Клонирование, экспрессия и поиск белков-партнеров нового селен-содержащего белка млекопитающих: SelV тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.03, кандидат биологических наук Варламова, Елена Геннадьевна

• Варламова, Елена Геннадьевна
• кандидат биологических наук
• 2012

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Варламова, Елена Геннадьевна

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИИ

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Селеноцистеин-двадцать первая аминокислота

1.1. Химический элемент селен. Преимущества перед серой

1.2. Эволюционное происхождение селеноцистеина

1.2.1. Идентификация селен- содержащих белков т бШсо

1.2.2. Филогенетическое распределение селен- содержащих белков

1.3. Биосинтез и механизм встраивания селеноцистеина в синтезируемые полипептидные цепи

2. Роль селена в здоровье человека

2.1. Участие селена в сперматогенезе

2.2. Селен-содержащие белки, экспрессирующиеся в семенниках

3. Суперсемейство тиоловых оксидоредуктаз

3.1. Яс1х- семейство тиоредоксин подобных белков

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

1. Материалы

2. Методы

2.1. Биоинформационный анализ

2.2. Выделение нуклеиновых кислот

2.3. Методика проведения обратной транскрипции и ГТЦР

2.4. Клонирование и сайт- направленный мутагенез

2.5. Экспрессия и очистка рекомбинантного белка

2.6. Идентификация белков- партнеров методами аффинной хроматографии и ко- иммуннопреципитации

2.7. Транзиентная трансфекция, иммунофлюоресценция, конфокальная микроскопия

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Биоинформационный анализ первичной последовательности 8еГУ

2. Определение внутриклеточной локализации 8е1У и его 14- и С-концевых доменов

3. Идентификация белков-партнеров БеГУ

4. Исследование специфичности взаимодействия 8е1У с его потенциальными партнерами методом ко-иммунопреципитации

5. Определение степени ко-локализации 8е1У и его белков-партнеров

6. Экспрессия мРНК 8еГУ в семенниках крысы в процессе сперматогенеза и онтогенеза

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

СПИСОК ПУБЛИКАЦИИ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ

Se селен

Sec селеноцистеин

SelH селен-содержащий белок H

SelL селен-содержащий белок L

SelM селен-содержащий белок M

SelT селен-содержащий белок Т

SelV селен-содержащий белок V

SelW селен-содержащий белок W

GPX глутатионпероксидаза

OGT О-связанная N- ацетилглюкозаминтрансфераза

д^ семейство белков, содержащих анкириновые повторы и

SOCS-домен-супрессор сигнализации цитокинов

Тгх тиоредоксин

GSH глутатион восстановленный

с„ „тс последовательность, необходимая для встраивания Sec в

oxido

полипептиды

РАСАР пептид, активирующий аденилатциклазу

ОТ-ПЦР обратно-транскриптазная полимеразная цепная реакция

ПЦР полимеразная цепная реакция

ПААГ-электрофорез электрофорез в полиакриламидном геле

dNTP смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов

SDS додецилсульфат натрия

DTT дитиотрейтол

BSA бычий сывороточный альбумин

GFP зеленый флуоресцентный белок

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Клонирование, экспрессия и поиск белков-партнеров нового селен-содержащего белка млекопитающих: SelV»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы

Селен-содержащий белок V млекопитающих (SelV) относится к новому семейству Rdx белков, функции которых до конца остаются неизученными. Однако, наличие консервативного CXXC/CXXU (где С-цистеин, Х- любая аминокислота, U-селеноцистеин) мотива в каталитических центрах данных белков и тиоредоксин- подобной укладки свидетельствуют о их участии в окислительно-восстановительных реакциях [Dikiy A. et al., 2007].

Из двадцати пяти селен- содержащих белков человека, четыре, включая SelV, являются представителями данного семейства (SelW, SelH, SelT и SelV), среди которых первым был открыт SelW, обладающий способностью связываться в нативных условиях с 14-3-3 белками, составляющими большой класс белков, вовлеченных в ключевые физиологические процессы [Darling D.L. et al., 2005; Pozuelo R.M. et al., 2004; Van Heusden G.P.H.]. Важная роль в сопротивляемости клеток окислительному стрессу, индуцированному перекисью водорода [Novoselov S.V. et al., 2007], а также в ингибировании процесса образования супероксид аниона посредством поддержания уровня глутатиона в клетках [Ben Jilani К.Е. et al., 2007], принадлежит другому представителю Rdx семейства- селеновому белку Н. При изучении SelT впервые было показано вовлечение селен- содержащих белков в

ГЧ 2+

поддержание Са -гомеостаза и контроль секреторной активности, что позволяет лучше понять роль селена в предотвращении человеческих болезней и рака.

Изучение нового белка осуществляется, как правило, по трем направлениям: определяется первичная структура белка, исследуется его локализация на клеточном и тканевом уровнях, осуществляется функциональная характеристика белка.

На данный момент известно, что селен-содержащий белок V млекопитающих (36.7 kDa) является гомологом известного белка SelW и несет дополнительный N- концевой пролин- богатый домен, кроме того, показано, что мРНК SelV экспрессируется исключительно в семенниках (сперматоцитах). Одним из основных эффектов селена считается его влияние на мужскую фертильность, что особенно хорошо показано на моделях животных с нарушенным синтезом и/или метаболизмом селен- содержащих белков. Эти данные дают основание предположить, что SelV может играть важную роль в сперматогенезе [Kryukov G.V. et al., 2003], поэтому выяснение механизмов функционирования данного белка является крайне актуальной проблемой.

Данная работа посвящена исследованиям внутриклеточной локализации, поиску белков- партнеров SelV, а также определению экспрессии его мРНК на ключевых стадиях сперматогенеза и онтогенеза млекопитающих. Полученные в ходе нашей работы результаты способствуют установлению роли SelV в белковых комплексах или в метаболических путях, что очень важно для накопления фундаментальных знаний.

Цель работы

Клонирование, экспрессия и поиск белков-партнеров нового селен-содержащего белка млекопитающих (SelV).

Задачи работы

1. Клонирование полученных путем сайт-направленного мутагенеза вариантов рекомбинантного SelV мыши {Mus mus cuius) в составе векторов, предназначенных для экспрессии в прокариотической и эукариотической системах.

2. Определение локализации полноразмерного SelV, а также его N- и С-концевого доменов в клетках млекопитающих линии COS-7.

3. Поиск белков-партнеров SelV методом аффинной хроматографии в тандеме с масс-спектрометрическим анализом.

4. Исследование специфичности белок-белковых взаимодействий SelV и его партнеров методами коиммунопреципитации и ко-локализации в клетках млекопитающих линии COS-7.

5. Выявление экспрессии мРНК SelV, полученной на различных стадиях сперматогенеза и онтогенеза крысы (Rattus norvegicus), с помощью ПЦР.

Научная новизна работы

Впервые определена локализация SelV в клетках млекопитающих. Методом аффинной хроматографии в тандеме с масс-спектрометрическим анализом идентифицированы возможные белки-партнеры SelV, взаимодействующие с ним путем образования межмолекулярных селенид-сульфидных связей. Ими оказались О- ацетилглюкозаминтрансфераза (OGT), а также Asb-9 и Asb-17, относящиеся к семейству ASB (семейство белков, содержащих анкириновые повторы и SOCS-домен-супрессор сигнализации цитокинов). Проверена специфичность данных белок- белковых взаимодействий методам коиммунопреципитации потенциальных партнеров на аффинном матриксе, а также путем определения степени их совместной локализации в клетках млекопитающих. Определена локализация рассматриваемых белков-партнеров SelV в клетках млекопитающих линии COS-7. Установлено наличие экспрессии мРНК SelV в процессе онтогенеза и сперматогенеза крысы.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Селеноцистеин- двадцать первая аминокислота

Универсальный генетический код предусматривает возможность кодирования только двадцати «канонических» аминокислот, тогда как селеноцистеин (Sec), являющийся двадцать первой аминокислотой, кодируется одним из трех известных стоп-кодонов (UGA). Для того чтобы аппарат синтеза белка интерпретировал данный кодон как селеноцистеиновый, необходимо наличие в З'-нетраслируемой области гена эукариотического селенового белка определенной последовательности нуклеотидов, называемой SECIS (selenocystein insertion sequence). Селеноцистеин является обязательным компонентом нескольких важных ферментов в организме млекопитающих, простейших, бактерий и архей. Белки, содержащие данную аминокислоту, называются селенопротеинами. В геноме человека содержится двадцать пять селенопротеинов, поэтому селен является необходимым компонентом питания, и его недостаток приводит к различным заболеваниям.

1.1. Химический элемент селен. Преимущества перед серой

Селен- химический элемент, открытый И. Я. Берцелиусом в 1817 г.,

обозначается символом Se (лат. Selenium). Наряду с кислородом, серой,

теллуром, полонием селен относится к элементам главной подгруппы VI

группы периодической системы, называемым халькогенами, атомы которых

имеют одинаковое строение внешнего энергетического уровня, что

обусловливает схожесть их физико-химический свойств. В природе селен в

большей степени представлен в качестве селеноцистеиновой аминокислоты,

отличающейся от цистеиновой наличием селена вместо серы. Подобная

замена вполне понятна и объясняется тем фактом, что по своим физико-

химическим свойствам: размеру атомного радиуса, значению

8

электроотрицательности, степени окисления, селен ближе именно к сере, чем к другим вышеперечисленным халькогенам. Несмотря на это, всё же существуют биохимические различия между цистеином и селеноцистеином в белках [Wessjohann L.A. et al., 2007].

В первую очередь, это обусловлено значительной разницей в величине рКа (отрицательный логарифм константы кислотности Ка), которая для селеноцистеина (селенолата) составляет 5.2, а в случае цистеина (тиолата) равна 8.5 [Arner E.S., 2010], следовательно, селен-содержащие белки обладают большей каталитической активностью, что и было экспериментально подтверждено рядом авторов [Jacob С. et al., 2003; Johansson L. Et al., 2005].

Во-вторых, установлено, что нуклеофильность (или нуклеофильная активность), которая определяется величиной рКа, поляризуемостью, электроотрицательностью и атомным радиусом, селеноцистеина выше, чем у цистеина [Wessjohann L.A. et al., 2007; Arner E.S., 2010]. При сравнении химических активностей производных 2,6-диметоксифенила с соединениями серы и селена, последние проявили более высокую нуклеофильность, и тем самым, большую реакционную способность [WadaM. et al., 1999].

Кроме того, с помощью ЯМР-спектроскопии было показано, что благодаря более высокой нуклеофильности селена при физиологических

п

значениях рН реакции селенол/диселенидного обмена протекают в 10 быстрее, чем реакции тиол/дисульфидного обмена [Pleasants J.С. et al., 1989]. Селеноцистеин взаимодействует с электрофильными соединениями, такими как хлоруксусная кислота или хлорацетамид, и тем более с йодоацетатной кислотой или йодацетамидом, намного быстрее, чем цистеин.

Помимо этого, преимущества селеноцистеина перед цистеиновой аминокислотой ранее были выявлены при рассмотрении механизма активации Sec в каталитических реакциях с участием известных селен-

содержащих белков: тиоредоксин редуктазы млекопитающих, формиат дегидрогеназы и глутатион пероксидазы [Flohe et al., 1973; Rotruck et al., 1973; Gladyshev et al., 1996; Tamura and Stadtman, 1996; Gromer et al., 1998; Kryukov G.V. et al., 2003].

1.2. Эволюционное происхождение селеноцистеина

Одним из основных направлений при изучении эволюционного происхождения белков является тщательный анализ геномов организмов, относящихся к различным доменам жизни. Несмотря на некоторые проблемы, возникающие при идентификации селен- содержащих белков, количество селенопротеиновых семейств значительно увеличилось за последние четыре десятилетия, в частности, благодаря биоинформационным подходам, компьютерным программам, специально разработанным алгоритмам.

1.2.1. Идентификация селен- содержащих белков in silico

Идентификация селенопротеиновых генов in silico, как правило, основана на анализе структурных и термодинамических особенностей SECIS-элементов и консервативности их последовательности в селенопротеиновых генах (программы SECISearch 1.0, SECISearch 2.0, SECISblastn), на обнаружении TGA кодонов в открытых рамках считывания этих генов (программа geneid, MSGS критерии) [Kryukov G.V. et al., 1999; Lescure A. et al.,1999; Kryukov G.V. and Gladyshev V.N., 2002; Castellano S. et al., 2003].

Использование указанных компьютерных программ, а также

разработанного для поиска селенопротеинов алгоритма, позволило

идентифицировать в геноме млекопитающих 24 селеновых белка, которые

затем были проанализированы на наличие гомологов. Результатом этого

анализа явилось обнаружение 25-го селен- содержащего белка человека,

названного глутатионпероксидазой 6 (GPx6), который не был

ю

идентифицирован программой SECISearch, поскольку его мышиный и крысиный ортологи не имели SECIS- элементов и содержали цистеин вместо селеноцистеина [Kryukov G.V. et al., 2003].

В настоящее время создана база данных SelenoDB 1.0, содержащая информацию о эукариотических селенопротеиновых генах, структуре SECIS-элементов, что является крайне необходимым для корректного аннотирования постоянно растущего количества селенопротеиновых генов [Castellano S. et al., 2008].

SelenoDB 1.0 позволяет анализировать три типа последовательностей для идентификации селенопротеинов и их гомологов: геномы, транскрипты (кДНК, ESTs), последовательности белков и их фрагментов. В основе поиска новых генов селен- содержащих белков лежит сравнительный анализ неизвестных последовательностей с уже имеющимися в основных базах данных (Ensembl, GenBank, RefSeq) [Pruitt K.D., 2007] последовательностями генов селен-содержащих белков человека или других видов, что осуществляется путем использованием программ BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) [Altschul S.F. et al., 1997] и HMMER (Hidden Markov Models) [Eddy S.R., 1999].

Для предсказания кодирующих и не кодирующих областей генов используют программы Spidey [Wheelan S.J. et al., 2001], Exonerate [Slater G.S. and Birney E., 2005]. Поиск SECIS-элементов в селенопротеиновых генах эукариотических организмов осуществляется с помощью программы SECISearch, в генах прокариот- bSECISearch [Kryukov G.V. et al., 1999].

Совокупность вышеперечисленных биоинформатических методов, компьютерных программ в формате SelenoDB 1.0 позволяет осуществлять последовательный и корректный поиск новых селен- содержащих белков. В настоящий момент SelenoDB 1.0 включает 81 селенопротеиновый ген различных эукариотических видов, в том числе, Homo sapiens, Drosophila

melanogaster, Caenorhabditis elegans, содержит информацию о селенопротеинах 20 различных семейств [Castellano S. et al., 2008].

Таким образом, на данный момент идентифицировано 25 селен-содержащих белков человека, тогда как мышиный и крысиный селенопротеомы представлены 24 белками. Большая часть из них может быть классифицирована на две группы на основании локализации селеноцистеина [Hatfield D.L., 2001]. К первой относятся селенопротеины, характеризующиеся наличием селеноцистеина в С- концевой последовательности этих белков. Так, у тиоредоксинредуктаз млекопитающих, содержащих GCUG мотив, селеноцистеин локализован в подвижном С- концевом положении [Sun Q.A. et al., 1999], что позволяет каталитическому центру осуществлять перенос восстановленных эквивалентов от трудно доступного дисульфид-активного сайта на активный центр белка-субстрата. В случае тиоредоксин редуктазы 2 (TR 2), содержащей N- концевой тиолдисульфидоксидоредуктазный домен, селеноцистеиновый центр данного белка осуществляет перенос электронов к этому домену [Sun Y. et al., 2001].

Вторая селенопротеиновая группа включает белки, содержащие селеноцистеин в N- концевой позиции коротких доменов. Это большая группа а/р белков, у которых, в соответствии со вторичной структурой, селеноцистеин- содержащий каталитический центр локализован между а-спиралью и (3-слоем, подобно расположению СХХС мотива (последовательность, в которой два цистеина разделены двумя другими аминокислотами) оксидоредуктаз, вовлеченных в тиол-дисульфидный обмен. Селеноцистеин в редокс центре может замещать как N- так и С- концевой цистеин с образованием CXXU/UXXC мотивов.

Независимо от локализации селеноцистеина в функционально

охарактеризованных белках, можно заключить, что данная аминокислота в

составе каталитического центра принимает участие в окислительно-

12

восстановительных реакциях, однако функции других селен- содержащих беков остаются неизученными [Hatfield D.L. and Gladyshev V.N., 2002].

При анализе прокариотических геномов на наличие селен- содержащих белков были разработаны подобные подходы, основанные на том, что все селенопротеины имеют ортологи, которые содержат консервативные цистеиновые остатки вместо селеноцистеиновых. Несмотря на то, что данный подход является не совсем достоверным, было показано, что только 20% эубактерий, геномы которых полностью расшифрованы, содержат гены селенопроинов. Кроме того, известно, что встраивание селеноцистеина в белки у прокариот происходит с участием определенных цис- и трансактивных факторов, в частности, селеноцистеин синтетазы (SelA), селеноцистеин-специфичного фактора элонгации трансляции (SelB), селеноцистеиновой тРНК (SelC) и селенофосфат синтетазы (SelD), поэтому обнаружение генов, кодирующих данные белки, в составе геномов прокариот является существенным доказательством утилизации селен-содержащих белков этими организмами [Copeland P.R., 2005].

1.2.2. Филогенетическое распределение селен- содержащих белков

В последнее время большое внимание уделяется филогенетическому распределению селен- содержащих белков. Данные, касающиеся этой области исследования эволюции селенопротеинов, свидетельствуют о значительных различиях и мозаичности их распределения. Например, некоторые семейства этих белков присутствуют только у прокариот, тогда как геномы эукариотических организмов не содержат даже их цистеиновых гомологов [Copeland P.R., 2005].

Первым шагом при изучении эволюции селенопротеинов В.Н. Гладышевым и коллегами [Kryukov G.V. et al., 2003; Kryukov G.V. and Gladyshev V.N., 2004] был анализ последовательностей, входящих в состав большой базы данных Саргассового моря, который осуществлялся с

помощью методов in silico, описанных выше. Результаты данного анализа показали, что три селенопротеиновых семейства, которые, как считалось ранее, имеют исключительно эукариотическое происхождение, встречаются и у бактерий, обитающих в Саргассовом море: дейодиназы, глутатион пероксидазы и семейство S el W-гомо логичных белков. Помимо этого выяснилось, что встречаемость гена а-цепи формиат дегидрогеназы в геномах этой базы данных минимально (приблизительно 3% от всех селенопротеиновых генов). Таким образом, всего было идентифицировано 310 известных и новых селенопротеинов при анализе 811372 последовательностей, причем 88% селен-содержащих белков относятся к одному из трех семейств: SelW- подобных белков, пероксиредоксинов и пролинредуктаз. Остальные 12% имеют принадлежность к 22 другим семействам селен- содержащих белков [Zhang Y. et al., 2005].

Поскольку база данных Саргассового моря представлена 1800 видами, сложно было сделать предположение относительно процентного соотношения видов, несущих гены селенопротеинов к видам, не обладающим этими генами. Однако поиск в этой базе данных высоко консервативных генов, содержащих UGA кодон в открытой рамке считывания, идентифицировал от 341 до 569 видов. Такое мозаичное распределение селенопротеиновых генов, наблюдаемое при анализе геномов, представленных в базе данных Саргассового моря, характерно для всех доменов жизни (таблица 1).

На данный момент существует гипотеза относительно данного феномена, согласно которой, подобная мозаичность объясняется снижением утилизации селен- содержащих белков организмами, обитающими в морской воде, ввиду относительно постоянного поступления в неё селена [Copeland P.R., 2005].

Таблица 1. Мозаичный характер распределения селенопротеиновых генов

среди доменов жизни

Домены Тип Геномы, содержащие Общее количество

жизни селенопротеиновые гены геномов

АсНпоЬайепа 2 18

Ас]ш'Лсае 1 1

Bacteroidetes/Chlorobi 0 5

СЫату&ае/УегтсогтсгоЫа 0 9

Chloroflexi 1 1

СЬгуБ^епйез -

СуапоЬайепа 1 9

ОеРетЪааегез -

Оетососсиз-ТЬеппиБ 1 3

ЕиЬасЛепа Dictyoglonli -

Fibrobacteres/Acidobacteria -

Ритша^еэ 9 58

РшоЬайепа 0 1

Gemmatimonadetes -

Кйгториае -

Р1апйошусе1ез 0 1

РгсЛеоЬайепа 29 95

8р1госНае1сз 1 6

ТЬегтс^езиИЪЬасЛепа -

Thermotogae 0 1

Сгспагс11асо1а 0 4

АгсЬаеа ЕигуагсЬае^а 4 16

(МеШаг^епев) (4) (6)

КогагсЛаесЛа -

Рго11315 1 1

Еикагуа Рта§1 0 л

Р1аШае 0 8

АттаНа 7 7

Тогда как локальное распределение данного микроэлемента на суше привело к существенной необходимости утилизации селен-содержащих белков наземными организмами, особенно обитающими в тех местах, где наблюдается острый дефицит селена. Так или иначе, обнаружение новых селенопротеиновых прокариотических семейств в базе данных Саргассового моря позволило расширить представление о филогенезе и явилось свидетельством независимого эволюции трех селенопротеиновых семейств (глутатионпероксидазного, дейодиназного и семейства SelW-гомологичных белков), встречающихся и у прокариот, и у эукариотических организмов.

Функции, которые выполняют различные селен-содержащие белки бактерий и архей свидетельствуют о том, что изначально данные ферменты были вовлечены в катаболические процессы, тогда как эукариотические селенопротеины, чьи функции известны, участвуют в NADPH-зависимых дисульфидоксидоредуктазных анаболических и регуляторных процессах (тиоредоксинредуктазы, глутатионпероксидазы, дейодиназы). При сравнении последовательностей селен-содержащих белков бактерий, архей и эукариотических организмов, было установлено, что только фермент селенофосфатсинтетаза, участвующий в процессах биосинтеза селеноцистеина, присутствует в селенопротеомах организмов, относящихся к трем различным доменам жизни, что является очередным доказательством отсутствия связи эволюционного развития этих селенопротеомов [Zhang Y. et al„ 2005].

Если говорить об эволюции селенопротеинов от низших к высшим эукариотическим организмам, то существует ряд данных, свидетельствующих о том, что она шла в направлении замещения цистеинового остатка селеноцистеиновым в их первичной последовательности. Так, например, фермент тиоредоксинредуктаза во всех охарактеризованных геномах грибов и низших растений, у которых она носит название малой тиоредоксин редуктазы, представлена как

цистеиновый гомолог большой тиоредоксин редуктазы (TRx) животных. Более того, в геноме Drosophila melanogaster содержится два гена, кодирующих цистеин-содержащую форму большой TRx, в геноме Caenorhabditis elegans- два гена большой TRx, один из которых кодирует селеноцистеин-содержащую форму данного фермента, а в геноме млекопитающих обнаружено три гена, каждый из которых кодирует её селеноцистеиновый вариант [Sun Q.-A. Et al., 1999].

Помимо этого, существует предположение о том, что гены, кодирующие некоторые селен-содержащие белки, могли возникнуть путем дупликации отдельных генов. Ярким примером, свидетельствующим в пользу данной гипотезы, является наличие удвоенных копий генов некоторых эукариотических селенопротеинов (глутатионпероксидазы 1 и 4, селенового белка SelT), а также селеноцистеиновой тРНК, гены которых были обнаружены в геноме zebrafish. Интересно также, что селен-содержащий белок SelP, представленный исключительно у позвоночных, содержит в своем составе несколько остатков селеноцистеина (от 10 до 17 в зависимости от вида) [Burk R.F. and Hill К.Е., 1999; Xu X.M. et al., 1999; Kryukov G.V. and Gladyshev V.N., 2000].

Таким образом, несмотря на то, что к настоящему моменту накоплено достаточно много информации о селен- содержащих белках, входящих в состав селенопротеомов различных организмов, большое количество вопросов, касающихся их эволюции, остаются открытыми. Хотя существует немало доказательств в пользу гипотезы о независимом развитии селен-содержащих белков в трех доменах жизни, наличие противоречивых данных, всё же, дает основания для рассмотрения других объяснений процесса их эволюции.

1.3. Биосинтез и механизм встраивания селеноцистеина в синтезируемые полипептидные цепи

Биосинтез селеноцистеина и его встраивание в синтеируемые полипептиды был описан для трех доменов жизни. В отличие от других двадцати аминокислот, он осуществляется на собственной тРНК, названой Sec tRNA [Ser]Sec [Lee B.J. et al., 1989; Leinfelder W. et al., 1989], которая на первом этапе аминоацилируется с серином в присутствии серил- тРНК-синтетазы. Впервые механизм биосинтеза селеноцистеина был описан у бактерий в начале 1990-х гг. [Forchhammer К. and Bock А., 1991; Forchhammer К., Boesmiller К., Bock А., 1991; Forchhammer К., 1991].

Было показано, что бактериальная Sec синтаза (8ес8)-пиридоксаль фосфат (PLP)-3aBHCHMbffl белок, катализирующий перенос гидроксильной группы с серина на аминоакрилиловый посредник, который выступает в качестве акцептора, необходимого для активации селена. В результате приведенных последовательных реакций формируется селеноцистеил- tRNA [Ser]Sec ^^ дк ^ ^ т1. Hatfield £).L., 2001]. Активация селена

происходит в результате реакции фосфорилирования селенида, при участии селенофосфатсинтетазы (SPS), известной как SelD у эубактерий, и АТФ [Glass R.S. et al., 1991]. Относительно недавно была описана система биосинтеза селеноцистеина для эукариот и архей [Amberg R. et al., 1996; Guimaraes M.J. et al., 1996; Kaiser J.T. et al., 2005], принципиальным отличием которой является наличие дополнительного этапа, заключающегося в синтезе О- фосфосерил- тРНК [Ser]SecB присутствии фосфосерил - tRNA tSerISec_ киназы (PSTK). Схематически процесс биосинтеза селеноцистеина у эукариот, предложенный Xu Х.М. et al. [Xu Х.М. et al., 2007] изображен на рисунке 1 :

Рис.1 Процесс биосинтеза селеноцистеина у эукариот

Известно, что UGA является терминирующим трансляцию кодоном, но при наличии определенных цис- и транс- активных факторов: SECIS-элемента (Sec Insertion Sequence) [Low S.C. and Berry M.J., 1996]; SBP2 (SECIS-Binding Protein 2) [Copeland P.R. et al., 2000; Copeland P.R. et al., 2001; Low S.C. et al., 2000]; Sec tRNA [Ser]Sec; EFsec (Sec- specific Elongation Factor) [Fagegaltier D. Et al., 2000; Hatfield D.L. and Berry M.J., 2000] и др.- кодирует селеноцистеин.

Ключевым транс- активным фактром в процессе биосинтеза селеноцистеина является Sec tRNA [Ser]Sec [Bock A.K. et al., 1991; Burk R. F., 1994], которая имеет отличительные особенности строения. Это самая длинная эукариотическая тРНК, 90 нуклеотидов длиной [Amberg R. et al., 1993; Diamond A.M. et al., 1981; Diamond A.M. et al., 1993; Hatfield D.L. et al., 1982], что обусловлено наличием нетипично длинной вариабельной петли, а также присутствием дополнительного нуклеотида в псевдоуридиновой петле (Т\|/С). В состав Sec tRNA fSer]Sec входит несколько модифицированных оснований [Chittum H.S. et al., 1997; Chittum H.S. et al., 1998; Choi I.S. et al., 1994; Hatfield D.L. and Gladyshev V.N., 2002].

Необычен и механизм транскрипции этой тРНК, который начинается с

первого нуклеотида кодирующей последовательности [Lee B.J. et al., 1987], a

19

не с лидерной последовательности, что характерно для других тРНК. Ген, кодирующий Sec tRNA [Ser]Sec у позвоночных, за исключением zebrafish [Xu Х.М. et al., 1999], представлен единственной копией на геном, размером 87 п.н. Терминирующая ССА последовательность присоединяется посттранскрипционно [Hatfield D.L. and Gladyshev V.N., 2002].

В клетках млекопитающих содержится две основные изоформы селеноцистеиновой тРНК, отличающиеся друг от друга наличием метальной группы в 34 позиции антикодоновой петли, присоединение которой является конечным этапом в процессе созревания Sec tRNA[Ser]Sec [Diamond A.M. et al., 1993].

Структура SECIS элемента эукариот представлена двумя спиральными участками (helixl, helix2), разделенными внутренней петлей (internal loop), центральным участком, названным квартетом, который представлен четырьмя не спаренными основаниями [Walczak R. et al., 1996].

Также имеется внешняя петля (apical loop), размер которой регулируется дополнительным министеблем [Diamond A.M. et al., 1993], по наличию или отсутствию которого, выделяют 2 структурные формы SECIS элементов [Grundner-Culemann Е. Et al., 1999].

В первичной структуре этого цис- активного фактора присутствуют консервативные нуклеотиды: последовательность UGA в 5'- позиции и GA в 3'-положении квартета. Во внешней петле имеется два консервативных аденозина, что характерно для большинства селенопротеиновых генов [Korotkov K.V. et al., 2002], за исключением SECIS- элементов некоторых хламидомонад и селен-содержащих белков SelM и SelO [Kryukov G.V. et al., 2003; Low S.C. and Berry M.J., 1993], в которых вместо адениновых оснований располагаются цитозиновые.

SECIS- элемент находится в 3'-нетранслируемой области мРНК

селенопротеиновых генов эукариот и архей [Hatfield D.L., 2001; Rother М. et

20

al., 2001], тогда как у бактерий он локализован в кодирующей области генов, непосредственно за UGA кодоном.

Для вирусов было показано, что SECIS- элемент может располагаться как в 3'- нетранслируемой области (селенопротеиновый ген Molluscum contagiosum virus, гомологичный человеческому гену GPxl), так и в кодирующей области, что характерно для GPx4 гена fowlpox virus, и его цистеинового гомолога у canarypox virus [Mix Н. et al., 2007; Shisler J.L. et al., 1998].

Ученые объясняют подобное «перемещение» SECIS- элементов в 3'-нетранслируемую область эукариот тем, что процессы транскрипции и трансляции у них разобщены во времени и пространстве. Известно, что хеликазы нарушают вторичную структуру РНК и, тем самым, ингибируют связывание SECIS- элементов с SBP белками, поэтому сопряженность этих двух процессов у прокариот, обусловливает биосинтез селеноцистеина при наличии SECIS- элемента в кодирующей области генов. Это подтверждается экспериментальными данными о том, что встраивание последовательностей SECIS- элементов вирусов в кодирующую область селенопротеиновых генов млекопитающих сильно снижает их экспрессию [Mix Н. et al., 2007].

Открытие эукариотического SECIS- элемента в 1991 г. [Berry M.J. et al., 2003] дало основание для проведения исследований, направленных на поиск связывающихся с ним факторов, результатом которых явилось открытие SBP2, выделенного из тестикулярного экстракта крысы [Copeland P.R. and Driscoll D.M., 1999]. Это белок, массой 94 kDa, специфично взаимодействующий с SECIS- элементом в области квартета, либо с предшествующей ему последовательностью с образованием комплекса SBP2-SECIS [Copeland P.R. et al., 2001; Fletcher J.E. et al., 2001].

Структурно-функциональный анализ SBP2 выявил наличие 3 основных доменов: N- концевой домен (1- 399 а.о.), присутствующий только у высших

эукариот, несет в себе сигнальную последовательность для ядерной локализации SBP2, функциональный домен (399- 517 а.о.), мутации в котором приводят к снижению эффективности связывания этого белка с рибосомами и РНК-связывающий домен (517-777 а.о.), имеющий консервативную последовательность L7AeRNA, необходимую для взаимодействия с 28S рРНК [Copeland P.R. et al., 2001]. Установлено, что посредством РНК- связывающего домена, SBP2 взаимодействует с SECIS-элементом, однако до конца этот механизм не понятен [Copeland P.R. et al., 2000; Fagegaltier D. Et al., 2000; Tujebajeva R.M. et al., 2000].

Одной из наиболее вероятных функций SBP2 является непосредственное/ опосредованное участие в связывании SECIS- элемента с фактором элонгации eEFSec, что способствует продвижению Sec tRNA rSci'Sec по рибосоме [Hatfield D.L. and Gladyshev V.N., 2002]. Сформировавшийся комплекс SECIS- SBP2- 28S rRNA- EFsec взаимодействует с Sec tRNA[Ser]Sec , что обусловливает встраивание селеноцистеина в растущий полипептид напротив UGA кодона [Fagegaltier D. Et al., 2000; Tujebajeva R.M. et al., 2000].

На рисунке 2 представлено схематическое изображение процесса встраивания селеноцистеина в растущий полипептид эукариот [Hatfield D.L. and Gladyshev V.N., 2002].

Рис.2. Механизм встраивания селеноцистеина у эукариот

2. Роль селена в здоровье человека

Селен является одним из важных пищевых антиоксидантов, способствующим детоксикации активных форм кислорода в организме и служит ключевым компонентом двадцати пяти селенопротеинов, необходимых для нормального здоровья.

Известно, что недостаток поступления селена в организм человека и животных вызывает одну из разновидностей гипомикроэлементозов, называемую гипоселенозом. Дефицит данного микроэлемента у домашних животных и птиц вызывает беломышечную болезнь, которая характеризуется замедлением роста, потерей массы тела, нарушением репродуктивной функции и выпадением шерсти. Патоморфологические изменения проявляются очаговыми деструктивно- некробиологическими процессами в скелетных мышцах и миокарде, исчезновением миоглобина из пораженных мышечных волокон, некрозом печени, дистрофией почек. Введение в рацион питания селена предупреждает эти процессы [Кактурский Л.В и др., 1990].

Гипоселенозы наиболее вероятно развиваются у жителей, проживающих в районах с выраженным недостатком селена в почвах и продуктах питания. Наиболее ярким проявлением эндемического гипоселеноза является болезнь Кэшан, получившая название от города Кэшань на северо- востоке Китая, где в 1935 году была зарегистрирована массовая вспышка данного заболевания, поразившего около 5 млн. человек. В этом эндемическом районе наблюдается острый недостаток селена в почвах и пищевых продуктах, а его содержание в крови и волосах больных резко снижено до 5-10 мкг/л и 0.03- 0.12 мкг/л при норме 90-150 мкг/л и 0.20.8 мкг/л соответственно [Авицин А.Л. и др., 1991; Ермаков В.В., 1999; Лужен Г., 1995; Никитина Л.П. и др., 1995].

Долгое время считалось, что дефицит селена- единственный фактор, способствующий развитию данного заболевания. В настоящее время

показано, что причина болезни Кэшан- энтеровирусная инфекция (Coxsackivirus ВЗ) [Beck М.А. et al., 1994] на фоне глубокого селенодефицита и недостаточного поступления кальция [Ge L.Y., 1993]. Причем пищевой оксидативный стресс (недостаток селена и витамина Е) позволяет Coxsackivirus ВЗ мутировать в вирулентный штамм, вызывающий поражение сердца, сопровождающееся увеличением его размеров (кардиомегалией), аритмией, фокальными некрозами миокарда. У взрослых основные патологические изменения представлены мультифокальным некрозом миокарда, циррозом, повреждением скелетных мышц. Заболевание имеет высокий процент летальности. Смертность при болезни Кэшана связана с нарушением антиокислительной активности крови и патологией обмена жирных кислот [Hensrud D.D. et al., 1994].

Другим заболеванием, вызванным дефицитом селена и распространенным, главным образом, в эндемических очагах Забайкалья, особенно в районе реки Уров, является болезнь Кашина- Бэка (уровская болезнь), описанная в 1848 году. Это остеопатия, поражающая преимущественно детей 6-13 лет (пик заболеваемости приходится на 8 лет) [Авицин А.Л. и др., 1991; Бек Е.В., 1996; Ермаков В.В., 1999; Никитина Л.П. и др., 1995], приводящая к некрозу суставов, вызванного окислительным стрессом в хрящевой ткани, деформации костей, структурному недоразвитию пальцев и костей, задержке роста и карликовости. Болезнь купируется при переезде в здоровую местность, но изменения костей и суставов необратимы [Ермаков В.В., 1999].

К другим эндемическим районам можно отнести Восточную Финляндию, Новую Зеландию, Белоруссию, некоторые районы Украины, Ярославскую область и некоторые районы северо- запада России.

Симптоматика заболеваний, вызванных недостаточным поступлением микроэлемента в организм человека, достаточно разнообразна.

Концентрация селена в сыворотке крови ниже 45 мкг/л является предрасполагающим фактором развития онкологических заболеваний [Torra М. Et al., 1997]. Данный микроэлемент обладает канцеропротекторным действием из-за избирательного накопления в опухолевых клетках, причем его концентрации в жизнеспособной опухоли в 5- 10 раз выше, чем в некротизированной [Boone W.T., 1998]. Однако, в настоящее время в литературе отсутствуют доказательства механизма действия селена на процессы онкообразования. Очевидно, что эти механизмы многоплановы в зависимости от действия канцерогена или иной причины формирования опухоли.

В экспериментах на животных показано действие микроэлемента на иммунные процессы. Так, у селенодефицитных крыс снижен как клеточный, так и гуморальный иммунитет [Kukreja R. and Khan А., 1998]. Селен улучшает способность лимфоцитов отвечать на стимуляцию антигена, пролиферировать и дифференцировать [Kiremidjian-Schumacher L. Et al., 1998]. Прием препаратов селена уменьшает количество циркулирующих лейкоцитов и увеличивает отношение агранулоцитов к гранулоцитам у мышей [Hogan G.R., 1998].

Низкая концентрация селена в сыворотке крови обнаружена у больных циррозом печени, причем степень селенодефицита пропорциональна тяжести заболевания. Лечение препаратами селена, альфа-токоферола и цинка заметно снижает смертность больных активным алкогольным гепатитом с 40 до 65% [Burk R.F. et al., 1998].

Дефицит селена (ниже 45 мкг/л в сыворотке крови) [Torra М. Et al., 1997] является фактором риска развития коронарных заболеваний, особенно в случаях сочетания селенодефицита с дефицитом витамина Е [Parko А., 1992; Peng A. et al., 1992].

Установлена обратная зависимость величины артериального давления у больных гипертонической болезнью с наличием в питьевой воде повышенных концентраций селена. Среди лиц, употребляющих бедную селеном питьевую воду, распространенность артериальной гипертонии в два раза выше, чем при употреблении воды с адекватным содержанием элемента [Mihailovic М.В. et al., 1998; Moreno-Reyes R. Et al., 1998].

При дефиците селена возрастает вероятность развития мужского бесплодия, так как селен обладает выраженным защитным действием по отношению к сперматозоидам и обеспечивает их подвижность. Исследования выявили [Clark L.C. et al., 1996,], что биодобавки селена оказывают защитный эффект в отношении рака простаты, при этом лучшие результаты отмечены на начальных стадиях заболевания и у лиц с низким исходным селеновым статусом.

Badmaev et al. [Badmaev V. Et al., 1996] делает вывод о том, что селен является незаменимым элементом питания, предупреждающим развитие многих заболеваний. Эпидемиологические исследования устанавливают связь между низким содержанием селена в питании и повышенным риском кардиомиопатии, сердечно-сосудистых заболеваний и карциногенезом. Селен играет эссенциальную роль в антиоксидантной защите организма, функций щитовидной железы, клеточном иммунитете, спермогенезе и функции предстательной железы. Однако избыточное поглощение селена животными приводит к хроническим отравлениям, при этом у них проявляются выраженные признаки расстройства, такие как затрудненное дыхание, нарушение движения и позы и др. Таким образом, селен является и эссенциальным и токсичным одновременно, поэтому назначение селено-содержащих препаратов несет опасность передозировки при неконтролируемом применении.

2.1.Участие селена в сперматогенезе

Исследования, посвященные утилизации, распределению и потреблению данного микроэлемента млекопитающими, в которых основное внимание было уделено влиянию селена на развитие мужской репродуктивной системы, были опубликованы уже в 1957 [Schwarz К. et al., 1957; Schwarz К. and Foltz C.M., 1957]. В 1964 году появились первые данные о том, что при введении в организм высоких концентраций селена, его накопление, в значительной степени, происходит в семенниках и печени [Rosenfeld I., 1964]. Используя авторадиографический метод, было показано, что при введении изотопа селена (73Se) крысам, страдающим недостатком этого микроэлемента, он преимущественно локализовался в средней части сперматозоидов [Brown D.G. and Burk R.F., 1973]. Животные, страдающие острой селеновой недостаточностью, оказались бесплодными, их сперматозоиды обладали слабой подвижностью, нарушениями в морфологии, особенно в их средней части [Leopold Flohe.,2007].

К настоящему времени известно, что в естественных условиях селен поступает в организм человека и животных, главным образом, в виде селен-содержащих аминокислот: селенометионина и селеноцистеина. Однако у позвоночных селен входит в состав селенопротеинов исключительно в виде селеноцистеинового аминокислотного остатка, тогда как растительные организмы способны синтезировать селенометионин [Sunde R.A., 1990; Waschulewski I.H. and Sunde R.A., 1988].

К настоящему времени известно 25 селен-содержащих белков млекопитающих, почти половина из них, помимо распределения в других органах и тканях, локализуется в семенниках [Kryukov G.V. et al., 2003]. Поэтому изучение функциональной роли селен-содержащих белков, экспрессирующихся именно в этом органе, является крайне необходимым для того, чтобы приблизиться к пониманию механизма действия селена и его

вклада в поддержание нормального развития мужской репродуктивной системы.

2.2. Селен-содержащие белки, экспрессирующиеся в семенниках

Глутатионпероксидаза 4 (СРХ4, РКГСРх)

Четвертая глутатионпероксидаза (ОРх4), называемая также фосфолипидгидропероксид глутатионпероксидазой (РНОРх), является одним из семи, известных к настоящему времени, представителей семейства глутатионпероксидаз млекопитающих. По своей структуре ОРх4 является мономерным белком, содержащим селеноцистеиновый остаток в активном центре. Каталитический цикл с участием глутатионпероксидаз, представлен в виде уравнений 1-3 на рисунке 3 [Маюппо М. е1 а1., 2003]:

СРх-$е + Н+ + Н202 —СРх-БеОН + Н20 (1)

Срх-БеОН + ББН - —> СРх-Бе-ЭС +Н20 (2)

СРх-Бе-БС + вБН —> СРх-Бе" + 6556 + Н+ (3)

Рис. 3. Каталитический цикл глутатионпероксидаз

Фосфолипидглутатионпероксидаза способна восстанавливать широкий спектр гидропероксидов, начиная с перекиси водорода и заканчивая гидропероксидными группами сложных липидов в биологических мембранах [игаш Б. & а1., 1995], что свидетельствует о её антиоксидантных свойствах. Однако высокий уровень гонадотропин- зависимой экспрессии РНОРх в семенниках [Вп§е1ш5-Р1о11е ' Я., 1999; Коуеп А., 1992] позволяет расширить представления о функциональной значимости этого фермента.

Результаты in situ гибридизации [Maiorino M. J. et al., 1998; Nam S.Y. et al., 1998] показали, что GPx4 преимущественно экспрессируется на поздних стадиях сперматогенеза, в сперматидах, однако активность данного фермента сложно детектировать в зрелых сперматозоидах. Возможно, это объясняется изменением окислительно-восстановительного статуса на заключительных этапах сперматогенеза, которое обусловлено полным истощением глутатиона и постепенным окислением тиоловых групп белков в клетках [Bauche F. et. al., 1994; Shalgi R. et al., 1989].

Таким образом, GPx4, лишенная своего основного восстановителя (глутатиона), использует тиоловые группы белков в качестве альтернативных субстратов, тем самым формируя внутри- и межселенодисульфидные связи с другими белками. На этом этапе, данный процесс согласуется с ферментативной функцией, свойственной глутатионпероксидазам (уравнения 1 и 2 на рис.3). Однако замена GSH на SH-группы белков приводит к образованию промежуточного продукта GPx-Se-S-белок, который непросто восстановить вторым глутатионом, согласно уравнению 3 [Roveri А. et al., 2001]. В результате образуются нерастворимые, кератин-подобные, не обладающие ферментативной активностью соединения. В этом случае, восстановление активной GPx4 возможно только путем продолжительного воздействия на низкомолекулярные тиоловые группы [Ursini F. et al., 1999]. По-видимому, окислительная инактивация GPx4 является основным этапом при созревании сперматозоидов [Roveri А. et al., 2002].

В семенниках gpx-4 (ген, кодирующий GPx4) путем альтернативного использования стартовых кодонов экспрессируется в трех различных формах: цитозольной, ядерной и митохондриальной [Pfeifer Н. et al., 2001; Pushpa Rekha Т. et al., 1985].

Ядерная глутатионпероксидаза (snGPx, nPHGPx) является селен-

содержащим белком массой 34 kDa, транскрипт которой имеет

дополнительный экзон Еа [Maiorino М. et.al., 2003; Moreno S. G. et.al., 2003],

29

кодирующий две сигнальных последовательности, обусловливающие ядерную локализацию белка. Помимо этого, данная изоформа содержит участки, богатые аргинином и пролином, что напоминает структуру протамин- подобных белков, локализованных в ядрах сперматозоидов и участвующих в организации хроматина, обеспечивая его конденсацию и уменьшение размеров ядер сперматозоидов [Pfeifer Н. et al., 2001]. Было показано [Imai Н., F. et al., 2003; Yant L. J. et al., 2003], что делеция как Ea, так и остальных семи экзонов гена snGPx приводит летальному исходу мышей на ранних стадиях эмбриогенеза.

Выяснение физиологической роли snGPx, в частности, в процессе мужского гаметогенеза, сопровождалось получением модели трансгенной мыши, у которой отсутствовал ген snGPx. Такие мыши оказались фертильными, и фенотипически не наблюдалось различий между гетеро-, гомозиготами по гену snGPx и мышами дикого типа. С помощью гистологического и ультраструктурного анализов семенников и сперматозоидов в них также не было выявлено аномалий. Кроме того, данная модель показала, что исследуемый белок в условиях in vivo служит акцептором электронов не только от тиоловых групп глутатиона, но и от протамин-подобных белков [Conrad S. G. et. al., 2005].

Стабильность хроматина в ядрах сперматозоидов обусловлена образованием между протамин- подобными белками дисульфидных мостиков, данный процесс завершается в придатке семенника, когда приблизительно 90% тиолов окислены. Однако было показано, что в сперматозоидах, лишенных snGPx, наблюдается достаточно высокий уровень свободных сульфгидрильных групп, поэтому было высказано предположение, что snGPx4 является основным катализатором окисления тиоловых групп белков [Maiorino М. et.al., 1998; Roveri А. et al., 2001; Ursini F. et al., 1995].

При выяснении чувствительности хроматина сперматозоидов, изолированных из придатка семенника, к действию денатурирующих агентов, было показано, что у особей дикого типа устойчивость хроматина наблюдается уже при перемещении сперматозоидов в придаток семенника, тогда как инактивация snGPx4 приводит к её значительному снижению [Conrad S. G. et. al., 2005]. Таким образом, существует ряд доказательств, свидетельствующих о том, что ядерная глутатионпероксидаза участвует в процессах конденсации мужского гаплоидного генома, скорее всего, путем формирования дисульфидных мостиков в протамин- подобных белках.

Митохондриальная изоформа GPx4 локализуется преимущественно в средней части зрелого сперматозоида, и является структурным компонентом митохондриальной капсулы [Ursini F. et al., 1999], где она находится в инактивированной форме в составе высокомолекулярных комплексов с другими белками капсулы [Maiorino M. et al., 2005]. Механизм инактивации, вероятно, связан со значительным снижением количества глутатиона в процессе созревания мужских половых клеток [Shalgi R. et. al., 1989]. Подобно самцам, лишенным ядерной глутатионпероксидазы 4, мыши без митохондриальной изоформы данного белка фенотипически неотличимы от особей дикого типа, нарушения не наблюдается ни на стадии эмбрионального развития, ни в постнатальный период. Однако в связи с серьезными структурными нарушениями в средней части сперматозоида и ухудшениями качества спермы такие самцы оказываются бесплодными [Schneider M. et al., 2009].

Дефекты в структуре сперматозоидов, вызванные выключением гена mGPx4, очень похожи на таковые, наблюдаемые при дефиците селена в организме млекопитающих, описанные более 30 лет назад [Wallace Е. С. and Calvin H. L., 1983; Wu S. H. et al., 1973]. Они включают изгибание сперматозоида, вызванное нарушением цитоскелета в его средней части, набухание митохондрий, отделение головки сперматозоида от остальной его

части, нарушение подвижности и т. д. Тем не менее, при инъекции сперматозоидов, полученных от гомозиготных самцов, не имеющих mGPx4, непосредственно в ооциты здоровых самок, наблюдалось оплодотворение яйцеклеток и нормальное развитие плода [Schneider М. et al., 2009]. Следовательно, выключение гена mGPx4 нарушает подвижность сперматозоидов, но не оказывает негативного влияния на развитие, главным образом, их ядер, содержащих гаплоидный геном.

Цитозольная GPx4 (cGPx4) является самой короткой изоформой данного белка. Предполагают, что этот фермент вовлечен в антиоксидантную защиту в клетках Лейдига синтеза стероидных гормонов [Peltola V. et al., 1996]. Имеются данные о том, что делеция cGPx4 значительно снижает количество сперматозоидов, следовательно, данная изоформа GPx4 необходима для нормального роста половых клеток в семенниках [Но Y-S. et al., 1997].

Тиоредоксин редуктазы

Тиоредоксин редуктазы (TR(s)) животных являются NADPH-зависимыми, FAD-содержащими белками, входящими в состав пиридин нуклеотид дисульфид оксидоредуктазного семейства [Holmgren A. and Bjornstedt М., 1995; Arne 'r E.S. and Holmgren A., 2000]. Тиоредоксин редуктазы и тиоредоксин, наряду с системой глутаредоксина, составляют основную окислительно-восстановительную систему клетки, защищая её от воздействия эндогенных и экзогенных активных форм кислорода и, тем самым, поддерживая корректный тиоловый гомеостаз. Основные ферментативные реакции тиоредоксиновой системы, установленные ранее [Mustacich D. and Powis G., 2000; Arne 'r E.S. and Holmgren A., 2000], отражены на рис.4.

У млекопитающих обнаружено три тиоредоксин редуктазы: TRI (TrxRl или Txnrdl) (24), TR3 (TrxR2 или Txnrd2) и TGR (Txnrd3) [Hayasaka

К. and Hanaoka and Y., 2003; Sun Q. A. et al., 2001]. TRI и TR3 являются основными тиоредоксин редуктазами цитозоля и митохондрий, соответственно, и экспрессируются в различных тканях и типах клеток.

Тиоредоксин редуктазы млекопитающих являются селен-содержащими белками, имеющими селеноцистеиновый остаток в составе С-концевого активного центра в предпоследнем положении [Sun Q. A. et al., 1999; Tamura T. and Stadtman Т. С., 1996]. Ранее было показано, что селен необходим для восстановления тиоредоксина [Gladyshev V. N. et al., 1996; Hill К. E. et al., 1997] путем переноса восстановительных эквивалентов с тиолдисульфидного активного центра фермента на активный центр тиоредоксина. TR1 и TR3 являются гомодимерными селенопротеиновыми оксидоредуктазами, содержащими FAD и имеющими С-концевой -Gly-Cys-Sec-Gly- активный сайт [Zhong L. et al., 1998; Zhong L. et al., 2000; Zhong L. and Holmgren A., 2000].

окисленный субстрат восстановленный продукт

NADPH + Н+ — TfXR NADP+

Рис. 4. Схема оксидоредуктазной активности тиоредоксиновой системы

Изофермент тиоредоксин редуктазы TGR, кодируемый геном TXNRD3,

по своей структуре похож на TRI и TR3, но имеет дополнительный

зз

монотиоловый глутаредоксиновый домен (Grx) на N-конце. Данный белок преимущественно экспрессируется в семенниках, в ранних сперматидах и предполагается, что участвует в окислительно-восстановительных реакциях в процессе созревания сперматозоидов [Su D. et al., 2005; Sun Q. A. et al., 2001; Sun Q. A. et al., 2005]. В результате сплайсинга на 5'-конце генов всех трех тиоредоксин редуктаз образуются транскрипты, которые кодируют различные изоформы белков [Rundlo"f А.-К. et al., 2000; Rundlo"f А.-К. et al., 2004; Su D. and Gladyshev V. N., 2004; Sun Q. A. et al., 2001; Turanov A. A. et al., 2006]. Было показано, что один из альтернативных транскриптов гена TXNRD1, содержащий нетипичный N-концевой Grx домен и названный авторами TXNRDl_v3 [Rundlo"f А.-К. et al., 2004], преимущественно экспрессируется в семенниках, в клетках Лейдига, а его Grx домен индуцирует полимеризацию актина и тубулина. Среди представителей системы тиоредоксина, экспрессирующихся исключительно в семенниках: TGR [Su D. et al., 2005], Txl-2 [Sadek С. M. et al., 2003] и Sptrx-1, -2, -3 [Miranda-Vizuete A. et al, 2001; Jimenez A. et al., 2004], только TXNRDl_v3 локализуется в клетках Лейдига [Dammeyer P. et al., 2008], где скорее всего участвует в сохранении целостности и формировании структурных компонентов, необходимых для функционирования клеток Лейдига.

Митохондриальная тиоредоксин редуктаза, согласно результатам Нозерн блоттинга, преимущественно экспрессируется в семенниках и печени. Также было показано, что данный фермент в значительной степени экспрессируется в процессе эмбрионального развития в сердце и печени [Miranda-Yizuete A. et al., 2005]. Такой профиль экспрессии TrxR2 связан с характерной для данных органов высокой метаболической активностью, где TrxR2, по-видимому, играет ключевую роль в защите от внутриклеточных активных форм кислорода [Conrad S. G. et al., 2005]. Однако, в настоящее время мало известно о том, какую физиологическую роль данный фермент выполняет в семенниках.

Среди селеноцистеин-содержащих тиоредоксин редуктаз, только TGR экспрессируется исключительно в семенниках, и тем самым, вызывает повышенный интерес при изучении проблемы влияния селена на процессы, связанные с мужской репродуктивностью. Относительно недавно открытая TGR подобно TRI [Gladyshev V. N. et al., 1996; Tamura T. and Stadtman T. C., 1996; Arne 'r E.S. and Holmgren A., 2000], содержит пиридин нуклеотид дисульфид оксидоредуктазную последовательность и селеноциетеиновый остаток, кодируемый TGA кодоном [Sun Q. A. et al., 2001]. Её отличительной особенностью является наличие дополнительного N- концевого глутаредоксинового домена (Grx) [Sun Q.A. et al., 1999]. В структурной модели TGR С- концевой селеноцистеин-содержащий каталитический центр локализован между активным цистеином Grx- домена и N -концевым активным центром данного фермента, что дает основание предположить следующее направление потока электронов: N-концевой тиол/дисульфидный активный центр -> С-концевой селенилсульфидный активный центр -> активный цистеин глутаредоксинового домена. [Sun Q. A. et al., 2005]. С помощью Нозерн блоттинга было показано, что мРНК TGR в значительной степени экспрессирется у мышей в возрасте 7 месяцев [Sun Q. A. et al., 2001].

Кроме того, у мышей, находящихся в течение 6 месяцев на селен-дефицитной диете, наблюдается снижение подвижности сперматозоидов, нарушение их морфологии, особенно в средней части. Эти результаты согласуются с ранее описанными дефектами сперматозоидов у млекопитающих, вызванные недостатком GPx4 в организме [Brigelius-Flohe ' R., 1999]. Помимо этого, с помощью световой и конфокальной микроскопии было показано, что оба фермента активны в процессе созревания сперматид, однако после этапа дифференцировки сперматид в зрелые сперматозоиды, TGR в них не наблюдается. Исходя из данных о параллельной пространственной и временной экспрессии обоих ферментов, было сделано предположение, что GPx4 и TGR, по-видимому, связаны функционально. В

подтверждение данной гипотезы было выявлено, что TGR участвует в изомеризации дисульфидных связей, формирующихся между GPx4 и определенными белками сперматозоидов [Su D. et al., 2005].

Дальнейшая характеристика каталитического механизма и функций как полноразмерной TGR, так и её доменов, установила, что благодаря наличию селеноцистеина в каталитическом центре, данный фермент обладает не только тиоредоксин редуктазной активностью но в присутствии NADPH ещё и глутатион редуктазной и глутаредоксиновой активностями [Sun Q. А. et al., 2005].

Селен-содержащий белок Р (SelP)

SelP является внеклеточным гликопротеином и уникальным представителем селенопротеинового семейства, содержащим от 10 до 17 остатков селеноцистеина в первичной структуре [Burk R.F. and Hill К.Е., 1999; Kryukov G.V. et al., 2003; Steinert P. et al., 1998]. Данный белок состоит из двух доменов: N-концевого, содержащего один селеноцистеин, и короткий С-концевой домен, в котором может присутствовать несколько селеноцистеиновых остатков. В настоящее время известно два селенопротеина плазмы крови: SelP и GPx3, причем большая часть SelP плазмы синтезируется печенью [Kato Т. et al., 1992]. Путем мечения SelP изотопом селена 7:>Se, было показано, что данный белок преимущественно локализуется в семенниках и их придатках [Burk R.F. et al., 1991]. Данные органы нуждаются в снабжении экзогенным селеном, необходимым для синтеза различных селенопротеинов, участвующих в сперматогенезе.

Направленная делеция гена SelP у самцов мыши, даже при достаточном потреблении ими селена, вызывает прогрессивное развитие структурных нарушений сперматозоидов как в процессе сперматогенеза, так и на поздних стадиях развития семенников, что в конечном итоге приводит к бесплодию [Olson G.E. et al., 2005]. Так, у самцов с инактивированным SelP и у особей с

дефицитом селена в организме наблюдается нарушения в формировании митохондриальной оболочки, что может быть вызвано снижением экспрессии GPx4 в сперматидах [Ursini F. et al., 1999], наблюдается ярко выраженная дезорганизация жгутика во время перемещения сперматозоидов в придаток семенника.

На долю SelP приходится приблизительно 60% селена, присутствующего в плазме крови [Read R. et al., 1990], тогда как у самцов, лишенных гена данного белка, уровень селена в плазме составляет лишь 6%, а в семенниках- 19% по сравнению с особями дикого типа [Hill К.Е. et al., 2003], что предполагает участие SelP в снабжении семенников селеном.

Согласно результатам in situ гибридизации, мРНК SelP экспрессируется в клетках Лейдига, но не в эпителии семеносных пузырьков [Koga M. et al., 1998]. Вероятнее всего, SelP, необходимый для развития сперматозоидов, поступает из интерстициальной жидкости семенников [Wilson D.S. et al., 1993]. В семяносных пузырьках только перитубулярные клетки, клетки Сертоли и сперматогонии могут быть функционально связаны с SelP, находящимся в интерстициальной жидкости семенников.

Действительно, было показано, что снабжение селеном семенников с помощью SelP происходит посредством рецептора 2 аполипопротеина (ApoRE2), принадлежащего к семейству рецепторов липопротеинов низкой плотности и экспрессирующегося в семенниках клетками Сертоли [Olson G.E. et al., 2007]. Взаимодействие ApoER2 и SelP было подтверждено с помощью ко- иммуннопреципитационного анализа, а также генетических подходов, свидетельствующих о том, что у мышей с инактивированным рецептором происходит снижение уровня селена в семенниках, но не в печени [Andersen О.М. et al., 2003; Olson G.E. et al., 2007]. Таким образом, и SelP, и ApoER2 необходимы для поддержания нормального уровня Селена в семенниках и функционально связаны друг с другом.

Селен-содержащий белок S (SelS)

Первоначально SelS был охарактеризован как белок, регуляция экспрессии которого в значительной степени зависела от концентрации селена в организме животных Psammomys obesus [Curran J.E. et al., 2005]. Так, в печени мышей, страдающих диабетом, сильно увеличивалась экспрессия SelS. Подобные результаты наблюдались при снижении уровня глюкозы и индукторов стресса эндоплазматического ретикулума, таких как туникамицин и тапсигаргин. Эти результаты свидетельствуют о том, что SelS является представителем семейства глюкозо-регулируемых белков и, более того, членом суперсемейства белков теплового шока [Eddy Е.М., 1998]. Также показано, что вариации в гене SelS в значительной степени зависят от уровней интерлейкина-6, интерлейкина-1 ß и фактора-a некроза опухоли в организме, что свидетельствует об участии SelS в воспалительных процессах [Gao Y. et al., 2003].

С помощью ПЦР в реальном времени выявлено, что SelS экспрессируется в различных тканях Psammomys obesus, включая семенники [Fisher Н.М. et al., 1997]. Известно, что некоторые представители суперсемейства белков теплового шока играют ключевую роль в процессах сперматогенеза и защите клеток от повреждающих факторов окружающей среды. Так, белок теплового шока 70-2 синтезируется в процессе мейотичской фазы сперматогенеза и в большом количестве присутствует в пахитенных сперматоцитах. Было показано, что он действует как шаперон для cdc-2, участвующего в регуляции клеточного цикла [Gao Y. et al., 2004]. У мышей с инактивированным геном 70-2 наблюдается задержка сперматогенеза, что приводит к мужскому бесплодию, но не оказывает негативного влияния на самок.

С помощью иммунногистохимического анализа было показано, что у

Psammomys obesus уровень экспрессии SelS резко возрастает к восьмой

неделе с момента рождения и не меняется до 17-ти недельного возраста. У

38

восьми недельных животных SelS наблюдается в ядрах первичных сперматоцитов и небольшое количество в клетках Сертоли, к 12-ти неделям, белок начинает синтезироваться в семенных канальцах, доминирует в ядрах пахитенных сперматоцитов, а также присутствует в клетках Сертоли и Лейдига. У животных в возрасте 17-ти недель SelS в основном присутствует в клетках Лейдига и пахитенных сперматоцитах [Gao Y. et al., 2003].

К настоящему моменту не существует прямых экспериментальных доказательств участия SelS в ключевых процессах, происходящих в семенниках, однако, известно, что данный селен-содержащий белок играет важную роль в защите клеток от окислительного стресса посредством воспалительных процессов. Таким образом, SelS может играть важную роль в поддержании уровня активных форм кислорода, необходимого для нормального физиологического состояния клетки.

Селен-содержащий белок W (SelW)

SelW -самый маленький селенопротеин, состоящий из 89 аминокислотных остатков, массой 9 kDa, который в значительной степени экспрессируется в мышцах и мозге [Beilstein M.A. et al., 1996; Gu Q.P. et al., 2000; Loflin J. et al., 2006; Sun Q.A. et al., 1999; Vendeland S.C. et al., 1993]. Было показано [Aachmann F.L. et al., 2007], что данный белок обладает способностью связываться в нативных условиях с 14-3-3 белками, составляющими большой класс белков, вовлеченных в ключевые физиологические процессы [Darling D.L. et al., 2005; Pozuelo R.M. et al., 2004; Van Heusden G.P.H. et al., 2005], что делает необходимым изучение SelW/14-3-3 взаимодействия.

С помощью Вестерн блоттинга было показано, что данный белок присутствует в мышцах, селезенке, семенниках и мозге [Yeh J.-Y. et al., 1995]. Интересно, что при снижении концентрации селена в семенниках животных, уровень экспрессии SelW изменялся подобно уровню GPx4 [Yeh

J.Y. et al., 1993]. Однако не существует информации о функциональной роли SelW в данном органе.

Селен-содержащий белок V (SelV)

Ещё одним селеновым белком с неизвестной функцией, но экспрессирующимся исключительно в семенниках является SelV. Ранее было показано, что он является гомологом SelW белка, несет дополнительный N-концевой пролин- богатый домен. С помощью in situ гибридизации было показано, что данный белок локализуется в семенных канальцах, в сперматоцитах [Kryukov G.V. et al., 2003].

Краткая характеристика основных селен-содержащих белков млекопитающих, локализующихся в семенниках, представлена в таблице 2.

Таблица 2. Характеристика основных селен-содержащих белков млекопитающих, экспрессирующихся в семенниках

Название селен-сдержащего белка Локализация в семенниках Процессы, в которых принимает участие

GPx4/ PHGPx snGPx/ nPHGPx сперматиды, ядра, средняя часть сперматозоидов, клетки Лейдига восстановление гидропероксидов, образование внутри- и межселениддисульфидных связей, участие в конденсации и стабилизации хроматина путем формирования дисульфидных связей в протаминах,, антиоксидантная защита клеток Лейдига

mGPx/ mPHGPx

cGPx/ cPHGPx

TR1/ Trxl/ Txnrdl TXNRD1 клетки Лейдига возможное участие в сохранении целостности и формировании структурных компонентов клеток Лейдига, полимеризация актина и тубулина

TR3/ нет данных нет данных

TrxR2/Txnr d2

TGR/ Txnrd3 сперматиды изомеризация дисульфидных связей между ОРх4 и белками-субстратами, обладает тиоредоксин редуктазной и глутаредоксин редуктазной активностями

SelP клетки Лейдига, клетки Сертоли снабжение семенников и придатков семенников экзогенным селеном путем специфического взаимодействия с АроЕЫ2 рецептором в клетках Сертоли

SelS ядра первичных сперматоцитов, клетки Сертоли, семенные канальцы, клетки Лейдига участвует в защите клеток от окислительного стресса посредством воспалительных реакций

SelW нет данных нет данных

SelV семенные канальцы нет данных

3. Суперсемейство тиоловых оксидоредуктаз

Многие белки, вовлеченные в тиол- зависимую редокс регуляцию, объединены в суперсемейство тиоловых оксидоредуктаз [Arne'г E.S. and Holmgren А., 2000]. Эта большая группа белков, характеризующихся тиоредоксиновым фолдом (укладкой) и различными биологическими функциями [Qi Y. and Grishin N.V., 2005].

Впервые тиоредоксиновый фолд был охарактеризован Eklund et.al. [Eklund Н. et al., 1984], и представляет собой последовательность четырех ß -слоев и трех фланкирующих а- спиралей, расположенных в следующем порядке : ßl- al- ß2- a2- ß3- ß4- a3 [Arne'r E.S. and Holmgren A., 2000; Qi Y. and Grishin N.V., 2005]. Ниже изображена структура тиоредоксинового фолда, предложенная Eklund et.al. [Eklund Н. et al., 1984].

COnnuCtiriQ

Ur'

? he' ^

1XT

I

г

ДЗ

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Варламова, Елена Геннадьевна

выводы

1. SelV, так же как и его N- и С-концевые домены, характеризуется ядерно-цитоплазматическим распределением в клетках млекопитающих линии COS-7 и отсутствием локализации в митохондриях.

2. Методом аффинной хроматографии в тандеме с масс-спектрометрическим анализом идентифицированы возможные белки-партнёры SelV: OGT (О-связывающая N ацетилглюкозаминтрансфераза), Asb-9 и Asb-17, относящиеся к семейству ASB (семейство белков, содержащих анкириновые повторы и SOCS-домен-супрессор сигнализации цитокинов).

3. Методом ко-иммунопреципитации SelV с его потенциальными партнерами специфичность белок- белковых взаимодействий подтверждена для SelV и OGT (которое осуществляется посредством N-концевого домена OGT), а также SelV и Asb-9.

4. SelV, N- концевой домен OGT и Asb-9 имеют одинаковый паттерн внутриклеточной локализации, что является косвенным доказательством специфичности их взаимодействий.

5. В семенниках крысы мРНК SelV экспрессируется на поздних стадиях сперматогенеза, а также на протяжении периода полового созревания и репродуктивного периода.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ Статьи

1. Варламова Е.Г. Внутриклеточная локализация селен-содержащих белков млекопитающих: SelV (Selenoprotein V) и Gpx6 (Glutathion peroxidase 6). // Фундаментальные исследования, 2011, №9 (2), с. 326-330

2. Варламова Е.Г., Новосёлов С.В., Новосёлов В.И., Фесенко Е.Е. Новый селенсодержащий белок млекопитающих V: поиск белков-партнеров. // Доклады Академии Наук, 2011, том 441, №3, с. 399-401.

3. Варламова Е.Г., Новосёлов В.И. Поиск партнеров нового селенового белка млекопитающих (SelV) и экспрессия его мРНК в процессе онтогенеза и сперматогенеза. // Молекулярная биология, 2012, том 46, №2, с. 278-286

Тезисы докладов

1. Варламова Е.Г., Новосёлова Т.С., Черенков Д. А., Новосёлов С.В. Биохимическая характеристика селенового белка V (SelV). // Международная конференция «Постгеномная эра в биологии и проблемы биотехнологии». Казань. 2008 г. с. 23.

2. Варламова Е.Г., Новосёлова Т.С., Черенков Д. А., Новосёлов С.В. Биохимическая характеристика селенового белка V (SelV). // XII Международная Пущинская конференция молодых ученых «Биология наука XXI века». Пущино. 2008 г. с. 10.

3. Варламова Е.Г., Новосёлов С.В. Биохимическая характеристика селенового белка V (SelV). // XV Международная конференция студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов». Москва. 2009 г. с. 4.

4. Варламова Е.Г. Внутриклеточная локализация, поиск белков-партнеров и экспрессия SelV в процессе сперматогенеза и онтогенеза крысы. // XV

Международная Пущинская конференция молодых ученых «Биология наука XXI века». Пущино. 2011 г. с. 9.

5. Варламова Е.Г., Новосёлов В.И. Новый селен-содержащий белок млекопитающих V (8е1У): поиск белков-партнеров, экспрессия его мРНК в процессе сперматогенеза и онтогенеза крысы. // Научная конференция по биоорганической химии и биотехнологии «X чтения памяти академика Юрия Анатольевича Овчинникова». Москва-Пущино. 2011 г. с. 15.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Данная работа направлена на выяснение функциональной значимости нового селен- содержащего белка млекопитающих (SelV) путем идентификации его физиологических партнеров и подтверждения специфичности таких белок-белковых взаимодействий с помощью независимых подходов, а также определение его внутриклеточной локализации и экспрессии мРНК SelV в процессе сперматогенеза и онтогенеза млекопитающих.

Являясь парнером OGT, SelV, скорее всего, подвергается процессу О-гликозилирования, осуществляемого данным ферментом и сопровождающегося переносом N-ацетил глюкозамина к сериновым и треониновым остаткам SelV. Данный вид посттрансляционной модификации белков, оказывающий существенное влияние на их стабильность (обычно усиливаемую гликозилированием), заряженность и нормальное функционирование в организме, характерен для таких ключевых ферментов, как РНК-полимераза 2, транскрипционные факторы, различные киназы и фосфотазы, а также для белков цитоскелета, белков теплового шока и др.

Другой предполагаемый партнер SelV -Asb-9 относится к семейству ASB белков, характеризующихся наличием анкириновых повторов и С-концевого SOCS-домена (SOCS- супрессор сигнализации цитокинов). Известно, что белки, обладающие таким доменом помимо участия в регуляции сигнализации цитокинов, осуществляемой посредством ингибирования Янус киназы, также вовлечены в убиквитин-опосредованную протеасомную деградацию белков. Так, было показано, что Asb-9, действуя подобно специфической ЕЗ убиквитин-лигазе, участвует в деградации митохондриальной креатинкиназы (uMtCK) и креатинкиназы мозга (СКВ) и, тем самым, является эффективным регулятором энергетического статуса клеток. Кроме того известно, что данная функция Asb-9 аналогична таковой, характерной для другого SOCS- домен содержащего белка- WSB-1 (белки,

84 имеющие WD повторы и SOCS- домен), который осуществляет убиквитин-опосредованную деградацию одного из 25 известных селен-содержащих белков млекопитающих- дейодиназы второго типа (DI2). Таким образом, SelV может служить мишенью для Asb-9 белка, который способствует его убиквитинилированию путем взаимодействия с элонгин В/С комплексом посредством С-концевого SOCS- домена, и тем самым, осуществляет его протеолиз. Однако данные об экспрессии мРНК SelV и Asb-9, свидетельствующие об одновременном синтезе и функционировании этих белков в семенниках млекопитающих, заставляют задуматься об их совместном участии в процессах, происходящих в данном органе, например, в созревании и дифференцировке сперматид, конденсации хроматина сперматозоидов, в антиоксидантную защиту стероидных гормонов в клетках Лейдига и др.

Таким образом, результаты, полученные в рамках настоящей работы, с одной стороны, представляют собой ценную информацию, необходимую для выяснения функциональной роли SelV в организме млекопитающих, а с другой- служат важным дополнением к уже существующим данным о идентифицированных нами физиологических партнерах исследуемого белка: OGT (О-связывающая N ацетилглюкозаминтрансфераза) и Asb-9.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Варламова, Елена Геннадьевна, 2012 год

СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

• Авцын А.П., Жаворонков А.А., Риш М.А., Строчкова Л.С. (1991). Микроэлементозы человека. // М.: Медицина. 496 с.

• Бек Е.В. (1996). К вопросу об osteoarthritis deformans endemica в Забайкальской области: Диссертация на соискание степени доктора мед. наук // Общее дело. Новосибирск: Сибирский хронограф, стр. 103171.

• Ермаков В.В. (1999). // Проблемы биогеохимии и геохимической экологии, стр. 160-166.

• Кактурский Л.В., Строчкова Л.С., Истомин А.А. Гипоселенозы (1990). // Архив патол, том 52, стр.3-8.

• Лужен Г. (1995). Дефицит селена: причины и следствия. // IV международн. симп. стр. 93-95.

• Никитина Л.П., Иванова Р.Н. (1995). Селен в жизни человека и животных. М. 242 с.

• Aachmann F.L., Fomenko D.E., Soragni A., Gladyshev V.N., and Dikiy A. (2007). Solution Structure of SelenoproteinW and NMR Analysiso f Its Interaction with 14-3-3 Proteins. IIJ Biol Chem. Vol. 282, pp. 37036-3744.

• Altschul S.F., et al. (1990). Basic local alignment search tool. // J. Mol. Biol. Vol. 215, pp. 403-410.

• Altschul S.F., Madden T.L., Schaffer A.A., Zhang J., Zhang Z., Miller W., Lipman D.J. (1997). Gapped BLAST and PSIBLAST: a new generation of protein database search programs. // J. Nucleic Acids Res. Vol. 25, pp. 33893402.

• Amberg R., Mizutani Т., Wu X.Q., Gross H.J. (1996). Selenocysteine synthesis in mammalia: An identity switch from tRNA(Ser) to tRNA(Sec). // J. Mol Biol Vol. 263, pp. 8-19.

• Amberg R., Urban C., Reuner B., Scharff P., Pomerantz S.C., McClockey J.A., and Gross H.J. (1993). Editing does not exist for mammalian selenocysteine tRNAs. II J. Nucleic Acids Res. Vol. 21, pp. 5583-5585.

• Andersen O.M., Yeung C.H., Vorum H. et al. (2003). Essential role of the apolipoprotein E receptor-2 in sperm development. // J Biol Chem. Vol. 278, pp. 23989-95.

• Arne 'r E.S., and Holmgren A. (2000). Physiological functions of thioredoxin and thioredoxin reductase. // Eur. J. Biochem. Vol. 267, pp. 6102-9.

• Arner E.S. (2010). Selenoproteins-What unique properties can arise with selenocysteine in place of cysteine? // Exp Cell Res. Vol. 316, pp. 1296-303.

• Badmaev V., Majeed M., Passwater R.A. (1996). Selenium: a quest for better understanding. II J. JAMA. Vol. 2, pp. 59-67.

• Bannai H., et al. (2002). Extensive feature detection of N- terminal protein sorting signals. // J. Bioinformatics. Vol. 18, pp. 298-305.

• Bauche F., Fouchard B., Je 'gou B. (1994). Antioxidant system in rat testicular cells. // FEBSLett. Vol. 349, pp. 392-6.

• Beck M.A., Kolbeck P.C., Rohr L.H. et al. (1994). Bening human enterovirus becomes virulent in selenium- deficient mise.// J. Med. Virol. Vol. 43, pp. 166-170.

• Beilstein M.A., Vendeland S.C., Barofsky E., Jensen O.N., and Whanger P.D. (1996). Selenoprotein W of rat muscle binds glutathione and an unknown small molecular weight moiety. // J. Inorg. Biochem. Vol. 61, pp.117-124.

• Ben Jilani K.E., Panee J., He Q., Berry M.J., and Li P.-A. (2007). Overexpression of Selenoprotein H Reduces Neuronal Cell Death after UVB Irradiation by Preventing Superoxide Formation. // J. Int. J. Biol. Sci. Vol. 33, pp. 198-204.

• Bendtsen J.D., et al. (2004). Improved predictions of signal peptides: SignalP 3.0. // J. Mol. Biol. Vol. 340, pp. 783-795.

• Berry M.J., Tujebajeva R.M., Copeland P.R., Xu X.M., Carlson B.A., Martin G.W.,111, Low S.C., Mansell J.B., Grundner-Culemann E., Harney J.W. et al. (2001). Selenocysteine incorporation directed from the 30UTR: characterization of eukaryotic EFsec and mechanistic implications. // J. Biofactors. Vol. 14, pp. 17-24.

• Boengier K., Pipp F., Fernandez B., Richter A., Schaper W., Deindl E. (2003). The ankyrin repeat containing SOCS box protein 5: a novel protein associated with arteriogenesis. // Biochem. Biophys. Res. Commun. Vol. 302, pp. 17-22

• Böck A.K., Forchhammer J.H, Baron C. (1991). Selenoprotein synthesis: an expansion of the genetic code. // J. Trends Biochem. Sei. Vol. 16, pp. 463467.

• Boone W.T. (1998). Colorectal cancer- chemoprevention. II J. Miss State Med Assoc. Vol. 39.

• Brigelius-Flohe ' R. (1999). Tissue-specific functions of individual glutathione peroxidases. // Free Radical Biol Med. Vol. 27, pp. 951-65.

• Brown D.G., and Burk R.F. (1973). Selenium retention in tissues and sperm of rats fed a Torula yeast diet. // J. Nutr. Vol. 103, pp. 102.

• Burk R. F. (1994). Selenium in biology and human health eukaryotes. // Springer-Verlag, New York, N.Y., pp. 25-44.

• Burk R.F. and Hill K.E. (1999). Orphan selenoproteins. // Bioessays. Vol. 21, pp. 231-237.

• Burk R.F., Early D.S., Hill K.E. et al. (1998). Plasma selenium in patients with cirrhosis. // Hepatology. Vol. 27, pp. 794-8.

• Burk R.F., Hill K.E., Read R., Beilew T. (1991).Response of rat selenoprotein P to selenium administration and fate of its selenium. // Am J Physiol.. Vol. 261, pp. 26-30.

• Bushweller J.H., Billeter M., Holmgren A., and Wuthrich K. (1994). The nuclear magnetic resonance solution structure of the mixed disulfide between Escherichia coli glutaredoxin (CHS) and glutathione. // J. Mol. Biol Vol. 235, pp. 1585-1597.

• Castellano S., Gladyshev V.N., Guigo' R., Berry M.J. (2008). SelenoDB 1.0: a database of selenoprotein genes, proteins and SECIS elements. // J. Nucleic Acids Research. Vol. 36, pp. 332-338.

• Castellano S., Morozova N., Morey M., Berry M.J, Serras F., Corominas M., Guigo R. (2001). In silico identification of novel selenoproteins in the Drosophila melanogaster genome. II J. EMBO. Vol. 2, pp. 697-702.

• Chittum H.S., Hill K.E., Carlson B.A., Lee B.J., Burk R.F., and Hatfield D.L. (1997). Replenishment of selenium deficient rats with selenium results in redistribution of the selenocysteine tRNA population in a tissue specific manner. // J. Biochim. Biophys. Acta. Vol. 1359, pp. 25-34.

• Chittum H.S., Lane W.S., Carlson B.A., Roller P.P., Lung F.T., Lee B.J., and Hatfield D.L. (1998). Rabbit- globin is extended beyond its UGA stop codon by multiple suppressions and translation reading gaps. // J. Biochemistry. Vol. 37, pp. 10866-10870.

• Choi I.S., Diamond A.M., Crain P.F., Kolker J.D., McCloskey J.A., and Hatfield D.L. (1994). Reconstitution of the biosynthetic pathway of selenocysteine tRNAs in Xenopus oocytes. // J. Biochemistry. Vol. 33, pp. 601-605.

• Chou T. Y., Dang C. V., Hart G. W. (1995) Glycosylation of the c-Myc transactivation domain. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. Vol. 92, pp. 44174421.

• Clark L.C., Combs G.F., Turnbull B.W. The nutritional prevention of cancer with selenium//J. JAMA.-1996.-V.276.-P. 1957-1963

• Comer F. I., Hart G. W. (2001). Dynamic O-glycosylation of nuclear and cytosolic proteins: cloning and characterization of a neutral, cytosolic beta-

N-acetylglucosaminidase from human brain. // Biochemistry. Vol 40, pp. 7845-7852.

• Conrad S., G. Moreno F., Sinowatz F., Ursini S., Ko "lie A., Roveri M., Brielmeier W., Wurst M., Maiorino and Bornkamm G. W. (2005). The nuclear form of phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase is a protein thiol peroxidase contributing to sperm chromatin stability. // Mol Cell Biol. Vol. 25, pp. 7637-44.

• Copeland P.R., and Driscoll D.M. (1999). Purification, redox sensitivity, and RNA binding properties of SECIS-binding protein 2, a protein involved in selenoprotein biosynthesis. // J. Biol. Chem. Vol. 274, pp. 25447-25454.

• Copeland P.R., Fletcher J.E., Carlson B.A., Hatfield D.L., and Driscoll D.M. (2000). A novel RNA binding protein, SBP2, is required for the translation of mammalian selenoprotein mRNAs. // J. EMBO. Vol. 19, pp. 306-314.

• Copeland P.R., Stepanik V.A., and Driscoll D.M. (2001). Insight into mammalian selenocysteine insertion: domain structure and ribosome binding properties of Sec insertion sequence binding protein 2. // J. Mol. Cell Biol. Vol. 21, pp. 1491-1498.

• Copeland PR. (2005). Making sense of nonsense: the evolution of selenocysteine usage in proteins. // J. Genome Biol. Vol. 6, pp. 221.

• Curran J.E., Jowett J.B., Elliott K.S., Gao Y., Gluschenko K., Wang J., Azim D.M., Cai G., Mahaney M.C., Comuzzie A.G., Dyer T.D., Walder K.R., Zimmet P., MacCluer J.W., Collier G.R., Kissebah A.H., Blangero J. (2005). Genetic variation in selenoprotein S influences inflammatory response. // Nat Genet. Vol. 37, pp. 1234-41.

• Dammeyer P., Damdimopoulos A.E., Nordman T., Jiménez A., Miranda-Vizuete A., Arnér E.S. (2008). Induction of cell membrane protrusions by the N-terminal glutaredoxin domain of a rare splice variant of human thioredoxin reductase 1. // J Biol Chem. Vol. 283, pp. 2814-21.

• Darling D.L., Yingling J., and Wynshaw-Boris A. (2005). Role of 14-3-3 proteins in eukaryotic signaling and development. // J. Curr. Top. Dev. Biol. Vol. 68, pp. 281-315.

• Debrincat M.A., Zhang J.G., Willson T.A., Silke J., Connolly L.M., Simpson R.J., Alexander W.S., Nicola N.A., Kile B.T., Hilton D.J. (2007). Ankyrin repeat and suppressors of cytokine signaling box protein Asb-9 trgets ceatine knase B for dgradation marlyse A. // Biol Chem. Vol. 282, pp. 4728-37.

• Diamond A.M., Choi I.S., Crain P.F., Hashizume T., Pomerantz S.C., Cruz R., Steer C., Hill K.E., Burk R.F., McCloskey J.A., and Hatfield D.L. (1993). Dietary selenium affects methylation of the wobble nucleoside in the anticodon of selenocysteine tRNA[Ser]Sec. // J. Biol. Chem. Vol. 268, pp. 14215-14223.

• Diamond A.M., Dudock B., and Hatfield D.L. (1981). Structure and properties of a bovine liver UGA suppressor serine tRNA with a tryptophan anticodon. H J. Cell. Vol. 25, pp. 497-506.

• Dikiy A., Novoselov S.V., Fomenko D.E., Sengupta A., Carlson B.A., Cerny R.L., Ginalski K., Grishin N.V., Hatfield D.L., Gladyshev V.N. (2007). SelT, SelW, SelH, and Rdxl2: genomics and molecular insights into the functions of selenoproteins of a novel thioredoxin-like family. // J. Biochemistry. Vol. 46, pp. 6871-6882.

• Donnell N., Zachara N. E., Hart G. W., Marth, J. D. (2004). Ogt-dependent X-chromosome-linked protein glycosylation is a requisite modification in somatic cell function and embryo viability. // Molecular and cellular biology. Vol 24, pp. 1680-1690.

• Eddy E.M. (1998). HSP70-2 heat-shock protein of mouse spermatogenic cells. IIJ Exp Zool. Vol. 282, pp. 261-71.

• Eddy S.R. (1998). Profile hidden Markov models. // J. Bioinformatics. Vol. 14, pp. 755-763.

• Eklund H., et al. (1984). Conformational and functional similarities between glutaredoxin and thioredoxins. II J. EMBO. Vol. 3, pp. 1443-1449.

• Eklund H., et al., and Petratos K. (1992). Structure of oxidized bacteriophage T4 glutaredoxin (thioredoxin): refinement of native and mutant proteins. II J. Mol. Biol. Vol. 228, pp. 596-618.

• Fagegaltier D., Hubert N., Yamada K., Mizutani T., Carbon P., and Krol A. (2000). Characterization of mSelB, a novel mammalian elongation factor for selenoprotein translation. II J. EMBO. Vol. 19, pp. 4796-4805.

• Ferguson A.D., Labunskyy V.M., Fomenko D.E., Arac D., Chelliah Y., Amezcua C.A., Rizo J., Gladyshev V.N., and Deisenhofer J. (2006). NMR structures of the selenoproteins Sep 15 and SelM reveal redox activity of a new thioredoxin-like family. II J. Biol. Chem. Vol. 281, pp. 3536-3543.

• Fisher H.M., Aitken R.J. (1997). Comparative analysis of the ability of precursor germ cells and epididymal spermatozoa to generate reactive oxygen metabolites. // J Exp Zool. Vol. 277, pp. 390-400.

• Fletcher J.E., Copeland P.R., Driscoll D.M., and Krol A. (2001). The selenocysteine incorporation machinery: interactions between the SECIS RNA and the SECIS-binding protein SBP2. // J. RNA. Vol. 7, pp. 14421453

• Flohe L., Gunzler W.A. Schock H.H. (1973). Glutathionperoxidase -selenoenzyme. // FEBS Lett. Vol. 32, pp. 132-134.

• Flohe L. (2007). Selenium in mammalian spermiogenesis. // Biol Chem. Vol. 388, pp. 987-95.

• Fomenko D.E., Gladyshev V.N. (2003). CxxS: fold-independent redox motif revealed by genome-wide searches for thiol/disulfide oxidoreductase function. // J. Biochemistry. Vol. 42, pp. 11214-11225.

• Forchhammer K., Bock A. (1991). Selenocysteine synthase from Escherichia coli. Analysis of the reaction sequence. // J Biol Chem. Vol. 266, pp. 6324-6328.

• Forchhammer K., Boesmiller K., Bock A. (1991). The function of selenocysteine synthase and SELB in the synthesis and incorporation of selenocysteine. // J. Biochimie. Vol. 73, pp. 1481-1486.

• Forchhammer K., Leinfelder W., Boesmiller K., Veprek B., Bock A. (1991). Selenocysteine synthase from Escherichia coli. Nucleotide sequence of the gene (selA) and purification of the protein. // J Biol Chem. Vol. 266, pp. 6318-6323.

• Formosa T., Barry J., Alberts B. M., and Greenblatt J. (1991). Using protein affinity chromatography to probe structure of protein machines. // Methods Enzymol Vol. 208, pp. 24-45.

• Gao Y., Feng H.C.,Walder K., Bolton K., Sunderland T., Bishara N., Quick M., Kantham L., Collier G.R. (2004). Regulation of the selenoprotein SelS by glucose deprivation and endoplasmic reticulum stress - SelS is a novel glucose-regulated protein. // FEBS Lett. Vol. 563, pp. 185-90.

• Gao Y., Walder K., Sunderland T., Kantham L., Feng H.C., Quick M., Bishara N., de Silva A., Augert G., Tenne-Brown J., Collier G.R. (2003). Elevation in Tanis expression alters glucose metabolism and insulin sensitivity in H4IIE cells. // Diabetes. Vol. 52, pp. 929-34.

• Ge L.Y. (1993). Effects of low calcium on myocardial necrosis of Keshan disease by food preference. // Chung-hua Ping Li Hsueh Tsa Chih. Vol. 22, pp. 133-136.

• Gladyshev V.N., Jeang K.T., and Stadtman T.C. (1996). Selenocysteine, identified as the penultimate C-terminal residue in human T-cell thioredoxin reductase, corresponds to TGA in the human placental gene. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. Vol. 93, pp. 6146-51.

• Glass R.S., Singh W.P., Jung W., Veres Z., Scholz T.D., Stadtman T.C. (1993). Monoselenophosphate: synthesis, characterization, and identity with the prokaryotic biological selenium donor, compound SePX. // J. Biochemistry.Vol. 32, pp. 2555-12559.

• Gromer S., Wissing J., Behne D., Ashman K., Schirmer R.H., Flohe L., Becker K. (1998). A hypothesis on the catalytic mechanism of the selenoenzyme thioredoxin reductase. // J. Biochem. Vol. 332, pp. 591-592.

• Grumolato L., Ghzili H., Montero-Hadjadje M., Gasman S., Lesage J., Tanguy Y., Galas L., Ait-Ali D., Leprince J., Guérineau N.C., Elkahloun A.G., Fournier A., Vieau D., Vaudry H., Anouar Y. (2008). Selenoprotein T is a PACAP-regulated gene involved in intracellular Ca2- mobilization and neuroendocrine secretion. // J. FASEB. Vol. 22, pp. 1756-1768.

• Grundner-Culemann. E., Martin III G.W., Harney W., and Berry M.J. (1999). Two distinct SECIS structures capable of directing selenocysteine incorporation in eukaryotes. // J. RNA. Vol. 5, pp. 625-635.

• Gu Q.P., Sun Y., Ream L.W., and Whanger P.D. (2000). Selenoprotein W accumulates primarily in primate skeletal muscle, heart, brain and tongue. // J. Mol. Cell Biochem. Vol. 204, pp. 49-56.

• Guibal F.C., Moog-Lutz C., Smolewski P., Di Gioia Y., Darzynkiewicz Z., Lutz P.G., Cayre Y.E. (2002). ASB-2 Inhibits growth and promotes commitment in myeloid leukemia cells. // Biol. Chem. Vol. 277, pp. 218224.

• Guimaraes M.J., Peterson D., Vicari A., Cocks B.G., Copeland N.G., et al. (1996). Identification of a novel selD homolog from eukaryotes, bacteria, and archaea: Is there an autoregulatory mechanism in selenocysteine metabolism? II J. Proc Natl Acad Sci USA. Vol. 93, pp. 15086-15091.

• Guo J.H., Saiyin H., Wei Y.H., Chen S., Chen L., Bi G., Ma L.J., Zhou G.J., Huang C.Q., Yu L., Dai L. (2004). Expression of testis specific ankyrin repeat and SOCS box-containing 17 gene. // Arch. Andrology. Vol. 50, pp. 155-161.

• Han I., Kudlow J. E. (1997). Reduced O glycosylation of Spl is associated with increased proteasome susceptibility. // Mol. Cell. Biol. Vol. 17, pp. 2550-2558.

• Hart G. W. (1997) Dynamic O-linked glycosylation of nuclear and cytoskeletal proteins. II Annu. Rev. Biochem. Vol. 66, pp. 315-335.

• Hatfield D.L., Diamond A., and Dudock B. (1982). Opal suppressor serine tRNAs from bovine liver form phosphoseryl-tRNA. // J. Proc. Natl. Acad. Sei. USA. Vol. 79, pp. 6215-6219.

• Hatfield D.L. (2001). Selenium: its molecular biology and role in human health. // Kluwer Academic Publishers, Norwell, Mass, pp.7-22.

• Hatfield D.L., Gladyshev V.N. (2002). How Selenium Has Altered Our Understanding of the Genetic Code. // J. Mol Cell Biol. Vol. 22, pp. 356576.

• Hensrud D.D., Heimburger D.C. et al. (1994). Antioxidant status, erythrocyte fatty acids, and mortality from cardiovascular disease in China. H Eur. J. Clin. Nutr. Vol. 48, pp. 455-464.

• Hill K. E., McCollum G. W., Boeglin M. E., and Burk R. F. (1997). Thioredoxin reductase activity is decreased by selenium deficiency. // Biochem. Biophys. Res. Commun. Vol. 234, pp. 293-5.

• Hill K.E., Zhou J., McMahan W.J., Motley A.K., Atkins J.F., Gesteland R.F., Burk R.F. (2003). Deletion of selenoprotein P alters distribution of selenium in the mouse. // J Biol Chem. Vol. 278, pp. 13640-6.

• Ho Y-S., Magnenat J. L., Bronson R.T., Cao J., Gargano M., Sugawara M., Funk C.D. (1997). Mice deficient in cellular glutathione peroxidase develop normally and show normally and show no increased sensitivity to hyperoxia. II J Biol Chem. Vol. 272, pp. 16644-51.

• Hogan G.R. (1998). Selenate-and selenomethionine- induced leucopenia in ICR female mice. II J. Toxicol. Environ Health. Vol. 53.

• Holmgren A., Soderberg B.O., Eklund H.,and Branden C.I. (1975). Three-dimensional structure of Escherichia coli thioredoxin-S2 to 2.7 A resolution. II J. Proc. Natl. Acad. Sei. USA. Vol. 72, pp. 2305-2309.

• Holmgren A. (1995). Thioredoxin structure and mechanism: conformational

changes on oxidation of the active-site sulfhydryls to a disulfide. // Structure. Vol. 3, pp. 239-43.

• Holmgren A., Bjornstedt M. (1995). Mice deficient in cellular glutathione peroxidase develop normally and show no increased sensitivity to hyperoxia. // Methods Enzymol. Vol. 252, pp. 16644-51.

• Iguchi H., Watanabe M., Kamitani A., Nagai A., Hosoya O., Tsutsui K., Kumon H. (2002). Localization of dynamin 2 in rat seminiferous tubules during the spermatogenic cycle. II Acta Med. Okayama. Vol. 56, pp. 205-9.

• Imai H., F. Hirao T. Sakamoto K. Sekine Y. Mizukura M. Saito T. Kitamoto M., Hayasaka M., Hanaoka K., Nakagawa. (2003). Early embryonic lethality caused by targeted disruption of the mouse PHGPx gene.// Biochem. Biophys. Res. Commun. Vol. 305, pp. 278-86.

• Iyer S.P., Hart G.W. (2003). Roles of the Tetratricopeptide repeat domain in O-GlcNAc transferase targeting and protein substrate specificity. // Biol. Chem. Vol. 278, pp. 24608-24616.

• Jacob C., Giles G.I., Giles N.M., Sies H. (2003). Sulfur and selenium: the role of oxidation state in protein structure and function. // J. Angew Chem Int Ed Engl. Vol. 42, pp. 4742-4758.

• Ji X., Zhang P., Armstrong R.N., and Gilliland G.L. (1992). The threedimensional structure of a glutathione S-transferase from the p. gene class. Structural analysis of the binary complex of isozyme 3-3 and glutathione at 2.2 A resolution. // J. Biochemistry. Vol. 31, pp. 10169-10184.

• Jinek M., Rehwinkel J., Lazarus BD., Izaurralde E., Hanover JA., Conti E. (2004). The superhelical TPR-repeat domain of O-linked GlcNAc transferase exhibits structural similarities to importin alpha. // Nat Struct MolBiol. Vol. 11, pp. 1001-7.

• Johansson L., Gafvelin G., Arne'r E.S. (2005). Selenocysteine in proteinsproperties and biotechnological use. // J. Biochim Biophys Acta. Vol.1726, pp. 1-13.

• Kaiser J.T., Gromadski K., Rother M., Engelhardt H., Rodnina M.V., et al. (2005). Structural and functional investigation of a putative archaeal selenocysteine synthase. II J. Biochemistry. Vol. 44, pp. 13315-13327.

• Kato T., Read R., Rozga J., Burk R.F. (1992). Evidence for intestinal release of absorbed selenium in a form with high hepatic extraction. // Am J Physiol. Vol. 262, pp. 854-8.

• Katti S.K., LeMaster D.M., and Eklund H. (1990). Crystal structure of thioredoxin from Escherichia coil at 1.68 A resolution. // J. Mol. Biol. Vol. 212, pp. 167-184.

• Kiremidjian-Schumacher L., Roy M. (1998). Selenium and immune function. // Z. Emahrungwiss. Vol. 37.

• Koga M., Tanaka H., Yomogida K., Tsuchida J., Uchida K., Kitamura ML, Sakoda S., Matsumiya K., Okuyama A., Nishimune Y. (1998). Expression of selenoprotein-P messenger ribonucleic acid in the rat testis. // Biol Reprod. Vol. 58, pp. 261-5.

• Kohroki J., Fujita S., Itoh N., Yamada Y., Imai H., Yumoto N., Nakanishi T., Tanaka K. (2001). ATRA-regulated Asb-2 gene induced in differentiation of HL-60 leukemia cells. IIFEBSLett. Vol. 505, pp. 223-228.

• Korotkov K.V., Kumaraswamy E., Zhou Y., Hatfield D.L., and Gladyshev V.N. (2001). Association between the 15-kDa Selenoprotein and UDP-glucose:glycoprotein glucosyltransferase in the endoplasmic reticulum of mammalian cells. // J. Biol. Chem. Vol. 276, pp. 15330-15336.

• Korotkov K.V., Novoselov S.V., Hatfield D.L., and Gladyshev V.N. (2002). Mammalian selenoprotein in which selenocysteine (Sec) incorporation is supported by a new form of Sec insertion sequence element. // J. Mol. Cell. Biol. Vol. 22, pp. 1402-1411.

• Kryukov G.V., Kryukov V.M., Gladyshev V.N. (1999). New mammalian selenocysteine-containing proteins identified with an algorithm that searches for selenocysteine insertion sequence elements. // J. Biol. Chem. Vol.274, pp.33888-33897.

• Kryukov G.V., Gladyshev V.N. (2002). Mammalian Selenoprotein Gene Signature: identification and functional analysis of selenoprotein genes using bioinformatics methods. // J.Methods Enzymol. Vol. 347, pp. 84-100.

• Kryukov G.V., Castellano S., Novoselov S.V., Lobanov A.V., Zehtab O., Guigo R., and Gladyshev V.N. (2003). Characterization of mammalian selenoproteomes. // Science. Vol. 300, pp. 1439-1443.

• Kryukov G.V., Gladyshev V.N. (2004). The prokaryotic selenoproteome. // EMBORep. Vol. 5, pp. 538-543.

• Kukreja R., Khan A. (1998). Effect of selenium deficiency and its supplementation on DTH response, antibody forming cells and antibody titre. II Indian J. Exp. Biol. Vol. 36.

• Leblond C.P., Clermont Y. (1952). Spermiogenesis of rat, mouse, hamster and guinea pig as revealed by the periodic acid-fuchsin sulfurous acid technique. II Am. J. Anat. Vol. 90, pp. 167-215.

• Lee B.J., P. de la Pena, Tobian J.A., Zasloff M., and Hatfield D.L. (1987). Unique pathway of expression of an opal suppressor phosphoserine tRNA. II J. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. Vol.84, pp. 6384-6388.

• Lee B.J., Worland P.J., Davis J.N., Stadtman T.C., Hatfield D.L. (1989). Identification of a selenocysteyl-tRNA(Ser) in mammalian cells that recognizes the nonsense codon, UGA. // J. Biol Chem. Vol. 264, pp. 97249727.

• Lee M.R., Kim S.K., Kim J.S., Rhim S.Y., Kim K.S. (2008). Expression of Murine Asb-9 During Mouse. //Mol. Cells. Vol. 26, pp. 621-624.

• Leinfelder W., Stadtman T.C, Bock A. (1989). Occurrence in vivo of selenocysteyl-tRNA(SERUCA) in Escherichia coli. Effect of sel mutations. // J. Biol Chem. Vol. 264, pp. 9720-9723.

• Lescure A., Gautheret D., Carbon P., Krol A. (1999). Structural analysis of new local features in SECIS RNA hairpins. // J. Biol. Chem. Vol. 274, pp. 38147-38154.

• Loflin J., Lopez N., Whanger P.D., and Kioussi C. (2006). Selenoprotein W during development and oxidative stress. // J. Inorg. Biochem. Vol. 100, pp. 1679-84.

• Low S.C., and Berry M.J. (1996). Knowing when not to stop: selenocysteine incorporation in eukaryotes. // J. Trends Biochem. Sci. Vol. 21, pp. 203-208.

• Low S.C., Grundner-Culemann E., Harney J.W., Berry M.J. (2000). SECIS-SBP2 interactions dictate selenocysteine incorporation efficiency and selenoprotein hierarchy. II J. EMBO. Vol. 19, pp. 6882-6890.

• Lu S.C. (1999). Regulation of hepatic glutathione synthesis: current concepts and controversies. // J. FASEB. Vol. 13, pp. 1169-1183.

• Maher P. (2005). The effects of stress and aging on glutathione metabolism. II J. Aging Res Rev. Vol. 4, pp. 288-314.

• Maiorino M. J. B. Wissing R., Brigelius-Flohe F., Calabrese A. Roveri P., Steinert F., Ursini and L. Flohe. (1998). Testosterone mediates expression of the selenoprotein PHGPx by induction of spermatogenesis and not by direct transcriptional gene activation. // FASEB J. Vol. 12, pp. 1359-70.

• Maiorino M., Bosello V., Ursini F., Foresta C., Garolla A., Scapin M., Sztajer H., and Flohe L. (2003). Genetic variations of gpx-4 and male infertility in humans. //Biology of reproduction. Vol. 68, pp. 1134-41.

• Maiorino M., M. Scapin F. Ursini M. Biasolo V. Bosello and L. Flohe. (2003). Distinct promoters determine alternative transcription of gpx-4 into phospholipid-hydroperoxide glutathione peroxidase variants. // J. Biol. Chem. Vol. 278, pp. 34286-90.

• Maiorino M., Roveri A., Benazzi L., Bosello V., Mauri P., Toppo S., Tosatto S. C., and Ursini F. (2005). Functional interaction of phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase with sperm mitochondrion-associated cysteine-rich protein discloses the adjacent cysteine motif as a new substrate of the selenoperoxidase. // J. Biol. Chem. Vol. 280, pp. 38395- 402.

• Martin J.L., Bardwell J.C.A., and Kuriyan J. (1993). Crystal structure of the DsbA protein required for disulphide bond formation in vivo. // J. Nature. Vol. 365, pp. 464.

• McClain D. A., Lubas W. A., Cooksey R. C., Hazel M., Parker G. J., Love D. C. (2002) Altered glycan-dependent signaling induces insulin resistance and hyperleptinemia. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. Vol. 99, pp. 1069510699.

• McDaneld T.G., Hancock D.L., Moody D.E. (2004). Altered mRNA abundance of ASB15 and four other genes in skeletal muscle following administration of B-adrenergic receptor agonists Physiol. // Genomics. Vol. 16, pp. 275-283.

• McDaneld T.G., Hannon K., Moody D.E. (2006). Ankyrin repeat and SOCS box protein 15 regulates protein synthesis in skeletal muscle. // Am. J. Physiol. Vol. 290, pp. 1672-1682.

• Meachem S.J., Mclachlan R.I., Stanton P.G., Robertson D.M., Wreford N.G. (1999). FSH immunoneutralization acutely impairs spermatogonial development in normal adult rats. // J. Androl. Vol. 20, pp. 756-62.

• Mihailovic M.B., Avramovic D.M. et al. (1998). Blood and plasma selenium levels and GSH-Px activities in patients with arterial hypertension and chronic heart disease. // J. Environ. Pathol. Toxicol. Oncol. Vol. 17, pp. 3-4.

• Miranda-Vizuete A., and Spyrou G. (2002). // Mol. Cells. Vol. 13, pp. 488.

• Miranda-Vizuete A., Ljung J., Damdimopoulos A. E., Gustafsson J. A., Oko

R., Pelto-Huikko M., and Spyrou G. (2001). Characterization of Sptrx, a

103

novel member of the thioredoxin family specifically expressed in human spermatozoa. II J. Biol. Chem. Vol. 276, pp. 31567-74.

• Mix H., Lobanov A.V., and Gladyshev V.N. (2007). SECIS elements in the coding regions of Selenoprotein transcripts are functional in higher eukaryotes. II J. Nucleic Acids Research. Vol. 35, pp. 414-423.

• Moreno S. G., G. Laux M. Brielmeier G. W. Bornkamm and M. Conrad. (2003). Testis-specific expression of the nuclear form of phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase (PHGPx). // Biol. Chem. Vol. 384, pp. 635-43.

• Moreno-Reyes R., Suetens C., Mathieu F. et al. (1998). Osteoarthropathy in rural Tibet in relation to selenium and iodine status. // N. Engi. J. Med. Vol. 16, pp. 339.

• Motohashi K., Kondoh A., Stumpp M.T., Hisabor T. (2001). Comprehensive survey of proteins targeted by chloroplast thioredoxin. // PNAS. Vol. 98, pp. 11224-29.

• Mustacich D., Powis G. (2000). Thioredoxin reductase. // Biochem J. Vol. 15, pp. 1-8.

• Nam S.Y., Fujisawa M., Kim J.S., Kurohmaru M., Hayashi Y. (1998). Expression pattern of phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase messenger ribonucleic acid in mouse testis. // Biol Reprod. Vol. 58, pp. 1272-6.

• Novoselov S.V., Kryukov G.V., Xu X-M., Carlson B.A., Hatfield D.L., and Gladyshev V.N. (2007). Selenoprotein H Is a Nucleolar Thioredoxin-like Protein with a Unique Expression Pattern. // J. Biol. Chem. Vol. 282, pp. 11960-11968.

• Olson G.E., Winfrey V.P., Nagdas S.K., Hill K.E., and Burk R.F. (2005). Selenoprotein P is required for mouse sperm development. // Biology of reproduction. Vol. 73, pp. 201-11.

• Parko A. (1992). Has the increase in selenium intake led to a decrease in caries among children and the young in Finland. // Proc-Finn-Dent-Soc. Vol. 88, pp. 57-59.

• Peltola V., Huhtaniemi I., Metsa- Ketela T., Ahotupa M. (1996). Induction of lipid peroxidation during steroidogenesis in the rat testis. // Endocrinology. Vol. 137, pp. 105-12.

• Peng A., Yang C., Rui H. et al. (1992). Study on the pathogenic factors of Kashin-Beck disease. // J. Toxicol. Environ Health. Vol. 35, pp.79-90.

• Pfeifer H., Conrad M., Roethlein D., Kyriakopoulos A., Brielmeier M., Bornkamm G. W., and Behne D. (2001). Identification of a specific sperm nuclei selenoenzyme necessary for protamine thiol cross-linking during sperm maturation. // FASEB J. Vol. 15, pp. 1236-8.

• Pleasants J.C., Guo W., Rabenstein D.L. (1989). A comparative study of the kinetics of selenol/diselenide and thiol/disulfide exchange reactions. // J. Am. Chem, Soc. Vol. 111, pp. 6553-6558.

• Pozuelo R.M., Geraghty K.M., Wong B.H., Wood N.T., Campbell D.G., Morrice N., and Mackintosh C. (2004). 14-3-3-affinity purification of over 200 human phosphoproteins reveals new links to regulation of cellular metabolism, proliferation and trafficking. // J. Biochem. Vol. 379, pp. 395408.

• Pruitt K.D., Tatusova T., Maglott D.R. (2007). NCBI reference sequences (RefSeq): a curated non-redundant sequence database of genomes, transcripts and proteins. // J. Nucleic Acids Res. Vol. 35, pp. 61-65.

• Pushpa Rekha T., Burdsal L.M., Chilsom G.M., Driscoll D.M. (1985). Rat phospholipid-hydroperoxide glutathione peroxidase. cDNA cloning and identification of multiple transcription and translation start sites. // J Biol Chem.. Vol. 270, pp. 26993-9.

• Qi Y., Grishin N.V. (2005). Structural classification of thioredoxin-like fold proteins // J. Proteins. Vol. 58, pp. 376-388

• Read R., Bellew T., Yang J-G., Hill K.E., Palmer I.S., Burk R.F. (1990). Selenium and amino acid composition of selenoprotein P, the major selenoprotein in rat serum. // J Biol Chem. Vol. 265, pp. 17899-905.

• Reinemer P., et al., and Huber R. (1991). The three-dimensional structure of class r glutathione S-transferase in complex with glutathione sulfonate at 2.3 A resolution. II J. EMBO. Vol. 10, pp. 1997-2005.

• Reinemer P., et al., and Parkes M.W. (1992). Three-dimensional structure of class r glutathione S-transferase from human placenta in complex with S-hexylglutathione at 2.8 A resolution. II J. Mol. Biol. Vol. 227, pp. 214-226.

• Rother M., Resch A., Gardner W.L., Whitman W.B., and Bock A. (2001). Heterologous expression of archaeal selenoprotein genes directed by the SECIS element located in the 3-non-translated region. // J. Mol. Microbiol. Vol .40, pp. 900-908.

• Rotruck J.T., Pope A.L., Ganther H.E., Swanson A.B., Hafeman D.G., Hoekstra W.G. (1973). Selenium - biochemical role as a component of glutathione peroxidase. II Science. Vol. 179, pp. 588-590.

• Roveri A., Casasco A., Maiorino M., Dalan P., Calligaro A., Ursini F. (1992). Phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase of rat testis. Gonadotropin dependence and immunocytochemical identification. // J Biol Chem.. Vol. 267, pp. 6142-6.

• Roveri A., F. Ursini L. Flohe, and Maiorino M. (2001). PHGPx and spermatogenesis. // Biofactors. Vol. 14, pp. 213-22.

• Roveri A., Flohe ' L., Maiorino M., Ursini F. (2002). Phospholipid-hydroperoxide glutathione peroxidase in sperm. // Methods Enzymol. Vol. 347, pp. 208-12.

• Rundlo"f A.-K., Carlsten M., Giacobini M.M. J., and Arne'r E. S. J. (2000). Prominent expression of the selenoprotein thioredoxin reductase in the medullary rays of the rat kidney and thioredoxin reductase mRNA variants differing at the 5' untranslated region. // Biochem. J. Vol. 347, pp. 661-8.

• Rundlcff A.-K., Janard M., Miranda-Vizuete A., and Arne'r E. S. J. (2004). Evidence for intriguingly complex transcription of human thioredoxin reductase 1. // Free Rad. Biol. Med. Vol. 36, pp. 641-56.

• Russell L.D., Alger L.E., Nequin L.G. (1987). Hormonal control of pubertal spermatogenesis. //Endocrinology. Vol. 120, pp. 1615-32.

• Sadek C. M., Jimenez A., Damdimopoulos A. E., Kieselbach T., Nord M., Gustafsson J.Ä., Spyrou G., Davis E.C., Oko R., van der Hoorn F.A., and Miranda-Vizuete A. (2003). Characterization of human thioredoxin-like 2. A novel microtubule-binding thioredoxin expressed predominantly in the cilia of lung airway epithelium and spermatid manchette and axoneme. // J. Biol. Chem. Vol. 278, pp. 13133-42.

• Schneider M., Förster H., Boersma A., Seiler A., Wehnes H., Sinowatz F., Neumüller C., Deutsch MJ., Walch A., FIrabe de Angelis M., Wurst W., Ursini F., Roveri A., Maleszewski M., Maiorino M., Conrad M. (2009). Mitochondrial glutathione peroxidase 4 disruption causes male infertility. // FASEBJ. Vol. 23, pp. 3233-42.

• Schwarz K. and Foltz C.M. (1957). Prevention of exudative diathesis in chicks by factor 3 and selenium. // J. Am. Chem. Soc. Vol. 79, pp. 3292.

• Schwarz K., Bieri J.G., Briggs G.M., and Scott M.L. (1957) // Proc. Soc. Exp. Biol Med. Vol. 95., pp. 621.

• Sedgwick S.G. and Smerdon S.J. (1999). The ankyrin repeat: a diversity of interactions on a common structural framework. // Trends Biochem Sei. Vol. 24, pp. 311-316.

• Shalgi R., Seligman J., Kosower N.S. (1989). Dynamics of the thiol status of rat spermatozoa during maturation: analysis with the fluorescent labeling agent monobromobimane. // Biol Reprod.. Vol. 40, pp. 1037-45.

• Shchedrina V.A., Novoselov S.V., Malinouski M.Yu., and Gladyshev V.N. (2007). Identification and characterization of a Selenoprotein family

containing a diselenide bond in a redox motif. // J.Proc. Natl.Acad. Sci. USA. Vol. 104, pp. 13919-13924.

• Shisler J.L., Senkevich T.G., Berry M.J., and Moss B. (1998). Ultraviolet-induced cell death blocked by a selenoprotein from a human dermatotropic poxvirus. II J. Science. Vol. 279, pp. 102-105.

• Sinning I., et al., and Jones T.A. (1993). Structure determination and refinement of human class glutathione transferase Al-1, and a comparison with the pi and it class enzymes. // J. Mol. Biol. Vol. 232, pp. 192-212.

• Slater G.S., Birney E. (2005). Automated generation of heuristics for biological sequence comparison. II J. BMC Bioinformatics. Vol. 6, pp. 31.

• Sodano P., et al., and Withrich K. (1991). Sequence specific H n.m.r. assignments and determination of the three-dimensional structure of reduced Escherichia coli glutaredoxin. // J. Mol. Biol. Vol. 221, pp. 1311-1324.

• Stadtman T.C. (1996). Selenocysteine. // Annu. Rev. Biochem. Vol. 65 ,pp. 83-100.

• Steinert P., Bachner D., Flohe L. (1998). Analysis of the mouse selenoprotein P gene. //Biol Chem. Vol. 379, pp. 683-91.

• Su D., and Gladyshev V. N. (2004). Alternative splicing involving the thioredoxin reductase module in mammals: a glutaredoxin-containing thioredoxin reductase 1. // Biochemistry. Vol. 43, pp. 12177-88.

• Su D., Novoselov S. V., Sun Q. A., Moustafa M. E., Zhou Y., Oko R., Hatfield D. L., and Gladyshev V. N. Mammalian selenoprotein thioredoxin-glutathione reductase. Roles in disulfide bond formation and sperm maturation. II J. Biol. Chem. 2005. Vol. 280, pp. 26491-8.

• Sun Q. A., Kirnarsky L., Sherman S., and Gladyshev V. N. (2001). Selenoprotein oxidoreductase with specificity for thioredoxin and glutathione systems. // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. Vol. 98, pp. 3673-8.

• Sun Q. A., Su D., Novoselov S. V., Carlson B. A., Hatfield D. L., and Giadyshev V. N. (2005). Reaction mechanism and regulation of mammalian thioredoxin/glutathione reductase. // Biochemistry. Vol. 44, pp. 14528-37.

• Sun Q. A., Zappacosta F., Factor V. M., Wirth P. J., Hatfield D. L., and Giadyshev V. N. (2001). Heterogeneity within animal thioredoxin reductases. Evidence for alternative first exon splicing. // J. Biol. Chem. Vol. 276, pp. 3106-14.

• Sun Q.A., Wu Y., Zappacosta F., Jeang K. T., Lee B. J., Hatfield D. L., and Giadyshev V. N. (1999). Redox regulation of cell signaling by selenocysteine in mammalian thioredoxin reductases. // J. Biol. Chem. Vol. 274, pp. 24522-24530.

• Sun Q.-A., Wu Y., Zappacosta F., Jeang K.-T., Lee B.J., Hatfield D.L. Kryukov G.V.and Giadyshev V.N. (2000). Selenium metabolism in zebrafish: multiplicity of selenoprotein genes and expressionof a protein containing seventeen selenocysteine residues. // Genes Cells. Vol. 5, pp. 1049-1060.

• Sun Y., Gu Q.P., and Whanger P.D. (2001). Selenoprotein W in overexpressed and underexpressed rat glial cells in culture. // J. Inorg. Biochem. Vol. 84, pp. 151-156.

• Sunde R.A. (1990). Molecular biology of selenoproteins. // J. Annu.Rev.Nutr. Vol. 10, pp. 451-74.

• Tamura T., Stadtman T.C. (1996). A new selenoprotein from human lung adenocarcinoma cells: purification, properties, and thioredoxin reductase activity. HProc. Natl. Acad. Sci. USA. Vol. 93, pp. 1006-1011.

• Torra M., Rodamilans M., Montero F. (1997). Serum selenium concentration of a healthy northwest Spanish population. // J. Biol. Trace Elem Res. Vol. 58, pp. 127-133.

• Tujebajeva R.M., Copeland P.R., Xu X.M., Carlson B.A., Harney J.W., Driscoll D.M. Hatfield D.L., and Berry M.J. (2000). Decoding apparatus for eukaryotic selenocysteine insertion. II J. EMBO. Vol. 1, pp. 158-163.

• Turanov A. A., Su D., and Gladyshev V. N. (2006). Characterization of alternative cytosolic forms and cellular targets of mouse mitochondrial thioredoxin reductase. // J. Biol. Chem. Vol. 281, pp. 22953-63.

• Ursini F., Heim S., Kiess M., Maiorino M., Roveri A., Wissing J., Flohe L. (1999). Dual function of the selenoprotein PHGPx during sperm maturation. II Science. Vol. 277, pp. 1393-6.

• Ursini F., M. Maiorino R., Brigelius-Flohe K. D., Aumann A., Roveri D., Schomburg, and L. Flohe. (1995). Probing the presumed catalytic triad of selenium-containing peroxidases by mutational analysis of phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase (PHGPx). // Methods Enzymol. Vol. 252, pp. 38-60.

• Van Heusden G.P.H. (2005). 14-3-3 proteins: regulators of numerous eukaryotic proteins. II J. IUBMB Life. Vol. 57, pp. 623-29.

• Vendeland S.C., Beilstein M.A., Chen C.L., Jensen O.N., Barofsky E., and Whanger P.D. (1993). Purification and properties of selenoprotein W from rat muscle. II J. Biol. Chem. Vol. 268, pp. 17103-7.

• Vosseller K., Wells L., Lane M. D., Hart G. W. (2002) Elevated nucleocytoplasmic glycosylation by O-GlcNAc results in insulin resistance associated with defects in Akt activation in 3T3-L1 adipocytes. // Proc. Natl. Acad. Sci. US. Vol. 99, pp. 5313-5318.

• Wada M., Nobuki S.-I., Tenkyuu Y., Natsume S., Asahara M., Erabi T. (1999). Bis(2,6-dimethoxyphenyl) sulfide, selenide and telluride, and their derivatives. II J. Organomet. Chem. Vol. 580, pp. 282-289.

• Walczak R., Westhof E., Carbon P., and Krol A. (1996). A novel RNA structural motif in the selenocysteine insertion element of eukaryotic Selenoprotein mRNAs. II J. RNA. Vol. 2, pp. 367-379

• Wallace E. C. G. W., and Calvin H. L. (1983). Mitochondrial glutathione peroxidase 4 disruption causes male infertility. // Gamete Res. Vol. 4, pp. 3233-3242.

• Waschulewski I.H., Sunde R.A. (1988). Effect of dietary methionine on utilization of tissue selenium from dietary selenomethionine for glutathione peroxidase in the rat. // J.Nutr. Vol. 118, pp. 367-74.

• Wessjohann L.A., Schneider A., Abbas M., Brandt W. (2007). Selenium in chemistry and biochemistry in comparison to sulfur. // Biol Chem. Vol.388, pp. 997-1006.

• Whanger P.D. Selenoprotein W: a review (2000). // J. Cell. Mol. Life Sei. Vol. 57, pp. 1846-1852.

• Wheelan S.J., Church D.M., and Ostell J.M. (2001). Spidey: a tool for mRNA-to-genomic alignments. II J. Genome Res. Vol. 11, pp. 1952-1957.

• Wilson D.S., Tappel A.L. (1993). Binding of plasma selenoprotein P to cell membranes. // JInorg Biochem. Vol. 51, pp. 707-14.

• Wu S. H., Oldfield J. E., Whanger P. D., and Weswig P. H. (1973). Effect of selenium, vitamin E, and antioxidants on testicular function in rats. // Biol. Reprod. Vol. 8, pp. 625-9.

• Xia T.H., et al., and Wothrich K. (1992). NMR structure of oxidized Escherichia coli glutaredoxin: comparison with reduced E. coli glutaredoxin and functionally related proteins. // J. Protein Sei. Vol. 1, pp. 310-321.

• Xu J., Beyer A.R., Walker W.H., McGee E.A. (2003). Developmental and stage-specific expression of Smad2 and Smad3 in rat testis. // JAndrol. Vol. 24, pp. 192-200.

• Xu X.M., Carlson B.A., Mix H., Zhang Y., Saira K., et al. (2007). Biosynthesis of selenocysteine on its tRNA in eukaryotes. // J. PLoS Biol. Vol. 5, pp. 96-105.

• Xu X.M., Zhou X., Carlson B.A., Kim L.K., Huh T.L., Lee B J. and Hatfield D.L. (1999). The zebrafish genome contains two distinct selenocysteine tRNA[Ser]sec genes. IIFEBS Lett. Vol. 454, pp. 16-20.

• Yant L. J., Ran Q., Rao L., Van Remmen H., Shibatani T., Belter J. G., Motta L., Richardson A., and Prolla T. A. (2003). The selenoprotein GPX4 is essential for mouse development and protects from radiation and oxidative damage insults. // Free Radio. Biol. Med. Vol. 34, pp. 496-502.

• Yeh J.-Y., Beilstein M. A., Andrews J. S. and Whanger P. D. Tissue distribution and influence of selenium status on levels of selenoprotein W. // FASEBJ. 1995. Vol. 9, pp. 392-6.

• Yeh J.Y., Vendeland S.C., Gu Q., Butler J.A., Ou B.R., Whanger P.D. (1997). Dietary selenium increases selenoprotein W levels in rat tissues. // J Nutr. Vol. 127, pp. 2165-72.

• Zhang Y., Fomenko D.E., Gladyshev V.N. (2005). The microbial selenoproteome of the Sargasso Sea. // Genome Biol. Vol. 6, pp. 37.

• Zhong L., and Holmgren A. (2000). Essential role of selenium in the catalytic activities of mammalian thioredoxin reductase revealed by characterization of recombinant enzymes with selenocysteine mutations. // J. Biol. Chem. Vol. 275, pp. 18121-8.

• Zhong L., Arne 'r E. S., Ljung J., Aslund F., and Holmgren A. (1998). Rat and calf thioredoxin reductase are homologous to glutathione reductase with a carboxyl-terminal elongation containing a conserved catalytically active penultimate selenocysteine residue. II J. Biol. Chem. Vol. 273, pp. 8581-91.

• Zhong L., Arne'r E. S. J., and Holmgren A. (2000). Mammalian thioredoxin reductase is irreversibly inhibited by dinitrohalobenzenes by alkylation of both the redox active selenocysteine and its neighboring cysteine residue. // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. Vol. 97, pp. 10835-42.