь1 from mutant Escherichia coli. -Eur.J.Biochem., 1980, v.112, N2, p.425-430.

87. Garrett R. Roles for ribosomal proteins. TIBS, 1983, v.8, N3, p.75-76.

88. Juan R.O., Steitz J.A., Moore P.В., Crothers D.M. The 3 terminus of 16S rRNA: secondary structure and interaction with ribosomal protein S1. Nucl.Acids.Res., 1979, v.7, N8, p.2399-2418.

89. Boni I.V., Zlatkin I.V., Budowsky E.I. Ribosomal protein S1 associates with Escherichia coli ribosomal 30S subunit by means of protein-protein interactions. Eur.J.Biochem., 1982, v.121, N2, p.371-376.

90. Isono K., Isono I. Lack of ribosomal protein S1 in bacillus stearothermophilus. Proc.Natl.Acad.Sci., 1976, v.73, N3, p.367-770.

91. Vasiliev v.D. Morphology of the ribosomal 30S subparicle according to electron microscopy date. Acta.Biol.Med.Germ., 1974, v.33, N5, p.779-793.

92. Tischendorf G.W., Zeichardt H., Stoffler G. location of proteins S5, S13 and S14 on the surface of the 30S ribosomal subunit from Escherichia coli as determinued by immune electron microscopy. Mol.Gen.Genet., 1974, v.134, N2, p.220-223.

93. Prince J.В., Gutell R.R., Garett R.H. A consensus model of the Escherichia coli ribosome. TIBS, 1983, v.8, N7, p.359-363.

94. Ramakrishnan V., Capel M., Kjeldgaard M., Engelman D.M., Moore P.B. Position of proteins S14, S18 and S20 in the 30S. Ribosomal subunit of Escherichia coli. J.Mol.Biol., 1984, v.174, N2, p.265-284.

95. Hamakrishnan V.R., Yabubi S., Sillers Y.-I., Schindler D.G., Engelman D.M., Moore P.B. Positions of proteins S6,

96. S11 and S15 in the 30S ribosomal subunit of Escherichia coli. J.Mol.Biol., 1981, v.153, N3, p.739-760.

97. Lambert J.M., Boileau G., J.Cover, Traut R.R. Crosslinks "between ribosomal proteins of 30S subunits in 70S tightcouples and in 30S subunits. Biochemistry, 1983,v.22,

98. Winkelmann D.A., Kahan L. Immunochemical accessibilityof ribosomal protein S4 in the 30S ribosome. J.Mol.Biol., 1983, v.165, N2, p.357-374.

99. Shatsky I.N., Mochalova L.V., Kojouharova H.S., Bogdanov A.A., Yasiliev V.D. Locali zation of the 3' end of Escherichia coli 16S RNA by electron microscopy of antibody-labelled subunits. J.Mol.Biol., 1979, v.133, N4, p.501-515.

100. Olson H.M., Glitz D.G. Ribosome structure: localization of 3'end of RNA in small subunit by immunoelectronomi-croscopy. Proc.Natl.Acad.Sci., 1979, v.76, N8, p.3769--3773.

101. Luhrmann H., Stoffler Meilicke M., Stoffler G. Localization of the 3'end of 16S rRNA in Escherichia coli 30S ribosomal subunits by immuno electron microscopy. - Mol. Gen.Genet., 1981, v.182, N3, p.369-376.

102. Mochalova L.Y., Shatsky I.N., Bogdanov A.A., Vasiliev V.D. Topography of RNA in the ribosome localization of the 16S RNA 5'end by immune electron microscopy. J.Mol.Biol., 1982, v.159, N4, p.637-650.

103. Politz S.M., Glitz D.G. Ribosome structure: localizationг (Zof N ,N dimethyladenosine by electron microscopy of ribosome-antibody complex. - Proc.Natl.Acad.Sci., 1977, v.74, N4, p.1468-1472.

104. Trempe M.R., Ohgi E., Glitz D.G. Ribosome structure. Localization of 7-methylguanosine in the small subunits of Esherichia coli and chloroplast ribosomes by immunoelectron microscopy. JTBiol.Chem., 1982, v.257, N16,p.9822-9829.

105. Boileau G., Butler P., Hershey J.W., Traut R.R. Direct cross-links between factors 1,2 and 3 and ribosomal proteins promoted by 2-iminothiolane. Biochemistry, 1983, v.22, N13, p.3162-3170.

106. Ponds 0., Stoffler G., Lanka E. The codone binding site of the Escherichia coli ribosome as studied with a chemically reactive A-U-G analog. J.Mol.Biol., 1975, v.99, N2-3, p.301-315.

107. Pongs 0., Stoffler G., Bald R.W. Location of protein S1 of Escherichia coli ribosomes at the A-site of the codon binding site. Affinity lobeling studies with a 3'-modified A-U-G analog. lucl. Acids Res., 1976, v.3, N7, p.1635-1646.

108. Ponds 0., Rossner E. Comparison of the reactions of chemically reactive analogs of U-G-A and of A-U-G with ribosomes of Escherichia coli. lucl.Acids Res., 1976, v.3, 17,p.1625-1633.

109. Ltihrmann R., Gassen H.G. Identification of the 30S Ribosomal proteins at the decoding site by affinity labeling with a rective oligonucleotide. Eur.J.Biochem., 1976, v.66,11, p. 1-6.

110. Towbin H., Elson D. A photoaffinity labeling study of the messenger RIA-binding region of Escherichia coli ribosomes. lucl.Acids Res., 1978, v.5, 19, p.3389-3408.

111. Fizer I., Margaritella P., Kuechler E. Photoaffinity reaction between polyuridylic acid and protein S1 on the Escherichia coli ribosome. ЖВБ Lett., 1975, v.52, 12, p.281-283.

112. Eizer I., Scheit K.H., Kuechler E. Poly(4-thiouridylic acid) as messenger R1A and its application for photoaffinity labelling of the ribosomal mRIA binding site. -Eur. J.Biochem., 1977, v.74, N3, p.447-456.

113. Broude I.E., Kussova K.S., Medvedeva U.S., Budowsky E.I. Proteins of the 30S subunit of Escherichia coli ribosomes wich interact directly with natural mRIA. Eur.J.Biochem., 1983, v.132, 11, p.139-145.

114. Wagner R., Gassen H.G., Ehresmann Ch., Steegler P., Ebel J.P. Identification of a 16S R1A sequence located in the decoding site of 30S ribosomes. 1EBS Lett., 1976, v.67, 13, p.312-315.

115. Jaynes E.l.Jr., Grant P.G., Giandgrande G., Weider R., Cooperman B.S. Photoinduced affinity labeling of the Esherichia coli ribosome puromycin site. Biochemistry 1978, v.17, 14, p.561-569.

116. Grant P.G., Strycharz W.A., Jaynes E.N.,Ir., Cooperman B.S. Antibiotic effects on the photoinduoed affinity labeling of Escherichia coli ribosomes by puromycin. Biochemistry, 1979, v.18, N11, p.2149-2154.

117. Olson H.M., Grant P.G., Glitz D.G., Cooperman B.S. Immuno-electron microscopic localization of the site of photoinduced affinity labeling of the small ribosomal subunit with puromycin. Proc.Natl.Acad.Sci., 1980, v.77, N2, p.890-894.

118. Zamir A., Miskin Е., Elson D. Inactivation and reactivation of ribosomal subunits: amyno acyl-transfer RNA binding activity of the 30S subunit of Escherichia coli. J.Mol. Biol., 1971, v.60, N2, p.347-364.

119. Zamir A., Miskin R., Vogel Z., Elson The inactivation and reactivation of Escherichia coli ribosomes. In Methods in Enzymology (K.Moldave, b.Grossman, eds.), Academic Press, New York, Xondon, 1974, v.30, p.406-426.

120. Hapke В., Noll H. Structural dynamics of bacterial ribosomes. IV". Classification of ribosomes by subunit interaction. J-Mol.Biol., 1976, v.105, N1, p.97-109.

121. Hogan J.J., Noller H.P. Altered topogphy of 16S RNA in the inactive form of Escherichia coli 30S ribosomal subunits. Biochemistry, 1978, v.17, N4, p.587-593.

122. Tammana P., Cantor Ch.R., Wollenzien Р.Ь., Hearst J.E. Crosslinking studies on the organization of the 16S ribosomal RNA within the 30S Escherihia coli ribosomal subunit. J-Mol.Biol., 1979, v.135, , p.271-283.

123. Thammana P., Cantor C.R. Studies on ribosome structureft fand interactions near the т^Ал^А sequence. Nucl.Acids Res., 1978, v.5, N3, p.805-823.

124. Kearney K.R., Moore P.B. X-ray solutin-scattering studies of active and inactive Escherichia coli ribosomal subunit.-J.Mol.Biol., 1983, v.170, N2, p.381-403.

125. Huang K., Cantor Ch.R. Surface topography of the 30S Escherichia coli ribosomal subunit. Reactivity towards fluorescein isothiocyanate. J.Mol.Biol., 1972, v.67, N2, p.265-267.

126. Moore P.B. Reaction of N-ethyl-maleimide with the ribosomes of Escherichia coli. J.Mol.Biol., 1971, v.60, N1, p.169-184.

127. Ginzburg I., Miskin R., Zamir A. N-Ethyl maleimide as a probe for the study of functional sites and conformations of 30S ribosomal subunits. J.Mol.Biol., 1973, v.79, N3, p.481-494.

128. Абдурашидова Г.Г., Пивазян А.Д., Турчинский М.Ф., Будов-ский Э.И. Изменение РНК-белковых взаимодействий при ассоциации 50S и 30S субчастиц рибосом I.colu — Биоорг. химия, 1980, т.6, М, с.626-628.

129. Gualerzi C., Risuleo G., Pon C.L. Circular dichroism analysis of the ribosomal binding of initiation factor II -3. J.Mol.Biol., 1975, v.95, N4. p.569-573.

130. Paradies H.H., Eromz A., Pon C.L., Gualerzi C. Conformational transition of the 30S ribosomal subunit induced by initiation factor 3 (IE-3). Bichem.Biophys.Res.Commun., 1974, v.59, N2, p.600-607.

131. Glri L., Pon C.L., Gualerzi C., Doster W., Hees B. Hydro-dynamic studies on the Escherichia coli 30S ribosomal subunits and 30S IE-3 complex. Biochem.Biophys.Res.Commun.,1979, v.87, N4, p.976-982.

132. Beandry P., Petersen H.U., Gruberg-Monago M., Jacrot B. A neutron study of the 30S ribosome subunit and of the 30S IE-3 complex. Biochem.Biophys. Res. Commun., 1976, v.72, N2, p.391-397.

133. Smith K.C. Dose-dependent decrease in extractability of DNA from bacteria following irradiation with ultraviolet light or visible light plus dye. Biochem.Biophys.Res. Commun., 1962, v.8, N3, p.157-163.

134. Alexander P., Moroson H.I. Cross-linking of deoxyribonucleic acid to protein following ultra-violet irradiation of different cells. Nature, 1962, v.194, N4831, p.882-883.

135. Eebout A.-M., Dubost S., Buisson M., Rebond J.P. Covalent attachment of poly(U) temolate to 40S-mammalian ribosomal subunits. Biochem.Biophys.Res.Commun., 1980, v.93, N3, p.974-978.

136. Simukova N.A., Budowsky E.I. Conversion of non-covalent interactions in nicleoproteins into covalent bonds: TTV--induced formation of polynucleotide-protein crosslinks in bacteriophage Sd virions. EEBS Lett., 1974, v.38, N3, p.299-303.

137. Eisher G.J., Johns H.E. Pyrimidine photohydrates. In Photochemistry and photobiology of nucleic acids !(S.I.Wang, eds.), Academic Press, New York, London, 1976, v.1, p.169-224.

138. Wang S.I. Pyromidine bimolecular photoproducts. In Photochemistry and photobiology of nucleic acids (S.I.Wang, eds.), Academic Pres, Hew York, London, 1976, v.1, p.296-356.

139. Склобовская M.B., Рябченко Н.И. Уменьшение количества ДНК при депротеинизации УФ- или гамма-облученных растворов де-зоксирибонуклеопротеидов: II. Некоторые проблемы образования повреждений. — Радиобиология, 1970, т.Ю, ЖЗ, с.332-337.

140. Markovitz A. Ultraviolet light-induced stable complexes of DNA and DNA-polymerase. Biochem.Biophys.Acta, 1972, v.281, N4, p.522-534.

141. Shimmel P.R., Budzik G.P. Photocross-linking of protein-nucleic acid complexes. In Methods in Enzymology (W.B. Jacoby, M.Wilchek, eds.), Academic Press, New York, 1977, v.46, p.168-180.

142. Schoemaker H.J.P., Shimmel P.R. Photoinduced joining of a transfer RNA with its congugate aminoacyl-transfer RNA synthetase. J.Mol.Biol., 1974, v.84, N4, p.503-513.

143. Budzik G.P., Lam S.H., Schoemaker H.J.P., Shimmel P.R. Two photocrosslinked complexes of isoleucine specific transfer RNA with amino-acyl transfer RNA synthetase. J. Biol.Chem., 1975, v.250, N12, p.4433-4439.

144. Schoemaker H.J.P., Budzik G.P., Giege R.C., Shimmel P.R. Three photocross-linked complex of yeast phenylalanine specific transfer RNA with aminoacyl transfer RNA with aminoacyl transfer ERA synthetases. J.Biol.Chem., 1975, v.250, N12, p.4440-4444.

145. Rosa J.J., Rosa М.Б., Sigler P.B. Photocross-linking analysis of the contact surface of tRNAMet in complexes with Escherichia coli methionine: tRNA ligase. Biochemistry, 1979, v.18, N4, p.637-647.

146. Strniste G.E., Smith D.A. Induction of stable linkagebetween the deoxyribonucleic acid-dependent ribonucleic acid polymerase and d (A-T)n by ultraviolet light. Biochemistry, 1974, v.13, N3, p.485-493.

147. Hillel Z., Wn. G.-W. Photochemical cross-linking studies on the interaction of Escherichia coli RNA polymerase with 17 DNA. Biochemistry, 1978, v.17, N15, p.2954-2961.

148. Gorelic Ь., Evidence for photoinduced cross-linkage, in situ, of 30S ribosomal proteins to 16S rRNA. Biochemistry, 1975, v.14, N21, p.4627-4633.

149. Gorelic Ъ. Photoinduced cross-linkage, in situ, of E.coli 30S ribosomal proteins to 16S RNA: identification of cross-linked proteins and relationships between reactivity and ribosome structure. Biochemistry, 1976, v.15, N16, p.3579-3590.

150. Gorelic Ь., Analysis of the kinetics of photoinduced crosslinkage of the protein and RNA components of the Escherichia coli 50S ribosomal subunit. Biochem.Biophys. Acta, 1976, v.454, N1, p.185-192.

151. Gorelic Ъ. Demonstration of ribosome-dependent photoinduced chain breakage of the 16S ribosomal ribonucleic acid component of the Escherichia coli 30S ribosomal subunit. Biochemistry, 1976, v.15, N25, p.5474-5480.

152. Moller K., Brimacombe R. Specific cross-linking of proteins S7 and 114 to ribosomal RNA by TJV irradiation of E.coli ribosomal subunits. Mol.Gen.Genet., 1975, v.141, H3, P.343-355.

153. Zwieb C., Brimacombe R. RNA-protein cross-linking in Escherichia coli 30S ribosomal subunits: a method for the direct analysis of the RNA region involved in the cross-links. Nucl.Acids Res., 1978, v.5, N4, p.1189-1206.

154. Ehresmann B., Reinbolt J., Ebel J.-P. Studies of the binding of E.coli ribosomal protein S4 to 16S rRNA after W irradiation of the S4-16S rRNA complex. EEBS Lett., 1975, v.58, N1, p.106-111.

155. Ehresmann В., Reinbolt J., Backendorf C., Sritsch D., Ebel J.P. Studies of the binding sites of Escherichia coli ribosomal protein S7 sites v/ith 16S RNA by ultraviolet irradiation. EBBS Lett., 1976, v.67,, N3,p.316-319.

156. Абдурашидова Г.Г., Овсепян В.А., Чёрный А.А., Каминир Л.Б.,

157. Будовский Э.И. Рибосомные белки, взаимодействующие с pkg

158. Phe-тРНК при энзиматическом связывании с транслирующей рибосомой до и после ухода фактора элонгации EF -Ти — Мо-лекулярн. биология, 1985.

159. Lake J.A. Aminoacyl-tRNA binding at the recognition site is the first step of the elongation cycle of protein synthesis. Proc.Natl.Acad.Soi., 1977, v.74, N5, p.1903-1907.

160. Haseltine W.A., Block R. Synthesis of guanosine tetra-and pentaphosphate requires the presence of a codon--specific, uncharged transfer ribonucleic acid in the acceptor site of ribosomal. Proc.Natl.Acad.Sci., 1973, v.70, N5, p.1564-1568.

161. Abduraschidova G.G., Turchinsky M.E., Budov/sky E.I. Ribosomal proteins contacting with deacylated tRNA in the S-site of the translating ribosome. EEBS Lett., 1981, v.129, N1, p.59-61.

162. Springer M., Gruberg-Manago M. Characteristies of

163. NAcPhe-tRNA binding and its correlation with internal aminoacyl-tRNA recognition. Biochem.Biophys.Res.Commun., 1972, v.47, N2, p.477-484.

164. Броуде H.E., Медведева Н.И., Кусова K.C., Будовский Э.И. Рибосомные б ежи, непосредственно взаимодействующие с тРНКв ЗОб-инициаторном комплексе. — Молекулярн. биология, 1985.

165. Kirillov S.V., Makhno Y.I., Semenkov Y.P. The mechanism of codon-anticodon interaction in ribosomes. Quantitative study of codon-dependent binding of tRNA to the 30S ribosomal subunits of Escherichia coli. Eur.J.Biochem., 1978, v.89, N2, p.297-304.

166. Hunter W.M., Greenwood F.C. Preparation of iodine-131 labelled human growth hormone of high specific activity. -Nature, 1962, v.194, N4826, p.495-496.

167. Miller R.Y., Sypherd P.S. Chemical and enzymatic modification of proteins in the 30S ribosome of Escherichia coli. J.Mol.Biol., 1973, v.78, N3, p.527-538.

168. Laemli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage Tu. Nature, 1970, v.227, N5259, p.680-685.

169. Shatlar M.D. Cross-linking of proteins to nucleic acids by ultraviolet light. Photochem.Photobiol.Rev., 1980, v.5, p.105-197.

170. Fritzinger D.C., Eournier M.J. Carbodiimide modification analysis of aminoacylated yeast phenylalanine tlffiA: evidence for change in the apex region. Nucl.Acids Res., 1982, v.10, N7, p.2419-2437.

171. Potts R.0., Ford N.C., Jr., Eournier M.J. Changes in the solution structure of yeast phenylalanine transfer ribonucleic acid associated with aminoacylation and magnesium binding. -Biochemistry, 1981, v.20, N6, p.1653-1659.

172. Watanabe K., Imahori K. The conformation difference between tRNA^et and formylmethionyl-tRNA|et from E.coli. Biochem. Biophys.Res.Commun., 1971, v.45, N2, p.488-494.

173. Caron M., Brisson N., Dugas H. Evidence for a conformatio1. Phenal change in tRNA upon aminoacylation. J.Biol.Chem., 1976, v. , N5, p.1529-1530.

174. Negishi К., Nishimura S., Harada F., Hayatsu Н. Chemical modification study of aminoacyl-tRNA conformation. -Nucl.Acids Res., 1979, v.6, N3, p.899-914.

175. Wong Y.P., Reid B.R., Kears D.P. Conformation of charged and uncharged tRNA^*16. Proc.Natl.Acad.Sci., 1973, v.70, N8, p.2193-2195.

176. Dale R.M.K., Martin E., Livingston D.C., Ward D.C. Direct covalent mercuration of nucleotides and polynucleotides. -Biochemistry, 1975, v.14, N11, p.2447-2457.

177. I.Dale R.M.K., Word D.C. Mercurated polynucleotides. New probes for hybridization and selective polymer fractionation. Biochemistry, 1975, v.14, N11, p.2458-2469.

178. Feist Р.1., Danna K.J. Sulfhydrylcellulose: a new medium for chromatography of mercurated polynucleotides. -Biochemistry, 1981, v.20, N15, p.4243-4246.

179. Dale R.M.K., Martin В., Livingston D.C., Ward D.C. Mercurated polynucleotides: new probes for hybridization and selective polymer fractionation. Biochemistry,1975, v.14, N11, p.2458-2469.

180. Colantoni V., Guarini Z., Cortese R. Fractionation of

181. Макарова Л.Г., Несмеянов А.Н. В кн. Синтетические методы в области металлоорганических соединений ртути. Наука, Москва, Ленинград, 1945.

182. Gavrilova L.P., Kostiashkina О.Е., Koteliansky Т.Е., Rutke-vitch N.M., Spirin U.S. Factor-free ("non-enzymec") and factor-dependent systems of translation of polyuridylic acid by Escherichia coli ribosomes. J.Mol.Biol., 1976, v.101, N4, p.537-552.

183. Kirillov S.V., Odinzov V.B. The interconversion of conformers of phenylalanyl-tRNA with different affinity to 70S ribosomes of Escherichia coli. Nucl.Acids Res., 1978, v.5, N5, p.1501-1514.

184. Zubay G. The isolation and fractionation of soluble ribonucleic acid. J.Mol.Biol., 1962, v.4, N5, p.347-356.

185. Ra;jBrandary U.L., Ghosh H.P. Studies on polynucleotides. XCI. Yeast methionine transfer ribonucleic acid: purification, properties and terminal nucleotide sequences. -J.Biol.Ghem., v.244, 115, p.1105-1113.

186. Haenni A.L., Chapeville P. The behaviour of acetylphenyl-alanyl soluble ribonucleic acid in polyphenylalanine synthesis. Biochem.Biophys.Acta, 1966, v.144, N2, p.135-148.

187. Cannon M. The ribosomal binding site for peptidyl transfer--ribonucleic acid. Biochem.J., 1967, v.104, N3, p.934-937.

188. Benne R., Voorma H.O. Entry site of formylmethionyl-tRNA. -PEBS Xett., 1972, v.20, 113, p.347-351.

189. Nathans D. Puromycin inhibition of protein synthesis: incorporation of puromycin into peptide chains. Proc.Natl. Acad.Sci. USA, 1964, v.51, N4, p.585-592.

190. Келезнова H.B., Симукова H.A., Яковлев Д.Ю. Определение ин-тенсивннсти светового потока бактерицидных ламп типа БУВ. — В: Этиология и специфическая профилактика гриппа. Труды института им. Пастера, Ленинград, 1979, т.52, с. 132-134.

191. Carmichael G.G. Isolation of bacterial and phage proteins by homopolimer RNA-cellulose chromatography. J.Biol. Chem., 1975, v.250, N15, p.6160-6167.

192. Devenyi Т., Bati J., Pabian P. Acta Biochim.Biophys. Acad. Sci.Hung., 1971, v.48, p.1295-1303.