Кристаллизация и исследования структуры фактора инициации трансляции 2 из эукариот и архей тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.03, кандидат наук Архипова, Валентина Ивановна

• Архипова, Валентина Ивановна
• кандидат наук
• 2015

Оглавление диссертации кандидат наук Архипова, Валентина Ивановна

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ИНИЦИАЦИЯ ТРАНСЛЯЦИИ У АРХЕЙ

1. Сравнительная характеристика системы инициации трансляции у бактерий, эукариот и архей

2. Архейные факторы инициации трансляции

2.1. alFl

2.2. alFlA

2.3. aIF2

2.4. alF5B

2.5. aIF6

Заключение

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

1. Материалы и приборы

1.1. Химические реактивы и ферменты

1.2. Буферы и среды

1.3. Бактериальные штаммы и плазмиды

1.4. Принадлежности

1.5. Приборы

2. Методы генной инженерии и микробиологии

2.1. Клонирование генов субъединиц e/aIF2

2.2. Метод сайт-направленного мутагенеза последовательности ДНК

2.3. Электрофорез ДНК в геле агарозы

2.4. Обработка ДНК сайт-специфическими эндонуклеазами рестрикции

2.5. Получение компетентных клеток Е. coli с применением хлорида кальция

2.6. Трансформация клеток Е. coli плазмидной ДНК методом теплового шока

2.7. Экспрессия генов субъединиц e/aIF2 в клетках Е. coli

3. Биохимические методы при работе с белками

3.1. Препаративное выделение и очистка у-субъединицы aIF2 S. solfataricus и ее мутантных форм из клеток штаммов-суперпродуцентов Е. coli

3.2. Препаративное выделение и очистка aIF2a, aIF2ao3, aIF2ctD23> aIF2ß

S. solfataricus из клеток штаммов-суперпродуцентов E. coli

3.3. Препаративное выделение и очистка гетеротримера aIF2 S. solfataricus из клеток штаммов-суперпродуцентов Е. coli

3.4. Препаративное выделение и очистка eIF2a и eIF2ß S. cerevisiae из клеток штаммов-суперпродуцентов Е. coli

3.5. Получение препаратов комплексов e/aIF2

3.6. Спектрофотометрическое определение концентраций белков

3.7. Электрофорез белков в ПААГ в присутствии ДСН

3.8. Электрофорез белков в ПААГ в неденатурирующих условиях в кислой среде

3.9. Кристаллизация aIF2y и ее мутантных форм в свободной и

нуклеотид-связанных формах

4. Биохимические методы при работе с РНК и нуклеотидами

4.1. Получение и очистка фрагментов мРНК

4.2. Препаративное выделение и очистка инициаторной тРНК Е. coli из клеток штамма-суперпродуцента

4.3. Аминоацилирование тРНК

4.4. Электрофорез РНК в ПААГ в денатурирующих условиях

4.5. Препаративная очистка нуклеотидов

4.6. Анализ чистоты препаратов нуклеотидов

4.7. Спектрофотометрическое определение концентраций нуклеиновых кислот и нуклеотидов

5. Биохимические методы при работе с РНК-белковыми комплексами

5.1. Получение мРНК-белковых комплексов

5.2. Электрофорез РНК-белковых комплексов в ПААГ

5.3. Электрофорез РНК-белковых комплексов в геле агарозы

5.4. Анализ РНК-белковых комплексов методом поверхностного плазмонного резонанса

5.5. Получение и препаративная очистка тройственных комплексов aIF2*GDPNP»Met-TPHKf и e/aIF2«GDPNP*Met-TPHKf

5.6. Кристаллизация тройственных комплексов aIF2*GDPNP*Met-TPHKf и e/aIF2«GDPNP'Met-TPHKf

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Получение и кристаллизация архейного тройственного комплекса aIF2«GDPNP*Met-тРНКг

2. Выделение субъединиц eIF2 S. cerevisiae

3. Получение и кристаллизация химерных форм фактора e/aIF2 и их тройственных комплексов e/aIF2-GDPNP'Met-TPHKf

4. Исследование мРНК-связывающих свойств aIF2y S. solfataricus

5. «Рабочий» цикл aIF2y S. solfataricus

ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

БЛАГОДАРНОСТИ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

а. о. - аминокислотный остаток

БСА - бычий сывороточный альбумин

ДСН — додецилсульфат натрия

ДТТ - 1,4-дитиотреитол

ИПТГ - изопропил-Р-Э-тиогалактопиранозид

ММЭПЭГ - монометиловый эфир полиэтиленгликоля

МПД - 2-метил-2,4-пентандиол

н. о. — нуклеотидный остаток

НТО - нетранслируемая область

о. е. - оптическая единица

ПААГ - полиакриламидный гель

ПАК - полиакриловая кислота

ПЦР - полимеразная цепная реакция

ТЕМЕД - N, N, N', N' - тетраметил этилендимамин

Трис - трис-(гидроксиметил)-аминометан

Фн - неорганический фосфат

ЭДТА — этилендиаминтетрауксусная кислота

CTD — С-концевой домен

D1 - домен 1, D2 - домен 2, D3 - домен

FMT - формиат-ион

GDPCP - гуанозин-5'-(Р,у-метилен)-трифосфат GDPNP - гуанозин-5'-(Р,у-имидо)-трифосфат

Hepes — Ы-2-гидроксиэтилпиперазин-Ы'-2-этансульфоновая кислота 1RES — внутренний участок посадки рибосом

MANT-GDP - (273')-0-(Ы-метилантранилоил)гуанозин-5'-дифосфат

MES - 2-(М-морфолино)этансульфоновая кислота

NDSB - неденатурирующий сульфобетаин

NTD - JV-концевой домен

PMSF - фенилметилсульфонилфторид

SPR - поверхностный плазмонный резонанс

SRL - сарцин-рициновая петля

Р-МЭ - р-меркаптоэтанол

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Кристаллизация и исследования структуры фактора инициации трансляции 2 из эукариот и архей»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Одной из важнейших задач молекулярной биологии является изучение механизма биосинтеза белка. Инициация синтеза полипептидной цепи на рибосоме - сложный процесс, в котором немаловажную роль играют белковые факторы. Ключевую роль в процессе инициации биосинтеза белка выполняет гомологичный между эукариотами и археями гетеротримерный фактор инициации трансляции 2 (е/а1Р2аРу), который доставляет инициаторную метионил-тРНК (МО-тРНК;) в Р-участок малой субчастицы рибосомы. Интенсивные структурные исследования е/а1Р2 ведутся в лабораториях ряда стран. Настоящая диссертационная работа является продолжением исследований структурной организации архейного фактора а1Р2, ведущихся в Институте белка РАН. В данной работе описано получение кристаллов и определение структуры тройственного комплекса сердцевинной части а1Р2 с метионилированной инициаторной тРНК и аналогом ГТФ. Эта работа делалась коллективом сотрудников лаборатории структурных исследований аппарата трансляции ИБ РАН при непосредственном участии автора диссертации. Автором работы проводились эксперименты по получению новых, более совершенных кристаллических форм комплекса полноразмерного а1Р2 с Ме^тРНК; и ГТФ, а также были начаты эксперименты по выделению и кристаллизации субъединиц эукариотического фактора е1Р2, пространственная структура которого до сих пор неизвестна (определена структура только его а-субъединицы). Несмотря на гомологию, архейный фактор а1Р2 не является идеальной моделью для интерпретации данных по функционированию е1Р2, и определение пространственной структуры е1Р2 необходимо для корректного описания механизма инициации трансляции у эукариот на молекулярном уровне. Параллельно с кристаллизацией и исследованиями структуры е/а1Р2 в данной работе проводилось изучение дополнительной функции у-субъединицы архейного фактора а1Р2. Помимо основной роли в связывании инициаторной метионил-тРНК в составе гетеротримерного фактора, у-субъединица а!Р2 как в составе фактора, так и в изолированном состоянии способна связывать и защищать мРНК от 5'-3' направленной деградации, однако на сегодняшний день данная функция а1Р2у мало изучена.

Цель работы: исследование структуры фактора инициации трансляции 2 из археи Би1/о1оЬш юЦМапыя и дрожжей Засскаготусе^ се/чгушае; исследование механизма взаимодействия а!Р2у с мРНК.

Основные задачи работы: Получение кристаллов и исследование структуры архейного тройственного комплекса aIF2*GDPNP*Met-TPHKf. Получение штаммов-продуцентов Escherichia coli для субъединиц eIF2 S. cerevisiae и разработка методов выделения этих белков. Получение и кристаллизация гетеротримера eIF2 и/или его химерных форм с субъединицами архейного фактора aIF2, а также получение химерных тройственных комплексов e/aIF2*GDPNP*Met-TPHKf и их кристаллизация. Сайт-направленный мутагенез предполагаемых участков узнавания 5'-концевого нуклеозид-трифосфата мРИК на у-субъединице aIF2 S. solfataricus. Кристаллизация aIF2y дикого типа и его мутантных форм в различных функциональных состояниях (в свободной форме, в комплексе с ГДФ и негидролизуемыми аналогами ГТФ).

Научная новизна и практическая ценность работы. Впервые получены кристаллы сердцевинной части архейного тройственного комплекса aIF2aD3y*GDPNP»Met-TPHKf, на основе которых была определена его пространственная структура. Показано, что, несмотря на структурную гомологию у-субъединицы aIF2 с бактериальным фактором элонгации EF-Tu, способы взаимодействия этих белков с тРНК принципиально отличаются. Разработаны методики выделения а- и ß-субъединиц eIF2 дрожжей. Впервые получены кристаллы химерных тройственных комплексов e/aIF2'GDPNP*Met-TPHKf, что открывает перспективы для определения структур субъединиц эукариотического фактора eIF2. Впервые показано, что канонический нуклеотид-связывающий сайт aIF2y является специфическим местом связывания 5'-концевого гуанозин-трифосфата мРНК. Определение кристаллических структур aIF2y в различных функциональных состояниях позволило построить схему конформационных переходов, происходящих в этом белке при связывании ГТФ, его гидролизе и освобождении ГДФ.

Результаты по структуре архейного тройственного комплекса aIF2 с ГТФ и инициаторной мстионил-тРНК и структурам комплексов у-субъединицы aIF2 с нуклеотидами имеют фундаментальный характер. Полученные в ходе работы генетические конструкции и штаммы-продуценты Е. coli для субъединиц eIF2 S. cerevisiae используются в ИБ РАН. В методическом аспекте данная работа будет полезна для специалистов, работающих в области препаративной биохимии и кристаллизации макромолекул, как в нашей стране, так и за рубежом.

Апробация работы и публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 статьи. Результаты данной работы докладывались на Российских и международных конференциях.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ИНИЦИАЦИЯ ТРАНСЛЯЦИИ У АРХЕЙ

1. Сравнительная характеристика системы инициации трансляции у

бактерий, эукариот и архей

Серия молекулярных событий, происходящих с рибосомой и предшествующих образованию пептидной связи между двумя первыми аминокислотными остатками белка обозначается как стадия инициации или начала трансляции. В процессе инициации трансляции рибосома помещается на инициаторный кодон и устанавливается правильная рамка считывания мРНК. Этот этап является мишенью для различных регуляторных механизмов и поэтому в большей степени определяет скорость и эффективность трансляции. Среди доменов жизни (архей, бактерий и эукариот) аппарат инициации трансляции подвергся существенной эволюционной дивергенции. Между прокариотами (архей и бактерии) и эукариотами существуют различия в организации ее участников: РНК (рРНК, мРНК и тРНК) и белков (рибосомных и факторов инициации трансляции). При этом архей занимают промежуточное положение, поскольку структура архейных мРНК и характер взаимодействия мРНК-рибосома напоминает таковые у бактерий, однако факторы инициации трансляции архей имеют большую гомологию с эукариотическими. Несмотря на существующие различия, в аппарате инициации трансляции сохранилось ядро эволюционно консервативных компонентов, общих среди трех доменов жизни.

Рибосома - сложная макромолекулярная машина, ответственная за синтез белка во

всех живущих организмах. Все рибосомы состоят из двух субчастиц. У бактерий малая

рибосомная субчастица 30S (образована 16S рРНК и примерно 20 белками) вместе с

большой субчастицей 50S (23S и 5S рРНК и 30-35 белков) формируют 70S рибосому. У

эукариот 40S субчастица (18S рРНК и около 30 белков) и 60S субчастица (25-28S, 5S и

5.8S рРНК и примерно 50 белков) формируют 80S рибосому. Архейные 70S рибосомы

образованы 30S и 50S субчастицами и содержат 16S, 23S и 5S рРНК бактериального типа.

Однако сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей 16S (18S) рРНК

позволил впервые выделить архей в отельную группу прокариот (Woese and Fox, 1977).

По содержанию белков рибосомы архей занимают промежуточное положение между

бактериальными и эукариотическими. В архейных рибосомах обнаружено 68 белков (28 в

малой и 40 в большой субчастице), из которых 34 белка (15 и 19, соответственно) имеются

у бактерий и эукариот, 33 белка (13 и 20, соответственно) представлены только у

7

эукариот, и 1 белок (LX, белок большой субчастицы) специфичен для архей (Lecompte et al., 2002).

Морфологическими элементами большой субчастицы рибосомы являются «тело», Ll-выступ, центральный протуберанец и Ы2-выступ (Р-выступ у архей и эукариот), или «палец». Малая субчастица имеет «головку», «тело» и боковую лопасть, или «платформу». У эукариот 40S субчастица дополнительно имеет «клюв» и так называемые «ноги». Архейная 30S субчастица обладает промежуточной формой по сравнению с малыми субчастицами бактерий и эукариот, поскольку имеет выраженный «клюв» на головке, но не имеет столь выраженных «ног» на конце тела (Рис. 1) (Lake, 1983).

Рис. 1. Схематическое изображение малых рибосомных субчастиц (а) бактерий, (б) архей и (в) эукариот со стороны, контактирующей с большой субчастицей, а также (г) целой архейной рибосомы в перекрывающейся проекции. Рисунок с небольшими изменениями взят из Lake, 1983.

Малая рибосомная субчастица участвует в инициации трансляции, и именно на ней расположен участок связывания мРЫК. В нуклеотидной последовательности мРНК содержится информация об аминокислотной последовательности белка, который необходимо синтезировать рибосоме. Помимо кодирующей последовательности, или цистрона, мРНК обычно содержит нетранслируемые области (НТО) на 5'- и З'-концах. Эукариотические мРНК в большинстве случаев моноцистронны, тогда как мРНК прокариот в связи с оперонной организацией генов обычно полицистронны, т.е. содержат несколько кодирующих последовательностей. Предшествующая кодирующей последовательности 5'-НТО включает специфические последовательности или структуры, которые участвуют в связывании рибосомы. В случае полицистронных мРНК каждому индивидуальному цистрону обычно предшествует его элементы участка инициации трансляции, которые часто перекрываются с кодирующими последовательностями предыдущих цистронов (см. обзор Kozak, 1999). Каждая кодирующая последовательность начинается с инициаторного, или стартового кодона, в качестве которого у эукариот практически всегда используется AUG, у бактерий и архей этот кодон используется в 90 и 79% случаев, соответственно, а также возможен старт с кодонов GUG (8 и 11%,

(а)

&

соответственно) или UUG (1 и 10%, соответственно) (Gualerzi and Pon, 1990; Tolstrup et al., 2000).

В процессе инициации трансляции происходит связывание мРНК малой рибосомной субчастицей, и за счет узнавания инициаторного кодона мРНК и его спаривания с инициаторной тРНК в /'-участке (участке связывания пептидил-тРНК) рибосомы установливается правильная рамка считывания всей последующей кодирующей последовательности мРНК. В бактериальной мРНК на расстоянии 7-10 нуклеотидных остатков (н. о.) перед стартовым кодоном располагается полипуриновая нуклеотидная последовательность, так называемая последовательность Шайна-Дальгарно, которая в большей или меньшей степени комплементарна последовательности «анти-Шайна-Дальгарно», расположенной на 3'-конце 16S рРНК малой рибосомной субчастицы (Shine and Dalgarno, 1974). Спаривание этих последовательностей способствует непосредственному связыванию мРНК с рибосомой таким образом, что стартовый кодон размещается вблизи /'-участка. Кроме того, у бактерий дополнительное связывание мРНК и рибосомы может осуществляться благодаря взаимодействию рибосомного белка SI (bSl согласно номенклатуре рибосомных белков Ban et al., 2014) с A/U-богатыми участками мРНК, расположенными перед последовательностью Шайна-Дальгарно (Komarova et al., 2002).

Эукариотические мРНК не содержат последовательности Шайна-Дальгарно и, как правило, имеют специфические постранскрипциониые модификации: 7-метилгуанозин (кэп-структура) на 5'-конце и поли(А)-хвост на З'-конце, которые при участии факторов инициации трансляции и поли(А)-связывающего белка РАВР способствуют узнаванию и связыванию мРНК с малой рибосомной субчастицей (см. обзор Gallie, 1998; Wells et al., 1998). У эукариот выбор инициаторного кодона главным образом осуществляется по механизму сканирования, при этом 40S рибосомная субчастица связывается с кэппированым 5'-концом мРНК и движется в 5'-3' направлении пока не достигнет инициаторного кодона, которым обычно является первый попавшийся AUG кодон (Kozak, 1989). Кроме того, возможны альтернативные механизмы инициации, связанные с наличием таких элементов мРНК, как короткие открытые рамки считывания (uORF), кэп-независимые трансляционные элементы (CITEs) или внутренние участки посадки рибосом (IRES структуры) (см. обзоры Shatsky et al., 2010, 2014; Martínez-Salas el al., 2012).

Архейные мРНК, подобно бактериальным, не кэппированы и не полиаденилированы, часто полицистронны (см. обзор Dennis, 1997; Kyrpides and Woese, 1998a), и имеют последовательность Шайна-Дальгарно, главным образом, перед внутренними цистронами (Tolstrup et al., 2000). У первых цистронов полицистронных

9

мРНК и моноцистронных мРНК архей часто отсутствует последовательность Шайна-Дальгарно, либо они начинаются непосредственно с инициаторного AUG кодона, такие мРНК называют безлидерными (Slupska et al., 2001; Brenneis et al., 2007). На основании типов мРНК различают следующие способы реализации связывания мРНК с рибосомой у архей.

Один из механизмов основан на каноническом взаимодействии последовательности Шайна-Дальгарно мРНК с 16S рРНК, который реализуется на внутренних цистронах полицистронных мРНК (Condö et al., 1999; Tolstrup et al., 2000). Эксперименты по мутагенезу in vitro и in vivo в археях показали, что нарушение последовательности Шайна-Дальгарно имеет неблагоприятное воздействие, приводящее к ослаблению или полной остановке синтеза белка (Condö et al., 1999; Sartorius-Neef and Pfeifer, 2004). Однако в случае архей Haloferax volcanii нарушение последовательности Шайна-Дальгарно, расположенной в 5'-НТО мРНК, не влияло на эффективность трансляции (Kramer et al., 2014).

Следующий способ взаимодействия характерен для безлидерных мРНК. Для ассоциации 30S субчастицы с безлидерными мРНК строго необходимо присутствие инициаторной тРНК (Benelli et al., 2003). Полагают, что за счет кодон-антикодонового взаимодействия между мРНК и тРНК происходит посадка малой рибосом ной субчастицы на иницииаторный AUG кодон, в результате чего стартовый кодон, расположенный на 5'-конце матрицы оказывается прямо в Р-участке рибосомной субчастицы. На сегодняшний день механизм трансляции безлидерных мРНК остается малоизученным. Безлидерные мРНК также имеются у бактерий и эукариот (Janssen, 1993) и могут транслироваться всеми типами рибосом, независимо от их происхождения (Grill et al., 2000). Это позволило предположить, что безлидерные мРНК предшествовали всем другим типам мРНК и широко использовались организмами, существовавшими до эволюционного расхождения трех доменов жизни. Стоит отметить, что в бактериях и эукариотах инициация трансляции на безлидерных мРНК может осуществляться недиссоциированными 70S или 80S рибосомами и в отсутствие факторов инициации трансляции (Balakin et al., 1992; O'Donnell and Janssen, 2002; Udagawa et al., 2004; Moll et al., 2004; Andreev et al., 2006).

В 2009 году был экспериментально охарактеризован новый тип инициации трансляции у архей, который осуществляется на лидерсодержащих мРНК, не имеющих последовательность Шайна-Дальгарно (Hering et al., 2009). Эффективность трансляции таких мРНК сильно зависела от длины 5'-НТО (минимальный размер - 15 н. о.) и ее вторичной структуры (отсутствие стабильных шпилек непосредственно перед стартовым

10

кодоном). Авторы предполагают, что при данном механизме инициации трансляции происходит внутренняя посадка малой рибосомной субчастицы на мРНК. Однако элементы, способствующие такому взаимодействию, остаются невыявленными. Например, у бактерий в связывании мРНК, не содержащих последовательность Шайно-Дальгарно, участвует рибосомный белок SI (Boni et al., 2001). Тогда как у архей и ряда бактерий белок S1 отсутствует (см. обзор Benelli and Londei, 2011).

В инициации трансляции важную роль играют белковые факторы, которые существенно усиливают связывание мРНК с малой рибосомной субчастицей и делают это взаимодействие более избирательным. У бактерий в этом процессе участвуют три мономерных фактора: 1F1,1F2 и IF3 (Табл. 1).

Таблица 1. Функциональные свойства бактериальных факторов инициации трансляции.

1F1 1) взаимодействует с Л-участком 30S субчастицы, препятствует связыванию шшциаторной тРНК в А-участке, стимулируя ее посадку строго в Р-участок; 2) стабилизирует связывание IF2 и IF3 с 30S субчастицей

IF2 ГТФ-связывающий белок 1) способствует связыванию шшциаторной тРНК с Р-участком 30S субчастицы; 2) способствует присоединению 50S субчастицы к инициаторному 30S комплексу

IF3 1) диссоциирует 70S рибосомы и препятствует ассоциации рибосомных субчастиц; 1) необходим для правильного узнавания AUG-кодона; 2) опосредованно участвует в отборе шшциаторной тРНК

Согласно кинетическим исследованиям образования преинициаторного комплекса факторы IF3 и IF2 первыми связываются с малой рибосомной субчастицей и образуют нестабильный комплекс, который стабилизируется при связывании IF1 (Milon et al., 2012). IF1 занимает Л-участок (участок связывания аминоацил-тРНК) малой рибосомной субчастицы (Moazed et al., 1995; Dahlquist and Puglisi, 2000) и препятствует преждевременной посадке элонгаторной тРНК. Бактериальная инициаторная метионил-тРНК, в отличие от элонгаторной, формилируется по остатку метионина (формилметионил-тРНК fMet-TPHKfMct), и с помощью фактора IF2 связывается в /■-участке 30S субчастицы. Связывание мРНК с малой рибосомной субчастицей может происходить на любой стадии образования преинициаторного комплекса, не зависит от факторов инициации трансляции и определяется концентрацией мРНК, а также наличием вторичной структуры участка связывания с рибосомой (Milon et al., 2012). Точность узнавания инициаторного кодона контролируется фактором IF3, который дестабилизирует неканонические кодон-антикодоновые взаимодействия (Sussman et al., 1996). После узнавания инициаторного кодона (на этом этапе бактериальный преинициаторный комплекс становится инициаторным) IF2 способствует присоединению 50S субчастицы,

11

что вызывает гидролиз ГТФ на IF2, и факторы покидают рибосому, которая переходит к стадии элонгации.

В отличие от прокариот, в эукариотических клетках, как правило, не происходит непосредственного узнавания инициаторного участка мРНК малой рибосомной субчастицей и в процессе инициации трансляции задействовано большее число белковых факторов, как мономерных, так и состоящих из нескольких субъединиц (Табл. 2). Одни эукариотические факторы (eIF4A, eIF4B, eIF4E, eIF4G и eIF4H) вовлечены в узнавание кэп-структуры и разворачивание вторичной структуры мРЫК, другие (elFl, elFIA, eIF2, eIF2B, eIF3, eIF5, eIF5B) взаимодействуют с рибосомой и/или мРНК и способствуют правильному узнаванию инициаторного кодона.

В процессе инициации трансляции эукариотический 43 S преинициаторный комплекс, состоящий из 40S рибосомной субчастицы, связанной с факторами elFl, elFIA, eIF3, eIF5 и тройственным комплексом е1Р2»ГТФ'МеМРНК|, взаимодействует с 5'-концом мРНК. Узнавание кэп-структуры мРНК осуществляется фактором eIF4F, состоящим из кэп-связывающей субъединицы (eIF4E), субъединицы-«платформы» (eIF4G) и РНК-хеликазы (eIF4A). Специфическое взаимодействие eIF4G с eIF3 обеспечивает связывание 40S субчастицы с 5'-концом мРНК, при этом З'-конец мРНК посредством белка РАВР также связан с eIF4G, в результате чего мРНК оказывается замкнутой в кольцо. Далее образовавшийся так называемый 48S преинициаторный комплекс начинает «сканировать» мРНК в поисках AUG кодона в оптимальном нуклеотидном контексте. Узнавание AUG кодона и его окружения контролируется факторами elFl и elFIA. После установления правильного взаимодействия AUG кодона с антикодоном тРНК* фактор elFl покидает рибосому, что вызывает высвобождение неорганического фосфата из тройственного комплекса eIF2#rT®*Met-TPHKj и тем самым обуславливает необратимость всего процесса (Algire et al., 2005; Maag et al., 2005). При этом гидролиз ГТФ на eIF2 активируется фактором eIF5, и eIF2 диссоциирует в комплексе с ГДФ. Для последующего присоединения 60S рибосомной субчастицы необходим eIF5B (Pestova et al., 2000), который ориентирует акцепторный черешок тРНК; в jP-участке большой субчастицы (Lomakin and Steitz, 2013), гидролизует ГТФ и покидает образовавшийся на этом этапе 80S инициаторпый комплекс, готовый к стадии элонгации. Отдельную роль в инициации трансляции играет фактор eIF6, который связывает большую рибосомную субчастицу и препятствует ее преждевременному объединению с малой субчастицей. Роль эукариотических факторов elFl, eIF2 (и eIF5B), elFIA аналогична роли бактериальных факторов IF3, IF2 и IF1, соответственно (Battiste et al., 2000; Pestova et al., 2000; Pestova and Kolupaeva, 2002).

У архей в инициации биосинтеза белка принимают участие факторы alFl, alFlA, aIF2, aIF2Bapô (гомологов y- и е-субъединиц eIF2B у архей не обнаружено), aIF4A, aIF5A, aIF5B и aIF6, которые гомологичны соответствующим факторам инициации трансляции эукариот (Kyrpides and Woese, 1998а, 1998b; Lee et al., 1999; см. обзор Marintchev and Wagner, 2004) (Табл. 2). Факторы e/alFlA и e/aIF5B имеют гомологию с бактериальными IF1 и IF2, соответственно, и поскольку они представлены во всех трех доменах жизни, их относят к универсально консервативным факторам (Kyrpides and Woese, 1998а; Lee et al., 1999).

Таблица 2. Факторы инициации трансляции эукариот и архей и их функциональные свойства.

Эукариотические Архейные

е1И, мономер а1Р1, мономер

1) необходим для правильного узнавания А1Ю-кодона и его окружения; взаимодействует с /'-участком 40Б субчастицы; 2) в паре с еНЧА способствует связыванию е1Р2«ГТФ'Ме1-тРНК, с 40Б рибосомной субчастицей 1) необходим для правильного узнавания А1Ю-кодона; взаимодействует с /'-участком ЗОБ субчастицы; 2) способствует связыванию аП-^'ГТФ'Мег-тРНК, с ЗОБ рибосомной субчастицей

е№1А (гомолог №1), мономер а1ИА (гомолог №1), мономер

1) в паре с е1Р 1 контролирует узнавание А1ГС-кодона; взаимодействует с ^-участком 40Б субчастицы; 2) стимулирует связывание е!Р2«ГТФ,Ме1-тРНК> с 408 субчастицей; 3) способствует связыванию е1Р5В с 40Б субчастицей в паре с аПЧ способствует связыванию а1Р2 с ЗОБ субчастицей

е1Р2, гетеротример (а,р,у) а1Р2, гетеротример (а,р,у)

ГТФ-связывающий белок 1) доставляет инициаторную тРНК в /"-участок 40Б субчастицы; 2) влияет на точность узнавания А1Ю-кодона; 3) регулирует синтез белка ГТФ-связывающий белок 1) доставляет инициаторную тРНК в Л-участок ЗОБ субчастицы; 2) у-субъединица связывает мРНК, содержащие трифосфат на 5'-конце, и защищает их от 5'—>3' направленной деградации

е1К2А, мономер функция не установлена гомолог не найден

еГР2В, гетеропентамер (а,р,у,8,е) а1Г2В. найдены гомологи субъединиц а,р,5

связывается с е1Р2*ГДФ и обеспечивает обмен ГДФ на ГТФ функция не установлена

е1Р2Б, мономер способен доставлять как инициаторную, так и элонгаторную тРНК в Р-участок 40Б субчастицы гомолог не найден

еШЗ, гетеромультимер (6-13 субъединиц) 1) служит площадкой для сборки других факторов: еПЧ, еНП А, е1Р2, е1Р4В, еИЖ}, е1Р5; 2) стимулирует присоединение мРНК и тройственного комплекса е1Р2«ГТФ«Ме1-тРНК, к 40Б субчастице; 3) диссоциирует рибосомы на субчастицы и препятствует их реассоциации гомологи не найдены ни для одной из субъединиц

Таблица 2. Продолжение.

факторы группы е1Р4 (е1Р4Р)

е1Р4Р служит адаптером для первичного связывания мРНК с 438 комплексом

е1Р4А, мономер aIF4A, мономер

АТФ-зависимая РНК-хеликаза «раскручивает» элементы вторичной структуры 5'-НТО мРНК А ТФ-связывающий белок функция не установлена

е1Р4В и е1Р4Н, мономеры стимулируют работу е1Р4А гомологи не найдены

е1Р4Е, мономер гомолог не найден

1) специфически связывается с кэп-структурой; 2) является мишенью для регуляции инициации трансляции е№4С, мономер гомолог не найден

1) является «платформой» для связывания е1Р4А, еП-ЧЕ, е!РЗ, РАВР и мРНК; 2) стимулирует хеликазную активность е1Р4А; 3) является мишенью для регуляции инициации трансляции

е1Р5, мономер 1) активирует ГТФазную активность е1Р2; 2) ингибирует диссоциацию ГДФ с е1Р2 гомолог не найден

е1Р5А (гомолог ЕР-Р), мономер aIF5A (гомолог EF-P), мономер

фактор элонгации трансляции способствует образованию первой пептидной связи функция не установлена

е1Р5В (гомолог №2), мономер aIF5B (гомолог IF2), мономер

ГТФ-связывающий белок 1) стимулирует связывание инициаторной тРНК в /'-участке рибосомы; 2) способствует присоединению бОБ субчастицы к преинициаторному комплексу ГТФ-связывающий белок 1) стимулирует связывание инициаторной тРНК в /'-участке рибосомы; 2) способствует присоединению 50S субчастицы к преинициаторному комплексу

е1Р6, мономер aLF6, мономер

взаимодействует с бОБ субчастицей и предотвращает ее ассоциацию с 40Б субчастицей взаимодействует с 50S субчастицей и предотвращает ее ассоциацию с 30S субчастицей

Основная масса исследований архейных факторов инициации трансляции проводится из организма S. solfataricus царства кренархеот (лат. Crenarchaeota), которые стоят ближе к эукариотам, чем остальные царства архей (см. обзоры Benelli and Londei, 2009, 2011; La Teana et al., 2013). Однако результаты экспериментов с факторами инициации трансляции из археи Н. volcanii, принадлежащего к царству эвриархеот (лат. Euryarchaeota), хорошо согласуются и дополняют данные о функционировании инициаторных факторов трансляции S. solfataricus (Gabel et al., 2013).

Было показано, что факторы alFl, alFIA, р- и у-субъединицы aIF2, aIF5A, aIF5B и aIF6 являются жизненно необходимыми белками для клеток архей (Giibel et al., 2013). Делеция гена, кодирующего а-субъединицу aIF2, приводила к существенному замедлению роста клеток. Удаление генов, кодирующих а- и 8-субъединицы aIF2B и aIF4A не изменяло ростовых характеристик. Функции факторов aIF4A и aIF5A не определены.

2. Архейные факторы инициации трансляции 2.1. alFl

Архейный фактор инициации трансляции 1, alFl - однодоменный белок с молекулярной массой около 10 кДа. Гомология alFl с эукариотическим фактором elFl составляет 52-56%. На сегодняшний день в научной литературе экспериментальные данные о факторе alFl достаточно скудны, как и для многих других архейных факторов трансляции. Всего три работы посвящены функциональным исследованиям alFl. Было установлено, что alFl является жизненно-необходимым белком (Gabel et al., 2013). Делеция гена фактора alFl Н. volcanii приводила к тому, что клетки архей становились нежизнеспособными. В экспериментах в бесклеточной системе трансляции было показано, что повышение содержания количества фактора alFl в реакционной смеси увеличивало синтез тотального белка, что указывает на участие alFl в стимуляции трансляции (Hasenohrl et al., 2006). С помощью ряда биохимических методов и метода резонансного переноса флуоресцентной энергии было установлено, что alFl (его С-концевая часть) стимулирует присоединение мРНК и тройственного комплекса aIF2*Fro*Met-TPHKj к малой рибосомной субчастице (Hasenohrl et al., 2006) и ингибирует связывание мРНК, содержащей неканонический AUU инициаторный кодон, с 30S субчастицей, ассоциированной с aIF2«FTO*Met-TPHKj (Hasenohrl et al., 2009). Эти результаты хорошо согласуются с данными о функционировании его эукариотического гомолога elFl. Мутации в белке elFl ослабляли взаимодействие е1Р2,ГТФ*Ме1-тРНК; с 43S преинициаторным комплексом (Cheung et al., 2007), либо вызывали Sui" фенотип (suppressor of initiation codon mutation), при котором инициация трансляции происходила на неканонических триплетах (Castilho-Valavicius et al., 1990; Yoon and Donahue, 1992). Таким образом, можно заключить, что аналогично elFl архейный фактор alFl способствует повышенной избирательности связывания тройственного комплекса е/а1Р2»ГТФ,Ме1-тРНК( с правильным инициаторным кодоном мРНК.

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Архипова, Валентина Ивановна, 2015 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Спирин, А.С. (2011). Молекулярная биология: рибосомы и биосинтез белка. Москва: Издательский центр «Академия». - 496 с.

2. Столбоушкина, Е.А. Исследования структуры архейного фактора инициации трансляции 2. Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук. 2009, Москва.

3. Algire, М.А., Maag, D., Savio, P., Acker, M.G., Tarun, S.Z.J., Sachs, А.В., Asano, K., Nielsen, K.H., Olsen, D.S., Phan, L., et al. (2002). Development and characterization of a reconstituted yeast translation initiation system. RNA 8, 382-397.

4. Algire, M.A., Maag, D., and Lorsch, J.R. (2005). Pi release from eIF2, not GTP hydrolysis, is the step controlled by start-site selection during eukaryotic translation initiation. Mol. Cell 20, 251-262.

5. Allen, G.S., Zavialov, A., Gursky, R., Ehrenberg, M., and Frank, J. (2005). The cryo-EM structure of a translation initiation complex from Escherichia coli. Cell 121, 703-712.

6. Andersen, G.R., Pedersen, L., Valente, L., Chatterjee, I., Kinzy, T.G., Kjeldgaard, M., and Nyborg, J. (2000). Structural basis for nucleotide exchange and competition with tRNA in the yeast elongation factor complex eEFlA:eEFl Ba. Mol. Cell 6, 1261-1266.

7. Andersen, G.R., Valente, L., Pedersen, L., Kinzy, T.G., and Nyborg, J. (2001). Crystal structures of nucleotide exchange intermediates in the eEFIA - eEFlBa complex. Nat. Struct. Biol. 5, 531-534.

8. Andreev, D.E., Terenin, 1.М., Dunaevsky, Y.E., Dmitriev, S.E., and Shatsky, I.N. (2006). A leaderless mRNA can bind to mammalian 80S ribosomes and direct polypeptide synthesis in the absence of translation initiation factors. Mol. Cell. Biol. 26, 3164-3169.

9. Antoun, A., Pavlov, M.Y., Lovmar, M., and Ehrenberg, M. (2006). How initiation factors tune the rate of initiation of protein synthesis in bacteria. EMBO J. 25, 2539-2550.

10. Arai, K., Arai, N., Nakamura, S., Oshima, Т., and Kaziro, Y. (1978). Studies on polypeptide-chain-elongation factors from an extreme thermophile, Thermus thermophilus HB8. 2. Catalytic properties. Eur J Biochem. 92, 521-531.

11. Asano, K., Krishnamoorthy, Т., Phan, L., Pavitt, G.D., and Hinnebusch, G. (1999). Conserved bipartite motifs in yeast eIF5 and eIF2Bs, GTPase-activating and GDP-GTP exchange factors in translation initiation, mediate binding to their common substrate eIF2. EMBO J. 18, 1673-1688.

12. Aylett, C.H.S., Boehringer, D., Erzberger, J.P., Schaefer, Т., and Ban, N. (2015). Structure of a yeast 40S-elFl-eIFl A-eIF3-eIF3j initiation complex. Nat. Struct. Mol. Biol. 22, 269-271.

13. Balakin, A.G., Skripkin, E.A., Shatsky, I.N., and Bogdanov, A.A. (1992). Unusual ribosome binding properties of mRNA encoding bacteriophage X, repressor. Nucleic Acids Res. 20, 563-571.

14. Ban, N., Bcckmann, R., Cate, J.H.D., Dinman, J.D., Dragon, F., Ellis, S.R., Lafontaine, D.L.J., Lindahl, L., Liljas, A., Lipton, J.M., et al. (2014). A new system for naming ribosomal proteins. Curr. Opin. Struct. Biol. 24, 165-169.

15. Barrieux, A., and Rosenfeld, M.G. (1977). Comparison of mRNA binding by Met-tRNAf binding protein and mRNA-associated proteins. J. Biol. Chem. 252, 392-398.

16. Barthelme, D., Dinkelaker, S., Albers, S., Londei, P., Ermler, U., and Tampé, R. (2011). Ribosome recycling depends on a mechanistic link between the FeS cluster domain and a conformational switch of the twin-ATPase ABCE1. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 32283233.

17. Basu, U., Si, K., Warner, J.R., and Maitra, U. (2001). The Saccharomyces cerevisiae T1F6 gene encoding translation initiation factor 6 is required for 60S ribosomal subunit biogenesis. Mol. Cell. Biol. 75, 1453-1462.

18. Battiste, J.L., Pestova, T. V., Mellen, C.U.T., and Wagner, G. (2000). The elFIA solution structure reveals a large RNA-binding surface important for scanning function. Mol. Cell 5, 109119.

19. Benelli, D., and Londei, P. (2009). Begin at the beginning: evolution of translational initiation. Res. Microbiol. 160, 493-501.

20. Benelli, D., and Londei, P. (2011). Translation initiation in Archaea: conserved and domain-specific features. Biochem. Soc. Trans. 39, 89-93.

21. Benelli, D., Maone, E., and Londei, P. (2003). Two different mechanisms for ribosome/mRNA interaction in archaeal translation initiation. Mol. Microbiol. 50, 635-643.

22. Benelli, D., Marzi, S., Mancone, C., Alonzi, T., La Teana, A., and Londei, P. (2009). Function and ribosomal localization of aIF6, a translational regulator shared by Archaea and Eukarya. Nucleic Acids Res. 37, 256-267.

23. Berchtold, H., Reshetnikova, L., Reiser, C.O.A., Schirmer, N.K., Sprinzl, M., and Hilgenfeld, R. (1993). Crystal structure of active elongation factor Tu reveals major domain rearrangements. Nature 365, 126-132.

24. Bommer, U.A., Lutsch, G., Behlke, J., Stahl, J., Nesytova, N., Henske, A., and Bielka, H. (1988). Shape and location of eukaryotic initiation factor eIF-2 on the 40s ribosomal subunit of rat liver. Immunoelectron-microscopic and hydrodynamic investigations. Eur. J. Biochem. 172, 653-662.

25. Boni, I. V, Artamonova, V.S., Tzareva, N. V, and Dreyfus, M. (2001). Non-canonical mechanism for translational control in bacteria: synthesis of ribosomal protein SI. EMBO J. 20, 4222-4232.

26. Brenneis, M., Hering, O., Lange, C., and Soppa, J. (2007). Experimental characterization of c7.s-acting elements important for translation and transcription in halophilic archaea. PLoS Genet. 3, e229.

27. Bult, C.J., White, O., Olsen, G.J., Zhou, L., Fleischmann, R.D., Sutton, G.G., Blake, J.A., Fitzgerald, L.M., Clayton, R.A., Gocayne, J.D., et al. (1996). Complete genome sequence of the methanogenic archaeon, Methanococcus jannaschii. Science 273, 1058-1073.

28. Carrcra, P., Johnstone, O., Nakamura, A., Casanova, J., Jackie, H., and Lasko, P. (2000). VASA mediates translation through interaction with a Drosophila yIF2 homolog. Mol. Cell 5, 181-187.

29. Carter, A.P., Clemons Jr., W.M., Brodersen, D.E., Morgan-Warren, R.J., Hartsch, T., Wimberly, B.T., and Ramakrishnan, V. (2001). Crystal structure of an initiation factor bound to the 30S ribosomal subunit. Science 291, 498-501.

30. Castilho-Valavicius, B., Yoon, H., and Donahue, T.F. (1990). Genetic characterization of the Saccharomyces cerevisiae translational initiation suppressors suil, sui2 and SU13 and their effects on IHS4 expression. Genetics 124, 483-495.

31. Castilho-Valavicius, B., Thompson, G.M., and Donahue, T.F. (1992). Mutation analysis of the Cys-X2-Cys-X19-Cys-X2-Cys motif in the beta subunit of eukaryotic translation initiation factor 2. Gene Expr. 2, 297-309.

32. Ceci, M., Gaviraghi, C., Gorrini, C., Sala, L.A., Offenhauser, N., Marchisio, P.C., and Biffo, S. (2003). Release of eIF6 (p27BBP) from the 60S subunit allows 80S ribosome assembly. Nature 426, 579-584.

33. Chakrabarti, A., and Maitra, U. (1991). Function of eukaryotic initiation factor 5 in the formation of an 80 S ribosomal polypeptide chain initiation complex. J. Biol. Chem. 266, 1403914045.

34. Cheung, Y.-N., Maag, D., Mitchell, S.F., Fekete, C.A., Algire, M.A., Takacs, J.E., Shirokikh, N., Pestova, T., Lorsch, J.R., and Hinnebusch, A.G. (2007). Dissociation of elFl from the 40S ribosomal subunit is a key step in start codon selection in vivo. Genes Dev. 21, 12171230.

35. Cho, S., and Hoffman, D.W. (2002). Structure of the p subunit of translation initiation factor 2 from the Archaeon Methanococcus jannaschii: a representative of the elF2p/eIF5 family of proteins. Biochemistry 41, 5730-5742.

36. Choi, S.K., Lee, J.H., Zoll, W.L., Merrick, W.C., and Dever, T.E. (1998). Promotion of Met-tRNAjMet binding to ribosomes by ylF2, a bacterial IF2 homolog in yeast. Science 280, 1757-1760.

37. Coleman, T.M., Wang, G., and Huang, F. (2004). Superior 5' homogeneity of RNA from ATP-initiated transcription under the T7 (p2.5 promoter. Nucleic Acids Res. 32, el4.

38. Condo, 1., Ciammaruconi, A., Benelli, D., Ruggero, D., and Londei, P. (1999). C/s-acting signals controlling translational initiation in the thermophilic archaeon Sulfolobus solfataricus. Mol. Microbiol. 34, 377-384.

39. Dahlquist, K.D., and Puglisi, J.D. (2000). Interaction of translation initiation factor IF1 with the E. coli ribosomal A site. J. Mol. Biol. 299, 1-15.

40. Dar, A.C., Dever, T.E., and Sicheri, F. (2005). Higher-order substrate recognition of eIF2alpha by the RNA-dependent protein kinase PK.R. Cell 122, 887-900.

41. Das, A., Bagchi, M.K., Ghosh-Dastidar, P., and Gupta, N.K. (1982). Protein synthesis in rabbit reticulocytes. A study of peptide chain initiation using native and beta-subunit-depleted eukaryotic initiation factor 2. J. Biol. Chem. 257, 1282-1288.

42. Das, S., Maiti, T., Das, K., and Maitra, U. (1997). Specific interaction of eukaryotic translation initiation factor 5 (eIF5) with the beta-subunit of eIF2. J. Biol. Chem. 272, 3171231718.

43. Das, S., Ghosh, R., and Maitra, U. (2001). Eukaryotic translation initiation factor 5 functions as a GTPase-activating protein. J. Biol. Chem. 276, 6720-6726.

44. Davies, D., and Segal, D. (1971). Protein crystallization: microtechniques involving vapor diffusion. Methods Enzym. 22, 266-269.

45. Dennis, P.P. (1997). Ancient ciphers: translation in Archaea. Cell 89, 1007-1010.

46. Dev, K., Santangelo, T.J., Rothenburg, S., Neculai, D., Dey, M., Sicheri, F., Dever, T.E., Reeve, J.N., and Hinnebusch, A.G. (2009). Archaeal aIF2B interacts with eukaryotic translation initiation factors eIF2alpha and eIF2Balpha: Implications for aIF2B function and eIF2B regulation. J. Mol. Biol. 392, 701-722.

47. Dhaliwal, S., and Hoffman, D.W. (2003). The crystal structure of the N-terminal region of the alpha subunit of translation initiation factor 2 (eIF2alpha) from Saccharomyces cerevisiae provides a view of the loop containing serine 51, the target of the eIF2alpha-specific kinases. J. Mol. Biol. 334, 187-195.

48. Dmitriev, S.E., Stolboushkina, E.A., Terenin, I.M., Andreev, D.E., Garber, M.B., and Shatsky, I.N. (2011). Archaeal translation initiation factor aIF2 can substitute for eukaryotic eIF2 in ribosomal scanning during mammalian 48S complex formation. J. Mol. Biol. 413, 106-114.

49. Donahue, T.F., Cigan, A.M., Pabich, E.K., and Valavicius, B.C. (1988). Mutations at a Zn(II) finger motif in the yeast eIF-2p gene alter ribosomal start-site selection during the scanning process. Cell 54, 621-632.

50. Drabkin, H.J., and Rajbhandary, U.L. (1998). Initiation of protein synthesis in mammalian cells with codons other than AUG and amino acids other than methionine. Mol. Cell. Biol. 18, 5140-5147.

51. Dubiez, E., Aleksandrov, A., Lazennec-Schurdevin, C., Mechulam, Y., and Schmitt, E. (2015). Identification of a second GTP-bound magnesium ion in archaeal initiation factor 2. Nucleic Acids Res. 43, 2946-2957.

52. Dubnoff, J.S., Lockwood, A.I I., and Maitra, U. (1972). Studies on the role of guanosine triphosphate in polypeptide chain initiation in Escherichia coli. J. Biol. Chem. 247, 2884—2894.

53. Eiler, D., Lin, J., Simonetti, A., Klaholz, B.P., and Steitz, T.A. (2013). Initiation factor 2 crystal structure reveals a different domain organization from eukaryotic initiation factor 5B and mechanism among translational GTPases. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110, 15662-15667.

54. Erickson, F.L., and Hannig, E.M. (1996). Ligand interactions with eukaryotic translation initiation factor 2: role of the gamma-subunit. EMBO J. 15, 6311-6320.

55. Erickson, F.L., Harding, L.D., Dorris, D.R., and Hannig, E.M. (1997). Functional analysis of homologs of translation initiation factor 2y in yeast. Mol. Gen. Genet. 253, 711-719.

56. Fekete, C.A., Applefield, D.J., Blakely, S.A., Shirokikh, N., Pestova, T., Lorsch, J.R., and Plinnebusch, A.G. (2005). The elFIA C-terminal domain promotes initiation complex assembly, scanning and AUG selection in vivo. EMBO J. 24, 3588-3601.

121

57. Fckete, C.A., Mitchell, S.F., Cherkasova, V.A., Applefield, D., Algire, M.A., Maag, D., Saini, A.K., Lorsch, J.R., and Hinnebusch, A.G. (2007). N- and C-terminal residues of elFIA have opposing effects on the fidelity of start codon selection. EMBO J. 26, 1602-1614.

58. Fernández, I.S., Bai, X.-C., Hussain, T., Kelley, A.C., Lorsch, J.R., Ramakrishnan, V., and Scheres, S.H.W. (2013). Molecular architecture of a eukaryotic translational initiation complex. Science 342, 1240585.

59. Fletcher, C.M., Pestova, T. V, Hellen, C.U.T., and Wagner, G. (1999). Structure and interactions of the translation initiation factor elFl. EMBO J. 18, 2631-2637.

60. Flynn, A., Oldfield, S., and Proud, C.G. (1993). The role of the p-subunit of initiation factor elF-2 in initiation complex formation. Biochim. Biophys. Acta 1174, 117-121.

61. Giibel, K., Schmitt, J., Schulz, S., Nather, D.J., and Soppa, J. (2013). A comprehensive analysis of the importance of translation initiation factors for Haloferax volcanii applying deletion and conditional depletion mutants. PLoS One 8, e77188.

62. Gallic, D.R. (1998). A tale of two termini: a functional interaction between the termini of an mRNA is a prerequisite for efficient translation initiation. Gene 216, 1-11.

63. Gandin, V., Miluzio, A., Barbieri, A.M., Beugnet, A., Kiyokawa, H., Marchisio, P.C., and Biffo, S. (2008). Eukaryotic initiation factor 6 is rate-limiting in translation, growth and transformation. Nature 455, 684-688.

64. Gartmann, M., Blau, M., Armache, J.-P., Mielke, T., Topf, M., and Beckmann, R. (2010). Mechanism of eIF6-mediated inhibition of ribosomal subunit joining. J. Biol. Chem. 285, 14848-14851.

65. Godefroy-Colburn, T., Wolfe, A.D., Dondon, J., and Grunberg-Manago, M. (1975). Light-scattering studies showing the effect of initiation factors on the reversible dissociation of Escherichia coli ribosomes. J. Mol. Biol. 94, 461-478.

66. Gonsky, R., Itamar, D., Harary, R., and Kaempfer, R. (1992). Binding of ATP and messenger RNA by the p-subunit of eukaryotic initiation factor 2. Biochimie 74, 427-434.

67. Greber, B.J., Boehringer, D., Godinic-Mikulcic, V., Crnkovic, A., Ibba, M., Weygand-Durasevic, I., and Ban, N. (2012). Cryo-EM structure of the archaeal 50S ribosomal subunit in complex with initiation factor 6 and implications for ribosome evolution. J. Mol. Biol. 418, 145160.

68. Grill, S., Gualerzi, C.O., Londei, P., and Blasi, U. (2000). Selective stimulation of translation of leaderless mRNA by initiation factor 2: evolutionary implications for translation. EMBO J. 19, 4101-4110.

69. Groft, C.M., Beckmann, R., Sali, A., and Burley, S.K. (2000). Crystal structures of ribosome anti-association factor IF6. Nat. Struct. Biol. 7, 1156-1164.

70. Gualerzi, C.O., and Pon, C.L. (1990). Initiation of mRNA translation in prokaryotes. Biochemistry 29, 5881-5889.

71. Guenneugues, M., Caserta, E., Brandi, L., Spurio, R., Meunier, S., Pon, C.L., Boelens, R., and Gualerzi, C.O. (2000). Mapping the fMet-tRNAfMet binding site of initiation factor IF2. EMBO J. 19, 5233-5240.

72. Guillon, L., Schmitt, E., Blanquet, S., and Mechulam, Y. (2005). Initiator tRNA binding by e/aIF5B, the eukaryotic/archaeal homologue of bacterial initiation factor IF2. Biochemistry 44, 15594-15601.

73. Gutiérrez, P., Coillet-Matillon, S., Arrowsmith, C., and Gehring, K. (2002). Zinc is required for structural stability of the C-terminus of archaeal translation initiation factor aIF2(i. FEBS Lett. 517, 155-158.

74. Gutierrez, P., Osborne, M.J., Siddiqui, N., Trempe, J.F., Arrowsmith, C., and Gehring, K. (2004). Structure of the archaeal translation initiation factor aIF2beta from Methanobacterium thermoautotrophicum: implications for translation initiation. Protein Sci. 13, 659-667.

75. Hasenohrl, D., Benelli, D., Barbazza, A., Londei, P., and Blasi, U. (2006). Sulfolobus solfalaricus translation initiation factor 1 stimulates translation initiation complex formation. RNA 12, 674-682.

76. Hasenohrl, D., Lombo, T., Kaberdin, V., Londei, P., and Blasi, U. (2008). Translation initiation factor a/eIF2 (-y) counteracts 5' to 3' mRNA decay in the archaeon Sulfolobus solfalaricus. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105, 2146-2150.

77. Hasenohrl, D., Fabbretti, A., Londei, P., Gualerzi, C.O., and Blasi, U. (2009). Translation initiation complex formation in the crenarchaeon Sulfolobus solfataricus. RNA 15, 2288-2298.

78. Hashem, Y., des Georges, A., Dhote, V., Langlois, R., Liao, II.Y., Grassucci, R.A., Hellen, C.U.T., Pestova, T. V, and Frank, J. (2013). Structure of the mammalian ribosomal 43S preinitiation complex bound to the scanning factor DI1X29. Cell 153, 1108-1119.

79. Hatzopoulos, G.N., and Mueller-Dieckmann, J. (2010). Structure of translation initiation factor 1 from Mycobacterium tuberculosis and inferred binding to the 30S ribosomal subunit. FEBS Lett. 584, 1011-1015.

80. Hauryliuk, V., Hansson, S., and Ehrenberg, M. (2008). Cofactor dependent conformational switching of GTPases. Biophys. J. 95, 1704-1715.

81. Hering, O., Brenneis, M., Beer, J., Suess, B., and Soppa, J. (2009). A novel mechanism for translation initiation operates in haloarchaea. Mol. Microbiol. 71, 1451-1463.

82. I-Iousman, D., Jacobs-Lorena, M., Rajbhandary, U.L., and Lodish, H.F. (1970). Initiation of haemoglobin synthesis by methionyl-tRNA. Nature 227, 913-918.

83. Huang, H., Yoon, H., Hannig, E.M., and Donahue, T.F. (1997). GTP hydrolysis controls stringent selection of the AUG start codon during translation initiation in Saccharomyces cerevisiae. Genes Dev. 11, 2396-2413.

84. Hussain, T., Llácer, J.L., Fernández, I.S., Muñoz, A., Martin-Marcos, P., Savva, C.G., Lorsch, J.R., Hinnebusch, A.G., and Ramakrishnan, V. (2014). Structural changes enable start codon recognition by the eukaryotic translation initiation complex. Cell 159, 597-607.

85. Ito, T., Marintchev, A., and Wagner, G. (2004). Solution structure of human initiation factor eIF2alpha reveals homology to the elongation factor eEFlB. Structure 12, 1693-1704.

86. Janssen, J.R. (1993). Eubacterial, archaebacterial and eukaryotic genes that encode Ieaderless mRNAs. In Industrial Microorganisms: Basic and Applied Molecular Genetics, Washington DC: American Society for Microbiology, pp. 59-67.

123

87. Jia, M.Z., Horita, S., Nagata, K., and Tanokura, M. (2010). An archaeal Dim2-like protein, aDim2p, forms a ternary complex with a/eIF2 alpha and the 3' end fragment of 16S rRNA. J. Mol. Biol. 398, 774-785.

88. Julian, P., Milon, P., Agirrezabala, X., Lasso, G., Gil, D., Rodnina, M. V, and Valle, M. (2011). The Cryo-EM structure of a complete 30S translation initiation complex from Escherichia coli. PLoS Biol. 9, el001095.

89. Kaempfer, R., Hollender, R., Abrams, W.R., and Israeli, R. (1978a). Specific binding of messenger RNA and methionyI-tRNAfMet by the same initiation factor for eukaryotic protein synthesis. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 75, 209-213.

90. Kaempfer, R., Rosen, I I., and Israeli, R. (1978b). Translational control: recognition of the methylated 5' end and an internal sequence in eukaryotic mRNA by the initiation factor that binds methionyl-tRNAfMct. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 75, 650-654.

91. Kapp, L.D., and Lorsch, J.R. (2004). GTP-dependent recognition of the methionine moiety on initiator tRNA by translation factor eIF2. J. Mol. Biol. 335, 923-936.

92. Kimball, S.R., Everson, W. V, Myers, L.M., and Jefferson, L.S. (1987). Purification and characterization of eukaryotic initiation factor 2 and a guanine nucleotide exchange factor from rat liver. J. Biol. Chem. 262, 2220-2227.

93. Kjeldgaard, M., and Nyborg, J. (1992). Refined structure of elongation factor EF-Tu from Escherichia coli. J. Mol. Biol. 223, 721-742.

94. Kjeldgaard, M., Nissen, P., Thirup, S., and Nyborg, J. (1993). The crystal structure of elongation factor EF-Tu from Thermus aquaticus in the GTP conformation. Structure 1, 35-50.

95. Klinge, S., Voigts-Hoffmann, F., Leibundgut, M., Arpagaus, S., and Ban, N. (2011). Crystal structure of the eukaryotic 60S ribosomal subunit in complex with initiation factor 6. Science 334, 941-948.

96. Komarova, A. V, Tchufistova, L.S., Supina, E. V, and Boni, I. V (2002). Protein SI counteracts the inhibitory effect of the extended Shine-Dalgarno sequence on translation. RNA 8, 1137-1147.

97. Konieczny, A., and Safer, B. (1983). Purification of the eukaryotic initiation factor 2-eukaryotic initiation factor 2B complex and characterization of its guanine nucleotide exchange activity during protein synthesis initiation. J. Biol. Chem. 258, 3402-3408.

98. Kozak, M. (1989). The scanning model for translation: an update. J. Cell Biol. 108, 229241.

99. Kozak, M. (1999). Initiation of translation in prokaryotes and eukaryotes. Gene 234, 187— 208.

100. Kramer, P., Gabel, K., Pfeiffer, F., and Soppa, J. (2014). Haloferax volcanii, a prokaryotic species that does not use the Shine Dalgarno mechanism for translation initiation at 5'-UTRs. PLoS One 9, e94979.

101. Kuhle, B., and Ficner, R. (2014). eIF5B employs a novel domain release mechanism to catalyze ribosomal subunit joining. EMBO J. 33, 1177-1191.

102. Kyrpides, N.C., and Woese, C.R. (1998a). Universally conserved translation initiation factors. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 95, 224-228.

103. Kyrpides, N.C., and Woese, C.R. (1998b). Archaeal translation initiation revisited: The initiation factor 2 and eukaryotic initiation factor 2B alpha-beta-delta subunit families. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 95, 3726-3730.

104. Laalami, S., Putzer, H., Plumbridge, J.A., and Grunberg-Manago, M. (1991). A severely truncated form of translational initiation factor 2 supports growth of Escherichia coli. J. Mol. Biol. 220, 335-349.

105. Laemmli, U.K. (1970). Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227, 680-685.

106. Lake, J.A. (1983). Evolving ribosome structure: domains in archaebacteria, cubacteria, and eucaryotes. Cell 33, 318-319.

107. Laurino, J.P., Thompson, G.M., Pacheco, E., and Castilho, B.A. (1999). The beta subunit of eukaryotic translation initiation factor 2 binds mRNA through the lysine repeats and a region comprising the C2-C2 motif. Mol. Cell. Biol. 19, 173-181.

108. Laursen, B.S., Mortensen, K.K., Sperling-Petersen, H.U., and Hoffman, DAY. (2003). A conserved structural motif at the N terminus of bacterial translation initiation factor 1F2. J. Biol. Chem .278, 16320-16328.

109. Lecomptc, O., Ripp, R., Thierry, J., Moras, D., and Poch, O. (2002). Comparative analysis of ribosomal proteins in complete genomes: an example of reductive evolution at the domain scale. Nucleic Acids Res. 30, 5382-5390.

110. Lee, J.H., Choi, S.K., Roll-Mecak, A., Burley, S.K., and Dever, T.E. (1999). Universal conservation in translation initiation revealed by human and archaeal homologs of bacterial translation initiation factor 1F2. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96, 4342^347.

111. Leipe, D.D., Wolf, Y.I., Koonin, E. V, and Aravind, L. (2002). Classification and evolution of P-loop GTPases and related ATPases. J. Mol. Biol. 317, 41-72.

112. Levin, D.H., Kyner, D., and Acs, G. (1973). Protein initiation in eukaryotes: formation and function of a ternary complex composed of a partially purified ribosomal factor, methionyl transfer RNA, and guanosine triphosphate. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 70, 41-45.

113. Li, W., and Hoffman, D.W. (2001). Structure and dynamics of translation initiation factor aIF-1 A from the archaeon Methanococcus jannaschii determined by NMR spectroscopy. Protein Sci. 10, 2426-2438.

114. Llacer, J.L., Hussain, T., Marler, L., Aitken, C.E., Thakur, A., Lorsch, J.R., Hinnebusch, A.G., and Ramakrishnan, V. (2015). Conformational differences between open and closed states of the eukaryotic translation initiation complex. Mol. Cell 59, 399^112.

115. Lomakin, I.B., and Steitz, T.A. (2013). The initiation of mammalian protein synthesis and mRNA scanning mechanism. Nature 500, 307-311.

116. Lomakin, I.B., Kolupaeva, V.G., Marintchev, A., Wagner, G., and Pestova, T. V (2003). Position of eukaryotic initiation factor elFl on the 40S ribosomal subunit determined by directed hydroxyl radical probing. Genes Dev. 17, 2786-2797.

125

117. Londci, P. (2005). Evolution of translational initiation: new insights from the archaea. FEMS Microbiol. Rev. 29, 185-200.

118. Maag, D., and Lorsch, J.R. (2003). Communication between eukaryotic translation initiation factors 1 and 1A on the yeast small ribosomal subunit. J. Mol. Biol. 330, 917-924.

119. Maag, D., Fekete, C.A., Gryczynski, Z., and Lorsch, J.R. (2005). A conformational change in the eukaryotic translation preinitiation complex and release of elFl signal recognition of the start codon. Mol. Cell 17, 265-275.

120. Mandel, M., and Higa, A. (1970). Calcium-dependent bacteriophage DNA infection. J. Mol. Biol. 53, 159-162.

121. Maone, E., Di Stefano, M., Berardi, A., Benelli, D., Marzi, S., La Teana, A., and Londei, P. (2007). Functional analysis of the translation factor aIF2/5B in the thermophilic archaeon Sulfolobus solfataricus. Mol. Microbiol. 65, 700-713.

122. Marck, C., and Grosjean, H. (2002). tRNomics: Analysis of tRNA genes from 50 genomes of Eukarya, Archaea, and Bacteria reveals anticodon-sparing strategies and domain-specific features. RNA 8, 1189-1232.

123. Marintchev, A., and Wagner, G. (2004). Translation initiation: structures, mechanisms and evolution. Q. Rev. Biophys. 37, 197-284.

124. Marintchev, A., Kolupaeva, V.G., Pestova, T. V, and Wagner, G. (2003). Mapping the binding interface between human eukaryotic initiation factors 1A and 5B: a new interaction between old partners. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100, 1535-1540.

125. Martens, B., Manoharadas, S., Hasenohrl, D., Zeichen, L., and Blasi, U. (2014). Back to translation: removal of aIF2 from the 5'-end of mRNAs by translation recovery factor in the crenarchaeon Sulfolobus solfataricus. Nucleic Acids Res. 42, 2505-2511.

126. Martínez-Salas, E., Pineiro, D., and Fernández, N. (2012). Alternative mechanisms to initiate translation in eukaryotic mRNAs. Comp. Funct. Genomics 2012, 391546.

127. Marzi, S., Knight, W., Brandi, L., Caserta, E., Soboleva, N., Hill, W.E., Gualerzi, C.O., and Lodmell, J.S. (2003). Ribosomal localization of translation initiation factor IF2. RNA 9, 958-969.

128. Mazumder, R. (1972). Initiation factor 2-dependent ribosomal binding of N-formylmethionyl-transfer RNA without added guanosine triphosphate. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 69, 2770-2773.

129. Menne, T.F., Goyenechea, B., Sánchez-Puig, N., Wong, C.C., Tonkin, L.M., Ancliff, P.J., Brost, R.L., Costanzo, M., Boone, C., and Warren, A.J. (2007). The Shwachman-Bodian-Diamond syndrome protein mediates translational activation of ribosomes in yeast. Nat. Genet. 39, 486-495.

130. Merrick, W.C. (1992). Mechanism and regulation of eukaryotic protein synthesis. Microbiol. Rev. 56, 291-315.

131. Meunier, S., Spurio, R., Czisch, M., Wechselberger, R., Guenneugues, M., Gualerzi, C.O., and Boelens, R. (2000). Structure of the fMct-tRNAfMet-binding domain of B. stearothermophilus initiation factor IF2. EMBO J. 19, 1918-1926.

126

132. Miller, M.J., and Wahba, A.J. (1973). Chain initiation factor 2. Purification and properties of two species from Escherichia coli MRE 600. J. Biol. Chem. Biol. 248, 1084-1090.

133. Milon, P., Carotti, M., Konevega, A.L., Wintermeyer, W., Rodnina, M. V, and Gualerzi, C.O. (2010). The ribosome-bound initiation factor 2 recruits initiator tRNA to the 30S initiation complex. EMBO Rep. 11, 312-316.

134. Milon, P., Maracci, C., Filonava, L., Gualerzi, C.O., and Rodnina, M. V (2012). Real-time assembly landscape of bacterial 30S translation initiation complex. Nat. Struct. Mol. Biol. 19, 609-615.

135. Moazed, D., Samaha, R.R., Gualerzi, C., and Noller, IT.F. (1995). Specific protection of 16S rRNA by translational initiation factors. J. Mol. Biol. 248, 207-210.

136. Mohr, D., Wintermeyer, W., and Rodnina, M. V (2002). GTPase activation of elongation factors Tu and G on the ribosome. Biochemistry 41, 12520-12528.

137. Moll, I., Afonyushkin, Т., Vytvytska, 0., Kaberdin, V.R., and Blasi, U. (2003). Coincident Hfq binding and RNase E cleavage sites on mRNA and small regulatory RNAs. RNA 9, 1308— 1314.

138. Moll, I., I-Iirokawa, G., Kiel, M.C., Kaji, A., and Blasi, U. (2004). Translation initiation with 70S ribosomes: an alternative pathway for Ieaderless mRNAs. Nucleic Acids Res. 32, 3354-3363.

139. Moreno, J.M.P., Dyrskjotersen, L., Kristensen, J.E., Mortensen, K.K., and Sperling-Petersen, H.U. (1999). Characterization of the domains of£. coli initiation factor IF2 responsible for recognition of the ribosome. FEBS Lett. 455, 130-134.

140. Myasnikov, A.G., Marzi, S., Simonetti, A., Giuliodori, A.M., Gualerzi, C.O., Yusupova, G., Yusupov, M., and Klaholz, B.P. (2005). Conformational transition of initiation factor 2 from the GTP- to GDP-bound state visualized on the ribosome. Nat. Struct. Mol. Biol. 12, 1145-1149.

141. Naveau, M., Lazennec-Schurdevin, C., Panvert, M., Mechulam, Y., and Schmitt, E. (2010). tRNA binding properties of eukaryotic translation initiation factor 2 from Encephalilozoon cuniculi. Biochemistry 49, 8680-8688.

142. Naveau, M., Lazennec-Schurdevin, C., Panvert, M., Dubiez, E., Mechulam, Y., and Schmitt, E. (2013). Roles of yeast eIF2a and eIF2p subunits in the binding of the initiator methionyl-tRNA. Nucleic Acids Res. 41, 1047-1057.

143. Nevskaya, N., Tishchenko, S., Gabdoulkhakov, A., Nikonova, E., Nikonov, O., Nikulin, A., Platonova, O., Garber, M., Nikonov, S., and Piendl, W. (2005). Ribosomal protein LI recognizes the same specific structural motif in its target sites on the autoregulatory mRNA and 23S rRNA. Nucleic Acids Res. 33, 478^185.

144. Nika, J., Rippel, S., and Flannig, E.M. (2001). Biochemical analysis of the eIF2beta gamma complex reveals a structural function for eIF2alpha in catalyzed nucleotide exchange. J. Biol. Chem. 276, 1051-1056.

145. Nikonov, O., Stolboushkina, E., Nikulin, A., Hasenohrl, D., Blasi, U., Manstein, D.J., Fedorov, R., Garber, M., and Nikonov, S. (2007). New insights into the interactions of the translation initiation factor 2 from archaea with guanine nucleotides and initiator tRNA. J. Mol. Biol. 373, 328-336.

146. Nisscn, P., Kjeldgaard, M., Thirup, S., Palekhina, G., Reshetnikava, L., Clark, B.F.C., and Nyborg, J. (1995). Crystal structure of the ternary complex of Phe-tRNAI>hc, EF-Tu, and a GTP analog. Science 270, 1464-1472.

147. Nissen, P., Thirup, S., Kjeldgaard, M., and Nyborg, J. (1999). The crystal structure of Cys-tRNACys-EF-Tu-GDPNP reveals general and specific features in the ternary complex and in tRNA. Structure 7, 143-156.

148. Nonato, M.C., Widom, J., and Clardy, J. (2002). Crystal structure of the N-terminal segment of human eukaryotic translation initiation factor 2 alpha. J. Biol. Chem. 277, 1705717061.

149. Nyengaard, N.R., Mortensen, K.K., Lassen, S.F., Hershey, J.W., and Sperling-Petersen, II.U. (1991). Tandem translation of E. coli initiation factor IF2 beta: Purification and characterization in vitro of two active forms. Biochem. Biophys. Res. Commun. 181, 1572— 1579.

150. Nygard, O., Westermann, P., and Hultin, T. (1980). Met-tRNAfMel is located in close proximity to the beta subunit of eIF-2 in the eukaryotic initiation complex, eIF-2*Met-tRNAfMct* GDPCP. FEBS Lett. 113, 125-128.

151. O'Donnell, S.M., and Janssen, G.R. (2002). Leaderless mRNAs bind 70S ribosomes more strongly than 30S ribosomal subunits in Escherichia coli. J. Bacteriol. 184, 6730-6733.

152. Olsen, D.S., Savner, E.M., Mathew, A., Zhang, F., Krishnamoorthy, T., Phan, L., and Hinnebusch, A.G. (2003). Domains of elFIA that mediate binding to eIF2 , eIF3 and eIF5B and promote ternary complex recruitment in vivo. EMBO J. 22, 193-204.

153. Panniers, R., and Henshaw, E.C. (1983). A GDP/GTP exchange factor essential for eukaryotic initiation factor 2 cycling in Ehrlich ascites tumor cells and its regulation by eukaryotic initiation factor 2 phosphorylation. J. Biol. Chem. 258, 7928-7934.

154. Passmore, L.A., Schmeing, T.M., Maag, D., Applefield, D.J., Acker, M.G., Algire, M.A., Lorsch, J.R., and Ramakrishnan, V. (2007). The eukaryotic translation initiation factors elFl and elFIA induce an open conformation of the 40S ribosome. Mol. Cell 26, 41-50.

155. Paulin, F.E., Campbell, L.E., O'Brien, K„ Loughlin, J., and Proud, C.G. (2001). Eukaryotic translation initiation factor 5 (eIF5) acts as a classical GTPase-activator protein. Curr. Biol. 11, 55-59.

156. Pavitt, G.D., Ramaiah, K.V.A., Kimball, S.R., and Hinnebusch, A.G. (1998). eIF2 independently binds two distinct eIF2B subcomplexes that catalyze and regulate guanine-nucleotide exchange. Genes Dev. 12, 514—526.

157. Pedulla, N., Palermo, R., Hasenohrl, D., Blasi, U., Cammarano, P., and Londei, P. (2005). The archaeal eIF2 homologue: functional properties of an ancient translation initiation factor. Nucleic Acids Res. 33, 1804-1812.

158. Pestova, T. V, and Kolupaeva, V.G. (2002). The roles of individual eukaryotic translation initiation factors in ribosomal scanning and initiation codon selection. Genes Dev. 16, 29062922.

159. Pestova, T. V, Lomakin, I.B., Lee, J.H., Choi, S.K., Dever, T.E., and Hellen, C.U.T. (2000). The joining of ribosomal subunits in eukaryotes requires eIF5B. Nature 403, 332-335.

128

160. Pestova, T. V, de Breyne, S., Pisarev, A. V, Abaeva, I.S., and Hellen, C.U.T. (2008). eIF2-dependent and eIF2-independcnt modes of initiation on the CSFV IRES: a common role of domain II. EMBO J. 27, 1060-1072.

161. Petersen, H.U., Roll, T., Grunberg-Manago, M., and Clark, B.F.C. (1979). Specific interaction of initiator factor IF2 of E. coli with formylmcthionyl-tRNAfMet. Biochem. Biophys. Res. Commun. 91, 1068-1074.

162. Pisarev, A. V, Kolupaeva, V.G., Pisareva, V.P., Merrick, W.C., Hellen, C.U.T., and Pestova, T. V (2006). Specific functional interactions of nucleotides at key -3 and +4 positions flanking the initiation codon with components of the mammalian 48S translation initiation complex. Genes Dev. 20, 624-636.

163. Pisarev, A. V., Skabkin, M.A., Pisareva, V.P., Skabkina, O. V., Rakotondrafara, A.M., Hentze, M.W., Hellen, C.U.T., and Pestova, T. V. (2010). The role of ABCE1 in eukaryotic posttermination ribosomal recycling. Mol. Cell 37, 196-210.

164. Pisareva, V.P., Hellen, C.U.T., and Pestova, T. V (2007). Kinetic analysis of the interaction of guanine nucleotides with eukaryotic translation initiation factor eIF5B. Biochemistry 46, 2622-2629.

165. Polekhina, G., Thirup, S., Kjeldgaard, M., Nissen, P., Lippmann, C., and Nyborg, J. (1996). Helix unwinding in the effector region of elongation factor EF-Tu-GDP. Structure 4, 1141-1151.

166. Price, N.T., Nakielny, S.F., Clark, S.J., and Proud, C.G. (1989). The two forms of the 0-subunit of initiation factor-2 from reticulocyte lysates arise from proteolytic degradation. Biochim. Biophys. Acta 1008, 177-182.

167. RabI, J., Leibundgut, M., Ataide, S.F., Ilaag, A., and Ban, N. (2011). Crystal structure of the eukaryotic 40S ribosomal subunit in complex with initiation factor 1. Science 331, 730-736.

168. RajBhandary, U.L., and Chow, C.M. (1995). Initiator tRNAs and initiation of protein synthesis. In tRNA: Structure, Biosynthesis, and Function, American Society for Microbiology, Washington, pp. 511-528.

169. Rasmussen, L.C.V., Oliveira, C.L., Jensen, J.M., Pedersen, J.S., Sperling-Petersen, H.U., and Mortensen, K.K. (2008). Solution structure of C-terminal Escherichia coli translation initiation factor IF2 by small-angle X-ray scattering. Biochemistry 47, 5590-5598.

170. Rasmussen, L.C.V., Oliveira, C.L.P., Byron, O., Jensen, J.M., Pedersen, J.S., Sperling-Petersen, H.U., and Mortensen, K.K. (2011). Structure and dimerization of translation initiation factor aIF5B in solution. Biochem. Biophys. Res. Commun. 416, 140-145.

171. Reibarkh, M., Yamamoto, Y., Singh, C.R., del Rio, F., Fahmy, A., Lee, B., Luna, R.E., Ii, M., Wagner, G., and Asano, K. (2008). Eukaryotic initiation factor (elF) 1 carries two distinct eIF5-binding faces important for multifactor assembly and AUG selection. J. Biol. Chem. 283, 1094—1103.

172. Roll-Mecak, A., Cao, C., Dever, T.E., and Burley, S.K. (2000). X-ray structure of the universal translation initiation factor IF2/eIF5B: conformational changes on GDP and GTP binding. Cell 103, 781-792.

173. Roll-Mecak, A., Alone, P., Cao, C., Dever, T.E., and Burley, S.K. (2004). X-ray structure of translation initiation factor eIF2gamma: implications for tRNA and eIF2a!pha binding. J. Biol. Chem .279, 10634-10642.

174. Russell, D.W., and Spremulli, L.L. (1979). Purification and characterization of a ribosome dissociation factor (eukaryotic initiation factor 6) from wheat germ. J. Biol. Chem. 254, 87968800.

175. Saini, A.K., Nanda, J.S., Lorsch, J.R., and Hinnebusch, A.G. (2010). Regulatory elements in elFIA control the fidelity of start codon selection by modulating tRNAjNct binding to the ribosome. Genes Dev. 24, 97-110.

176. Sanvito, F., Piatti, S., Villa, A., Bossi, M., Lucchini, G., Marchisio, P.C., and Biffo, S. (1999). The beta4 integrin interactor p27(BBP/eIF6) is an essential nuclear matrix protein involved in 60S ribosomal subunit assembly. J. Cell Biol. 144, 823-838.

177. Sartorius-Neef, S., and Pfeifer, F. (2004). In vivo studies on putative Shine-Dalgarno sequences of the halophilic archaeon Halobacterium salinarum. Mol. Microbiol. 51, 579-588.

178. Satpati, P., and Simonson, T. (2012). Conformational selection by the alF2 GTPase: a molecular dynamics study of functional pathways. Biochemistry 51, 353-361.

179. Schmitt, E., Blanquet, S., and Mechulam, Y. (2002). The large subunit of initiation factor alF2 is a close structural homologue of elongation factors. EMBO J. 21, 1821-1832.

180. Schmitt, E., Panvert, M., Lazennec-Schurdevin, C., Coureux, P.-D., Perez, J., Thompson, A., and Mechulam, Y. (2012). Structure of the ternary initiation complex aIF2-GDPNP-methionylated initiator tRNA. Nat. Struct. Mol. Biol. 19, 450-454.

181. Schreier, M.H., and Staehelin, T. (1973). Initiation of eukaryotic protein synthesis: (Met-tRNAr40S ribosome) initiation complex catalysed by purified initiation factors in the absence of mRNA. Nat. New Biol. 242, 35-38.

182. Senger, B., Lafontaine, D.L.J., Graindorge, J., Gadal, O., Camasses, A., Sanni, A., Gamier, J.-M., Breitenbach, M., Hurt, E., and Fasiolo, F. (2001). The nucle(ol)ar Tif6p and Efllp are required for a late cytoplasmic step of ribosome synthesis. Mol. Cell 8, 1363-1373.

183. Sette, M., Tilborg, P. Van, Spurio, R., Kaptein, R., Paci, M., Gualerzi, C.O., and Boelens, R. (1997). The structure of the translational initiation factor IF1 from E. coli contains an oligomer-binding motif. EMBO J. 16, 1436-1443.

184. Sharifulin, D., Babaylova, E., Kossinova, O., Bartuli, Y., Graifer, D., and Karpova, G. (2013). Ribosomal protein S5e is implicated in translation initiation through its interaction with the N-terminal domain of initiation factor eIF2a. Chembiochem 14, 2136-2143.

185. Shatsky, I.N., Dmitriev, S.E., Terenin, I.M., and Andreev, D.E. (2010). Cap- and 1RES-indepcndent scanning mechanism of translation initiation as an alternative to the concept of cellular IRESs. Mol. Cells 30, 285-293.

186. Shatsky, I.N., Dmitriev, S.E., Andreev, D.E., and Terenin, I.M. (2014). Transcriptome-wide studies uncover the diversity of modes of mRNA recruitment to eukaryotic ribosomes. Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 49, 164-177.

187. Shin, B.-S., Kim, J.-R., Walker, S.E., Dong, J., Lorsch, J.R., and Dever, T.E. (2011a). Initiation factor eIF2y promotes eIF2-GTP-Met-tRNAj(Met) ternary complex binding to the 40S ribosome. Nat. Struct. Mol. Biol. 18, 1227-1234.

188. Shin, B.-S., Acker, M.G., Kim, J.-R., Maher, K.N., Arefin, S.M., Lorsch, J.R., and Dever, T.E. (2011b). Structural integrity of a-helix H12 in translation initiation factor eIF5B is critical for 80S complex stability. RNA 17, 687-696.

189. Shine, J., and Dalgarno, L. (1974). The 3'-terminal sequence of Escherichia coli 16S ribosomal RNA: complementarity to nonsense triplets and ribosome binding sites. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 71, 1342-1346.

190. Si, K., and Maitra, U. (1999). The Saccharomyces cerevisiae homologue of mammalian translation initiation factor 6 does not function as a translation initiation factor. Mol. Cell. Biol. 19, 1416-1426.

191. Simonctti, A., Marzi, S., Myasnikov, A.G., Fabbretti, A., Yusupov, M., Gualerzi, C.O., and Kiaholz, B.P. (2008). Structure of the 30S translation initiation complex. Nature 455, 416-420.

192. Simonetti, A., Marzi, S., Billas, I.M.L., Tsai, A., Fabbretti, A., Myasnikov, A.G., Roblin, P., Vaiana, A.C., Hazemann, I., Eiler, D., et al. (2013a). Involvement of protein IF2 N domain in ribosomal subunit joining revealed from architecture and function of the full-length initiation factor. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110, 15656-15661.

193. Simonetti, A., Marzi, S., Fabbretti, A., Hazemann, I., Jenner, L., Urzhumtsev, A., Gualerzi, C.O., and Kiaholz, B.P. (2013b). Structure of the protein core of translation initiation factor 2 in apo, GTP-bound and GDP-bound forms. Acta Crystallogr. Sect. D Biol. Crystallogr. 69, 925933.

194. Simonson, T., and Satpati, P. (2012). Nucleotide recognition by the initiation factor aIF5B: free energy simulations of a neoclassical GTPase. Proteins 80, 2742-2757.

195. Singh, C.R., He, II., Ii, M., Yamamoto, Y., and Asano, K. (2004). Efficient incorporation of eukaryotic initiation factor 1 into the multifactor complex is critical for formation of functional ribosomal preinitiation complexes in vivo. J. Biol. Chem. 279, 31910-31920.

196. Slupska, M.M., King, A.G., Fitz-Gibbon, S., Besemer, J., Borodovsky, M., and Miller, J.I I. (2001). Leaderless transcripts of the crenarchaeal hyperthermophile Pyrobaculum aerophilum. J. Mol. Biol. 309, 347-360.

197. Sokabe, M., Yao, M., Sakai, N., Toya, S., and Tanaka, I. (2006). Structure of archaeal translational initiation factor 2Py-GDP reveals significant conformational change of the p-subunitand switch 1 region. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103, 13016-13021.

198. Spurio, R., Brandi, L., Caserta, E., Pon, C.L., Gualerzi, C.O., Misselwitz, R., Krafft, C., Wei fie, K., and Welfle, II. (2000). The C-terminal subdomain (IF2 C-2) contains the entire fMet-tRNA binding site of initiation factor IF2. J. Biol. Chem. 275, 2447-2454.

199. Steffensen, S.A., Poulsen, A.B., Mortensen, K.K., and Sperling-Petersen, I I.U. (1997). E. coli translation initiation factor IF2 - an extremely conserved protein. Comparative sequence analysis of the infB gene in clinical isolates of E. coli. FEBS Lett. 419, 281-284.

200. Stolboushkina, E.A., and Garber, M.B. (2011). Eukaryotic type translation initiation factor 2: Structure-functional aspects. Biochem. 76, 283-294.

131

201. Stolboushkina, E., Nikonov, S., Nikulin, A., Blasi, U., Manstein, D.J., Fedorov, R., Garber, M., and Nikonov, O. (2008). Crystal structure of the intact archaeal translation initiation factor 2 demonstrates very high conformational flexibility in the alpha- and beta-subunits. J. Mol. Biol. 382, 680-691.

202. Stolboushkina, E., Nikonov, S., Zelinskaya, N., Arkhipova, V., Nikulin, A., Garber, M., and Nikonov, O. (2013). Crystal structure of the archaeal translation initiation factor 2 in complex with a GTP analogue and Met-tRNAf(Met.). J. Mol. Biol. 425, 989-998.

203. Studier, F.W., Rosenberg, A.M., Dunn, J.J., and Dubendorff, J.W. (1990). Use of T7 RNA polymerase to direct expression of cloned genes. J. Methods Enzimol 185, 60-89.

204. Sundari, R.M., Stringer, E.A., Schulman, L.H., and Maitra, U. (1976). Interaction of bacterial initiation factor 2 with initiator tRNA. J. Biol. Chem. 251, 3338-3345.

205. Sussman, J.K., Simons, E.L., and Simons, R.W. (1996). Escherichia coli translation initiation factor 3 discriminates the initiation codon in vivo. Mol. Microbiol. 21, 347-360.

206. Tahara, M., Ohsawa, A., Saito, S., and Kimura, M. (2004). In vitro phosphorylation of initiation factor 2 alpha (aIF2 alpha) from hyperthermophilic archaeon Pyrococcus horikoshii OT3. J. Biochem. 135, 479^185.

207. La Teana, A., Benelli, D., Londei, P., and Blasi, U. (2013). Translation initiation in the crenarchaeon Sulfolobus solfataricus: eukaryotic features but bacterial route. Biochem. Soc. Trans. 41, 350-355.

208. Terenin, I.M., Dmitriev, S.E., Andreev, D.E., and Shatsky, I.N. (2008). Eukaryotic translation initiation machinery can operate in a bacterial-like mode without eIF2. Nat. Struct. Mol. Biol. 75,836-841.

209. Thakor, N., and Holcik, M. (2012). IRES-mediated translation of cellular messenger RNA operates in eIF2a-independent manner during stress. Nuclcic Acids Res. 40, 541-552.

210. Thompson, G.M., Pacheco, E., Melo, E.O., and Castilho, B.A. (2000). Conserved sequences in the beta subunit of archaeal and eukaryal translation initiation factor 2 (eIF2), absent from eIF5, mediate interaction with eIF2gamma. J. Biochem. 347, 703-709.

211. Tishchenko, S., Nikonova, E., Nikulin, A., Nevskaya, N., Volchkov, S., Piendl, W., Garber, M., and Nikonov, S. (2006). Structure of the ribosomal protein Ll-mRNA complex at 2.1 A resolution: common features of crystal packing of LI-RNA complexes. Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 62, 1545-1554.

212. Tolstrup, N., Sensen, C.W., Garrett, R.A., and Clausen, I.G. (2000). Two different and highly organized mechanisms of translation initiation in the archaeon Sulfolobus solfataricus. Extremophiles 4, 175-179.

213. Udagawa, T., Shimizu, Y., and Ueda, T. (2004). Evidence for the translation initiation of leaderless mRNAs by the intact 70 S ribosome without its dissociation into subunits in eubacteria. J. Biol. Chem. 279, 8539-8546.

214. Unbehaun, A., Marintchev, A., Lomakin, I.B., Didenko, T., Wagner, G., I lellen, C.U.T., and Pestova, T. V (2007). Position of eukaryotic initiation factor eIF5B on the 80S ribosome mapped by directed hydroxyl radical probing. EMBO J. 26, 3109-3123.

215. Valenzuela, D.M., Chaudhuri, A., and Maitra, U. (1982). Eukaryotic ribosomal subunit anti-association activity of calf liver is contained in a single polypeptide chain protein of Mr = 25,500 (eukaryotic initiation factor 6). J. Biol. Chem. 257, 7712-7719.

216. Vasile, F., Pechkova, E., and Nicolini, C. (2007). Solution structure of the beta-subunit of the translation initiation factor aIF2 from archaebacteria Sulfolobus solfataricus. Proteins 70, 1112-1115.

217. Vitagliano, L., Masullo, M., Sica, F., Zagari, A., and Bocchini, V. (2001). The crystal structure of Sulfolobus solfataricus elongation factor la in complex with GDP reveals novel features in nucleotide binding and exchange. EMBO J. 20, 5305-5311.

218. Wagner, T., Gross, M., and Sigler, P.B. (1984). Isoleucyl initiator tRNA does not initiate eucaryotic protein synthesis. J. Biol. Chem. 259, 4706—4709.

219. Walton, G.M., and Gill, G.N. (1975). Nucleotide regulation of a eukaryotic protein synthesis initiation complex. Biochim. Biophys. Acta 390, 231-245.

220. Weisser, M., Voigts-Hoffmann, F., Rabl, J., Leibundgut, M., and Ban, N. (2013). The crystal structure of the eukaryotic 40S ribosomal subunit in complex with elFl and elFlA. Nat. Struct. Mol. Biol. 20, 1015-1017.

221. Wells, S.E., Hillner, P.E., Vale, R.D., and Sachs, A.B. (1998). Circularization of mRNA by eukaryotic translation initiation factors. Mol. Cell 2, 135-140.

222. Westermann, P., Nygard, O., and Bielka, H. (1980). The alpha and gamma subunits of initiation factor elF-2 can be cross-linked to 18S ribosomal RNA within the quaternary initiation complex, eIF-2-Met-tRNArGDPCP-small ribosomal subunit. Nucleic Acids Res. 8, 3065-3071.

223. White, B.N., and Baylcy, S.T. (1972). Methionine transfer RNAs from the extreme halophile, Halobacterium cutirubrum. Biochim. Biophys. Acta 272, 583-587.

224. Wienk, H., Tomaselli, S., Bernard, C., Spurio, R., Picone, D., Gualerzi, C.O., and Boelens, R. (2005). Solution structure of the Cl-subdomain of Bacillus stearothermophilus translation initiation factor IF2. Protein Sci. 14, 2461-2468.

225. Wienk, H., Tishchenko, E., Belardinelli, R., Tomaselli, S., Dongre, R., Spurio, R., Folkers, G.E., Gualerzi, C.O., and Boelens, R. (2012). Structural dynamics of bacterial translation initiation factor IF2. J. Biol. Chem. 287, 10922-10932.

226. Wilson, S.A., Sieiro-Vazquez, C., Edwards, N.J., Iourin, O., Byles, E.D., Kotsopoulou, E., Adamson, C.S., Kingsman, S.M., Kingsman, A.J., and Martin-Rendon, E. (1999). Cloning and characterization of hlF2, a human homologue of bacterial translation initiation factor 2, and its interaction with HIV-1 matrix. Biochem. J. 342, 97-103.

227. Woese, C.R., and Fox, G.E. (1977). Phylogenetic structure of the prokaryotic domain : The primary kingdoms. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 74, 5088-5090.

228. Wurtzel, O., Sapra, R., Chen, F„ Zhu, Y., Simmons, B.A., and Sorek, R. (2010). A singlebase resolution map of an archaeal transcriptome. Genome Res. 20, 133-141.

229. Yamamoto, II., Unbehaun, A., Loerke, J., Behrmann, E., Collier, M., Burger, J., Miclke, T., and Spahn, C.M.T. (2014). Structure of the mammalian 80S initiation complex with initiation factor 5B on HCV-IRES RNA. Nat. Struct. Mol. Biol. 21, 721-727.

133

230. Yatime, L., Schmitt, E., Blanquet, S., and Mechulam, Y. (2004). Functional molecular mapping of archaeal translation initiation factor 2. J. Biol. Chem. 279, 15984-15993.

231. Yatime, L., Schmitt, E., Blanquet, S., and Mechulam, Y. (2005). Structure-function relationships of the intact aIF2a subunit from the archaeon Pyrococcus abyssi. Biochemistry 44, 8749-8756.

232. Yatime, L., Mechulam, Y., Blanquet, S., and Schmitt, E. (2006). Structural switch of the y subunit in an archaeal aIF2 ay heterodimer. Structure 14, 119-128.

233. Yatime, L., Mechulam, Y., Blanquet, S., and Schmitt, E. (2007). Structure of an archaeal heterotrimeric initiation factor 2 reveals a nucleotide state between the GTP and the GDP states. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104, 18445-18450.

234. Yoon, H., and Donahue, T.F. (1992). The suil suppressor locus in Saccharomyces cerevisiae encodes a translation factor that functions during tRNA,Met recognition of the start codon. Mol. Cell. Biol. 12, 248-260.

235. Zheng, A., Yu, J., Yamamoto, R., Ose, T., Tanaka, I., and Yao, M. (2014). X-ray structures of eIF5B and the eIF5B-eIFlA complex: the conformational flexibility of elF5B is restricted on the ribosome by interaction with elFlA. Acta Crystallogr. Sect. D Biol. Crystallogr. 70, 30903098.

236. Zubay, G. (1962). The isolation and fractionation of soluble ribonucleic acid. J. Mol. Biol. 4, 347-356.

БЛАГОДАРНОСТИ

Выражаю искреннюю благодарность моему научному руководителю Марине Борисовне Гарбер за внимательное руководство, доброжелательность и поддержку при выполнении данной работы.

Бесконечно благодарна своему наставнику Елене Столбоушкиной за то, что научила меня биохимическим методам, за помощь в планировании и проведении экспериментов, за терпение и ценные рекомендации.

Особую благодарность хочу выразить Станиславу Владимировичу Никонову, Алексею Донатовичу Никулину, Олегу Никонову, Азату Габдулхакову и Олесе Кравченко, при участии которых была выполнена структурная часть работы.

Очень признательна Сергею Александровичу Мошковскому и Сергею Евгеньевичу Пермякову за возможность проведения экспериментов на биосенсорах. Спасибо Анне Сычевой и Алексею Казакову за помощь в освоении метода вРЯ и ценные советы.

Отдельно хочется поблагодарить зарубежных коллег: Удо Блэзи (Венский биоцентр, Австрия) и Уве Мюллера (Центр Гельмгольца, Берлин, Германия) за предоставленную возможность освоить новые методы и гостеприимность.

Благодарю весь коллектив лаборатории структурных исследований аппарата трансляции и группы структурных исследований рибосомных белков за дружную атмосферу, способствовавшую выполнению данной работы, за ценные дискуссии и полезные замечания.

Хочу выразить безмерную благодарность своим родителям, сестре и мужу за вдохновение, любовь и поддержку.