Изучение особенностей селекции аутореактивных Т-клеток тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.00.14, кандидат биологических наук Звездова, Екатерина Сейрулловна

• Звездова, Екатерина Сейрулловна
• кандидат биологических наук
• 2008

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Звездова, Екатерина Сейрулловна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1. Этапы дифференцировки предшественников Т-клеток. Формирование разнообразия TCR.

2. Структура молекул МНС и их созревание.

3. Структурная организация взаимодействия молекул МНС и TCR.

4. Внутриклеточные сигналы, вовлеченные в активацию Т-клетки.

5. Зависимость развития Т-клеток от экспрессии молекул МНС в тимусе.

6. Развития Т-клеток в отсутствие экспрессии корецепторов.

7. Позитивная и негативная селекция тимоцитов.

8. Гипотезы, объясняющие детерминацию путей развития тимоцитов в Т-клетки CD4+ и CD8+.

9. Механизмы индукции толерантности Т-клеток к собственным антигенам.

10. Предположительные гипотезы, объясняющие селекцию аутореактивных Т-клеток.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

РЕЗУЛЬТАТЫ.

ГЛАВА 1. Изучение особенностей аутореактивных рецепторов Т-клеточных гибридом.

1.1. Клонирование и анализ TCR аутореактивных гибридом.

1.2. Специфичность аутореаткивных TCR Т гибридом. Зависимость от корецепторных молекул CD4 и CD8.

ГЛАВА 2. Роль корецептора CD4 в распознавании молекул МНС класса 1.

ГЛАВА 3. Анализ периферического пула Т-лимфоцитов мышей 7Altg а-цепи аутореактивного TCR.

3.1. Клонирование геномной ДНК реаранжерованного TCR аутореактивной гибридомы 7. Создание мышей трансгенных по а цепи

3.2. Фенотипирование Т-клеток трансгенных мышей.

3.3. Функциональность наивных Т-клеток трансгенных мышей.

3.4. Цитотоксичкая функция Т-клеток CD8+ трансгенных мышей.

3.5 ФункциональностьТ-клеток памяти трансгенных мышей.

3.6 Распознавание молекулы Аь МНС класса II Т-клетками трансгенных мышей 7Altg.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Изучение особенностей селекции аутореактивных Т-клеток»

Как сказал Ганс Стаусс, "Antitumor immunity is beneficial autoimmunity." -«Противоопухолевый иммунитет это полезный аутоиммунитет.» Действительно, работы последних лет привели к пониманию того факта, что большинство антигенов опухолевых клеток представляют собой нормальные белки организма, экспрессируемые аберрантно, т.е. не в то время и не в том месте. В процессе своего нормального развития иммунная система теряет способность к распознаванию таких антигенов, как и прочих собственных антигенов организма. Центральная роль в этом разграничении распознавания «своего» и «чужого» принадлежит внутритимусной негативной селекции, устраняющей клоны Т-клеток с высокой авидностью к «своему». Этот процесс охватывает и широчайший спектр Т-клеток, специфичных к стадие- и органоспецифическим антигенам, включая «забарьерные» антигены тестиса, что обусловлено способностью тимусного эпителия к их стохастической экспрессии [Magalhaes DA., et al., 2006; Cloosen S, et al., 2007; Derbinski J., et al., 2008].

Вместе с тем дефекты тимусной селекции могут приводить к опасным заболеваниям, которые связаны с выживанием и активацией аутоиммунных клеток на периферии. То, каким образом аутореактивные Т-клетки избегают негативной селекции в тимусе, остается неясным. Понимание закономерностей этого процесса позволит найти способы управления специфичностью развивающихся Т-клеток, - а значит, с одной стороны, научиться лечить аутоиммунные заболевания, а с другой стороны, сделать аутоиммунитет действительно полезным для лечения опухолей. Таким образом, изучение селекции аутореактивных TCR, присутствующих в репертуаре нормальных животных, является актуальным направлением современной иммунологии. Используя метод получения Т-гибридом в нашей лаборатории удалось попучить Т-гибридомы, экспрессирующие аутореактивные TCR, из репертуара Т-клеток CD8+ мышей дикого типа C57BL/6. TCR полученых гибридом обладали двойной специфичностью, способных распознавать аллогенные молекулы Kbm3 МНС класса I и сингенные молекулы А МНС класса II в присутствие корецептора CD4 [Побезинский Л.А., 2004].

Целью данной работы является исследование природы аутореактивных Т клеток и механизмов избегания ими негативной селекции. С целью выяснить это в работе были поставлены следующие задачи:

1. Определить а и |3 цепи Т- клеточных рецепторов аутореактивных гибридом и проанализировать их CDR районы.

2. Определить специфичность TCR аутореактивных гибридом путем создания трансфектантов на основе линии тимомы 4G4, эскпресирующих а и (3 цепи TCR полученных аутоиммунных гибридом в паре с корецепторами CD4 и CD8.

3. Выяснить роль корецептора CD4 в распознавании молекул МНС класса I.

4. Создать трансгенных животных, экспрессирующих TCR аутореактивной гибридомы 7. /

5. Провести иммунофенотипирование и функциональный анализ Т клеток мышей, трансгенных по TCR ауторективной гибридомы 7.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Иммунная система служит средством защиты организма от чужеродных агентов- вирусов, бактерий, грибов. Т и В-лимфоциты составляют основу адаптивного иммунного ответа. Т- клетки несут на своей поверхности рецепторы, позволяющие им распознавать антигены, процессированные в антигенпрезентирующих клетках (АРС — дендритных клетках, В-клетках и макрофагах) и представленные в виде пептидов, связанных в комплексы с молекулами главного комплекса гистосовместимости (МНС). Т- и В-лимфоциты обладают свойствами, отличающими их от Т-клеток врожденного иммунитета. Во-первых, они клональны, то есть, каждый клон, например, Т-лимфоцитов, имеет уникальный TCR, образованный путем случайной реаранжировки генных сегментов. Во-вторых, в ходе процессов позитивной и негативной селекции формируются лимфоциты, толерантные к собственным антигенам организма, но способные реагировать на чужеродные. В-третьих, лимфоциты обладают "иммунологической памятью", обеспечивающей более быстрый и эффективный ответ при вторичной встрече с тем же антигеном. Т-лимфоциты подразделяют на подклассы в зависимости от фенотипа и выполняемых ими функций. Цитотоксические Т-лимфоциты (CTL) несут на своей поверхности корецептор CD8 и осуществляют прямой антигенспецифический лизис инфицированных клеток. Т-хелперы (Th) экспрессируют на поверхности корецептор CD4 и участвуют в активации макрофагов, дендритных клеток, В клеток, в некоторых случаях, CD8+ клеток. Корецепторы представляют собой гликопротеиды, содержащие иммуноглобулиноподобные домены. Молекулы CD4 экспрессируются в мономерной форме, a CD8 в виде гомо- или гетеродимеров (CD8aa или CD8aP). Внеклеточная часть этих белков имеет сайты связывания с молекулами МНС, причём CD4 связывается с молекулами MTIC класса II, а CD8 связывается с молекулами МНС класса I.

Заключение диссертации по теме «Онкология», Звездова, Екатерина Сейрулловна

выводы j L.

1. В периферическом пуле Т клеток CD8 мышей C57BL/6(H-2 ) дикого типа присутствуют аутореактивные Т клетки, распознающие сингенные молекулы МНС класса II. Часть этих клеток экспрессирует два TCR, один из которых способен к распознаванию аллогенной молекулы МНС класса I, в то время как другой-сингенной молекулы МНС класса II. Другая часть клеток экспрессирует один TCR, обладающий двойной специфичностью в распознавании аллогенной молекулы МНС класса I и сингенной молекулы МНС класса II.

2. Корецептор CD4 может замещать корецептор CD8 Т клеток в ответе на молекулу МНС класса I. При экспрессии обоих корецепторов на поверхности Т-клетки наблюдается функциональное доминирование корецептора CD4 над корецептором CD8.

3. Ограничение разнообразия Т-клеток по а-цепи TCR Vail приводит к усилению ответа репертуара Т-лимфоцитов на молекулу Kd МНС класса I и угнетению ответа на молекулы МНС линий мышей bml, ЬтЗ, Ьт12. Наблюдаемый эффект обусловлен врожденным предпочтением вариабельных регионов TCR к взаимодействию с аллельными формами молекул МНС.

4. У мышей с трансгенной экспрессией а-цепи аутореактивного TCR наблюдается селекция Т-клеток CD4 с фенотипом клеток высокоафинных к собственным лигандам.

БЛАГОДАРНОСТИ Я глубоко благодарна своему научному руководителю -Казанскому Д.Б. - за мудрое руководство и всестороннюю помощь на всех этапах работы. Я очень признательна Побезинскому Л.А. и Побезинской Е.Л., обучивших меня многим методам и оказывававшим всестороннюю поддержку на всем протяжении работы.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Главной задачей данной работы было изучение принципов селекции аутоиммунных Т-клеток у мышей дикого типа C57BL/6. Мы предположили, что в Т-клетках CD4+, получивших слишком сильный сигнал, вызванный взаимодействием TCR с собственными молекулами МНС класса II в тимусе, \ происходит замена экспрессии корецептора CD4 на CD8, что приводит к дифференцировки их в цитотоксические Т-клетки. Таким образом, в периферическом пуле Т-клеток CD8+ должны существовать аутореактивные Т-клетки, способные распознавать сингенные молекулы МНС класса II.

В нашей лаборатории были получены Т-гибридомы из клеток CD8+, экспрессирующие TCR, аутореактивные к молекулам МНС класа II в присутсвие корецептора CD4. Гены TCR были клонированы и секвенированы, определена их специфичность. Нами было выяснено, что часть из полученных гибридом экспрессируют два TCR, каждый из которых обладает индивидуальной специфичностью: один-к сингенным молекулам Аь МНС класса II, второй-к аллогенным молекулам

Kbm3 МНС класса I. Экспрессия двух TCR, обладающих индивидуальной специфичностью, по-видимому, помогает аутореактивным Т-клеткам избежать негативной селекции.

Изучая специфичность и рестрикцию TCR гибридомы клеток памяти 1D1 на трансфектантах линии 4G4, было обнаружено необычное свойство корецептора CD4. Оказалось, что корецептор CD4 не менее эффективно способствует активации трансфектантов, специфичных к молекуле МНС класса I, чем CD8. При одновременной экспрессии обоих корецепторов на поверхности трансфектанта мы наблюдали эффект функционального доминирования корецептора CD4 над корецептором CD8 за проведение сигнала через TCR.

Впервые в России мы создали мышей с трансгенной экспрессией а-цепи аутореактивного TCR. Было установлено, что у таких мышей около 90% Т-клеток экспрессируют исследуемую а-цепь. На периферию у таких животных селектируются Т-клетки CD4+, CD8+ и DN. Нами было обнаружено, что на Т-клетках CD4+ обнаруживается повышенная экспрессия ингибиторов костимуляции PD-1h CTLA-4, а также повышенная экспрессия молекул CD5, что говорит о том, что данные Т-клетки экспрессируют TCR, высокоавидный к «своему».

Исследуя функциональные особенности Т-клеток трансгенных мышей, мы выяснили, что ограничение разнообразия Т-клеток по а-цепи TCR Val 1 приводит к усилению ответа репертуара Т-лимфоцитов на молекулу Kd МНС класса I и угнетению ответа на молекулы МНС линий мышей bml, ЬтЗ, Ьт12. Таким образом, а-цепь TCR существенно влияет на его специфичность к аллельным вариантам молекул МНС. Причем наблюдаемый эффект обусловлен врожденным предпочтением вариабельных регионов TCR к взаимодействию с аллельными формами молекул МНС, так как при переводе мышей 7Altg на линию мышей ЬтЗ, отличающейся от линии мышей C57BL/6 двумя точечными мутациями в молекуле L к°мнс класса I, специфичность Т-клеток трансгенных животных 7Altg(H-2bm3) в отношении аллогенных молекул МНС осталась той же.

Таким образом в данной работе были выяснены возможные принципы внутритимусной селекции аутоиммунных Т-клеток и их миграции на периферию и детально исследована роль а-цепи TCR в формировании специфичности TCR к антигенам. Все это может иметь важное значение для выяснения способов управления специфичностью развивающихся Т-клеток и способов лечения как аутоиммунных заболеваний, так и онкологических заболеваний.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Звездова, Екатерина Сейрулловна, 2008 год

1. Казанский Д.Б., Петрищев В.Н., Штиль А.А., и др. Использование теплового шока антигенпрезентирующих клеток для функционального тестирования аллоспецифических Т-клеток памяти.// Биоорг. Химия. 1996 Т. 256 С. 117-128.

2. Побезинский Л.А. 2003. Иммунорегуляторные аспекты взаимодействия Т-клеточного рецептора с естественными и искусственно синтезированными лигандами. Автореферат.

3. Гриненко Т.С. 2005. Изучение функциональных особенностей и антигенспецифических рецепторов клеток памяти CD8+. Автореферат

4. Abarrategui I, Krangel MS. 2006. Regulation of T cell receptor-alpha gene recombination by transcription. Nat Immunol. V.l0:1109-15.

5. Aebischer T, Oehen S, Hengartner H. 1990. Preferential usage of V alpha 4 and V beta 10 T cell receptor genes by lymphocytic choriomeningitis virus glycoprotein-specific H-2Db-restricted cytotoxic T cells. Eur J Immunol. 20(3):523-31.

6. Al-Alwan M.M., Rowden G., Lee T.D., West K.A. 2001. The dendritic cell cytoskeleton is critical for the formation of the immunological synapse. ./. Immunol. V. 166. P. 1452-1456

7. Anderson MS, Venanzi ES, Klein L, Chen Z, Berzins SP, Turley SJ, von Boehmer H, Branson R, Dierich A, Bcnoist C, Mathis D. 2002. Projection of an immunological self shadow within the thymus by the aire protein. Science. Nov 15;298:1395-401.

8. Anderson M.K. 2006. At the crossroads: diverse roles of early thymocyte transcriptional regulators. Immunol Rev. 209, 191—211.

9. Arsov I, Vukmanovic S. 1999. Dual MHC class I and class II restriction of a single T cell receptor: distinct modes of tolerance induction by two classes of autoantigens. J Immunol. 1999 162(4):2008-15.

10. Azzam H. S, Alex Grinberg, Kin Lui, Howard Shen, Elizabeth W. Shores, and Paul E. Love. CD5 Expression Is Developmentally Regulated By T Cell Receptor (TCR) Signals and TCR Avidity. 1998. J. Exp. Med., V. 188, 2301-2311.

11. Azzam, H. S., J. B. DeJarnettc, K. Huang, R. Emmons, C. S. Park, C. L. Sommers, D. El-Khoury, E. W. Shores, P. E. Love. 2001. Fine tuning of TCR signaling by CD5.,J. Immunol. V.166: 5464-5472.

12. Bachmann M. B. A Oxenius, TW Мак, and RM Zinkernagel. 1995. T cell development in CD8-/- mice. Thymic positive selection is biased toward the helper phenotype. J Immunol. 155: 3727-3733.

13. Baldwin ТА, Sandau MM, Jameson SC, Hogquist KA. The timing of TCR alpha expression critically influences T cell development and selection. J Exp Med. 2005 V.202(l):lll-21.

14. Bennett CL, Ochs HD. 2001. IPEX is a unique X-linked syndrome characterized by immune dysfunction, polyendocrinopathy, enteropathy, and a variety of autoimmune phenomena. Curr Opin Pediatr. 13 V.(6):533-8.

15. Benoist, C. and Mathis, D. 2001. Autoimmunity provoked by infection: how good is the case for T cell epitope mimicry? Nature Immunol. ,V.9, p.797-801

16. Blank C, Brown I, Marks R, Nishimura H, Honjo T, Gajewski TF. 2003. Absence of programmed death receptor 1 alters thymic development and enhances generation of CD4/CD8 double-negative TCR-transgenic T cells. J Immunol. V.171(9):4574-81.

17. Bogue M, Gilfillan S, Benoist C, Mathis D. 1992. Regulation of N-region diversity in antigen receptors through thymocyte differentiation and thymus ontogeny. Proc Natl Acad Sci U SA, Nov 15;89(22): 11011-5

18. Boissier MC, Carlioz A, Fournier C. 1988. Experimental autoimmune arthritis in mice. II. Early events in the elicitation of the autoimmune phenomenon induced by homologous type II collagcn. Clin Immunol Immunopathol. 48(2):225-37.

19. Peptide: Evidence for a Dominant Role of a Germline-encoded V Region in Antigen/Major Histocompatibility Complex Recognition. J. Exp. Med. V. 175, p. 765-777

20. Bouneaud C., Philippe Kourilsky, and Philippe Bousso. 2000. Impact of Negative Selection on the T Cell Repertoire Reactive to a Self-Peptide: A Large Fraction of T Cell Clones Escapes Clonal Deletion. Immunity., V.13., 829-840

21. Borowski Christine, Xiaoyan Li, Iannis Aifantis, Fotini Gounari, and Harald von Boehmer. 2004. Pre- TCRa and TCRa are not interchangeable partners of TCRp during T lymphocyte development. J. Exp. Med, V. 199, N.5, 607-615

22. Bosselut R, Feigenbaum L, Sharrow SO, Singer A. 2001. Strength of signaling by CD4 and CD8 coreceptor tails determines the number but not the lineage direction of positively selected thymocytes. Immunity. Apr;14(4):483-94.

23. Bouneaud C, Kourilsky P, Bousso P. 2000. Impact of negative selection on the T cell repertoire reactive to a self-peptide: a large fraction of T cell clones escapes clonal deletion. Immunity. Dec;13(6):829-40.

24. Bour-Jordan H, Salomon BL, Thompson IIL, Santos R, Abbas AK, Bluestone JA. 2007. Constitutive expression of B7-1 on В cells uncovers autoimmunity toward the В cell compartment in the nonobese diabetic mouse. J Immunol. V.l 79(2): 1004-12.

25. Bruno L., Hans Jorg Fehling, and Harald von Boehmer. 1996. The сф T Cell Receptor Can Replace the y8 Receptor in the Development of y5 Lineage Cells. Immunity. V.5 (4) 343

26. Budd RC, Mixter PF. 1995. The origin of CD4-CD8-TCR alpha beta+ thymocytes: a model based on T-cell receptor avidity. Immunol Today. 16(9):428-31.

27. Buch T, Rieux-Laucat F, Forster I, Rajewsky K. 2002. Failure of HY-specific thymocytes to escape negative selection by receptor editing. Immunity. May;16(5):707-18.

28. Burns R.P., Kannan Natarajan, Nicola J.H. LoCascio,David P. O'Brien, Joan A. Kobori.Nilabh Shastri, Richard K. Barth. 1998. Molecular analysis of skewed Tcra-V gene use in T-cell receptor b-chain transgenic mice. Immunogenetics 47: 107-114

29. Cabaniolis Jean-Pierre, Nicolas Fazilleau, Armanda Casrouge, Philippe Kourilsky, and Jean M. Kanellopoulos. 2001. Most a/13 T Cell Receptor Diversity Is Due to Terminal Deoxynucleotidyl Transferase. J. Exp. Med., Nov; 194: 1385 1390.

30. Casrouge, A., E. Beaudoing, S. Dalle, C. Pannetier, J. Kanellopoulos, and P. Kourilsky. 2000. Size estimate of the alpha beta TCR repertoire of naive mouse splenocytes. J. Immunol. 164:5782-5787.

31. Chambers C. A., Dragana Cado, Thien Truong, and James P. Allison. 1997. Thymocyte development is normal in CTLA-4-deficient mice. Proc. Natl. Acad. Sci. USA Vol. 94, pp. 9296-9301.

32. Chao DL, Davenport MP, Forrest S, Perelson AS. 2005. The effects of thymic selection on the range of T cell cross-reactivity. Eur J Immunol. V. 12,p.3452-9

33. Chi TH, Wan M, Zhao K, Taniuchi I, Chen L, Littman DR, Crabtree GR. 2002. Reciprocal regulation of CD4/CD8 expression by SWI/SNF-like BAF complexes. Nature. Jul 11;418(6894): 195-9.

34. Chmielowski В, Muranski P, Ignatowicz L. 1999. In the normal repertoire of CD4+ T cells, a single class II МНС/peptide complex positively selects TCRs with various antigen specificities. J Immunol. Jan 1;162(1):95-105

35. Correia-Neves M, Mathis D, Benoist C. 2001. A molecular chart of thymocyte positive selection. Eur J Immunol. Sep;31(9):2583-92

36. Coss R.A., Linnemans W.A. 1996. The effects of hyperthermia on the cytoskeleton. Int. J. Hyperthermia. V. 12. P. 173-96

37. Curtsinger J. M., Debra C. Lins, Christopher M. Johnson, and Matthew F. Mescher. 2005. Signal 3 Tolerant CD8 T Cells Degranulate in Response to Antigen but Lack Granzyme В to Mediate Cytolysis. The Journal of Immunology, 2005, 175: 4392-4399.

38. Dent Alexander L., Fink Pamela J., Hedrick Stephan M. 1989. Characterization of an alternative exon of the murine T cell receptor beta-chain. Pattern of expression and evolutionary conservation J Immunol,, V. 143, N.l, 322-328

39. Derbinski J, Pinto S, Rosch S, Ilexel K, Kyewski B. 2008. Promiscuous gene expression patterns in single medullary thymic epithelial cells argue for a stochastic mechanism. Proc Natl Acad Sci USA. 105(2):657-62.

40. Ding YH, Smith KJ, Garboczi DN, Utz U, Biddison WE, Wiley DC. 1998 Two human T cell receptors bind in a similar diagonal mode to the IILA-A2/Tax peptide complex using different TCR amino acids. Immunity. Apr;8(4):403-11.

41. Dudley DD, Sekiguchi J, Zhu C, Sadofsky MJ, Whitlow S, DeVido J, Monroe RJ, Bassing CH, Alt FW. 2003. Impaired V(D)J recombination and lymphocyte development in core RAG 1-expressing mice. J Exp Med. Nov 3;198(9): 1439-50.

42. Delaire S, Huang YH, Chan SW, Robey EA. 2004. Dynamic repositioning of CD4 and CD8 genes during T cell development. J Exp Med. Dec 6;200(11):1427-35.

43. Egawa Т., Tillman R.E., Naoe Y., Taniuchi I., Littman D.R. 2007. The role of the Runx transcription factors in thymocyte differentiation and in homeostasis of naive T cells. J Exp Med. 204, 1945-1957.

44. Ellmeier Wilfried., Sawada Shinichiro, Littman Dan R. 1999. The regulation of CD4 and CDS coreccptor gene expression during T cell development. Annu. Rev. Immunol.,, V. 17, 523554

45. Erman В, Feigenbaum L, Coligan JE, Singer A. 2002. Early TCRalpha expression generates TCRalphagamma complexes that signal the DN-to-DP transition and impair development. Nat ImmunolV.3(6):564-9

46. Filipp D, Zhang J, Leung BL, Shaw A, Levin SD, Veillette A, Julius M. 2003. Regulation of Fyn through translocation of activated Lck into lipid rafts. ./ Exp Med. May 5;197(9): 1221-7.

47. Filipp D, Leung BL, Zhang J, Veillette A, Julius M. 2004. Enrichment of lck in lipid rafts regulates colocalized fyn activation and the initiation of proximal signals through TCR alpha beta. J Immunol. Apr l;172(7):4266-74.

48. Fournier C. 2005 K/BxN T-cell-receptor transgenic mice Where do T cells stand in rheumatoid arthritis? Joint Bone Spine. 72(6):527-32.

49. Furmanski AL, Ferreira C, Bartok I, Dimakou S, Rice J, Stevenson FK, Millrain MM, Simpson E, Dyson J. 2008. Public T cell receptor beta-chains are not advantaged during positive selection. J Immunol. 180(2): 1029-39

50. Garcia КС, Degano M, Pease LR, Huang M, Peterson PA, Teyton L, Wilson IA. 1998. Structural basis of plasticity in T cell receptor recognition of a self peptide-МНС antigen. Science. Feb 20;279(5354):1166-72.

51. Gavin MA, Bevan MJ. 1995 Increased peptide promiscuity provides a rationale for the lack of N regions in the neonatal T cell repertoire. Immunity. Dec;3(6):793-800

52. Gerdes Tobias& Matthias Wabl. 2004. Autoreactivity and allclic inclusion in а В cell nuclear transfer mouse. Nature Immunology 5, 1282-1287

53. Germain R., N. 2002. T cell development and the CD4-CD8 lineage decision. Nature, V. 2, 309-322

54. Gilfillan S, Waltzinger C, Benoist C, Mathis D. 1994. More efficient positive selection of thymocytes in mice lacking terminal deoxynucleotidyl transferase. Int Immunol. Nov;6(l l):1681-6

55. Goldrath AW, Hogquist KA, Bevan MJ. 1997. CD8 lineage commitment in the absence of CD8. Immunity. May;6(5):633-42.

56. Goldrath A. W., Bevan M. J. 1999. Selecting and maintaining a diverse T- cell repertoire. Nature, V.402, 255-262

57. Guo Jian, Abbas Hawwari, Hong Li, Zuoming Sun, Sanjeev K. Mahanta, Dan R. Littman, Michael S. Krangel, You-Wen He. 2002. Regulation of the TCR repertoire by the survival window of CD4+CD8+ thymocytes. Nature Immunology,3, 469 476

58. Haks MC, Lefebvre JM, Lauritsen JP, Carleton M, Rhodes M, Miyazaki T, Kappes DJ, Wiest DL. Attenuation of gammadeltaTCR signaling efficiently diverts thymocytes to the alphabeta lineage.Immunity. 2005 May;22(5):595-606

59. Hawwari A. &Krangel M.S. 2007. Role for rearranged variable gene segments in directing secondary T cell receptor alpha recombination. PNAS, V. 104(3):903-7.

60. Hayday A. C. 2000. Cells: A right time and a right place for a conserved third way of protection. Annu. Rev. Immunol, V. 18, 975- 1026

61. Hayes SM, Li L, Love PE. TCR signal strength influences alphabeta/gammadelta lineage fate. Immunity. 2005 May;22(5):583-93

62. He X., Kappes D.J. 2006. CD4/CD8 lineage commitment: light at the end of the tunnel? Curr Opin Immunol. 18, 135—142.

63. Heath WR, Carbone FR, Bertolino P, Kelly J, Cose S, Miller JF. . 1995. Expression of two T cell receptor alpha chains on the surface of normal murine T cells. Eur J Immunol. V. 25(6): 1617-23.

64. Hedrick S. M. 2002. T cell development: bottoms- up. Immunity,V. 16, 619- 622

65. Hernandez-Hoyos G, Sohn SJ, Rothenberg EV, Alberola-Ila J. 2000. Lck activity controls CD4/CD8 T cell lineage commitment. Immunity. Mar; 12(3):313-22.

66. Hernandez-Hoyos G, Anderson MK, Wang C, Rothenberg EV, Alberola-Ila J. 2003. GATA-3 expression is controlled by TCR signals and regulates CD4/CD8 differentiation. Immunity. Jul;19(l):83-94.

67. He X, Janeway CA Jr, Levine M, Robinson E, Preston-Hurlburt P, Viret C, Bottomly K. 2002. Dual receptor T cells extend the immune repertoire for foreign antigens. Nat Immunol. Feb;3(2): 127-34

68. He X, He X, Dave VP, Zhang Y, Hua X, Nicolas E, Xu W, Roe BA, Kappes DJ. 2005. The zinc finger transcription factor Th-POK regulates CD4 versus CD8 T-cell lineage commitment. Nature. Feb 24;433(7028):826-33.

69. Ho I.C, Glimcher LH. 2002. Transcription: tantalizing times for T cells. Cell. Apr; 109 Suppl:S 109-20.

70. Hogquist KA. 2001. Signal strength in thymic selection and lineage commitment. Curr Opin Immunol. Apr;13(2):225-31.

71. Hsu Lih-Yun, Josh Lauring, Hong-Erh Liang, Stephen Greenbaum, Dragana Cado, Yuan Zhuang, and Mark S. Schlissel. 2003. A Conserved Transcriptional Enhancer Regulates RAG Gene Expression in Developing В Cells. Immunity, V.19,105-117

72. Huang Ching-Yu & Osami Kanagawa. 2001. Ordered and coordinated rearrangement of the TCRa Locus: role of secondary rearrangement in thymic selection. J Immunol., V.166, 2597-2601

73. Huseby ES, Crawford F, White J, Kappler J, Marrack P. 2003. Negative selection imparts peptide specificity to the mature T cell repertoire. Proc Natl Acad Sci USA. Sep 30;100(20):11565-70.

74. Huseby E. S., Janice White, Frances Crawford, Tibor Vass, Dean Becker, Clemencia Pinilla, Philippa Marrack, and John W. Kappler. 2005. How the T Cell Repertoire Becomes Peptide and MHC Specific. Cell. V. 122: 247-260

75. Janeway C. A., Travers P., Walport M., Capra J.D. 1999. Immunobiology. The immune system in health and disease.

76. Johnson NA, Carland F, Allen PM, Glimcher LH. 1989 T cell receptor gene segment usage in a panel of hen-egg white lysozyme specific, I-Ak-restricted T helper hybridomas.J/mmM«o/.V142(9):3298-304.

77. Kang J, Raulet DH. 1997. Events that regulate differentiation of alpha beta TCR+ and gamma delta TCR+ T cells from a common precursor. Semin Immunol. V.9(3): 171-9.

78. Kang J, Fehling HJ, Laplace C, Malissen M, Cado D, Raulet DH. 1998. T cell receptor gamma gene regulatory sequences prevent the function of a novel TCRgamma/pTalpha pre-T cell receptor. Immunity. V. 8(6):713-21.

79. Karges W, Rajasalu T, Spyrantis A, Wieland A, Boehm B, Schirmbeck R. 2007. The diabetogenic, insulin-specific CD8 T cell response primed in the experimental autoimmune diabetes model in RIP-B7.1 mice. Eur J Immunol. 37(8):2097-103

80. Keir ME, Liang SC, Guleria I, Latchman YE, Qipo A, Albacker LA, Koulmanda M, Freeman GJ, Sayegh MH, Sharpe AH. 2006. Tissue expression of PD-L1 mediates peripheral T cell tolerance. J Exp Med. V. 203(4):883-95.

81. Keir ME, Freeman GJ, Sharpe AH. 2007. PD-1 regulates self-reactive CD8+ T cell responses to antigen in lymph nodes and tissues. J.Immunol. V.179(8):5064-70

82. Kouskoff V., Kathy Signorelli , Christophe Benoist, Diane Mathis. 1995. Cassette vectors directing expression of T cell receptor genes in transgenic mice. J Immunol Methods. Mar 27;180(2):273-80

83. Lacorazza HD, Tucek-Szabo C, Vasovic LV, Remus K, Nikolich-Zugich J. 2001. Premature TCR alpha beta expression and signaling in early thymocytes impair thymocyte expansion and partially block their development J Immunol. V.166(5):3184-93

84. Lacorazza H. D. and Janko Nikolich-Zugich. 2004. Exclusion and Inclusion of TCR Proteins during T Cell Development in TCR-Transgenic and Normal Mice. J Immunol., 173: 55915600

85. Leiter EH. Curr Protoc Immunol. 2001 The NOD mouse: a model for insulin-dependent diabetes mellitus. Chapter 15:Unit 15.9.

86. Leng Q, Ge Q, Nguyen T, Eisen HN, Chen J. 2007. Stage-dependent reactivity of thymocytes to self-peptide-MHC complexes. Proc Natl Acad Sci USA. V. 104(12):5038-43.

87. Li QJ, Chau J, Ebert PJ, Sylvester G, Min H, Liu G, Braich R, Manoharan M, Soutschek J, Skare P, Klein LO, Davis MM, Chen CZ. 2007. miR-181a is an intrinsic modulator of T cell sensitivity and selection Cell. Apr 6; 129(1): 147-61

88. Liston A, Lesage S, Wilson J, Peltonen L, Goodnow CC. 2003. Aire regulates negative selection of organ-specific T cells. Nat Immunol. Apr;4(4):350-4.

89. Liu X. & Bosselut R. 2004. Duration of TCR signaling controls CD4-CD8 lineage differentiation in vivo. Nat. Immunology, V. 5, N. 3, 280- 288.

90. Logunova NN, Viret C, Pobezinsky LA, Miller SA, Kazansky DB, Sundberg JP, Chervonsky AV. 2005. Restricted МНС-peptide repertoire predisposes to autoimmunity. J Exp Med. Jul 4;202(l):73-84.

91. Magalhaes DA, Silveira EL, Junta CM, Sandrin-Garcia P, Fachin AL, Donadi EA, Sakamoto-Hojo ET, Passos GA. 2006. Promiscuous gene expression in the thymus: the root of central tolerance. Clin Dev Immunol. 13(2-4):81-99.

92. Mason D.1994. Allelic exclusion of alpha chains in TCRs.Jnt.ImunoL V.6, N.6, pp881-885

93. Masuda K., Manami Itoi, Takashi Amagai, Nagahiro Minato, Yoshimoto Katsura and Hiroshi Kawamoto. 2005. Thymic Anlage Is Colonized by Progenitors Restricted to T, NK, and Dendritic Cell Lineages. The Journal of Immunology, V. 174: 2525-2532.

94. Merkenschlager M, Graf D, Lovatt M, Bommhardt U, Zamoyska R, Fisher AG. 1997. How many thymocytes audition for selection? J Exp Med. Oct 6;186(7):1149-58

95. Merkenschlager M, Amoils S, Roldan E, Rahemtulla A, O'connor E, Fisher AG, Brown KE. 2004. Centromeric repositioning of coreceptor loci predicts their stable silencing and the CD4/CD8 lineage choice. J Exp Med. Dec 6;200(11): 1437-44.

96. Munir Alam S. and Nicholas R. J. Gascoigne. 1998. Posttranslational Regulation of TCR V Allelic Exclusion During T Cell Differentiation. J Immunol. 160: 3883-3890

97. Nishimura H, Nose M, Hiai H, Minato N, Honjo Т. 1999Development of lupus-like autoimmune diseases by disruption of the PD-1 gene encoding an ITIM motif-carrying immunoreceptor. Immunity. V. 11 (2): 141 -51.

98. Nishimura H, Okazaki T, Tanaka Y, Nakatani К, Нага M, Matsumori A, Sasayama S, Mizoguchi A, Hiai H, Minato N, Honjo T. 2001. Autoimmune dilated cardiomyopathy in PD-1 receptor-deficient mice. Science. V.291(5502):319-22.

99. Ono Т., Teresa P. DiLorenzo, Fuming Wang, Alexis M. Kalergis, and Stanley G. Nathenson. 1998. Alterations in TCR-MHC Contacts Subsequent toCross-Recognition of Class I MHC and Singly Substituted Peptide Variants. Journal of Immunology, 161: 5454-5463.

100. Padovan E, Casorati G, Dellabona P, Meyer S, Brockhaus M, Lanzavecchia A. 1993. Expression of two T cell receptor alpha chains: dual receptor T cells. Science. V.262:422-4.

101. Phadke K, Fouts R, Parrish J, Baker RS. 1984. Autoreactivity to collagen in a murine lupus model. Arthritis Rheum. 27(3):313-9

102. Punt JA, BA Osborne, Y Takahama, SO Sharrow, and A Singer .1994. Negative selection of CD4+CD8+ thymocytes by T cell receptor-induced apoptosis requires a costimulatory signal that can be provided by CD28. J. Exp. Med. 179: 709-713

103. Regner, M. and Lambert, P. II. 2001. Autoimmunity through infection or immunization? Nature Immunol., V.3, p. 185-188.

104. Robey E. The alphabeta versus gammadelta T cell fate decision: when less is more. Immunity. 2005 May;22(5):533-4

105. Robey, E. & Fowlkes, B. J. Selective events in T-cell development. Annu. Rev. Immunol. V.12, p.675-705 (1994).

106. Rock EP, Sibbald PR, Davis MM, Chien YH. . 1994. CDR3 length in antigen-specific immune receptors. J Exp Med. 1994 Jan l;179(l):323-8.

107. Salmon P, Mong M, Kang XJ, Cado D, Robey E. 1999. The role of CD8 alpha' in the CD4 versus CD8 lineage choice. J Immunol. Nov 15;163(10):5312-8.

108. Sant'Angelo DB, Cresswell P, Janeway С A Jr, Denzin LK. 2001. Maintenance of TCR clonality in T cells expressing genes for two TCR heterodimers. Proc. Natl. Acad. Sci. 98(12):6824-9.

109. Sarukhan A., Corinne Garcia, Astrid Lanoue, and Harald von Boehmer. 1998. Allelic Inclusion of T Cell Receptor a Genes Poses an Autoimmune Hazard Due to Low-Level Expression of Autospecific Receptors. Immunity, V.8, 563-570

110. Schwartz RH. 2003. T cell anergy. Annu Rev Immunol. V. 21:305-34.

111. Sharpe AH, Freeman GJ. 2002. The B7-CD28 superfamily. Nat Rev Immunol. Feb;2(2): 116-26.

112. Sim Bee- Cheng, Najla Aftahi, Christina Reilly, Bjarne Bogen, Ronald H. Schwartz, Nicholas R. J. Gascoigne and David Lo. 1998a. Thymic skewing of the CD4/CD8 ratio maps with the T cell receptor a chain locus. Curr. Biol., 8: 701-704.

113. Sim Bee- Cheng, David Lo, Nicholas R. J. Gascoigne, 1998b. Preferential expression of TCR Va regions in CD4/CD8 subsets: class discrimination or coreceptor recognition? Immunol Today 19(6):276-82

114. Sim Bee- Cheng, Jay L. Wung, and Nicholas R. J. Gascoigne. 1998. Polymorphism Within a TCRAV Family Influences the Repertoire Through Class l/II Restriction. J Immunol. 160: 1204-1211

115. Sim Bee-Cheng and Nicholas R. J. Gascoigne. 1999. Reciprocal Expression in CD4 or CD8 Subsets of Different Members of the Vo-11 Gene Family Correlates with Sequence Polymorphism. J Immunol. 162: 3153-3159

116. Subudhi SK, Zhou P, Yerian LM, Chin RK, Lo JC, Anders RA, Sun Y, Chen L, Wang Y, Alegre ML, Fu YX. 2004 Local expression of B7-H1 promotes organ-specific autoimmunity and transplant rejection. J Clin Invest. V.l 13(5):694-700.

117. Takahama Y., A Kosugi, and A Singer. 1991. Phenotype, ontogeny, and repertoire of CD4-CD8- T cell receptor alpha beta + thymocytes. Variable influence of self-antigens on T cell receptor V beta usage. J Immunol. 146: 1134-1141

118. Tarakhovsky, A., S. B. Kanner, J. Hombach, J. A. Ledbetter, W. Muller, N. Killeen, K. Rajewsky. 1995. A role for CD5 in TCR-mediated signal transduction and thymocyte selection. Science 269: 535-537

119. Teh HS, Kishi H, Scott B, Von Boehmer H. 1989. Deletion of autospecific T cells in T cell receptor (TCR) transgenic mice spares cells with normal TCR levels and low levels of CD8 molecules. J Exp Med. V. 169(3):795-806.

120. Torres-Nagel N, Deutschlander A, Herrmann T, Arden B, Hunig T. 1997. Control of TCR V alpha-mediated positive repertoire selection and alloreactivity by differential J alpha usage and CDR3 alpha composition. Int Immunol. 0ct;9(10): 1441-52.

121. Torres-Nagel N, Mehling B, LeRolle AF, Joly E, Hunig T. 2001. Genetic control of peripheral TCRAV usage by representation in the preselection repertoire and MHC allele-specific overselection. Int Immunol. Jan;13(l):63-73

122. Tyznik AJ, Sun JC, Bevan MJ. 2004. The CD8 population in CD4-deficient mice is heavily contaminated with MHC class II-restricted T cells. J Exp Med. Feb 16;199(4):559-65.

123. Uematsu Y, Donda A, De Libero G. 1997. Thymocytes control the CD4 gene differently from mature T lymphocytes. Int Immunol. Jan;9(l): 179-87.

124. Viret С, Janeway CA Jr. 2003. Self-specific MHC class II-restricted CD4-CD8- T cells that escape deletion and lack regulatory activity. J Immunol. Jan l;170(l):201-9.161. von Boehmer H. 1994. Positive selection of lymphocytes. Cell V. 76: 219-228.

125. Wada H, Masuda K, Satoh R, Kakugawa K, Ikawa T, Katsura Y, Kawamoto H. 2008. Adult T-cell progenitors retain myeloid potential. Nature. V.452(7188):768-72

126. Waterhousc P, Penninger JM, Timms E, Wakeham A, Shahinian A, Lee KP, Thompson CB, Griesser H, Мак TW. 1995. Lymphoproliferative disorders with early lethality in mice deficient in Ctla-4. Science. V. 270(5238):985-8.

127. Wucherpffennig Kay W. 2004. T cell receptor crossreactivity as a general property of T cell recognition. Mol. Immunology, V. 40, 1009-1017

128. Yan J. and Mamula M. J., 2002 Autoreactive T cells revealed in the normal repertoire: escape from nagative selection and peripheral tolerance. J Immunol. V. 168, 3188-3194

129. Yanagi Y, Maekawa R, Cook T, KanagawaO, Oldstone MB. 1990. Restricted V-segment usage in T-cell receptors from cytotoxic T lymphocytes specific for a major epitope of lymphocytic choriomeningitis virus. J Virol. Dec;64(12):5919-26

130. Yasutomo К, Doyle С, Miele L, Fuehs C, Germain RN. 2000. The duration of antigen receptor signalling determines CD4+ versus CD8+ T-cell lineage fate. Nature. 404(6777):506-10.

131. Yoshida T, Jiang F, Honjo T, Okazaki T. 2008. PD-1 deficiency reveals various tissue-specific autoimmunity by H-2b and dose-dependent requirement of H-2g7 for diabetes in NOD mice. Proc Natl Acad Sci USA. V.105(9):3533-8.

132. Yu Q, Erman B, Bhandoola A, Sharrow SO, Singer A. 2003. In vitro evidence that cytokine receptor signals are required for differentiation of double positive thymocytes into functionally mature CD8+ T cells. J Exp Med. Feb 17;197(4):475-87.

133. Yu W, Misulovin Z, Suh H, Hardy RR, Jankovic M, Yannoutsos N, Nussenzweig MC. 1999. Coordinate regulation of RAG1 and RAG2 by cell type-specific DNA elements 5' of RAG2. Science. Aug 13;285(5430):1080-4.

134. Zal T, Weiss S, Mellor A, Stockinger B. 1996. Expression of a second receptor rescues self-specific T cells from thymic deletion and allows activation of autoreactive effector function. Proc Natl Acad Sci USA. 93(17):9102-7

135. Zamoyska R, Basson A, Filby A, Legname G, Lovatt M, Seddon B. 2003. The influence of the sre-family kinases, Lck and Fyn, on T ccll differentiation, survival and activation.Immunol. R e v. 191:107-18.

136. Zerrahn Jens, Werner Held, and David H Raulet. 1997. The MHC Reactivity of the T Cell Repertoire Prior to Positive and Negative Selection. Cell, V. 88, 627-636