Изучение интерактома протеинкиназы MAK-V с целью характеризации ее функциональных свойств тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.03, кандидат биологических наук Калиниченко, Светлана Викторовна

• Калиниченко, Светлана Викторовна
• кандидат биологических наук
• 2012

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Калиниченко, Светлана Викторовна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

1. ВВЕДЕНИЕ.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1. Семейство АМРК-подобных протеинкиназ.

2.1.1. Протеинкиназы AMPK/SNFl/SnRKl.

Строение и регуляция АМРК.

Функции AMPK/SNFl/SnRKl.

2.1.2. Протеинкиназы MARK/Par

Строение MARK.

Регуляция MARK.

Функции MARK/Par-1.

2.1.3. Протеинкиназы BRSK/SAD-1.

2.1.4. Протеинкиназы NUAK.

2.1.6. Протеинкиназы SIK.

2.1.7. Протеинкиназа MELK.

2.1.8. Протеинкиназы NIM 1 и SNRK.

2.1.9. Протеинкиназа MAK-V/HUNK.

Функции MAK-V.

Участие MAK-V в онкогенезе.

2.2. Убиквигин-лигазы Nedd4 и Nedd4-2.

2.2.1. Убиквитинирование белков.

2.2.2. Семейство Nedd4-noAo6Hbix убиквитин-лигаз.

2.2.3. Идентификация и строение Nedd4.

2.2.4. Функции Nedd4.

Регуляция стабильности и активности внутриклеточных белков.

Регуляция мембранных рецепторов, ионных транспортеров и ассоциированных с мембранами белков.

Сортировка транспортируемых белков.

Участие в вирусном почковании.

2.2.5. Функции и регуляция убиквитин-лш азы Nedd4-2.

2.3. Актин-связывающий белок синаптоподин.

3. ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ.

4. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

4.1. Реактивы.

4.2. Бактериальные штаммы, среды, антибиотики.

4.3. Приготовление компетентных клеток E.coli.

4.4. Трансформация компетентных клеток E.coli.

4.5. Выделение плазмидной ДНК.

4.6. Электофорез ДНК в агарозном геле.

4.7. Плазмидные конструкции.

4.7.1. Конструирование плазмид для in vitro транскрипции Nedd4 и Nedd4(C854S).

4.7.2. Конструирование плазмид для продукции белков как химер с глутатион-S-трансферазой в E.coli.

4.7.3. Конструирование плазмид для продукции микроРНК к гену Nedd4.

4.7.4. Плазмиды для анализа белок-белковых взаимодействий в дрожжах.

4.8. Секвенирование.

4.9. Электрофорез белков в денатурирующем полиакриламидном геле.

4.10. Вестерн-блот анализ.

4.11. Получение бактериальных лизатов, содержащих рекомбинантные белки GST, GST-Nedd4 и GST-C-MAK-V.

4.12. Анализ GST-пулл-даун.

4.13. Получение аффинного матрикса с иммобилизованным С-концевым фрагментом протеинкиназы MAK-V.

4.14. Получение фракции периферических мембран.

4.15. Аффинная очистка белков на матриксе GST-C-MAK-V.

4.16. Масс-спектрометрический анализ.

4.17. Анализ связывания белков из фракции периферических мембран головного мозга мыши с полноразмерной протеинкиназой MAK-V.

4.18. Получение и очистка анти-MAK-V антител.

4.19. Культивирование клеток, трансфекция.

4.20. Количественный анализ уровня белка MAK-V-FLAG в клетках, обработанных циклогексимидом.

4.21. Биохимическое фракционирование клеток.

4.22. Получение суммарного клеточного лизата.

4.23. Очистка протеинкиназы MAK-V-FLAG и взаимодействующих с ней белков из клеток РС12ТеЮп.

4.24. Ко-иммунопреципитация MAK-V-FLAG за анти-№сМ4-антитела.

4.25. Ко-иммуиопреципитация эндогенной протеинкиназы MAK-V за anTH-Ncdd4-антитсла и эндогенной убиквитин-лигазы Nedd4 за анти-МАК-У-антитела.

4.26. Анализ убиквитинирования in vitro.

4.27. Иммуноцитохимический анализ.

4.28.Эксперименты с использованием дрожжей.

4.28.1 Штаммы дрожжей.

4.28.2. Среды и реактивы для культивирования дрожжей.

4.28.3. Трансформация дрожжей плазмидной ДНК.

4.28.4. Анализ мембранной локализации протеинкиназы MAK-V в дрожжах.

4.28.5. Анализ взаимодействия MAK-V и синаптоподина в дрожжевой двугибридной системе.

4.28.6. Анализ взаимодействия белков MAK.-V и Nedd4 в дрожжевой двугибридной системе.

4.29. Эксперименты с использованием эмбрионов X. laevis.

5. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

5.1. Изучение влияния протеинкиназы MAK-V на статус фосфорилирования кофилина 1 и активацию сигнальных путей протеинкиназ ERK1/2 и Akt в клетках РС12ТеЮп с индуцибельной экспрессией протеинкиназы MAK.-V.

5.2. Мембранная локализация протеинкиназы MAK-V.

5.2.1. Биохимическое фракционирование клеток с индуцированной экспрессией протеинкиназы MAK-V.

5.2.2. Эндогенный белок MAK-V ассоциирован с клеточными мембранами.

5.2.3. Мембранная локализация протеинкиназы MAK-V в дрожжах.

5.3. Взаимодействие протеинкиназы MAK-V с синаитоподином.

5.3.1. Очистка и идентификация белков, взаимодействующих с С-концевым доменом протеинкиназы MAK-V.

5.3.2. Установление аутентичности белков и анализ специфичности взаимодействия с С-концевым доменом MAK-V.

5.3.3. Взаимодействие синаптоподина с полноразмерной протеинкиназой MAK-V.

5.4. Взаимодействие протеинкиназы MAK-V и убиквитин-лигазы Ncdd4.

5.4.1. Идентификация Nedd4 как белка-партнера по взаимодействию с протеинкиназой MAK-V.

5.4.2. Картирование взаимодействия между MAK.-V и Nedd4.

5.4.3. MAK-V подвергается протеасомной деградации.

5.4.4. Nedd4 не участвует в протеасомной деградации MAK-V.

5.4.5. Nedd4 регулирует функции MAK-V независимо от убиквитин-лигазной активности.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Изучение интерактома протеинкиназы MAK-V с целью характеризации ее функциональных свойств»

Протеинкиназы представляют собой одно из крупнейших суперсемейств эукариотических белков. Они ф о с фор ил и ру ют белковый субстрат, катализируя перенос у-фосфата с АТР на гидроксильную группу остатков серина, треонина или тирозина. Такая модификация может изменять ферментативную активность белка-субстрата, его внутриклеточную локализацию или взаимодействие с другими белками. Протеинкиназы являются медиаторами большинства сигнальных путей в эукариотической клетке и контролируют многие клеточные процессы, включая метаболизм, транскрипцию, прогрессию клеточного цикла, перестройку цитоскелега, клеточную подвижность, дифференцировку и апоптоз. Они играют ключевую роль в межклеточной коммуникации во время эмбрионального развития, в поддержании гомеостаза, в функционировании нервной и иммунной систем. Протеинкиназы индуцируют и поддерживают механизм долговременной потенциации синаптической передачи, лежащей в основе памяти и обучения.

Из 518 генов протеинкиназ человека почти половина картируется в локусах хромосом, ассоциированных с различными заболеваниями. Мутации и нарушение регуляции протеинкиназ напрямую связаны с развитием многих болезней, в том числе и онкологических. Модулирование активности протеинкиназ с помощью специфических ингибиторов и активаторов является одним из подходов к терапии этих заболеваний. Ключевая роль протеинкиназ во всех аспектах клеточной физиологии и их участие в патологических процессах объясняет большой интерес к изучению молекулярных механизмов, лежащих в основе регуляции и функционирования этой группы ферментов.

Протеинкиназа MAK-V относится к семейству АМРК-иодобных серин-треониновых протеинкиназ, многие представители которого выполняют высококонсервативные функции во всех эукариотических организмах, от дрожжей до человека. Однако на сегодняшний день протеинкиназа MAK.-V является одним из наименее изученных представителей семейства АМРК-иодобных протеинкиназ. При этом остаются практически неизвестными механизмы регуляции протеинкиназы MAK-V, ее мишени и молекулярные процессы, в которых она принимает участие. Принимая во внимание не вызывающую сомнений ключевую роль протеинкиназ в регуляции клеточных процессов, исследование свойств и функций протеинкиназы MAK-V является актуальным и представляет несомненный интерес.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Калиниченко, Светлана Викторовна

Основные результаты работы получены автором лично или при его непосредственном участии. Масс-спектрометрический анализ белков проведен Р.Х. Зиганшиным (ИБХ РАН, г. Москва). Биохимическое фракционирование клеток РС12ТеЮп с индуцированной экспрессией протеинкиназы MAK-V мыши и анализ ее мембранной локализации в дрожжах выполнен совместно с И.В. Коробко. Иммунофлуоресцентный анализ колокализации синаптоподина и протеинкиназы MAK-V в клетках линии NCI-H1299 проведен И.В. Коробко. Фракция периферических мембран клеток головного мозга мыши были получена П.Н. Вихревой (ИБГ РАН, г. Москва). Получение клонов клеток PC12TetOn, продуцирующих микроРНК к гену Nedd4 крысы и контрольную микроРНК, проводилось при участии И.В. Коробко. Эксперименты по трансляции мРНК генов mak-v и Nedd4 в эмбрионах X.laevis выполнены Кейджи Ито (Mount Sinai School of Medicine, г. Нью-Йорк, США) с использованием предоставленных автором плазмидных конструкций и планом эксперимента. Имена соавторов приведены в соответствующих публикациях.

БЛАГОДАРНОСТИ

Автор выражает искреннюю благодарность своему научному руководителю И.В. Коробко за чуткое руководство, за неоценимые научные и практические советы, а также за критическое чтение диссертации;

С.Ю. Соколу (Mount Sinai School of Medicine, г. Нью-Йорк, США) за организацию экспериментов с эмбрионами лягушки, позволивших выявить функциональность взаимодействия белков MAK-V и Nedd4;

Р.Х. Зиганшину (ИБХ РАН, г. Москва) за проведение масс-спектрометрического анализа; Е.В. Коробко и Е.Ю.Лысюк (ИБГ РАН, г. Москва) за помощь в работе с культурами клеток; а также всем сотрудникам Отдела генной терапии рака ИБГ РАН за моральную поддержку, помощь в работе, теплую и дружескую атмосферу в коллективе.

6. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В работе был» изучены некоторые функциональные связи протеинкиназы MAK-V в клетке. При этом были исследованы возможные механизмы анти-апоптотической активности MAK-V, проанализирована ее внутриклеточная локализация и предпринят поиск белков — партнеров но взаимодействию с последующим анализом функциональных следствий выявленных взаимодействий.

Анализ молекулярных событий, которые могли бы опосредовать анти-аиоптотическую активность протеинкиназы MAK-V в клетках РС12ТеЮп при их контакте с коллагеном IV, выявил отсутствие влияния MAK-V на статус фосфорилирования кофилина 1 и уровень активации сигнальных путей протеинкиназ Akt и ERK1/2. Полученные данные свидетельствуют о том, что анти-апоптотическая активность MAK-V в этих клетках проявляется через воздействие на другие молекулярные события. Выявление сигнальных каскадов, регулирующих возникновение, рост и развитие опухоли, имеет большую практическую ценность для терапии онкологических заболеваний. Полученные нами результаты способствуют дальнейшему изучению роли MAK-V в канцерогенезе и направляют внимание на другие возможные механизмы анти-апоптотической активности протеинкиназы MAK-V, например, па регуляцию экспрессии гена одной из матриксных мегаллопротеиназ.

Изменение внутриклеточной локализации протеинкиназ является одним из способов регуляции их активности. В данной работе было обнаружено, что значительная часть клеточного пула эндогенного белка MAK-V локализована на мембране. Анализ первичной структуры выявил в каталитическом домене белка MAK-V сайт связывания с фосфатидилинозитол-(4,5)-бифосфатом. Можно предположить, что эта последовательность опосредует взаимодействие протеинкиназы MAK-V с мембраной. Кроме того, была продемонстрирована зависимость мембранной локализации белка MAK-V от присутствия убиквитин-ассоциированного домена, регулирующего каталитическую активность и внутриклеточную локализацию других АМРК-иодобных протеинкиназ. Выявленная ассоциация белка MAK-V с мембранами может обеспечивать корректную локализацию относительно субстрата и указывает на один из возможных способов регуляции протеинкиназной активности MAK-V посредством пространственного контроля.

В работе было впервые обнаружено взаимодействие протеинкиназы MAK-V с синаптоподином. Анализируя профили экспрессии генов mak-v и Synpo, можно предположить функциональную связь протеинкиназы MAK-V и синаптоподина в головном мозге. Опубликованные ранее данные свидетельствуют о возможной роли протеинкиназы MAK-V в регуляции эндоцитоза и функционировании синапсов, а анализ хромосомной локализации гена mak-v выявил его возможную ассоциацию с шизофренией, аутизмом и фенотипическими проявлениями синдрома Дауна. Синаптоподин ассоциирован с шиииковым аппаратом дендритных шипиков и регулирует формирование долговременной потенциации, лежащей в основе памяти и обучения. Обнаруженное в работе взаимодействие протеинкиназы MAK-V и синаитоподина может иметь регуляториое значение и определять локализацию MAK-V на шипиковым аппарате. С другой стороны, MAK-V потенциально может фосфорилировагь и предотвращать деградацию синаптоподина, способствуя формированию долговременной потенциации. Полученные результаты открывают дальнейшие перспективы для изучения роли протеинкиназы MAK.-V в головном мозге в свете ее возможного участия в функционировании синапсов, процессах памяти, обучения, интеллектуального развития.

В работе было впервые выявлено взаимодействие протеинкиназы MAK-V и убиквитин-лигазы Nedd4 и установлена его функциональность. В процессе изучения этого взаимодействия было показано, что уровень белка MAK-V контролируется в клетке путем протеасомной деградации, однако Nedd4 не является убиквитин-лигазой протеинкиназы MAK-V и не влияет на ее стабильность. Nedd4 регулирует функции MAK-V независимо от убиквитин-лигазной активности. Установленное влияние Nedd4 на MAK-V вместе с ранее выявленной регуляторной ролыо MAK-V в Wnt сигнальном пути впервые свидетельствует о роли в этом сигнальном пути убиквитин-лигазы Ncdd4. Более того, поскольку убиквитин-лигаза Nedd4 вовлечена в регуляцию Notch и IGF-R1 сигнальных путей, обнаруженная взаимосвязь служит основой для интеграции не только этих сигнальных путей, но и, в дополнение к ним, Wnt сигнального пути через взаимодействие между Nedd4 и MAK-V.

Полученные в работе результаты существенно расширяют наши представления о регуляции и функциональных связях протеинкиназы MAK-V и открывают перспективы для дальнейшего изучения роли MAK-V в клетке и в организме. Это, в свою очередь, является необходимой предпосылкой для установления роли протеинкиназы MAK-V в патологических процессах в организме, что абсолютно необходимо для валидации MAK.-V как молекулярной мишени для терапии и, в конечном итоге, для разработки новых стратегий лечения заболеваний человека, в которых протеинкиназа MAK-V может играть существенную роль, в частности, онкологических заболеваний.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Калиниченко, Светлана Викторовна, 2012 год

1. Коробко ИВ, Кабишев АА, Киселев СЛ. Идентификация новой протеипкиназы, специфически траскрибирующейся в опухолях мыши с высоким метастатическим потенциалом. Докл. Акад. Наук. 1997;354(4):554-556.

2. Коробко ИВ, Коробко ЕВ, Нинкина НИ, Бухман ВЛ, Киселев СЛ. Фосфорилирование протеипкиназы MAK-V в клетках млекопитающих. Докл. Акад. Наук. 2007;412:555-557.

3. Коробко ИВ. Ген протеипкиназы MAK-V и ряд других генов с измененной экспрессией в опухолях и их использование в онкологии: диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук: 03.00.26; 03.00.03. Москва, 2009. -296 с.

4. Коробко ИВ, Завалишина ЛЕ, Киселев СЛ, Райхлин ИТ, Франк ГА. Продукция протеипкиназы MAK-V/HUNK как возможный диагностический и прогностический маркер рака молочной железы человека. Арх. Патол. 2004;66(5):6-9.

5. Сорокин АВ, Ким ЕР, Овчинников ЛР. Протеасомная система деградации и ироцесинга белков. Biochemistry (Mosc). 2009;49:3-76.

6. Manning G, Whyte DB, Martinez R, Hunter T, Sudarsanam S. The protein kinase complement of the human genome. Science. 2002;298(5600):1912-1934.

7. Ghillebert R, Swinnen E, Wen J, Vandesteene L, Ramon M, Norga K, Rolland F, Winderickx J. The AMPK/SNFl/SnRKl fuel gauge and energy regulator: structure, function and regulation. FEBSJ. 2011;278(21):3978-3990.

8. Hardie DG, Ross FA, Hawley SA. AMPK: a nutrient and energy sensor that maintains energy homeostasis. Nat Rev Mol Cell Biol. 2012; 13(4):251 -262.

9. Woods A, Johnstone SR, Dickerson K, Leiper FC, Fryer LG, Neumann D, Schlattner U, Wallimann T, Carlson M, Carling D. LKB1 is the upstream kinase in the AMP-activated protein kinase cascade. Curr Biol. 2003;13(22):2004-2008.

10. Alessi DR, Sakamoto K, Bayascas JR. LKB1-dependent signaling pathways. Annu Rev Biochem. 2006;75:137-163.

11. Hawley SA, Boudeau J, Reid JL, Mustard KJ, Udd L, Makela TP, Alessi DR, Hardie DG. Complexes between the LKB1 tumor suppressor, STRAD alpha/beta and M025 alpha/beta are upstream kinases in the AMP-activated protein kinase cascade. J Biol. 2003;2(4):28.

12. Lizcano JM, Goransson O, Toth R, Deak M, Morrice NA, Boudeau J, Hawley SA, Udd L, Makela TP, Hardie DG, Alessi DR. LKB1 is a master kinase that activates 13 kinases of the AMPK subfamily, including MARK/PAR-1. EMBOJ. 2004;23(4):833-843.

13. Hawley SA, Pan DA, Mustard KJ, Ross L, Bain J, Edelman AM, Frenguelli BG, Hardie DG. Calmodulin-dependent protein kinase kinase-bcta is an alternative upstream kinase for AMP-activated protein kinase. Cell Metab. 2005;2(1):9-19.

14. Momcilovic M, Hong SP, Carlson M. Mammalian TAK1 activates Snfl protein kinase in yeast and phosphorylates AMP-activated protein kinase in vitro. J Biol Chem. 2006;281(35):25336-25343.

15. Hedbacker K, Carlson M. SNF1/AMPK pathways in yeast. Front Biosci. 2008;13:2408-2420.17