Изучение клеточной функции транскрипционного фактора E. coli GreA тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.28, кандидат биологических наук Степанова, Екатерина Викторовна

• Степанова, Екатерина Викторовна
• кандидат биологических наук
• 2009

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Степанова, Екатерина Викторовна

I. Литературный обзор

Введение

1.1 Общие сведения об РНК-полимеразах прокариот

1.2 Транскрипционные факторы GreA и GreB

1.3 Регуляция факторами, взаимодействующими с РНКП через 27 вторичный канал

Структура и функции эукариотического аналога Gre — 27 транскрипционного фактора TFIIS

Структура и функции транскрипционного фактора Gfhl — 32 гомолога Gre

Структура и функции транскрипционного фактора DksA

Структура и функции транскрипционного фактора Rnk

Структура и функции транскрипционного фактора TraR

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Изучение клеточной функции транскрипционного фактора E. coli GreA»

В настоящее время интенсивно изучаются механизмы регуляции транскрипции, основанные на модуляции каталитической активности РНК-полимеразы (РНКП). Большой интерес вызывают молекулярные механизмы действия факторов, связывающихся во вторичном канале РНКП (Рис.1). Число известных факторов этой группы постоянно растет. К ним относятся как гомологичные, так и неродственные белки со сходной пространственной организацией, которая приспособлена для связывания с ферментом. К настоящему моменту известны следующие факторы этого класса: транскрипт-расщепляющие факторы семейства вге [1, 2], обнаруженные почти во всех эубактериях; ингибитор транскрипции ОЙ11 [3], обнаруженный в микроорганизмах группы Ветососси8-Ткегти8\ глобальный регулятор системы строгого контроля ЭкзА [4, 5], осуществляющий регуляцию кооперативно с алармоном ррОрр; недавно открытый глобальный регулятор ТгаЯ [6], последовательность которого кодируется на ДНК конъюгативных плазмид широкого круга хозяев, а также фактор Япк [7].

Несмотря на обилие имеющейся информации, представления о факторах, действующих через вторичный канал, все еще остаются неполными: для некоторых из них отсутствуют структурные данные (ТгаЯ), для других остается невыясненным механизм связывания и регуляции активности РНКП (ЭкзА, ТгаК, Кпк), для третьих - не до конца установлена их биологическая роль в клетке (вгеА, ОгеВ, вШ, Япк). Очевидно, однако, что регуляция транскрипции через вторичный канал РНКП — это один из важных, эволюционно консервативных механизмов клеточной регуляции.

1.1 Общие сведения об РНК-полимеразах прокариот

ДНК-зависимая РНК-полимераза - главный фермент транскрипции в клетке, который ответственен за синтез цепи РНК, комплементарной транскрибируемой цепи ДНК-матрицы, в присутствии субстратов -рибонуклеозид-5'-трифосфатов. Мультисубъединичные РНКП эукариот, архебактерий и эубактерий гомологичны друг другу [8]. Каталитически активный кор-фермент РНКП большинства эубактерий состоит из 5 (агрр'ш) субъединиц: двух а (-36 кДа), р (-150 кДа), р' (-155 кДа) и со (-8,5 кДа) и имеет общий молекулярный вес, равный —380 кДа. Для специфической инициации транскрипции с определённой позиции ДНК-матрицы кор-фермент должен связаться с одним из факторов специфичности о (или а-субъединицей, -20-70 кДа) с образованием холо-фермента РНКП (агрр'соа) [8-12].

Структуру РНКП можно описать как глобулу эллипсоидальной формы с глубоким вырезом посередине молекулы, что придает ей сходство с клешней краба. Основанием «клешни» является димер а-субъединиц, взаимодействующие с ним участки р и р' и каталитический центр. Основная белковая масса Р и р' субъединиц образует своеобразные «зажимы», полость между которыми служит для связывания ДНК-матрицы и РНК-продукта. Удобно выделить передний и задний края фермента, взяв за основу направление движения РНКП вдоль молекулы ДНК. Соответственно, ДНК-дуплекс, входящий в полость фермента, будет называться передним, а выходящий — задним (Рис.1). Передняя часть полости разделена перегородкой на два канала: большой первичный и малый вторичный каналы [8-12].

Первичный канал (Рис. 1) служит для связывания входящего ДНК-дуплекса (длиной -15-20 пн), транскрипционного пузыря (участка ДНК длиной 12-14 пн, где происходит плавление ДНК-дуплекса) и ДНК-РНК-гетеродуплекса (длиной в 9±1 нт) (Рис.1) [13]. Для предотвращения схлопывания транскрипционного пузыря нематричная цепь удерживается элементами зажима ß, а матричная цепь ДНК направляется элементами субъединицы ß' к каталитическому центру. Каталитический центр РНКП встроен в стенку первичного канала. Он образован консервативным мотивом ß'-субъединицы NADFDGD. Три остатка Asp этого мотива (у Е. coli — Asp

0-4739, Asp-741 и Asp-743) хелатируют первый ион Mg I, необходимый для катализа. Эти остатки вместе с кислыми остатками ß-субъединицы (у Е. coli —

Glu-685 и Asp-686) также участвуют в хелатировании второго pi. каталитического иона Mg И [9, 11, 13]. ДНК-РНК-гетеродуплекс берёт своё начало от каталитического центра и, проходя по стенке первичного канала, заканчивается в задней части фермента, на перегородке, разделяющей ДНК и

РНК. Выходя из ДНК-РНК-гетеродуплекса, 5'-концевой одноцепочечный участок транскрипта (длиной в ~6 нт) поступает в канал выхода РНК. После

разделения РНК-ДНК-гетеродуплекса верхняя часть матричной цепи ДНК восстанавливает дуплекс с нематричной цепью ДНК и свободно покидает первичный канал, не вступая в дальнейшее взаимодействие с РНКП [9, 13].

Вторичный канал имеет форму воронки (Рис.1). Широкое отверстие воронки открывается на передней поверхности РНКП. Постепенно сужаясь, вторичный канал проходит внутрь фермента, и его малое отверстие открывается рядом с каталитическим центром. В нижней части полость вторичного канала отделена от первичного канала перегородкой, состоящей из элементов ¡З'Е-мост и ¡З'О-петля [9, 13]. Через вторичный канал в каталитический центр поступают субстраты, и происходит диссоциация 3'-концевого фрагмента РНК в обратно-смещенных комплексах (см. ниже). Вторичный канал также служит сайтом связывания транскрипционных факторов, рассмотренных в данном обзоре.

Транскрипция представляет собой циклический процесс, который можно разделить на три стадии: связывание РНКП промоторной ДНК и инициация синтеза РНК; процессивная элонгация цепи РНК; и терминация синтеза и диссоциация конечного продукта (полноразмерного РНК-транскрипта).

РНКП начинает новый транскрипционный цикл в виде холофермента, включающего а-субъединицу [9, 14, 15]. С ее помощью происходит узнавание и связывание промоторной последовательности ДНК. Для узнавания некоторых промоторов также необходимо участие а-субъединицы [16, 17]. После плавления ДНК-дуплекса в районе точки старта транскрипции и формирования транскрипционного пузыря начинается синтез РНК. Перед тем, как РНКП начнет процессивную элонгацию, фермент проходит стадию первичного, т.н. абортивного, синтеза транскрипта [9, 18].

Рис. 1.1 Эпонгационный комплекс (ЭК) РНКП. На рисунке схематически показано устройство ЭК, вид со стороны первичного канала. В полости первичного канала РНКП располагается каталитический центр (консервативный мотив ИАВРООО - тонкой линией, его аминокислоты хелатируют ионы М02+ I и Мц2+ II, изображенные серыми сферами), транскрипционный пузырь и ДНК-РНК-гетеродуплекс, в котором РНК изображена толстой прерывистой черной линией. Вблизи от каталитического центра открывается воронка вторичного капала (изображен как желоб серого цвета), которая отделена от первичного канала элементами рТ-мост и [З'О-петля. Передний ДНК-дуплекс связывается элементом РНКП передний ДНК связывающей зажим. Матричная цепь ДНК изображена черной толстой линией, нематричная цепь ДНК - серой. В задней части фермента расположен канал выхода РНК. В канале выхода РНК располагается эвакуируемый одноцепочсчный РПК-продукт.

На начальной стадии абортивного синтеза транскрипта кор-фермент сохраняет контакты с ст-субъединицей, а ст-субъединица - с промоторной последовательностью ДНК. В ходе синтеза, двигаясь вперёд относительно матрицы, РНКП, по-видимому, втягивает транскрибируемый участок двухцепочечной ДНК внутрь, а расплетенные одноцепочечные участки, вероятно, выпетливаются наружу. Этот процесс, т.н. сжатие (scrunching), должен сопровождаться внутренней деформацией фермента и ДНК-матрицы [19]. Накапливающееся по мере синтеза РНК упругое напряжение в инициаторном комплексе может являться источником энергии либо для высвобождения абортивного транскрипта, либо для перехода комплекса к стадии элонгации. В случае высвобождения абортивного транскрипта, продукт диссоциирует из комплекса через вторичный канал, РНКП возвращается к позиции старта и повторяет цикл заново. Количество абортивных циклов на разных промоторах может варьировать от десятка до нескольких тысяч, что может приводить к накоплению большого количества абортивных продуктов, а иногда и фактически блокировать синтез полноразмерной РНК [9, 18].

Когда длина транскрипта достигает 7-9 нт, инициаторный комплекс притерпевает существенную конформационную перестройку. В результате, а-субъединица высвобождается, как следствие, разрушается контакт РНКП с промоторной последовательностью ДНК, и фермент переходит к стадии продуктивной элонгации [9, 14]. Элонгационный комплекс (ЭК) обладает высокой стабильностью и процессивностью.

ЭК способен синтезировать РНК размером несколько десятков тысяч нт без диссоциации от ДНК-матрицы и РНК-продукта. На стадии терминации

ЭК распознаёт сигнал, закодированный в особой структуре транскрипта, формируемой в канале выхода РНК, и быстро диссоциирует с высвобождением ДНК-матрицы и РНК-продукта [20]. После этого кор-фермент РНКП оказывается готовым снова присоединить а-субъединицу и начать новый цикл транскрипции.

В процессе элонгации движение РНКП по ДНК-матрице не является непрерывным. Исследование динамики синтеза индивидуальных молекул показывает, что монотонное продвижение вперед чередуется с остановками различной продолжительности [21, 22]. В клетке к образованию пауз могут привести неоптимальные концентрации субстрата, локальные особенности структуры матричной ДНК, влияние транскрипционных факторов и малых молекул-регуляторов, а также спонтанные нарушения в структуре самой РНКП [23-28]. Транскрипционные паузы часто определяют общую скорость транскрипции, играя важную роль в синхронизации процессов транскрипции и трансляции.

В экспериментах по транскрипции in vitro ЭК в состоянии паузы могут быть получены при отсутствии одного из четырех субстратов или за счет создания механического препятствия, например ДНК-связывающего белка, на пути следования РНКП. [28-30]. Как показывают ДНК-футпринты таких «остановленных» комплексов, фермент в них не пребывает в статическом состоянии, а напротив, совершает постоянные осцилляции, перемещаясь вперед-назад вдоль ДНК. При этом РНКП вместе с каталитическим центром может сместиться на несколько (2-20) нт назад относительно З'-конца РНК [29-31]. Способность к смещению комплекса в обратном направлении определяется локальными свойствами ЭК и может резко изменяться при удлинении транскрипта даже на один нуклеотид [32].

Активный ЭК

• Каталитичесхии центр 1 ТТЛ ДНК-матрица - РНК-продукт

CZZI^ рнкп

О Транскрипционный пузырь

Обратное смешение ^ на 2-3 нт

Обратное смещение более чем наЗ нт

Арест

Дюинироввннык ЭК

Рис. 1.2 Механизмы образования и преодоления пауз и перманентных остановок транскрипции. Активный ЭК (сверху) содержит транскрипционный пузырь и РНК-продукт, 3'-конец которого находится в каталитическом центре. Обратное смещении па два-три нуклеотида назад (слева) приводит к образованию транскрипционной паузы. Это состояние является обратимым, ЭК способен активироваться спонтанно или за счет реакции расщепления транскрипта, стимулируемой факторами СгеА и/илн СгеВ (слева внизу). Отщепление З'-коицевого фрагмента РНК-продукта приводит к образованию нового З'-конца РНК в каталитическом центре, и ЭК переходит в активное состояние. При обратном смещении более чем на три нуклеотида (справа), комплекс не может самостоятельно совместить каталитический центр с З'-концом РНК и инактивируется, что приводит к перманентной остановке транскрипции и образованию тупикового комплексаю В случае тупикового комплекса для совмещения каталитического центра с 3'-концом РНК потребуется отщепление РНК-олигонуклеотида длиной 3-20 нт. Такой тип расщепления способен стимулировать только фактор ОгеВ (справа внизу)

Смещение назад на 2-3 нт (происходит при транскрипционной паузе), как правило, является обратимым, и при длительной инкубации с субстратами комплекс способен возобновить элонгацию (Рис.1.2). Таким образом, при наличии субстратов, в ЭК с малым смещением осциллирующая РНКП стабилизируется в активном положении, при котором каталитический центр располагается в непосредственной близости от 3'-конца РНК [29, 33].

После смещения в обратном направлении более чем на 3 нт происходит перманентная остановка транскрипции. Фермент теряет способность самостоятельно совместить каталитический центр с 3'-концом транскрипта, который попадает во вторичный канал [34, 35]. Такой ЭК инактивируется, превращаясь в тупиковый комплекс, который неспособен удлинять РНК-транскрипт даже при длительной икубации с NTP (Рис. 2). Этот переход коррелирует со значительным смещением футпринта РНКП в обратном направлении. Так же как и ЭК, тупиковый комплекс обладает большой стабильностью [29, 33]. Выйти из состояния перманентной остановки РНКП может за счет активации эндонуклеазной реакции, в результате которой в каталитическом центре происходит гидролитический разрыв цепи РНК. После реакции расщепления вновь образованный 3'-конец РНК оказывается совмещённым с каталитическим центром, а отщепленный РНК-фрагмент покидает ЭК через вторичный канал [29, 33, 37]. Помимо эндонуклеазного расщепления транскрипта, реактивация тупиковых комплексов in vivo может происходить с помощью транскрипционного фактора Mfd. Этот фактор связывается с ДНК позади РНКП и транслоцирует ЭК вперёд по ДНК-матрице за счет энергии гидролиза АТР, таким образом совмещая 3'-конец

РНК с каталитическим центром и восстанавливая активность РНКП [37]. Аналогичным образом обратно-смещенный комплекс может быть активирован второй молекулой РНКП, активно транскрибирующей ДНК позади него [30].

Образование тупиковых комплексов возможно также в ходе инициации на некоторых промоторах. В таких инициаторных комплексах фермент не способен разорвать связи с промоторной ДНК и поэтому удерживается от транслокации вперед. С другой стороны, первичный транскрипт стабильно связан с комплексом и не может диссоциировать (абортироваться), чтобы позволить РНКП начать новый цикл транскрипции [38, 39]. Как и в случае перманентной остановки ЭК, РНКП в тупиковом инициаторном комплексе приобретает конформацию обратного смещения, при которой фермент смещается назад, а 3'-конец РНК попадает во вторичный канал. Такой комплекс не только не способен продолжить транскрипцию, но и блокирует инициацию на данном промоторе другими молекулами фермента, тем самым исключая возможность активации тупикового комплекса за счет кооперативного действия РНКП, двигающихся сзади. Аналогично ЭК, тупиковый инициаторный комплекс может быть активирован за счет реакции расщепления транскрипта [38, 39].

Заключение диссертации по теме «Биоинформатика», Степанова, Екатерина Викторовна

Выводы

1. Выявлено 282 гена, экспрессия которых регулируется за счет транкрипт-расщепляющей активности GreA (103 гена положительно и 179 генов отрицательно).

2. С помощью компьютерного анализа предсказано, что регуляция транскрипции фактором GreA in vivo происходит на стадии инициации, а не на стадии элонгации, как считалось ранее. Выявлен ряд генов, экспрессию которых GreA стимулирует напрямую (среди них гены трансляционной машинерии, а также гены синтеза липополисахаридов и несколько ^охарактеризованных генов).

3. С помощью транскрипционных реакций in vitro подтверждена гипотеза о прямой стимуляции транскрипции фактором GreA на стадии инициации. Для стимуляции необходима транскрипт-расщепляющая активность.

4. Показано на примере промоторов генов rplN и отрХ, что РНКП образует ранее не описанные тупиковые инициаторные комплексы, находящиеся в состоянии обратного смещения, и что Gre-факторы реактивируют эти комплексы за счет реакции расщепления транскрипта. Данный механизм осуществляется in vitro и in vivo.

5. Показано, что в образовании тупиковых инициаторных комплексов на РrplN и РотрХ принимает участие а субъединица РНКП.

6. Установлено, что для образования тупиковых комплексов на РrplN необходимо наличие двух участков промоторной последовательности — одного в области расширенного элемента "-10", а другого - в начальной транскрибируемой последовательности в области от +2 до +5.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Степанова, Екатерина Викторовна, 2009 год

1. Borukhov S., Polyakov A., Nikiforov V., Goldfarb A. GreA protein: a transcription elongation factor from Escherichia coli II Proc. Natl. Acad. Sei. U S A. 1992. V. 89. P. 8899-8902.

2. Borukhov SSagitov V., Goldfarb A. Transcript cleavage factors from E. coli II Cell. 1993. V. 72. P. 459-466.

3. Laptenko O., Borukhov S. Biochemical assays of Gre factors of Thermus thermophilic И Methods Enzymol. 2003. V. 371. P. 219-232.

4. Blankschien M.D., Potrykus K., Grace E., Choudhary A., Vinella D., Cashel M., Herman C. TraR, a homolog of a RNAP secondary channel interactor, modulates transcription // PLoS Genet. 2009. V. 5. el000345.

5. Lamour V., Rutherford S.T., Kuznedelov K., Ramagopal U.A., Gourse R.L., Severinov K., Darst S.A. Crystal structure of Escherichia coli Rnk, a new RNA polymerase-interacting protein // J. Mol. Biol. 2008. V. 383. P. 367-379.

6. Cramer P. Multisubunit RNA polymerases // Cuit. Opin. Struct. Biol. 2002. V. 12. P. 89-97.

7. Borukhov S., Nudler E. RNA polymerase: the vehicle of transcription // Trends Microbiol. 2008. V. 16. P. 126-134.

8. Zhang G., Campbell E.A., Minakhin L., Richter С., Severinov К., Darst S.A. Crystal structure of Thermus aquaticus core RNA polymerase at 3.3 Â resolution // Cell. 1999. V. 98. P. 811-824.

9. Vassylyev D.G., Sekine S., Laptenko O., Lee J., Vassylyeva M.N., Borukhov S., Yokoyama S. Crystal structure of a bacterial RNA polymerase holoenzyme at 2.6 Ä resolution // Nature. 2002. V. 417. P.712-719

10. Murakami K.S., Masuda S., Campbell E.A., Muzzin O., Darst S.A. Structural basis of transcription initiation: an RNA polymerase holoenzyme-DNA complex // Science. 2002 V. 296. P. 1285-1290.

11. Vassylyev D.G., Vassylyeva M.N., Perederina A., Tahirov T.H., Artsimovitch I. Structural basis for transcription elongation by bacterial RNA polymerase // Nature. 2007. V. 448. P. 157-162

12. Murakami K., Darst S.A. Bacterial RNA polymerases: the wholo story // Curr. Opin. Struct. Biol. 2003. V. 13. P. 31-39.

13. Borukhov S, Lee J. RNA polymerase structure and function at lac operon // C. R. Biol. 2005. V. 328. P. 576-587.

14. Kamzolova S.G., Osipov A.A., Beskaravainyi P.M., Dzheliadin T.R., Sorokin A.A. Regulation of promoter activity through electrostatic interactions with RNA-polymerase. // Biofizika. 2007. V. 52. P. 228-236.

15. Hsu L. M. Promoter clearance and escape in prokaryotes // Biochim. Biophys. Acta. 2002. V. 1577. P. 191-207.

16. Revyakin A., Liu C., Ebright R.H., Strick T.R. Abortive initiation and productive initiation by RNA polymerase involve DNA scrunching // Science. 2006. V. 314. P. 1139-1143.

17. Epshtein V., Cardinale C.J., Ruckenstein A.E., Borukhov S., Nudler E. An allosteric path to transcription termination //Mol. Cell. 2007. V. 28. P. 991-1001

18. Herbert K.M., La Porta A., Wong B.J., Mooney R.A., Neuman K.C., Landick R., Block S.M. Sequence-resolved detection of pausing by single RNA polymerase molecules // Cell. 2006.V.125. P.1083-1094

19. Herbert K.M., Greenleaf W.J., Block S.M. Single-molecule studies of RNA polymerase: motoring along //Annu. Rev. Biochem. 2008. V. 77. P. 149-176.

20. Fish R.N., Kane C.M. Promoting elongation with transcript cleavage stimulatory factors // Biochim. Biophys. Acta. 2002. V. 1577. P.287-307

21. Aivasashvilli V.A., Beabealashvilli R.S. Sequence-specific inhibition of RNA elongation by actinomycin D // FEBS Lett. 1983. V. 160. P. 124-128.

22. Duquesne S., Petit V., Peduzzi J., Rebuffat S. Structural and functional diversity of microcins, gene-encoded antibacterial peptides from enterobacteria // J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 2007. V. 13. P. 200-209.

23. Toulokhonov L, Zhang J., Palangat M., Landick R. A central role of the RNA polymerase trigger loop in active-site rearrangement during transcriptional pausing //Mol. Cell. 2007. V. 27. P. 406-419.

24. Roberts J. IV., Shankar S., Filter J.J. RNA polymerase elongation factors // Annu. Rev. Microbiol. 2008. V. 62. P. 211-233.

25. Pavco P.A., Steege D.A. Elongation by Escherichia coli RNA polymerase is blocked in vitro by a site-specific DNA binding protein // J. Biol. Chem. 1990. V. 265.P. 9960-9969.

26. Komissarova N., Kashlev M. RNA polymerase switches between inactivated and activated states translocating back and forth along the DNA and the RNA // J. Biol. Chem. 1997. V. 272. P. 15329-15338.

27. Epshtein V., Toulme F., Rahmouni A.R., Borukhov S., Nudler E. Transcription through the roadblocks: the role of RNA polymerase cooperation // EMBO J. 2003. V. 22. P. 4719-4727.

28. Toulme F., Guerin M., Robichon N., LengM., Rahmouni A.R. In vivo evidence for back and forth oscillations of the transcription elongation complex // EMBO J. 1999. V. 18. P. 5052-5060.

29. Kashkina E., Anikin M., Tahirov T.H., Kochetkov S.N., Vassylyev D.G., Temiakov D. Elongation complexes of Thermus thermophilus RNA polymerase that possess distinct translocation conformations // Nucleic Acids Res. 2006. V. 34. P. 4036-4045.

30. Komissar ova N., Kashlev M. Transcriptional arrest: Escherichia coli RNA polymerase translocates backward, leaving the 3' end of the RNA intact and extruded // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1997.V. 94. P. 1755-1760.

31. Borukhov S., Lee J., Goldfarb A. Mapping of a contact for the RNA 3' terminus in the largest submit of RNA polymerase // J. Biol. Chem. 1991. V. 266. P. 2393223935.

32. Markovtsov V., Mustaev A., Goldfarb A. Protein-RNA interactions in the active center of transcription elongation complex // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1996. V. 93. P. 3221-3226.

33. Toulmé F., Mosrin-Huaman С., Sparkowski J., Das A., Leng M., Rahmouni A.R. GreA and GreB proteins revive backtracked RNA polymerase in vivo by promoting transcript trimming // EMBO J. 2000. V. 19. P. 6853-6859.

34. Park J.S., Marr M.T., Roberts J.W. E. coli transcription repair coupling factor (Mfd protein) rescues arrested complexes by promoting forward translocation // Cell. 2002. V. 109. P.757-767.

35. Susa M., Kubori T., Shimamoto N. A pathway branching in transcription initiation in Escherichia coli И Mol. Microbiol. 2006. V. 59. P.1807-1817.

36. Hatoum A., Roberts J. Prevalence of RNA polymerase stalling at Escherichia coli promoters after open complex formation // Mol. Microbiol. 2008. V. 68. P. 1728.

37. Surratt C.K, Milan S.C, Chamberlin M.J. Spontaneous cleavage of RNA in ternary complexes of Escherichia coli RNA polymerase and its significance for the mechanism of transcription // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1991. V. 88. P. 79837987.

38. Orlova M., Newlands J., Das A., Goldfarb A., Borukhov S. Intrinsic transcript cleavage activity of RNA polymerase // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1995. V. 92. P. 4596-4600.

39. Rozovskaya T.A., Chenchik A.A., Beabealashvilli R.Sh. Processive pyrophosphorolysis of RNA by Escherichia coli RNA polymerase // FEB S Lett. 1982. V. 137. P. 100-104.

40. Rudd M.D., Izban M.G., Luse D.S. The active site of RNA polymerase II participates in transcript cleavage within arrested ternary complexes // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994. V. 91. P. 8057-8061.

41. Stebbins C.E., Borukhov S., Orlova M., Polyakov A., Goldfarb A., Darst S.A. Crystal structure of the GreA transcript cleavage factor from Escherichia coli II Nature. 1995. V. 373. P. 636-640.

42. Vassylyeva M.N., Svetlov V., Dearborn A.D., Klyuyev S., Artsimovitch I., Vassylyev D.G. The carboxy-terminal coiled-coil of the RNA polymerase beta'-subunit is the main binding site for Gre factors // EMBO Rep. 2007. V. 8. P.1038-1043.

43. Koulich D., Nikiforov V., Borukhov S. Distinct functions of N and C-terminal domains of GreA, an Escherichia coli transcript cleavage factor // J. Mol. Biol. 1998. V. 276. P. 379-89.

44. Koulich D., Orlova M., Malhotra A., Sali A., Darst S.A., Borukhov S. Domain organization of Escherichia coli transcript cleavage factors GreA and GreB // J. Biol. Chem. 1997. V. 272. P. 7201-7210.

45. Kulish D., Lee J., Lomakin I., Nowicka B., Das A., Darst S., Normet K., Borukhov S. The functional role of basic patch, a structural element of Escherichia coli transcript cleavage factors GreA and GreB // J. Biol. Chem. 2000. V. 275. P. 12789-12798.

46. Polyakov A., Richter C., Malhotra A., Koulich D., Borukhov S., Darst S.A. Visualization of the binding site for the transcript cleavage factor GreB on Escherichia coli RNA polymerase // J. Mol. Biol. 1998. V. 281. P. 465-473.

47. Opalka N., Chlenov M., Chacon P., Rice W.J., Wriggers W., Darst S.A. Structure and function of the transcription elongation factor GreB bound to bacterial RNA polymerase // Cell. 2003. V. 114. P. 335-345.

48. Laptenko O., Lee J., Lomakin I., Borukhov S. Transcript cleavage factors GreA and GreB act as transient catalytic components of RNA polymerase // EMBO J. 2003. V. 22. P. 6322-6334.

49. Sosunov V., Sosunova E., Mnstaev A., Bass I., Nikiforov V., Goldfarb A. Unified two-metal mechanism of RNA synthesis and degradation by RNA polymerase // EMBO J. 2003. V. 22. P. 2234-2244.

50. Glass J.I., Assad-Garcia N., Alperovich N., Yooseph S., Lewis M.R., Maruf M., Hutchison C.A. 3rd, Smith H.O., Venter J.C. Essential genes of a minimal bacterium // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 2006. V. 103 P. 425-430.

51. Stepanova E., Lee J., Ozerova M., Semenova E., Datsenko K., Wanner B.L., Severinov K., Borukhov S. Analysis of promoter targets for Escherichia coli transcription elongation factor GreA in vivo and in vitro // J. Bacteriol. 2007. V. 189. P. 8772-8785.

52. Rhodius V.A., Suh W.C., Nonaka G., West J., Gross C.A. Conserved and variable functions of the sigmaE stress response in related genomes // PLoS Biol. 2006. V. 4. e2.

53. Len A.C., Harty D. W., Jacques N.A. Stress-responsive proteins are upregulated in Streptococcus mutans during acid tolerance // Microbiology. 2004. V. 150. V. 1339-1351.

54. Wei W., Jiang J., Li X., Wang L., Yang S.S. Isolation of salt-sensitive mutants from Sinorhizobium meliloti and characterization of genes involved . in salt tolerance// Lett. Appl. Microbiol. 2004. V. 39. P. 278-283.

55. Kawamoto J., Kurihara T., Kitagawa M., Kato /., Esaki N. Proteomic studies of an Antarctic cold-adapted bacterium, Shewanella livingstonensis Ac 10, forglobal identification of cold-inducible proteins // Extremophiles. 2007. V. 11. P. 819-26.

56. Singh V.K., Jayaswal R.K., Wilkinson B.J. Cell wall-active antibiotic induced proteins of Staphylococcus aureus identified using a proteomic approach // FEMS Microbiol. Lett. 2001. V. 199. P. 79-84.

57. Izban M.G., Litse D.S. The RNA polymerase II ternary complex cleaves the nascent transcript in a 3'—>5* direction in the presence of elongation factor SII // Genes Dev. 1992. V. 6. P. 1342-1356.

58. Wind M., Reines D. Transcription elongation factor SII // Bioessays. 2000. V. 22. P. 327-36

59. Kettenberger H., Armache K.J., Cramer P. Architecture of the RNA polymerase II-TFIIS complex and implications for mRNA cleavage // Cell. 2003. V. 114. P. 347-357.

60. Kim B., Nesvizhskii A.I., Rani P.G., Hahn S., Aebersold R., Ranish J.A. The transcription elongation factor TFIIS is a component of RNA polymerase II preinitiation complexes // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2007. V. 104. P. 1606816073.

61. Guglielmi B., Soutourina J., Esnault C., Werner M. TFIIS elongation factor and Mediator act in conjunction during transcription initiation in vivo // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2007. V. 104. P. 16062-16067.

62. Galburt E.A., Grill S. W., Wiedmann A., Lubkowska L., Choy J., Nogales E., Kashlev M., Bustamante C. Backtracking determines the force sensitivity of RNAP II in a factor-dependent manner // Nature. 2007. V. 446. P. 820-3. c

63. Guermah M., Palhan V.B., Tackett A.J., Chait B.T., Roeder R.G. Synergistic functions of SII and p300 in productive activator-dependent transcription of chromatin templates // Cell. 2006. V. 125. P. 275-286.

64. Charlet-Berguerand N., Feuerhahn S., Kong S.E., Ziserman H., Conaway J.W., Conaway R., Egly J.M. RNA polymerase II bypass of oxidative DNA damage is regulated by transcription elongation factors // EMBO J. 2006. V. 25. P. 54815491.

65. Fousteri M., Mullenders L.H. Transcription-coupled nucleotide excision repair in mammalian cells: molecular mechanisms and biological effects // Cell Res. 2008. V. 18. P. 73-84.

66. Laptenko O., Kim S.S., Lee J., Starodubtseva M., Cava F., Berenguer J., Kong X.P., Borukhov S. pH-dependent conformational switch activates the inhibitor of transcription elongation // EMBO J. 2006. V. 25. P. 2131-2141.

67. Haugen S.P., Ross W., Gourse R.L. Advances in bacterial promoter recognition and its control by factors that do not bind DNA // Nat. Rev. Microbiol. 2008. V. 6. P. 507-519.

68. Szalewska-Palasz A., Wegrzyn G., Wegrzyn A. Mechanisms of physiological regulation of RNA synthesis in bacteria: new discoveries breaking old schemes // J. Appl. Genet. 2007. V. 48. P. 281-294.

69. Magnusson L.U., Gummesson B., Joksimovic P., Farewell A., Nystrdm T. Identical, independent, and opposing roles of ppGpp and DksA in Escherichia coli //J. Bacterid. 2007. V. 189. P. 193-202.

70. Artsimovitch ./., Patlan V, Sekine S., Vassylyeva M.N., Hosaka 71, Ochi K., Yokoyama S., Vassylyev D.G. Structural basis for transcription regulation by alarmone ppGpp // Cell. 2004. V. 117.P. 299-310.

71. Paul B.J., Berkmen M.B., Gourse R.L. DksA potentiates direct activation of amino acid promoters by ppGpp // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2005. V. 102. P. 7823-7828.

72. Leon E. A., Ezkurdia I., Garci'a B., Valencia A. and Juan D. EcID. A database for the inference of functional interactions in E. coli Nucleic Acids Research. 2009. V. 37. P. D629-D635.

73. Nechaev S, Adelman K. Promoter-proximal Pol II: when stalling speeds things up//Cell Cycle. 2008. V. 7. P. 1539-1544.

74. Datsenko K. A. u B. L. Wanner. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000. V. 97. P. 6640-6645.

75. Ko D.C., Marr M.T., Guo J., Roberts J. W. A surface of Escherichia coli sigma 70 required for promoter function and antitermination by phage lambda Q protein. Genes Dev. 1998. V. 20.P. 3276-3285.

76. Barker M.M., Gaal T., Josaitis C.A., Gourse R.L. Mechanism of regulation of transcription initiation by ppGpp. I. Effects of ppGpp on transcription initiation in vivo and in vitro. J Mol Biol (2001). Y. 305. P. 673-688.

77. Maniatis T., Fritsch E., SambrookJ. Molecular cloning // A laboratory manual. 1989. Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY.

78. Hager D.A., Jin D.J. and Burgess R.R. Use of Mono-Q high-resolution ion exchange chromatography to obtain highly pure and active Escherichia coli RNA polymerase ¡/Biochemistry. 1990. V. 29. P. 7890-7894.

79. Borukhov S., Goldfarb A. Recombinant Escherichia coli RNA polymerase: purification of individually overexpressed subunits and in vitro assembly // Protein ExprPurif. 1993. V. 6. P. 503-511.