Участие зависимых от убиквитина систем в регуляции эндоцитоза рецептора ЭФР тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.25, кандидат биологических наук Меликова, Мария Сергеевна

• Меликова, Мария Сергеевна
• кандидат биологических наук
• 2005

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Меликова, Мария Сергеевна

Список сокращений

1. Введение

2. Обзор литературы 10 2.1 .Общие понятия о везикулярном транспорте

2.2. Рецептор эпидермального фактора роста

2.2.1. Общие сведения о рецепторе ЭФР

2.2.2. Сигнальные молекулы, связанные с рецептором

2.3. Общая схема РОЭ

2.4. Регуляция РОЭ

2.4.1. Белки, участвующие в интернализации ЭФР-рецепторных комплексов

2.4.2. Белки, опосредующие слияние мембран

2.4.3. Белки, участвующие в переходе из ранних в поздние эндосомы

2.5. Фосфатидилинозитол-киназы

2.6. Роль убиквитинирования белков в регуляции РОЭ

2.6.1. Убиквитинирование

2.6.2. Протеасомы и их ингибиторы

2.6.3. Убиквитин-лигаза с-СЫ

3. Материалы и методы

3.1. Культивирование клеточных линий

3.2. Получение йодированного ЭФР

3.3. Обработка клеток ингибиторами

3.4. Стимуляция эндоцитоза

3.5. Субклеточное фракционирование в градиенте плотности 17% Перколла

3.6. Получение мембранных фракций

3.7. Получение тотально-клеточного лизата

3.8. Иммунопреципитация

3.9. Электрофоретическое разделение белков

3.10. Иммуноблотинг

3.11. Иммунофлуоресценция

3.12. Антитела

4. Результаты

4.1. Участие протеасом в эндоцитозном процессинге рецептора ЭФР

4.2. Влияние ингибитора протеасом МС на эндоцитоз рецептора ЭФР

4.3. Влияние М0132 на динамику компартментализации ЭФР-рецепторных комплексов

4.4. Исследование возможного влияния Мв на функционирование лизосом

4.5. Влияние ингибиторов протеасом и ингибитора вакуолярной протонной помпы Баф А1 на убиквитинирование клеточных белков

4.6. Влияние ингибитора протеасом ]УЮ132 на убиквитинирование рецептора ЭФР и его взаимоотношения с убиквитин-лигазой с-СЫ

4.7. Анализ поведения рецептора ЭФР, ассоциированного с убиквитин-лигазой с-СЫ, во фракциях ранних и поздних эндосом/лизосом

4.8. Участие Р13-киназ I и III классов в регуляции эндоцитоза рецептора ЭФР

4.9. Взаимоотношение убиквитин-лигазы с-СЫ и Р13К в процессе эндоцитоза ЭФР-рецепторных комплексов

5. Обсуждение

6. Выводы

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Участие зависимых от убиквитина систем в регуляции эндоцитоза рецептора ЭФР»

Сигналы, стимулируемые эпидермальным фактором роста (ЭФР), играют исключительно важную роль на ранних стадиях формирования клеток эпителиальной линии, в регуляции пролиферации и дифференцировки/дедифференцировки зрелых клеток различных тканей, в регуляции выживаемости и подвижности клеток, а нарушения в их функционировании зачастую приводит к злокачественной трансформации. Биологические эффекты ЭФР опосредуются в клетке его рецептором -трансмембранным белком, цитоплазматический домен которого обладает тирозинкиназной активностью. Рецепторы ЭФР чрезвычайно широко экспрессируются различными типами клеток.

Взаимодействие ЭФР с рецептором стимулирует два ряда событий: с одной стороны, инициируются каскадные сигнальные пути, с другой стороны, происходит поступление ЭФР-рецепторных комплексов внутрь клетки с помощью рецептор-опосредованного эндоцитоза. Схематично этот процесс можно представить следующим образом: после связывания лиганда с рецептором ЭФР-рецепторные комплексы интернализуются и попадают в ранние эндосомы (РЭ), где происходит их сортировка: часть комплексов рециклирует обратно на плазматическую мембрану (ПМ), а остальные попадают в предлизосомальный компартмент, называемый поздними эндосомами (ПЭ), после чего деградируют в лизо.сомах (Никольский и др., 1987). В последние годы появляются данные, отводящие рецептору, находящемуся в эндосомах (как ранних, так и поздних), самостоятельную роль в реализации сигнала, стимулируемого ЭФР. В связи с этим изучение механизмов регуляции вступления рецептора на путь деградации и продвижения по нему приобретает большое значение.

Несмотря на длительную историю исследований, ответа на вопрос о том, как именно происходит сортировка ЭФР-рецепторных комплексов на путь лизосомальной деградации (т.е. переход из РЭ в ПЭ), до сих пор нет.

Все больше подтверждений получает точка зрения, в соответствии с которой переход из РЭ в ПЭ связан с попаданием белков, направляемых в лизосомы, в везикулярные домены мембраны РЭ, на которых в дальнейшем образуются инвагинации. Эти инвагинации превращаются затем во внутренние пузырьки, что приводит к формированию так называемых мультивезикулярных эндосом (МВЭ), встречающихся на поздних стадиях эндоцитоза практически у всех известных организмов (Felder et al., 1990; Ullrich, Schiessinger, 1990; Dunn, Maxfield, 1992). Образование инвагинаций (и заякоривание в них направляемых на деградацию белков) начинается, по-видимому, уже на стадии РЭ, полностью сформированная МВЭ соответствует по характеристикам ПЭ. Таким образом, РЭ превращаются в ПЭ в ходе процесса, называемого созреванием. Молекулярные основы этого процесса неясны. В настоящее время можно считать установленным, что для перехода в ПЭ рецептор ЭФР должен обладать активированной тирозинкиназой (ТК) (Благовещенская и др., 1994). Известен также ряд белков и белковых комплексов, нарушения в функционировании которых в той или иной степени нарушают доставку рецепторов в лизосомы. Это фосфатидилинозитол-3-киназа (PI3K), убиквитин-лигаза c-Cbl, адапторный белок SNX1, субстрат рецепторной тирозинкиназы HRS, комплексы ESCRT I, II, III и др. Сайты действия этих белков не всегда известны, а механизм координации их действия практически не изучен.

Давно показано, что рецептор ЭФР подвергается убиквитинированию - пострансляционной модификации, заключающейся в ковалентном присоединении убиквитина к остаткам лизина, содержащимся в молекуле рецептора (Galcheva-Gargova et al., 1995). Убиквитинирование, как известно, является маркером для деградации на протеасомах (Wilkinson, 2000; Myuang et al., 2001), однако в последнее время появились указания на то, что убиквитинирование может быть необходимо также для интернализации и включения лиганд-рецепторных комплексов во внутренние пузырьки МВЭ (Бирге е1 а1., 2001). Показано, что рецептор ЭФР подвергается убиквитинированию убиквитин-лигазой с-СЫ (Ьеук0\уй2 е1 а1., 1999). Данные о том, на каком этапе с-СЫ ассоциируется с рецептором, как долго сохраняется комплекс, каков статус убиквитинирования рецептора, т.е количество убиквитинов и убиквитиновых цепочек, присоединенных к одной молекуле рецептора, так же как и «молекулярный» смысл этой модификации, противоречивы и неполны. Не исключена вероятность того, что убиквитинированный рецептор узнается протеасомой и подвергается частичному протеолизу, в результате чего он становится доступен белкам, вовлекающим его на путь лизосомальной деградации. Существует ряд работ, авторы которых делают вывод об участии протеасом в регуляции эндоцитоза рецептора ЭФР (Longva е! а1., 2002), рецептора липопротеинов низкой плотности (Ме1шап а1., 2002) и рецепторов гормона роста (Так^ & а1., 2001). Подобное заключение делается ими на основании того, что ингибиторы активности протеасом, в частности, наиболее широко применяемый синтетический ингибитор МО 132, подавляют процессинг рецепторов по лизосомальному пути. Этими авторами, однако, не анализируется и не учитывается неоднозначность действия ]УЮ132 на клетку. Таким образом, вопрос о том, насколько протеасомы вовлечены в регуляцию внутриклеточного процессинга рецепторов ЭФР на поздних стадиях эндоцитоза, и какова роль убиквитинирования рецептора, остается открытым.

Цели и задачи исследования.

Цель настоящей работы заключалась в том, чтобы проанализировать возможное участие протеасом в регуляции разных стадий эндоцитоза рецептора ЭФР, а также исследовать поведение убиквитинирующего рецептор белка с-СЫ в процессе эндоцитоза.

В связи с этим задачи исследования были сформулированы следующим образом:

1. Проанализировать влияние ингибитора протеасом ]УЮ132 на динамику эндоцитоза ЭФР-рецепторных комплексов, определить, на каком этапе он действует;

2. Изучить поведение убиквитин-лигазы с-СЫ в ходе эндоцитоза ЭФР-рецепторных комплексов;

3. Сравнить спектр убиквитинирования рецептора ЭФР в различных эндосомальных компартментах;

4. Идентифицировать фосфатидилинозитол-3-киназу, участвующую в регуляции сортировки рецептора ЭФР в поздние эндосомы;

5. Определить последовательность действия с-СЫ и Р13К в ходе эндоцитоза.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Рецептор ЭФР в эндосомах не является непосредственной мишенью действия протеасом.

2. Убиквитинирование рецептора ЭФР в ранних и поздних эндосомах различно; высокоубиквитинированные формы составляют относительно небольшую долю общего пула интернализованного рецептора, и именно эти формы преимущественно сортируются в поздние эндосомы.

3. Синтетический ингибитор протеасом МС132 может замедлять как переход ЭФР-рецепторных комплексов из ранних эндосом в поздние, так и взаимодействие поздних эндосом с лизосомами, основной сайт его действия зависит от скорости процесса эндоцитоза в конкретных клетках, а механизм связан в основном с истощением пула свободного убиквитина.

4. Убиквитин-лигаза с-СЫ после стимуляции эндоцитоза ассоциируется с рецептором ЭФР как в ранних, так и в поздних эндосомах, при этом сайт ее первоначального действия находится выше по эндоцитозному пути, чем сайт действия фосфатидилинозитол-3-киназы.

5. В регуляцию перехода рецептора из ранних в поздние эндосомы вовлечена не Р13К I класса р85\р110, а Р13КIII класса ЬУР834.

2. Обзор литературы

2.1. Общие понятия о везикулярном транспорте.

Эукариотическая клетка состоит из мембранных компартментов, которые взаимодействуют между собой с помощью тубуловезикулярного транспорта. В клетке постоянно происходит отпочковывание мембранных пузырьков, от одного компартмента и последующего слияния их с другим. Ряд возбудителей опасных заболеваний человека и животных способны проникать через отпочковывающиеся везикулы внутрь клетки, при этом микроорганизмы меняют свойства этих пузырьков таким образом, что они теряют способность сливаться с лизосомами, тем самым, приводя к беспрепятственному размножению патогенных микроорганизмов. Кроме того, с помощью везикулярного транспорта экспортируются вновь синтезированные белки и другие молекулы во внеклеточную среду, обеспечивая тем самым регуляцию на уровне организма. Поступление внутрь клетки питательных веществ, транспорт иммуноглобулинов и многие другие процессы также опосредуются перераспределением мембран. Возможно, что с помощью везикулярного транспорта регулируется внутриклеточный и трансмембранный сигналинг, позволяя влиять на такие процессы, как дифференцировка, пролиферация, апоптоз, выброс ионов кальция из внутриклеточного депо и др. Нельзя не сказать, что везикулярный транспорт контролирует гомеостаз мембран в течение всей жизни клетки.

В клетке можно выделить несколько основных везикулярных потоков. Так, вновь синтезированные белки поступают из эндоплазматического ретикулума в цистерны аппарата Гольджи, а затем или переносятся в составе секреторных пузырьков к плазматической мембране, где выделяются во внутриклеточную среду посредством экзоцитоза, или направляются к другим внутриклеточным компартментам. Трансцитоз - транспорт с апикальной поверхности поляризованных клеток к базальной мембране, что характерно для транспорта иммуноглобулинов. Одной из важнейших функций, осуществляемых вакуолярным аппаратом клетки, является эндоцитоз - процесс поглощения клеткой содержащегося в окружающей среде макромолекулярного материала и распределения его между внутриклеточными компартментами.

В настоящее время в клетках выделяют два основных типа эндоцитоза: жидкофазный (пиноцитоз) и рецептор-опосредованный эндоцитоз (РОЭ). В случае пиноцитоза происходит неизбирательное поступление внутрь клетки молекул, присутствующих в межклеточной среде. Этот процесс считают конститутивным, поскольку в общем случае он происходит постоянно в условиях метаболической активности клетки. Строго говоря, это не так, поскольку в ряде случаев клетка способна регулировать эффективность пиноцитоза, например, увеличивая его в ответ на стимулированную секрецию, что обеспечивает нормальный оборот мембран и поддерживает ' постоянный размер клетки. Таким образом, о пиноцитозе следует говорить не столько как о конститутивном, сколько как о неселективном, но регулируемом компенсаторном процессе.

Другим типом является рецептор-опосредованный эндоцитоз, высокоспецифический путь поступления в клетку многих биологически важных молекул после связывания их с соответствующим рецептором на плазматической мембране (ПМ). К таким молекулам относятся белки плазмы (липопротеины низкой плотности), полипептидные гормоны (инсулин), факторы роста (эпидермальный фактор роста, фактор роста фибробластов) и др.

На самом деле оба пути в экспериментальных условиях достаточно тесно переплетены между собой. Так, было продемонстрировано, что т ростовые факторы встречаются в пиноцитозных везикулах при * определенных условиях (Hopkins et al., 1985), также как маркер конститутивного эндоцитоза, пероксидаза хрена, может поступать в клетку в одних пузырьках с ростовыми факторами (Synnes et al., 1999).

Заключение диссертации по теме «Гистология, цитология, клеточная биология», Меликова, Мария Сергеевна

6. ВЫВОДЫ

1. Рецептор в эндосомах не является прямой мишенью протеасом.

2. Действие синтетического ингибитора активности протеасом 1УЮ132 на прохождение ЭФР-рецепторных комплексов по эндоцитозному пути с наибольшей вероятностью связано с истощением внутриклеточного пула свободного убиквитина.

3. В ходе эндоцитоза рецептор подвергается нескольким актам убиквитинирования. Появление высокоубиквитинированных форм рецепторов ЭФР существенно как для их сортировки из ранних в поздние эндосомы, так и для полноценного созревания поздних эндосом.

4. Динамика убиквитинирования рецептора ЭФР в эндосомах коррелирует с фосфорилированием рецептора по тирозину и его ассоциацией с убиквитин-лигазой с-СЫ. Стимуляция эндоцитоза ЭФР приводит к образованию комплекса «с-СЫ-рецептор», а диссоциация комплекса происходит в поздних эндосомах, до попадания рецептора в лизосомы.

5. В сортировке рецепторов ЭФР в поздние эндосомы участвует Р13К III класса ЬУР834, а не рецептор-активируемая РОК I класса р85/р110.

6. Р13К регулирует более позднюю стадию в процессе перехода ЭФР-рецепторных комплексов из ранних эндосом в поздние, чем с-СЫ.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Меликова, Мария Сергеевна, 2005 год

1. Авров К.О., Благовещенская А.Д., Корнилова Е.С., Никольский Н.Н. 1996. Зависимость типа эндоцитоза ЭФР-рецепторных комплексов от базального уровня активности тирозинкиназы рецептора эпидермального фактора роста. Цитология. 38(10): 1084-1091.

2. Благовещенская А.Д., Соколова И.П., Корнилова Е.С., Никольский Н.Н. 1994. Зависимость эндоцитоза эпидермального фактора роста от степени занятости рецепторов. Цитология. 36(7): 664-674.

3. Вдовина И.Б., Бурова Е.Б., Корнилова Е.С., Никольский Н.Н. 1993. Сравнительный анализ раннего и позднего эндоцитоза эпидермального фактора роста в клетках А431. Цитология. 35 (2): 60-67.

4. Железнова Н.Н., Никольский Н.Н., Корнилова Е.С. 2001. Влияние вортманнина на эндоцитоз рецепторов эпидермального фактора роста. Цитология. 43 (2) : 156-165.

5. Корнилова Е.С., Соркин А.Д., Никольский Н.Н. 1987. Динамика компартментализации эпидермального фактора роста в клетках А431. Цитология. 29: 904-910.

6. Медведева Н.Д. Евдонин А.Л., Цупкина Н.В., Константинова И.М. 2002. Рецептор ЭФР деградирует по протеасом-зависимому пути в клетках А431. Цитология. 44 (7): 697-701.

7. Меликова М.С., Филатова М.М., Корнилова Е.С. 2003. с-СЫ -полифункциональный регулятор клеточных процессов. Цитология. 45(11) : 11341148.

8. Никольский Н.Н., Соркин А.Д., Сорокин А.Б. 1987. Эпидермальный фактор роста. Л.: Наука. 200 с.

9. Соколова И.П., Арнаутов A.M., Никольский Н.Н., Корнилова Е.С. 1998. Исследование ассоциации малой ГТФазы Rab7 с эндосомами клеток, экспрессирующих нормальный и мутантные формы рецептора эпидермального фактора роста. Цитология. 27(12): 1367-1373.

10. Achiriloaie М., Barylko В., Albanesi J.P. 1999. Essential role of the dynamin pleckstrin homology domain in receptor-mediated endocytosis. Mol. Cell Biol. 19: 1410-1415.

11. Alwan H. A. J., Everardus J. J. van Zoelen, and Jeroen E. M. van Leeuwen. 2003. Ligand-induced Lysosomal Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) Degradation Is Preceded by Proteasome-dependent EGFR De-ubiquitination. J. Biol. Chem. 278: 35781-35790

12. Amerik A.Y., Nowak J., Swaminathan S., Hochstrasser M. 2000. The Doa4 deubiquinating enzyme is functionally linked to the vacuolar protein-sorting and endocytic pathway. Mol. Biol. Cell. 11 : 3365-3380.

13. Andoniou C., Thien C., Langdon W. 1994. Tumour induction by activated abl involves tyrosine phosphorylation of the product of the cbl oncogene.EMBO J. 13:4515-14523.

14. Andoniou C., Thien C., Langdon W. 1996 .The two major sites of cbl tyrosine phosphorylation in abl-transformed cells select the crkL SH2 domain. Oncogene. 12:1981-1989.17.18,19,20,21,22.