Дизайн систем экспрессии для экспериментальных моделей с использованием трансгенных растений тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.15, кандидат биологических наук Мирахорли Неда

• Мирахорли Неда
• кандидат биологических наук
• 2008

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Мирахорли Неда

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Системы экспрессии чужеродных генов в растениях.

1.1 Л. Экспрессионные растительные вектора на основе Ti-плазмид.

1 > I

1.1.2.Экспрессионные вектора, полученные на основе растительных патогенов.

1.1.3. Альтернативные системы экспрессии растений.

1.1.4. Пространственная и временная регуляция экспрессии генов в растениях.

1.2. Дефензины растений.

1.2.1. Структура и классификация растительных дефензинов.

1.2.2. Антимикробная и антигрибная активность дефензинов растений.

1.2.3. Возможности применения растительных дефензинов.

1.3. Репортерные системы для изучения различных аспектов регуляции экспрессии». . генов.

ГЛАВА II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

ГЛАВА III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Конструирование базовых экспрессионных векторов для трансформации растений.683.2. Разработка количественного метода оценки уровня транзиентной экспрессии гетерологичных генов в растительных клетках.

3.3. Сравнение результатов транзиентной и стабильной экспрессии репортерного гена термостабильной лихеназы в растениях.

3.4. Дизайн систем экспрессии для целевого гена в растениях на модели модифицированного гена дефензина подсолнечника.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Дизайн систем экспрессии для экспериментальных моделей с использованием трансгенных растений»

В области биотехнологии растений основной задачей является создание трансгенных форм с заданными признаками и свойствами, а также конструирование растений для наработки целевых белковых продуктов.

Успех в создании новых форм растений с заданными свойствами и в> конструировании трансгенных растеиий зависит от эффективности экспрессии перенесенных генов, направленной компартментализации генного продукта и его стабильности в растительной клетке. В связи с этим крайне актуальным остается вопрос разработки и создания растительных векторных конструкций, позволяющих облегчить клонирование целевых генов и увеличить выход рекомбинантного белка.

Как известно, уровень накопления рекомбинантного белка в растениях зависит от многих факторов, в том числе, от силы используемого промотора, от соответствия кодонового состава экспрессируемого гена кодоновому составу растения-хозяина, от места локализации белкового продукта и других факторов. Очень часто экспрессиоиные системы,идеальные для экспрессии одного гена,оказываются совершенно непригодными для экспрессии другого. Так, экспрессия гена под контролем сильного конститутивного промотора гена 35S РНК вируса мозаики цветной капусты приводит, с одной стороны, к наработке большого количества белка в растениях, а, с другой стороны, к повсеместной экспрессии во всех тканях растения, что часто нежелательно для исследователей. Кроме того, сильная экспрессия некоторых генов может приводить к гибели растения, так как синтезируемый белок в большом количестве может оказаться токсичным.

В связи с этим, создание растительных векторных конструкций, в которых можно легко проводить замены регуляторных элементов и использовать их для различных целей, является важной задачей современной биотехнологии.

Достаточно сложной и многоэтапной работой является также тестирование наличия экспрессии исследуемого целевого гена в трансгенном растении. Наиболее быстрым и удобным способом предварительной оценки работы созданной векторной конструкции в растениях является транзиентная экспрессия. С помощью транзиентной экспрессии можно также легко нарабатывать белок в достаточно больших количествах, что часто используется для получения терапевтических белков. Кроме того, при проведении дизайна и подбора наиболее оптимальной векторной конструкции этот метод позволяет быстро проверять эффективность работы различных регуляторных элементов.

В связи с вышеизложенным, целью данной работы явилось создание универсального вектора для экспрессии целевых генов в растениях, позволяющего осуществлять дизайн систем экспрессии, и разработка метода количественной оценки транзиентной экспрессии данных генов.

Для достижения поставленной цели работы, необходимо было решить следующие задачи:

1. Сконструировать базовые экспрессионные вектора для трансформации растений, в которых можно легко проводить модификационные замены основных регуляторных элементов с целью создания оптимальной векторной конструкции для экспрессии целевых генов.

2. Разработать метод эффективной оценки экспрессии гетерологичных генов в растениях.

3. Оценить эффективность разработанного метода оценки экспрессии гетерологичных генов в растениях в сравнении с результатами стабильной экспрессии этих генов в растениях на примере экспрессии гена репортерного белка лихеназы.

4. Изучить экспрессию модифицированного гена дефензина подсолнечника в растениях: подобрать оптимальную векторную конструкцию на основе разработанных базовых векторов для экспрессии модифицированного гена дефензина подсолнечника в растениях;

- по активности репортерного белка лихеназы провести оценку транзиентной экспрессии гена дефензина в листьях салата Lactuca sativa.

Научная новизна работы.

Впервые для оценки эффективности транзиентной экспрессии гена дефензина использован ген термостабильной глюканазы (лихеназы) Clostridium thermocellum, ранее предложенный в качестве нового репортерного гена. Создана новая векторная конструкция для трансформации растений, содержащая уникальные сайты рестрикции, позволяющие легко изменять регуляторные элементы вектора, с целью дизайна систем экспрессии для каждого конкретного случая.

Апробация результатов работы.

Результаты работы были представлены на VI Съезде общества физиологов растений России и Международной конференции «Современная физиология растений: от молекул до экосистем» (Сыктывкар, Республика Коми, 2007); на Международной научной конференции "От классических методов генетики и селекции к ДНК-технологиям" ( Гомель, 2007); на Международной конференции «Nutrient Biofortification and Exclusion of Pollutants in Food Plants» (Израиль, 2007); а также на лабораторных и межинститутских семинарах .

Структура и объем диссертации.

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов и обсуждения, заключения, а также выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 132 страницах машинописного текста, включая 3 таблицы, 20 рисунков и графиков. Список цитируемых литературных источников включает 152 наименований.

Заключение диссертации по теме «Генетика», Мирахорли Неда

выводы

1. С помощью разработанной универсальной векторной конструкции для трансформации растений, позволяющей легко осуществлять замену регуляторных элементов, найдена наиболее оптимальная векторная система для экспрессии гена репортерного белка лихеназы.

2. Впервые разработан экспресс-метод для оценки эффективности использования векторных конструкций. Результаты оценки эффективности экспрессии гетерологичных генов в растениях разработанным экспресс-методом сравнимы с данными, получаемыми при оценке уровня экспрессии гетерологичных генов в трансгенных растениях.

3. С применением экспресс-метода подобрана оптимальная векторная конструкция для экспрессии модифицированного гена дефензина подсолнечника Sd2mod в растениях. Векторная конструкция p-SD2mod-LicBM2-ER обеспечивает самый высокий уровень накопления гибридного белка.

4. Разработанная экспресс-система предлагается в качестве метода предварительной оценки эффективности экспрессии гетерологичных генов в растениях для работ по дизайну экспрессионных растительных систем.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Значительный прогресс в понимании молекулярных механизмов, лежащих в основе взаимодействия растение - патоген, достигнут в последние 5-10 лет и, прежде всего, благодаря использованию генетических подходов к изучению этого процесса на модельных системах, таких как Arabidopsis thaliana, и некоторых других культурах, включая томаты и рис. Как следует из анализа работ, представленного в главе I, несмотря на целый ряд исследований, посвященных растительным дефензинам, структурные детерминанты, обеспечивающие их антигрибную активность, и механизмы, которыми они осуществляют ингибировапие роста патогенных грибов, остаются неизвестными. Дальнейшие исследования механизмов действия дефензинов на патогены растений, так же как на патогены человека и животных, нуждаются в разработке простых и удобных тест-систем для изучения взаимодействия хозяин-патоген.

В нашей работе были сконструированы базовые экспрессионные вектора для трансформации растений, которые позволят легко проводить дизайн систем экспрессии гетерологичных генов, поскольку их структура дает возможность заменять регулягорные элементы и целевые гены, трансляционно слитые с последовательностью репортерного гена термостабильной лихеназы, либо без такового слияния. Сконструированные вектора можно использовать для изучения новых регуляторных элементов (промоторов, последовательностей лидерных пептидов), а также для изучения экспрессии целевых генов в растениях.

С использованием созданных растительных векторов нами был разработан оригинальный метод, основанный на агроинфильтрации, который позволяет предварительно количественно оценить уровень транзиентной экспрессии гетерологичных генов в растительных клетках, что является важным для разработки оптимальной системы экспрессии гетерологичных генов. С использованием данного метода была проведена оценка эффективности экспрессии репортерного гена лихеназы при транзиентной экспрессии под контролем различных регуляторных элементов. Причем, было установлено, что общая закономерность эффективности экспрессии репортерного гена под контролем исследованных регуляторных элементов как при транзиентной (в листьях салата), так и при стабильной экспрессии (трапсформанты табака), в целом, сохраняется.

Впервые было показано, что для сравнительной количественной оценки эффективности экспрессии различных регуляторных элементов (при использовании лихеназы как репортера) можно использовать как значения относительного содержания белкового продукта гетерологичного гена, так и средние значения оптической плотности OD540, а также диапазон распределения OD540 при условии использования растительных белковых лизатов, выровненных по количеству содержания суммарного растворимого белка.

Разработанный и апробированный нами метод количественной оценки эффективности экспрессии, основанный на использовании агроинфильтрации листьев салата, был применен для оценки эффективности экспрессии целевого гена дефензипа подсолнечника с целью выбора наиболее оптимальной системы экспрессии его в растениях. Было установлено, что векторная конструкция р-SD2mod-LicBM2-ER обеспечивает самый высокий уровень накопления гибридного белка дефензипа и локализацию его в эндоплазматическом ретикулуме.

Полученные результаты позволяют предложить разработанную нами экспресс-систему в качестве метода предварительной оценки эффективности экспрессии гетерологичных генов в растениях для работ по дизайну экспрессионных растительных систем.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Мирахорли Неда, 2008 год

1. Абдеев P.M., Голденкова И.В., Мусийчук К.А., Пирузян Э.С. (2001) Изучение свойств термостабильной целлюлазы CelE Clostridium thermocellum с целью экспрессии в растениях // Биохимия, , т.66, вып.7, с. 991-998.

2. Великодворская Г.А., Зверлов В.В., Лаптев Д.А., Метт В.Л., Пирузян Э.С. (1990) Клонирование и некоторые свойства гена licB, кодирующего новую эндоклюкапазу Clostridium thermocellum Ф7 // Биотехнология, №4, 18-19.

3. Голденкова И.В. Репортерные системы: возможности для изучения различных аспектов регуляции экспрессии генов (2002) //Успехи современной биологии, т. 122, № 6, с. 515-526.

4. Дрейпер Д., Скотт Р., Армитидж Ф., Уолден Р. Генная инженерия растений. Лабораторное руководство.- Москва: Мир, 1991 .-408с.

5. Р.А. Комахин, И.А. Абдеева, Г.Р. Салехи Джузани, И.В. Голденкова, А.А. Жученко. Термостабильная лихеназа как трансляционный репортер. // Генетика. 2005. Т. 41, №1. с. 31-40.

6. Кучук Н.В. (2007) Трансгенный, транпластинчатый и трапзиентный подходы для экспрессии чужеродных генов в растениях // Цитология и генетика, №3,, с. 50-54.

7. Ю.Матвеева Н.А., Шаховский A.M., Кучук Н.В. (2005) Генетическая трансформация хлоропластной ДНК S.rickii// Цитология и генетика, т.39, №5, с.3-8

8. Монзави-Карбасси Б., Голденкова И.В., Кобец Н.С., Мусийчук К.А., Волкова JI.B., Пирузян Э.С. (1997) Гетерологическая экспрессия гена lie В Clostridium thermocellum в протопластах тбака // Генетика, т.33,№7, 899-905.

9. НЦовська 1.О., Шаховський A.M., Череп М.Н., Городенська М.М., Кучук М.В. (2006) Отримання цибридних транспластомних рослин Brassica napus з хлоропластами Lesquerella fendleri II Цитология и генетика, v.40, №4.с.3-11.

10. Пирузян Э.С., Могутов М.А., Великодворская Г.А., Акименко В.К. (1985) Клонирование и экспрессия структурного гена эндонуклеазы целлюлолитического комплекса Clostridium thermocellum Ф7 в клетках E.coli К12 // ДоклАН СССР, т.281,№4, 963-965.

11. Пирузян Э.С., Могугов М.А., Великодворская Г.А., Пушкарская Т.А. Изучение целлюлолитических (eel) генов Clostridium thermocellum Ф7 и кодируемых ими белков // Генетика, 1988, №2, 204-209.

12. Д.В. Сотченков, И.В. Голденкова, II. Мирахоли, Л.В. Волкова. Модификация последовательности гена дефензина SD2 из подсолнечника и его экспрессия в бактериальных и дрожжевых.// Генетика, 2005. Т. 41. № 11. с. 1453-1461.

13. Alting-Mees M.A., Short J.M. (1989) pBluescript II: gene mapping vectors //Nucleic Acids Res., 17(22):9494

14. Ait N, Greuzet—N— Gattaneo J.(1979) Characterization and purification of thermostable beta-glucosidase from Clostridium thermocellum.// Biochem Biophys Res Commun., v.113, p. 399-402.

15. Alam J., Cook J.L. (1990) Reporter genes: application to the study of mammalian gene transcription//Analyt.Biochem.,v.l88, p.245

16. Apel K., Bohlmann H. & Reinmann-Philipp U. (1990) Leaf tionins: A novel class of putative defence factors // Physiol.Plant, v.80, p.315-321.

17. Baum T.j., Hiatt A., Parrott W.A., Pralt L.H., Hussey R.S. (1996) Expression in tobacco of a functional monoclonal antibody specific to stylet secretions of the root-knot nematode. //Mol. Plant-Microbe Int., 9, p. 382-387.

18. Bevan M. (1984) Binary Agrobacterium vectors for plant transformation. // Nucleic Acids Res., 12(22), p. 8711-21.

19. Bradford M. M. (1976) A Rapid Sensitive Method for Quantification of Microgram Quantities of Protein Utilizing the Principle of Protein-Dye Binding// Anal. Biochem.- V.72.- P.248-254.

20. Brauenr-Osborne H., Brann M.R. (1996) Functional partial agonism at cloned human muscarinic acetylcholine receptors //Eur. J. Pharmacol., v.295, p.93.

21. Broekaert W.F., Cammue B.P.A., De Bolle M., Thevissen K., De Samblanx G.W., Osborn R.W. (1997) Antimicrobal peptides from plants. // Crit. Rev. Plant Sci., v.16, p. 297-323.

22. Broekaert W.F., Terras F.R.G., Cammue B.P.A.& Osborn R.W. (1995) Plant defensins: Novel antimicrobial peptides as components of the host defense system. //Physiol.Plant., v.108, p. 1353-1358.

23. Bronstein I., Fortin J., Stanley P.E., Stewart G.S.A.B., Kricka L.J. (1994) Chemiluminescent and bioluminescent reporter gene assays //Anal. Biochem., V. 219(2), P. 169-181.

24. Burton D.R., (2002) Antibodies, viruses and vaccines. //Nat. Rev. Immunol., 2, p. 706-713.

25. Caldwell J.E., Abildgaard F., Dzakula Z., Ming D., Hellekant G., Markley J.L. (1998) Solution structure of the thermostable sweet-tasting protein brazzein. //Nat. Struct. Biol., v.5, p. 427-431.

26. Саттие В. P. A., Francois I. Е. J. A., De Bolle М. F. С. et al. Transgenic expression in Arabidopsis of a polyprotein construct leading to production of two different antimicrobial proteins // Plant Physiology. 2002. V.128. P.1346-1358.

27. Canal L., Urdangarin M. C., Norero N. S., Broekaert W. F. A defensin gene expressed in sunflower inflorescence // Plant Physiol. Biochem., 2000. V.38. N.3. P.253-258.

28. Chalfie M., Tu Y., Euskirchen G., Ward W.W., Prasher D.C. (1994) Green fluorescent protein as a marker for gene expression //Science, v.263, №1548, p.802-805.

29. Charlet M., Chernysh S., Philippe H., Hertu C„ Hoffmann J.A., Bulet P. (1996) Innate immunity. Isolation of several cysteine-rich antimicrobial peptides from the the blood of a mollusk, Mytilus edulis. IIJ. Biol. Chem., v.274, p. 21808-21813.

30. Chen C.-C., Wu P.-H., Huang C.-T., Cheng K.-J. (2004) A Pichia pastoris fermentation strategy for enchancing the heterologous expression of a Escherichia coli phytase. //Enz. Microb. Technol., 35, p. 315-320.

31. Colilla R.J., Rocher A., Mendez E. (1990) gamma-Purothionins : amino acid sequence of two polypeptides of a new family of thionins from wheat endosperm. //FEBS Lett., v.270, p. 191-194.

32. Cornet В., Bonmatin J.M., Hertu C., Hoffmann J.A., Ptak M., Vovelle F. (1995) Refined three-dimensional solution structure of insect defensin. //A. Structure, v.3, p. 435-448.

33. Craig F.F., Simmonds A.C., Watmore D., McCapra F., White M.R.H. (1991) Membrane-permeable luciferin esters for assay~of firefly luciferase in live intact cells // Biochem.J., v.276, p.637-641.

34. Cutt J.R., Harpster M.H., Dixon D.C., Carr J.P., Dunsmuir P., Klessig D.F. Disease response to tobacco mosaic virus in transgenic tobacco plants that constitutively express the pathogenesis- related PR-lb gene // Virology.- 1989.-V.173.- P.89- 97.

35. Doran P.M. (2000) Foreign protein production in plant tissue culture. //Curr. Opin.' Biotech., 11,p. 199-204.

36. Fischer R., Vaquero-Martin C., Sack M. et al. (1999b) Towards molecular farming in the future: transient protein expression in plants // Biotechnol. Appl. Biochem., 30, p. 113-114.

37. Flenbok B. (1991) The etanol utilization regulon of Aspergillus nidulans: the alcA-alcR system as tool for the expression of recombinant proteins. // J. Biotechnol., v.17, p. 177-180.

38. Gao A.G., Hakimi S.M., Mittanck C.A., Wu Y., Woerner B.M., Stark D.M., et al., (2000) Fungal pathogen protection in potato by expression of a plant defensin peptide.//Nat Biotechnol., 18, p. 1307-1310.

39. Gatz C. (1996) Chemically inducible promoters in transgenic plants. //Curr. Opin. Biotechnol., v.7, p. 168-172.

40. Gatz С. (1997) Chemical control of gene expression. // Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., v.48, p. 89-108.

41. Gatz C. and Lenk I. (1998) Promoters that respond to chemical inducers. // Trend Plant Sci., v.3, p. 352-358.

42. Gatz C., Frohberg C., Wendenburg R. (1992) Stringent repression and homogeneous derepression by tetracycline of modified CaMV 35S promoter in intact transgenic plants. // Plant J., v.2, p. 397-404.

43. George S.E., Bungay P.J., Naylor L.H. (1998) Functional analysis of the D2L dopamine receptor expressed in a cAMP-responsive luciferase reporter cell line//Biochem. Pharmacol., v.56, p.25-30.

44. Gleba Y., Marillonnet S., Klimyuk V. (2004) Engineering vector expression system in plants: the «full virus» and the «deconstructed virus» strategies // Curr. Opin. Plant Biol., v.7, p. 182-188.

45. Gorman C. DNA cloning II-A Practical Approach/ Ed.Glover D.M., 1985,p. 143

46. Gossen M. and Bujard H. (1992) Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA., v.89, p. 5547-5551.

47. Gura T. (2001) Innate immunity. Engineering protection for plants. // Science, v. 291(5511), p. 2070.

48. Harder J., Siebert R., Zhang Y., Matthiesen P., Christophers E., Schlegelberger В., Schroder J.M. (1997) Mapping of the gene encoding human P-defensin-2 (DEFB2) to chromosome region 8p22-p23.1. //Genomics, v.46, p. 472-475.

49. Heim R., Prasher D.C., Tsien R.Y. (1994) Wavelength mutations and posttranslational autoxidation of green fluorescent protein.//Proc. Natl.Acad.Sci.USA,, v.91, p. 12501

50. HeIIens R.P., Edwards E.A., Leyland N.R. et al. (2000) pGreen: a versatile and flexible binary Ti vector for Agrobacterium-mediated plant transformation //Plant Mol. Biol., № 42(6), p.819-832.

51. Hiatt A., Caffertey R., Bowdish K. (1989) Production of antibodies in transgenic plants. //Nature, 342, p. 76-78.

52. Hitchcock C.A. (1991) Cytochrome Р-450-dependent 14 alpha-sterol demethylase of Candida albicans and its interaction with azole antifungals //Biochem. Soc. Trans., 19, p. 782-787.

53. Hoekema A., Roelvink PW, Hooykaas PJ, Schilperoort RA. (1984) Delivery of T-DNA from the Agrobacterium tumefaciens chromosome into plant cells. //EMBO J., 3(11), p. 2485-2490.

54. Hou B.K., Zhou Y.H., Wan L.H., et al. (2003) Chloroplast transformation in oilseed rape. //Transgenic Res., 12, p. 111-114.

55. Hristova K., Selsted M.E., White S.H. (1996) Interactions of monomeri rabbit neutrophil defensins with bilayers: comparison with dimeric human defensin HNP-2. // Biochemistry, v.35, p. 11888-11894.

56. Jefferson RA, Kavanagh ТА, Bevan MW. (1987) GUS fusions: beta-glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants // EMBO J., v.6, № 13, p.3901-3907.

57. Jia H.P., Schutte B.C., Schudy A., Linzmeier R., Guthmiller J.M., Johnson G.K., Tack B.F., Mitros J.P., Rosenthal A., Ganz Т., Mc Cray P.B. (2001) Discovery of new human (3-defensin using a genomics-based approach. //Gene, v.263, p. 211218.

58. Joyeux A., Balaguer P., Germain P., Boussioux A.M., Pons M., Nicolas J.C. (1997) Engineered cell lines as a tool for monitoring biological activity of hormone analogs. // Anal. Biochem.,v.249 (2), p. 119-130.

59. К. Ко, H. Koprowski. (2005) Plant biopharming of monoclonal antibodies// Virus Research, №111, p. 93-100.

60. К. Ко, Wei X., Crooks P.A., Koprowski H. (2004) Elimination of alkaloids from plant-derived human monoclonal antibody. //J. Immunol. Methods, 286, p. 79-85.

61. Kapila J.,R. de Rycke, M. van Montagum and g. Angenon. (1997) An Agrobacterium-mediated transient gene expression system for intact leaves // Plant Sci., v.122, p. 101-108.

62. Kawaoka A., Kawamoto Т., Ohta H. et al. Wound-induced expression of horseradish peroxidase // Plant Cell Rep.-1994.-V.13.-P.149-154.

63. Khoudi H., Laberge S., Ferullo, Bazin R., Darveau A., Castonguay Y., Allard G., Lemieux R., Vezina L.P. (1999) Production of a diagnostic monoclonal antibody in perennial alfalfa plants. //Biotechnol. Bioeng., 64, p. 373-381.

64. Koncz C. and Schell J., (1986) The promoter of TL-DNA gene 5 controls the tissue-specific expression of chimaeric genes carried by a novel type of Agrobacterium binary vector //Mol. Gen. Genet., v.204, p. 383-396.

65. Kononowicz A.K., Nelson D.E., Singh N.K., Hasegawa P.M., Bressan R.A. Regulation of the osmotin gene promoter // Plant Cell.- 1992.- V.4.- P.513-524.

66. Kuchuk N., Sytnik K., Vasilenko M., Shakhovsky A., Komarnitsky I., Kushnir S., Gleba Yu. (2006) Genetic transformation of plastids of different Solanaceae species using tobacco cells as organelle hosts// Theor.Appl.Genet., v. 113, № 3, p.519-527

67. Lanberty M., Caille A., Landon C., Tassin-Moindrot S., Hertu C., Bulet P., Vovelle F. (2001)Solution structures of the antifungal heliomicin and a selected variant with both antibacterial and antifungal activites. //Biochemistry, v.40, p. 11995-12003.

68. Landon C., Pajon A., Vovelle F., Sodano P. (2000) The active site of drosomycin, a small insect antifugal protein, delineated by comparison with the modeled structure of Rs-AFP2, a plant antifungal protein. // J. Pept. Res., v.56, p. 231-238.

69. Lazo G.R., Stein P.A., Ludwig R.A. (1991) A DNA Transformation-competent Arabidopsis Genomic Library in Agrobacterium. Biotechnology (NY).,)9 (10): 963-967.

70. Lessard P.A. et al. (2002) Manipulating gene expression for the metabolic engineering of plants. // Metab. Eng., v.4, p. 67-79.

71. Lorenz W.W., Cormier M.J., O'Kane D.J., Hua D., Escher A.A., Szalay A.A. (1996) Expression of the Renilla reniformis luciferase gene in mammalian cells // J. Biolumin. Chemilumin., v.l 1, p.31-37.

72. Lu S., Shi R., Tsao C.C., Yi X., Li L., Chiang V.L. RNA Silencing in Plants by the Expression of siRNA Duplexes// Nucleic Acids Res. 2004 V.32(21). P. 171.

73. M. Padidam. (2003) Chemically regulated gene expression in plants // Current Opinion in Plant Biology, №6, p. 169-177.

74. M. Venter. (2007) Synthetic promoters: genetic control through cis engineering // Trends in Plant Science, v.12, № 3,

75. Ma J.K., Hikmat B.Y., Wycoff K., Vine N.D., Chargelegue D., Yu L., Hein M.B., Lehner T. (1998) Characterization of a recombinant plant monoclonal secretory antibody and preventive immunotherapy in humans. //Nat. Med., 4, p. 601-606.

76. Manen-D., Pougeon M., Damay P., Geiselmann J. (1997) A sensitive reporter gene system using bacterial luciferase based on a series of plasmid cloning vectors compatible with derivatives of pBR322 // Gene, v. 186, p. 197-200.

77. Marillonnet S. et al.(2004) In planta engineering of viral RNA replicons: efficient assembly by recombination of DNA modules delivered by Agrobacterium // Proc.

78. Natl. Acad. Sci US A,.v. 101, p. 6852-6857.

79. Marillonnet S., Thoeringer C., Kandzia R., Klimyuk V., Gleba Y. (2005) Systemic Agrobacterium tumefacient -mediated transfection of viral replicons for efficient transient expression in plants //Nature biotechnology, v. 23, p. 718-723.

80. Hamilton DA, Roy M, Rueda J, Sindhu RK, Sanford J, Mascarenhas JP. (1992) Dissection of a pollen-specific promoter from maize by transient transformation assays //Plant J., v.18 (2), p.211-218.

81. Matsunaga Т. and Rahman A. (1998) What brought the adaptive immune system to veterbrates?-The jaw hypothesis and the seahorse. //Immunol. Rev., v. 166, p. 177-186.

82. Matz M.V., Fradkov A.F., Labas Yu.A., Savitsky A.P., Zaraisky A.G., Markelov M.L., Lukyanov S.A. (1999) Fluorescent proteins from nonbioluminescent Anthozoa species. //Nature Biotech., v. 17, p.969-973.

83. Misteli Т., Spector D.L. (1997) Applications of the green fluorescent protein in cell biology and biotechnology // Nat.Biotechnol., v. 15, p.961-964.

84. Pazzagli M., Devine J.H., Peterson D.O., Baldwin Т.О. (1992) Use of bacterial and firefly luciferases as reporter genes in DEAE-dextran-mediated transfection of mammalian cells // Anal. Biochem., v. 204 (2), p. 315-323.

85. Picard C. (1994) Regulation of protein function through expression of chimeric proteins. // Curr. Top.Biotech., v.5, p. 511-515.

86. Piruzian E.S., Monzavi-Karbassi В., Darbinian N.S., Goldenkova I.V., Kobets N.S., Mochulsky A.V.(1998) The use of a thermostable beta-glucanase gene from Clostridium thermocellum as a reporter gene in plants // Mol. Gen.Genet, v. 257, p. 561-567

87. E.S. Piruzian, I.V. Goldenkova-Pavlova, R.M. Abdeev, R.A. Komakhin, S.A. Brouskin, I.A. Abdeeva. (2006) Transgenic plants expressing bacterial genes as a model system for plant functional genomics. // Current Genomics, V.7, p. 3342.

88. Porta C. and Lomonossoff G.P. (2002) Viruses as vectors for expression of foreign sequences in plants //Biotechnol. Genet. Eng. Rev., v. 19, p. 245-291.

89. Potrycus I., Mutelstein-Sheid O., Suatter C., Spangenberg G. (1991) Gene transfer to plants. EMBO advanced cources. Zurich: Swiss Federal Institute of Technology, -125p.

90. Prats E., Galindo J.C., Bazzalo M.E., Leon A., Macias F.A., Rubiales D., Jorrfn J.V. (2007) Antifungal activity of a new phenolic compound from capitulum of a head rot-resistant sunflower genotype. // J Chem Ecol., 33(12), p. 2245-53

91. Rigden J.E., Dry I.B., Mullineaux P.M., Rezaian M.A. (1993) Mutagenesis of the virion-sense open reading frames of tomato leaf curl geminivirus.// Virology, 193(2), p.1001-1005.

92. R. Boehm. (2007) Bioproduction of therapeutic proteins in the 21 st century and the role of plants and plant cells as production platforms// Ann.N.Y. Acad.Sci. 1102, p.121-134.

93. Tyagi AK, Khurana JP. (2003) Plant molecular biology and biotechnology research in the post-recombinant DNA era.// Adv Biochem Eng Biotechnol., 84, P. 91-121.

94. R.M. Twyman, E.Stoger, S. Schillberg, P. Christou, R. Fischer. (2003) Molecular farming in plants: host systems and expression technology// Trends in Biotechnology, vol. 21, № 12, p. 570-578.

95. Reed R. and Hurt E. (2002) A conserved mRNA export machinery coupled to pre-mRNA splicing //Cell, v. 108, p. 523-531.

96. Salter M.G., Paine J.A., Riddell K.V., Jepson I., Greenland A.J., Caddick M.X., Tomsett A.B. (1998) Characterization of the ethanol-inducible ale gene expression system for transgenic plants. // Plant J., v.16, p. 127-132.

97. Samach A., Onouchi H., Gold S.E., Ditta G.S., Schwarz-Sommer Z., Yanofsky M.F., Coupland G. (2000) Distinct roles of constans target genes in reproductive development of Arabidopsis // Science, v.288, p. 1613-1616.

98. Sambrook J. and Russell D. W. Molecular Cloning: A Laboratory Manual.-Cold Spring Harbor Laboratory; 3rd edition 2001.-999 p.

99. Sandhu J. S. • Osadjan M. D. • Krasnyanski S. F. Domier L. L. • Korban S. S., -Buetow D. E. Enhanced expression of the human respiratory syncytial virus-F gene in apple leaf protoplasts Plant Cell Reports (1999) 18: 394-397.

100. Sawai M.V., Jia H.P., Liu L., Aseyev V., Wiencek J.M., McCray P.B., Ganz Т., Kearney W.R., Tack B.F. (2001) The NMR structure of human defensin-2 reveals a novel alpha-helical segment. //Biochemistry, v.40, p. 381038.16.

101. Schillberg S. et al. (2002) Antibody molecular farming in plants and plant cells. // Phytochem. Rev., v.l, p.45-54.

102. Schinmyo A., Garsia-Martinez D.V., Demain A.L. (1979) Classification and biological distribution of histamine receptor sub-types // J.Appl.Biocem., v.l, p. 202-209.

103. Segura A., Moreno M., Molina A., Garcia-Olmedo F. (1998) Novel defensin subfamily spinach (Spinacia oleracea). //FEBS Lett., v.435, p. 159-162.

104. Serge Remy, Els Thiry, Bert Coemans, Saskia Windelinckx, Rony Swennen, and Laszlo Sagi. Improved T-DNA vector for tagging plant promoters via high-throughput luciferase screening. //BioTechniques. Vol. 38, No. 5 (2005) 763-770.

105. Sergeyenko T.V., Los D.A. (2000) Identification of secreted proteins of the cyanobacterium Synechocystis sp. strain PCC6803. FEMS Microbiol. Lett. 193: 2113-216.

106. Spaink H.P. (1994) The molecular basis of the host specificity of the Rhizobium bacteria. // Antonie Van Leeuwenhoek., 65(2), p. 81-98.

107. Sytnik K., Komarnytsky I., Gleba Y., Kuchuk N. (2005) Transfer of transformed chloroplasts from Nicotiana tabacum to the Lycium barbarum plants// Cell Biol.Int., v.29, p.71-75.

108. Taylor C.B. (1997) Plant Vegetative Development: From Seed and Embryo to Shoot and Root //Plant cell, v.9 (7), p.981-988.

109. Taylor С. B. (1997) Promoter fusion analysis: an insufficient measures of gene expression// Plant Cell.- V.9.- P.273-275.

110. Giddings G. (2001) Transgenic plants as protein factories// Current Opinion in Biotechnology V.12.- P.450-454.

111. Thevissen K., Kathelijne K.A. Ferket, Isabelle E.J.A. Francois, Bruno P.A. Cammue. (2003) Interactions of antifungal plant defensins with fungal membrane components. //Peptides, 24, p. 1705-1712.

112. Templeton M.D., Rikkerink E.A.H. & Beever R.E.(1994) Small, cystein-rich proteins and recognition in fungal-plants interactions // Mol.Plant-Microbe Interact., v.7, p.320-325.

113. Thomma В., Cammue B. and Thevissen K. (2003) Mode of action of plant defensins suggests therapeutic potential // Curr. Drug Targets-Infectious Disorders, v.3, p. 1-8.

114. Thomma B.P.H.J., Cammue B.P.A., Thevissen K. (2002) Plant defensins. // Planta, v.216, p. 193-202.

115. Topfer, R., V. Matzeit, et al. (1987). A set of plant expression vectors for transcriptional and translational fusions.// Nucleic Acids Res 15(14): 5890.

116. Van Lijsebettens M. and Valvekens D. (1987). Tobacco Leaf Disk Infection with Agrobacterium tumefaciens EMBO Practical Course on Plant Molecular Biology. Montagu M. V. Gent., Belgium: 15-18.

117. Vasilenko M., Ovcharenko O., Kuchuk N., Gleba Yu.(2006) Production of cybrids in Brassiacaceae species// Molecular Biology, Plant Cell Cultire Protocols. Totowa, NJ:Humana Press Inc., v.318, p.221-234.

118. Verch Т., Yusibov. V., Koprowski H. (1998) Expression and assembly of a full-length monoclonal antibody in plants using a plant virus vector. //J. Immunol. Metods, 220, p. 69-75.

119. Walsh T.J., Viviani M.A., Arathoon E., Chiou C., Ghannoum M., Groll A.H., Odds F.C. (2000) New targets and delivery systems for antifungal therapy // Med. Mycol, 38, p. 335-347.

120. Welsh S., Kay S.A. (1997) Reporter gene expression for monitoring gene transfer //Curr.Opin.Biotechnol., v.8,p.617-622.

121. Wong E.Y., Hironaka C.M., Fishholf D.A. (1992) Arabidopsis thaliana small subunit leader and transit peptide enhance the expression of Bacillus thuringiensis protein in transgenic plants. Plant Mol. Biol., 20: 81-93.

122. Wood Т. M. and Bhat К. M. (1988) Methods for measuring cellulase activities// Meth Enzymol.- V.160.- P.87-112.

123. Yang Y.S., Mitta G., Chavanieu A., Calas В., Sanchez J.F., Roch P., Aumelas A. (2000) Solution structure and activity of the synthetic four-disulfide bond Mediterranean mussel defensin (MGD-1). //Biochemistry, v.39, p. 1443614447.

124. Yoshida K. and Shinmoy A. (2000) Transgene expression systems in plant, a nature bioreactor. //J. Biosci. Bioeng., v.90, p. 353-362.

125. Yano A., Maeda F., Takekoshi M. (2004) Transgenic tobacco cells producing the human monoclonal antibody to hepatitis В virus surface antigen. //J. Med. Virol., 73, p. 208-215.

126. Zeidler В., Gatz c., Hartmann E., Hughes J. (1995) Tetracycline regulated reporter gene expression in the moss Physcomitrella patens //Plant Mol. Biol., v.30, p. 199-205.

127. Zhong Huang and Hugh S. Mason. (2004) Conformational analysis of hepatitis В surface antigen fusions in an Agrobacterium-mediated^ transient expression system. // Plant Biotechnology Journal, 2 , pp. 241-249.

128. Автор выражает искреннюю и глубокую признательность своему научному руководителю, профессору, доктору биологических наук Пирузян ЭлеонореN

129. Суреновне за поддержку, внимание и неоценимую помощь в ходе выполнения научной работы.