Новые репортерные системы для изучения регуляции экспрессии генов тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.15, доктор биологических наук Голденкова, Ирина Васильевна

• Голденкова, Ирина Васильевна
• доктор биологических наук
• 2002

Оглавление диссертации доктор биологических наук Голденкова, Ирина Васильевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЯ И ОБОЗНАЧЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА I. ЦЕЛЛЮЛОСОМЫ Clostridium thermocellum, СТРУКТУРА, ФУНКЦИИ, МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ ФЕРМЕНТОВ ЦЕЛЛЮЛОСОМ И ИСПОЛЬЗОВАНИЕ

ДЛЯ ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПРИКЛАДНЫХ

ИССЛЕДОВАНИЙ (ЛИТЕРАТУРНЫЕ ДАННЫЕ).

1.1. Гидролиз целлюлозы микроорганизмами

1.2. Структурная организация целлюлосомы Clostridium thermocellum.

1.3. Структура гликозилгидролаз.

1.4. Механизм действия гликозилгидролаз.

1.5. Трехмерная структура гликозилгидролаз и топология активных центров.

1.6. Использование гликозилгидролаз в прикладных и фундаментальных исследованиях.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Новые репортерные системы для изучения регуляции экспрессии генов»

Актуальность темы. В последние годы определены последовательности геномов многих организмов (вирусов, про- и эукариот), всего более 800 организмов. Однако расшифровка нуклеотидной последовательности не всегда дает полное представление об ее функциональном значении, и для понимания механизмов функционирования организма важным представляется изучение регуляции экспрессии генов. Экспрессия генов может регулироваться на разных уровнях: организации хроматина, транскрипции, трансляции и процессинга.

Для изучения регуляции экспрессии генов используют целый арсенал молекулярно-биолот ических методов: Нозерн- или Вестерн-блот гибридизация, визуализация РНК или белка in situ. определение ферментативной активности белкового продукта (если таковая имеется), и ряд других. Однако эти методы исследований в большинстве случаев требуют больших затрат времени, реагентов, а также специального оборудования, и исследователи для изучения структурно-функциональных характеристик интересующих их последовательностей часто используют стратегию репортерных систем. Для этого конструируются химерные гены, в которых промотор интересующего гена или последовательность регуляторного элемента присоединяю! к последовательности репортерного гена.

Репортерные гены кодируют белки, которые обладают либо уникальными особенностями, либо уникальными ферментативными активностями, за счет чего они могут быть легко выделены из совокупности внутри- и внеклеточных белков.

10

Методология репортер пых систем позволяет осуществлять контроль за временной и пространственной экспрессией генов во время таких сложных процессов как клеточный цикл, при воздействии на клетки гормонами, факторами роста, питательными веществами, факторами внешней среды; изучать механизмы сортировки, транспорта и внутриклеточной локализации белков; проводить проверки большого числа клеточных линий к лекарственной чувствительности или устойчивости; осуществлять слежение за «доставкой» генов (gene delivery), а таюке использовать их для других целей.

К репортерным генам и их продуктам предъявляется ряд требований. Одно из них - простота и высокая чувствительность количественных и качественных методов определения активности репортерного белка на фоне других клеточных компонентов. Немаловажные факторы - это возможность проводить динамические наблюдения, как увеличения, так и уменьшения экспрессии генов (в этом случае важными характеристиками являются период полужизни и/или время созревания белка); отсутствие схожих активностей в клетках исследуемого организма, а таюке размер репортерного гена и его продукта (для удобства клонирования и анализа экспрессии репортерного белка). Важным свойством репортерных белков является возможност ь достроек в N- и С-концевых областях репортерного белка без потери его активности.

В настоящее время предложен и широко используется ряд репортерных систем. Однако, следует отметить, что ни одна из используемых репортерных систем не является универсальной - все они наряду с преимуществами имеют недостатки. Эти недостатки ограничивают их применение для ряда клеток модельных организмов, а также и для некоторых исследований. Поэтом)'

11 исследователям важно иметь в распоряжении несколько репортерных систем, которые можно использовать в одних и тех же клетках. Работы по модификации широко используемых репортерных систем, усовершенствованию методов определения активности продуктов репортерных генов, поиску новых репортеров являются актуальными.

В последние годы уделяется много внимания использованию термостабильиых ферментов, особенно гликозилгидролаз, в биотехнологии. Гликозилгидролазы термофильных бактерий являются удобными моделями и для изучения многих фундаментальных проблем: молекулярных основ термостабильности, укладки (фолдинга) белковых молекул, структурных и функциональных элементов каталитических и некаталитических модулей ферментов и ряда других.

Области использования этих ферментов в фундаментальных исследованиях могут быть расширены, если учитывать, что большинство из них, наряду с высокой удельной активностью, обладают таким уникальным свойством как высокая термостабильность. Поэтому изучение структуры и свойств термостабильных гликозилгидролаз, модификация их последовательностей, а также конструирование на их основе репортерных белков, многофункциональных ферментов и белков-носителей являются перспективными направлениями исследований.

Цель диссертационной работы: разработать новые репортерные системы на основе термостабильной лихеназы ((5-1,3-1,4-глюканазы) Clostridium theriaoceUuin для изучения регуляции экспрессии генов в клетках про- и эукариот.

12

Для выполнения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

1. Провести анализ нуклеотидной последовательности гена, кодирующего термостабильную лихеназу (LicB), н анализ структуры фермента.

2. Модифицировать последовательность гена лихеназы и провести сравнительный анализ биохимических свойств модифицированных и нативного ферментов.

3. Изучить возможность использования гена термостабилыюй лихеназы в качестве транскрипционного репортера для клеток про- и эукариот, для этого:

- сконструировать экспрессионные вектора, в которых модифицированный ген лихеназы (7/сВМ2) находится под контролем различных регуляторных элементов, для трансформации клеток про- и эукариот.

- проанализировать экспрессию гена //сВМ2 в клетках бактерий, дрожжей, растений и млекопитающих.

4. Из\чить возможность использования термостабильной лихеназы в экспериментах по секреции, транспорту и компартментализации белков в клетках сине-зеленых водорослей и растений.

5. Разработать методические подходы к использованию гена лихеназы в качестве потенциального селективного маркера для клеток про- и эукариот.

6. Сконструировать бифункциональные репортерные белки LicB-GFP, GFP-LicB. LicB-GUS, GUS-LicB и изучить возможность их использования в качестве регтортерпых систем для про- и эукариот.

Изучить возможность использования термостабильной лихеназы в качестве трансляционного репортерного белка для клеток про- и эукариот, для этого:

- сконструировать экспрессионные вектора, в которых последовательности синтетических генов аналогов белка каркасной нити паутины (епидроина 1) Nephila clavipes, имеющих различное количество мономеров, слиты в одной рамке считывания с последовательностью репортерного гена лихеназы (7/гВМ2).

- проанализировать экспрессию гибридных генов в рас гениях.

Изучить возможность использования термостабильной лихеназы в качестве репортерного белка-носителя случайных и определенных пегггидов, для нот:

- сконструировать лихеназу (вариант АС), у которой N- и С-конны перенесены в область петлевого домена белковой молекулы, a N- и С-коицы нативного фермента соединены линкером для встраивания последовательностей пептидов (circularly permutated лихеназа).

- сконструировать лихеназу (вариант СА), у которой в область петлевого домена добавлен линкер для встраивания последовател ьностей пептидов.

- провести сравнительный анализ биохимических свойств circularly permutated лихеназы (вариант АС) и нативного фермента (вариант СА).

- сконструировать экспрессионные вектора, в которых последовательности, кодирующие исследуемые пептиды (GFP, INFA, Epitope for Human respiratory syncytial virus), встроены в последовательность лихеназы (вариант АС) как внутренний гетерологичпый модуль фермента.

15

Научная новизна работы. Впервые свойство термостабильности фермента использовали для того, чтобы предложить белок в качестве репортерпого для клеток про- и эукариот. Анализ экспрессии бактериального гена лихепазы в E.coli, клетках дрожжей, млекопитающих и растений показал, что бактериальная лихеназа обладает многими свойствами, необходимыми для репортера. Во всех клетках лихеназа продуцируется в активной форме. Индукционный анализ трансформированных клеток показал быстрые изменения ферментативной активности лихеназы при действии соответствующих индукторов или репрессоров, что позволило предложить использование фермента в кинетических исследованиях. Показано, что лихеназа сохраняет активность при значительных достройках в N- и С-концевых областях белка, что является важным свойством репортеров.

Впервые сконструированы бифункциональные репортерные белки на основе делеционного варианта лихеназы (LicBM2) и зеленого флуоресцентного белка (GFP). Показано, что в составе бифункциональных гибридных белков лихеназа, GFP и 1ЛсВМ2 сохраняют основные свойства репортерных белков, лихеназа остается активной при температуре 65°С, GFP - флуоресцентным белком.

Впервые термостабильная лихеназа успешно использована как трансляционный репортерпый белок для клеток про- и эукариотических организмов.

Впервые термостабильная лихеназа успешно использована в качестве репортсрного белка-носителя пептидов, поскольку в составе гибридных белков, в которых последовательности пептидов, имеющих различную длину и

16 структуру, встроены в последовательность лихеназы в виде внутреннего модуля, лихеназа проявляет высокую активность и термостабильность, а исследуемые пептиды сохраняют свои свойства.

Практическая значимость работы. Полученные результаты позволяют предложить использовать как саму лихеназу, так и бифункциональные репортерные белки, сконструированные на ее основе, в качестве удобных репортерных систем для изучения молекулярных механизмов генетических процессов, таких как транскрипция, трансляция, транспорт и секреция белков, а также структурно-функциональных особенностей геномов организмов про- и эукариотического происхождения. Модифицированные варианты лихеназы могут быть использованы в качестве белков-носителей случайных пептидов в исследованиях пептидных библиотек.

Основные положения, выдвигаемые на защиту.

1. Нукдеотидная последовательность тепа, кодирующего термостабильную лихеназу Clostridium thcrmocellum, а также структура белковой молекулы и свойства бактериального фермента позволяют использовать лихеназу в качестве репортерной системы для широкого круга модельных организмов про- и эукариотического происхождения.

2. Некаталитические модули термостабильной лихеназы (лидерная последовательность, 'docerirf модуль) не оказывают значительного влияния на основные свойства фермента: активность, термостабильность, температурный и рН оптимумы. Термостабильная лихеназа предлагается в качестве удобного транскрипционного репортера при изучении силы и ипдуцибсльности промоторов и регулятор пых элементов для клеток бактерий, дрожжей, растений и млекопитающих. Ген, кодирующий термостабильпую лихеназу. успешно экспрессируется во всех исследованных модельных организмах, с образованием активного фермента, который не претерпевает дополнительных модификаций в гетерологичных организмах. Высокая удельная активность и термостабильность этого фермента позволяют точно и легко определять уровень его ферментативной активности на фоне термолабильных ферментов про-и эукариотических клеткок качественными и количественными методами. Методы анализа активности лихеназы являются быстрыми, точными и чувствительными и не требуют дорогостоящего оборудования и реактивов.

Эффективная секреция термостабильной лихеназы через секреторные пути про- (Synechocystis) и эукариот (растения) посредством соответствующих лидерных пептидов является достаточно убедительной для использования этого фермента в исследованиях секреции, транспорта и компаргментализации белков, а также для поиска и изучения новых лидерных последовательностей.

Термостабильная лихеиаза может быть использована как потенциальный селективный маркер для клеток бактерий, дрожжей и растений.

В составе бифункциональных гибридных белков (GFP-LicB, LicB-GFP, GUS-LicB, LicB-GUS) лихеиаза, GFP и GUS сохраняют основные свойства репортерных белков: лихеназа остается активной при 65°С, GFP - флуоресцентным белком, GUS - гидролизует соответствующие субстраты. Бифункциональные репортерные системы, в которых преимущества одной репортерной системы компенсируют недостатки другой, предлагаются в качестве удобных репортерных систем для изучения регуляции экспрессии генов в клетках про- и эукариот. Термостабильная лихеназа предлагается в качестве удобного трансляционного репортера для клеток про- и эукариот. Лихеназа сохраняет активность и остается термостабильной при значительных достройках в N-концевой области белка. Метод зимограмм (метод качественного определения активности термостабильной лихеназы) позволяет точно определять молекулярные массы гибридных белков, в состав которых входит лихеназа. Этот метод может быть использован вместо Вестерн-блот гибридизации при использовании лихеназы в качестве рспортерного белка.

Перенос N- и С-копцов фермента в область петлевого домена нативного фермента не оказывает влияния на основные свойства фермента, за исключением уменьшения времени стабильности белка при 70°С и 75°С.

19

9. Термостабильная лихеназа предлагается в качестве репортерного белка-носитсля пептидов. В составе гибридных белков, в которых последовательности пептидов, имеющих различную длину и структуру, встроены в последовательность лихеназу в виде внутреннего модуля, лихеназа проявляет высокую активность и термостабильность, а исследуемые пептиды сохраняют свои свойства.

Апробация работы. Результаты работы докладывались на IV International Symposium "Molecular Responses of Plants to Biotic and Abiotic Stresses" (Helsinki, Finland, 1997); International Conference "Molecular Genetics and Biotechnology" (Minsk, Belarus, 1998); International Symposium "Molecular Mechanisms of Stress Responses in Plants" (Moscow, Russia, 1998); Annual Meeting of the American Society of Plant Physiologists (Baltimor, Marryland, USA, 1999); IV съезде Общества физиологов растений России (Москва, Россия, 1999); Annual Meeting of American Society of Plant Physiologists (San Diego, California, USA, 2000); International Symposium "Molecular Mcchanisms of Genctic Processes and Biotechnology" (Moscow-Minsk, Russia-Belarus, 2001), на заседании научного семинара Института генетики и цитологии НАН Беларуси, на заседаниях Ученого совета и научного семинара Института общей генетики им. И.И. Вавилова РАН, на семинарах лаборатории генетической инженерии растений Институ та общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН.

Заключение диссертации по теме «Генетика», Голденкова, Ирина Васильевна

ВЫВОДЫ

Впервые свойство термостабильности фермента лихеназы Clostridium thermocellum использовали, чтобы предложить фермент в качестве репортерного белка для изучения регуляции экспрессии генов в про- и эукариотических организмах. Делеции нуклеотидной последовательности гена лихеназы в области, кодирующей некаталитические компоненты, не изменяют свойства ферментов. Делеционные варианты лихеназы, у которых частично или полностью удалены некаталитические модули (лидерный сигнал, 'docerin' модуль), сохраняют основные свойства полноразмерного фермента: активность в широком диапазоне рН и температур, стабильность при высоких температурах, способность к ренатурации с сохранением активности и термостабильности при действии денатурирующих агентов (SDS, тритон Х-100, этанол, ТХУ). На основании результатов по действию протеолитических ферментов на термостабильную лихеназу определен минимальный размер каталитического модуля, который составляет 24,7 кДа и сохраняет активность и термостабильность.

Впервые показано, что ген термостабильной лихеназы является удобным репортерным геном для изучения молекулярных механизмов экспрессии генов на уровне транскрипции для клеток про- и эукариотических организмов: Ген лихеназы транзиентно и стабильно экспрессируется в клетках бактерий, дрожжей, растений и млекопитающих с образованием активного и термостабильного фермента.

Уровень экспрессии бактериального гена лихеназы зависит от регуляторного элемента, контролирующего его экспрессию. Индукционные исследования трансформированных модельных организмов, в которых ген лихеназы находится под контролем индуцибельных промоторов, показали быстрые изменения ферментативной активности лихеназы при действии соответствующих индукторов и репрессоров.

Высокая удельная активность и термостабильность лихеназы позволяют определять ее активность простыми, быстрыми, чувствительными качественными и количественными методами, которые не требуют дорогостоящего оборудования и реактивов. Впервые ген лихеназы успешно использован в экспериментах по изучению секреции и компартментализации белков в растениях и цианобактериях.

Впервые показана возможность быстрого отбора трансформантов бактерий, дрожжей и растений, экспрессирующих ген лихеназы, методом чашечного теста, а также способность тканей трансгенных растений, экспрессирующих ген лихеназы, к каллусообразованию на средах с р-глю капом (лихенан). Эти результаты свидетельствуют о том, что ген лихеназы является удобным селективным маркером для этих организмов. Обнаружено, что в составе бифункциональных гибридных белков как лихеназа, так и GFP и GUS, сохраняют свои основные свойства репортерных белков: лихеназа -термостабильность и активность, GFP - флуоресцентность, GUS - гидролизует соответствующие субстраты. Впервые показано, что бифункциональные репортерные системы, созданные на основе термостабильной лихеназы (GFP-LicB, LicB-GFP, GUS-LicB, LicB-GUS), являются удобными репортерными системами, в которых преимущества одной репортерной системы компенсируют недостатки другой репортерной системы.

Впервые термостабильная лихеназа успешно использована как трансляционный репортерный белок для клеток про- и эукариотических организмов, поскольку остается активной и термостабильной при значительных достройках в N- и С-концевой областях белка. Об этом свидетельствуют результаты по экспрессии гибридных генов, которые содержат последовательности синтетических генов - аналогов генов белка каркасной нити паутины (спидроина 1) Nephila clavipes, содержащих различное число повторяющихся мотивов, слитых в рамке считывания с последовательностью репортерного гена лихеназы. Метод зимограмм (метод качественного определения активности термостабильной лихеназы) позволяет точно определять молекулярные массы гибридных белков, в состав которых входит лихеназа. Этот метод предлагается вместо Вестерн-блот гибридизации при использовании лихеназы в качестве репортерного белка.

Впервые сконструированы модифицированные варианты термостабильной лихеназы: вариант АС, у которого N- и С-концы фермента перенесены в область петлевого домена, a N- и С-концы нативного фермента соединены линкером для встраивания последовательностей пептидов, и вариант СА, у которого в область петлевого домена добавлен линкер для встраивания последовательностей пептидов. Показано, что перенос N- и С-концов фермента в область петлевого домена (вариант АС) не оказывает влияния на основные свойства лихеназы: активность, термостабильность при температурные и рН оптимумы, однако приводит к уменьшению времени стабильности фермента при 70°С и

75°С, по сравнению с нативным ферментом.

Впервые термостабильная лихеназа успешно использована в качестве репортерного белка-носителя пептидов, поскольку в

221

Заключение.

Таким образом, представленные результаты исследования позволяют заключить, что делеции в последовательности гена лихеназы в области, кодирующей некаталитические модули фермента, не приводят к значительным изменениям его основных свойств: сдвигу оптимума рН и температуры или к изменению активности и стабильности. Более того, делеционный вариант LicBM2 имеет ряд преимуществ для использования его в качестве репортерного белка, а также для получения гибридных бифункциональных белков - он содержит только каталитический домен и сохраняет основные свойства полноразмерного фермента.

Анализ экспрессии бактериального гена лихеназы в E.coli, клетках дрожжей и млекопитающих, а также в растениях, показал, что бактериальная лихеназа обладает многими свойствами, необходимыми для репортера. Уровень экспрессии термостабильной лихеназы зависит от регуляторного элемента, контролирующего экспрессию ее гена. Термостабильная лихеназа является удобным транскрипционным репортером при изучении механизмов регуляции экспрессии генов на уровне включения/выключения транскрипции для всех использованных в исследовании модельных организмов.

Термостабильность лихеназы позволяет легко тестировать экспрессию бактериального гена /гсВМ2 качественными и количественными методами на фоне термолабильных ферментов многих модельных организмов, во всех клетках лихеназа продуцируется в активной форме и

213 не оказывает влияния на их метаболизм. Количественный анализ позволяет определить до 25 нг лихеназы за 10 минут инкубации. За счет высокой стабильности лихеназы при 65°С (по крайней мере, в течение 5 часов) можно увеличить время инкубации, что даст возможность увеличить чувствительность количественного метода определения активности фермента. Качественные методы позволяют определить до 100 нг фермента за 1 час инкубации геля (метод зимограмм) и такое же количество лихеназы за 16 часов инкубации (метод чашечного теста). Эти методы являются высокочувствительными, быстрыми и дешевыми. LicBM2 показывает чувствительность и диапазон измерений, эквивалентные (3-галактозидазе, для тестирования промоторных активностей количественными и качественными методами.

После электрофоретического разделения белков в присутствии ДСН, лихеназа может быть ренатурирована, с восстановлением активности (метод зимограмм). Этот метод может быть предложен вместо Вестерн-блот анализа.

Как показали результаты чашечного теста, ген лихеназы может быть предложен в качестве потенциального селективного маркера при получении трансформантов бактерий, дрожжей и растений.

Важно отметить, что не обнаружено фоновых активностей, а также изменений в росте трансформированных клеток ни в одной из используемых модельных систем.

214

Полученные бифункциональные белки GFP-LicBM2 и LicBM2-GFP позволяют тестировать активность гибридных белков in vivo, in situ чувствительными количественными методами за счет объединения свойств двух репортеров - GFP и LicBM2. Слияние GFP и LicBM2 позволяет проводить координированную экспрессию двух репортерных белков. Данные о сохранении основных свойств лихеназы (активность) и GFP (флуоресцентность) в составе бифункциональных гибридных белков дают основание предложить их в качестве бифункциональных репортеров для изучения регуляции экспрессии генов.

Лихеназа остается активной при значительных достройках в N- и С-концевых областях. Показана возможность использования ее в качестве трансляционного репортера при изучении экспрессии генов, имеющих необычный состав и кодирующих продукты с высокой молекулярной массой.

Результаты по сохранению основных свойств лихеназы при модификациях, связанных с переносом N- и С-концевых областей в область петлевого домена (вариант АС), а также с добавлением линкерной последовательности в области петлевого домена (вариант СА), позволяют использовать этот фермент в качестве белка-носителя пептидов, имеющих различную структуру и состав.

Таким образом, репортерная система, основанная на высокой активности и термостабильности лихеназы, является удобной для исследований молекулярных механизмов многих генетических процессов,

215 таких как трансляция, транскрипция, секреция, транспорт и компартментализация клеточных компонентов, а также для поиска новых регуляторных элементов геномов и изучения структурно-функциональных особенностей генетической информации про- и эукариотических организмов.

Список литературы диссертационного исследования доктор биологических наук Голденкова, Ирина Васильевна, 2002 год

1. Безукладников П.В., Елякова JI.A., Мазур А.К. (1992) Явление многократной атаки в механизме действия эндоглюканаз. Биоорганическая химия, 18 (9): 1141-1161.

2. Зверлов В.В. (1993) Изучение структуры гена лихеназы Clostridium thermocellum Ф7 и характеристика продукта данного гена. Дисс. канд. биол. наук, ИМГ РАН, Москва.

3. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Д. (1984) Молекулярное клонирование, М., Мир. 480 с.

4. Мовсесян Н.Р., Ализаде X., Абдеев Р.А., Мусийчук К.А., Попов Ю.Г., Пирузян Э.С. (2001) Трансгенные растения табака, экспрессирующие бактериальные гены термостабильных глюканаз. Генетика, 37(6): 745-752.

5. Патрушев Л.И. Экспрессия генов. М.: Наука, 2000. 527 с.

6. Пирузян Э.С., Могутов М.А., Великодворская Г.А., Пушкарская Т.А. (1988) Изучение целлюлолитических (eel) генов Clostridium thermocellum Ф7 и кодируемых ими белков. Генетика, 24: 204-209.

7. Пирузян Э.С., Могутов М.А., Великодворская Г.А. (1985) Клонирование генов целлюлолитического комплекса Clostridium thermocellum в клетках Escherichia coli. Генетика, 21: 1925-1931.

8. Пирузян Э.С., Могутов М.А., Великодворская Г.А., Акименко В.К. (1985) Клонирование и экспрессия структурного гена эндоглюканазы целлюлолитического комплекса Clostridium thermocellum Ф7 в клетках Escherichia coli. Докл. АН СССР, 281: 963-965.222

9. П.Свердлов Е.Д. (1999) Ретровирусные регуляторы экспрессии генов в геноме человека как возможные факторы его эволюции. Биоорг. Химия, 25(11): 821827.

10. Янике Р. (1998) Что можно узнать о стабилизации ультростабильных глобулярных белков. Биохимия, 63: 370-380.

11. Alam J., Cook J.L. (1990) Reporter Genes: Application to the Study of Mammalian Gene Transcription. Analytical Biochemistry, 188: 245-254.

12. Alliotte Т., Zhu L.H., Van Montagu M., Inze D. (1988) Plant Expression Vectors with the Origin of Replication of the Wild-type Plasmid Sa. Plasmid 19: 251-254.

13. Arnim A.G., Deng X.W., Stacey M.G. (1998) Cloning Vectors for the Expression of Green Fluorescent Protein Fusion Proteins in Transgenic Plants. Gene. 221: 3543.

14. Atassi, M.Z., 1975. Antigenic structure of myoglobin: the complete immunochemical anatomy of a protein and conclusions relating to antigenic structures of proteins. Immunochemistry 12, 423.

15. Atassi, M.Z., Lee, C.L., 1978. The precise and entire antigenic structure of native lysozyme. Biochem. J. 171, 429.

16. Atassi, M.Z., Saplin, B.J., 1968. Immunochemistry of sperm whale myoglobin: I. The specific interaction of some tryptic peptides and of peptides containing all the reactive regions of the antigen. Biochemistry 7, 688.

17. Atassi, M.Z., 1967. Specific cleavage of tryptophyl peptide bonds with periodate in sperm whale myoglobin. Arch. Biochem. Biophys. 120, 56.

18. Atassi, M.Z., Singhal, R.P., 1970. Immunochemistry of sperm whale myoglobin: 8. Specific interaction of peptides obtained by cleavage at proline peptide bonds. Biochemistry 9, 3854.

19. Ay J., Gotz F., Borriss R., Heimann U. (1998a) Structure and Function of the Bacillus Hybrid Enzyme GluXyn-1 :Native-like Jellyroll Fold Preserved after Insertion of Autonomous Globular Domain. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95: 66136618.

20. Ay J., Hahn M., Decanniere K., Piotukh K., Borriss R., Heinemann U. (19986) Crystal Structures and Properties of de novo Circularly Permuted 1,3-1,4-beta

21. Glucanases. Proteins Struct. Funct. Genet., 30: 155-167.

22. Bamberger C.M., Else Т., Bamberger A.M., Beil F.U. and Schulte H.M. (1997) Regulation of the Human Interleukin-2 Gene by the a and b Isoforms of the Glucocorticoid Receptor. Mol. Cell Endocrinol, 136: 23-28.

23. Bayer E.A, Chanzy H.R., Lamed R., Shoham Y. (1998 a) Cellulose, Cellulases and Cellulosomes. Current Opinion in Structural Biology, 8: 548-557.

24. Bayer E.A., Shimon L.J.W., Shoham Y., Lamed R. (1998 6) Cellulosomes -Structure and Ultrastructure. J. Structural Biology, 124: 221-234.

25. Bayer E.A., Kenig R., Lamed R., Shoham Y. (1983) Adherence of Clostridium thermocellum to Cellulose. J. Bacteriol., 156: 818-827.

26. Beattie L., Bhat K.M., Wood T.M. (1994) The Effect of Cations on Reassociation of the Components of the Cellulosome Cellulase Complex Synthesized by Bacterium Clostridium thermocellum. Appl. Microbiol. Biotechnol., 40: 740-744.

27. Beguin P. (1990) Molecular Biology of Cellulose Degradation. Annu. Rev. Microbiol., 44: 219-248.

28. Beguin P., Lemaire M. (1996) The Cellulosome: an Exocellular, Multiprotein Complex Specialized in Cellulose Degradation. Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol., 31: 201-236.

29. Beguin Pierre. (1999) Hybrid Enzymes. Current Opinion in Biotechnology, 10:336-340.

30. Benzakour O., Kanthou C., Dennehy U., Al Haq A., Berg L-P., Kakkar V.V. and Cooper D.N. (1995) Evaluation of the Use of the Luciferase-Reporter-Gene System for Gene-Regulation Studies Involving Cyclic AMP-Elevating Agents. Biochem J., 309: 385-387.

31. Bhat S., Goodenough P.W., Bhat M.K., Owen E. (1994) Isolation of four Major Subunits from Clostridium thermocellum Cellulosome and Their Synergism in the Hydrolysis of Crystalline Cellulose. IntJ. Biol. Macromol., 16: 335-342.

32. Bhaya D., Takahashi A., Grossman A.R. (2001) Light Regulation of Type IV Pilus-Dependent Motility by Chemosensor-like Elements in Synechocystis PCC6803. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98: 7540-7545.224

33. Bhaya D., Bianco N.R., Bryant D., Grossman A. (2000) Type IV pilus Biogenesis and Motility in Cyanobacterium Synechocystis sp. PCC6803. Mol. Microbiol., 37: 941-951.

34. Bhaya D., Watanabe N., Ogawa Т., Grossman A.R. (1999) The Role of an Alternative Sigma Factor in Motility and Pilus Formation in Cyanobacterium Synechocystis sp. strain PCC6803. Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 96: 3188-3193.

35. Blake C.C.F., Koenig D.F., Mair G.A., North A.C.T., Phillips D.C., Sarma V.R. (1965) Structure of Hen Egg White Lysozyme. A Three-Dimensional Fourier Synthesis at 2 E Resolution. Nature, 206: 757-763.

36. Blum D.L., Kataeva I.A., Li X.L., Ljungdahnl L.G. (2000) Feruloyl Esterase Activity of the Clostridium thermocellum Cellulosome Can Be Attributed to Previously Unknown Domains of XynY and XynZ. Journal of Bacteriology., 182 (5): 1346-1351.

37. В oyer M.H., Chambost J.P., Magnan M. and Caltaneo J. (1984) Carboxymethylcellulase from Erwinia chrysanthemi. II. Purification and Partial Characterization of an Endo-P-l,4-glucanase. J. Biotechnol., 1: 241-252.

38. Bradford M.M. (1976) A Rapid Sensitive Method for Quantification of Microgram Quantities of Protein Utilizing the Principle of Protein-Dye Binding. Anal. Biochem., 72: 248-254.

39. Brandes C., Plautz J.D., Stanewsky R., Jamison C.F., Straume M., Wood K.V., Kay S.A. and Hall J.C. (1996) Novel Features of Drosophila Period Transcription Revealed by Real-Time Luciferase Reporting. Neuron, 16: 687-692.

40. Brauner-Osborne H. and Brann M.R. (1996) Pharmacology of Mus-carinic Acetylcholine Receptor Subtypes (ml-m5): High Throughput Assays in Mammalian Cells. Eur J Pharmacol., 295: 93-102.

41. Brejc K.A., Sixma Т.К., Kitts P.A., Kain S.R., Tsein R.Y., Ormo M., Remington S.J. (1997) Structural Basis for Dual Excitation and Photoisomerization of the Aequorea victoria Green Fluorescent Protein. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94: 2306-2311.

42. Bronstein I., Fortin J., Stanley P.E., Stewart G.S.A.B. and Kricka L.J. (1994) Chemiluminescent and Bioluminescent Reporter Gene Assays. Anal Biochem., 219: 169-181.

43. Bumazhkin B.K., Velikodvorskaya G.A., Tuka K., Mogutov M.A., Strongin A. Ya. (1990) Cloning of Clostridium thermocellum Endoglucanase Genes in Escherichia coli. Biochem. Biophys. Res. Commun., 167: 1057-1063.225

44. Burton J., Wood S.G., Pedyczak A. and Siemion I.Z. (1989) Conformational Preferences of Sequential Fragments of the Hinge Region of Human IgAl Immunoglobulin Molecule. II. Biophys. Chem., 33: 39-45.

45. Bushuev V.N., Gudkov A.T., Liljas A. and Sepetov N.F. (1989) The Flexible Region of Protein LI2 from Bacterial Ribosome Studied by Nuclear Magnetic Resonance. J. Biol. Chem., 264: 4498-4505.

46. Calza R.E., Irwin D.C. and Wilson D.B. (1985) Purification and Characterization of Two P-l,4-Endoglucanases from Thermomonospora fusca. Biochemistry, 24: 7797-7804.

47. Chalfie M., Tu Y., Euskirchen G., Ward W.W., Prasher D.C. (1994) Green Fluorescent Protein as a Marker for Gene Expression. Science, 263 (5148): 802805.

48. Chen J., Varner J.E. (1985) An Extracellular Matrix Protein in Plants: Characterization of Genomic Clone for Carrot Extensin. EMBOJ., 4: 2145-2151.

49. Chong S., Mersha F.B., Scott M.E., Landry D., Vence L.M., Perler F.B., Benner J., Kucera R.B., Hirvonen C.A. (1997) Single-column purification of free recombinant proteins using tag derived from protein-splicing element. Gene. 192: 278-281.

50. Cody C.W., Prasher D.C., Westler W.M., Prendergast F.G., Ward W.W. (1993) Chemical Structure of the Hexapeptide Chromophore of the Aequorea Green-Fluorescent Protein. Biochemistry, 32: 1212-1218.

51. Crabb D.W., Dixon J.E. (1987) A Method for Increasing the Sensitivity of Chloramphenicol Acetyltransferase Assays in Extracts of Transfected Cultured Cells. Anal. Biochem., 163 (1): 88-92.

52. Craig F.F, Simmonds A.C., Watmore D., McCapra F., White M.R.H. (1991) Membrane Permeable Luciferin Esters for Assay of Firefly Luciferase in Living Cells. Biochem. J., 276: 637-641.

53. Crennel S.J., Garman E.F., Laver W.G., Vimr E.R., Taylor G.L. (1993) Crystal Structure of a Bacterial Sialidase (from Salmonella typhimurium LT2) Shows the Same Fold as an Influenza Virus Neuraminidase. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 9852-9856.

54. Cubitt A.B., Heim R., Adams S.R., Boyd A.E., Gross L.A., Tsien R.Y. (1995) Understanding, Improving and Using Green Fluorescent Proteins. Trends Biochem. Sci., 20: 448-455.

55. Datla R.S.S., Hammerlindl J.K., Pelcher L.E., Crosby W.L., Selvaraj G. (1991) A Bifunctional Fusion between P-Glucoronidase and Neomycin Phosphotransferase: a Broad-Spectrum Marker Enzyme for Plants. Gene 101:239-246.226

56. Davies G., Henrissat B. (1995) Structures and Mechanisms of Glycosyl Hydrolases. Structure, 3: 853-859.

57. Davies J.M. (2000) Introduction: Epitope Mimicry as a Component of Autoimmune Disease. Cellular and Molecular Life Sciences. 57: 523-526.

58. De Wit P.J.G.M., Spikman G. (1982) Evidence for the Occurrence of Race and Cultivar-Specific Elicitors of Necrosis in Intercellular Fluid of Compatible Interactions of Cladosporium fulvum and Tomato. Physiol Plant Pathol., 21: 1-11.

59. Deblaere R., Reynaerts A., Hofte H., Hernalsteens J.P., Leemans J., Van Montagu M. (1987) Vector for Cloning in Plant Cells. Meth Enzymol., 153: 277-292.

60. Deckert G. (1998) The Complete Genome Sequence of the Hyperthermophilic Bacterium Aquifex aeolicus. Nature, 392: 353-358.

61. Dhundale A. and Goddard C. (1996) Reporter Assays in the High Throughput Screening Laboratory: A Rapid and Robust First Look? JBiomol Screen., 2: 115— 121.

62. Divne C., Jones T.A. (1994) The Three-Dimensional Crystal Structure of the Catalytic Core of Cellobiohydrolase I from Trichoderma reesei. Science, 265: 524-528.

63. Dorr J., Hurek Т., Reinhold-Hurek B. (1998) Type IV Pili are Involved in Plant-Microbe and Fungus-Microbe Interactions. Mol. Microbil., 30: 7-17.

64. Eastman S.J., Tousignant J.D., Lukason M.J., Chu Q., Cheng S.H. and Scheule R.K. (1998) Aerosolization of Cationic Lipid:pDNA Complexes— In vitro227

65. Optimization of Nebulizer Parameters for Human Clinical Studies. Hum Gene Ther., 9:43-52.

66. Endebrecht J., Silverman M. (1984) Identification of Genes and Gene Products Necessary for Bacterial Bioluminescence. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81 (13): 4154-4158.

67. Fahnestock, S.R. and Bedzyk, L.A. (1997) Production of Synthetic Spider Dragline Silk Protein in Pichiapastoris. Appl. Microbiol. Biotechnol., 47: 33-39.

68. Fahnestock, S.R. and Irwin, S.L. (1997) Synthetic Spider Dragline Silk Proteins and Their Production in E. coli. Appl. Microbiol. Biotechnol., 47: 23-32.

69. Farris A.D., Keech C.L., Gordon T.P., McGluskey J. (2000). Epitope Mimics and Determinant Spreading: Pathways to Autoimmunity. Cellular and Molecular Life Sciences. 57: 569-578.

70. Faure E., Belaich A., Bagnara C., Gaudin C. and J.-P. Belaich. (1990) Sequence Analysis of the Clostridium cellulolyticum celCCA Endoglucanase Gene. Gene, 65: 51-58.

71. Ferrari S., Moro E., Pettenazzo A., Behr J.P., Zacchello F. and Scarpa M. (1997) ExGen 500 is an Efficient Vector for Gene Delivery to Lung Epithelial Cells in vitro and in vivo. Gene Ther., 4: 1100-1106.

72. Ferreira L.M.A., Durrant A.J., Hall J., Hazlewood G.P. and Gilbert H.J. (1990) Spatial Separation of Protein Domains is not Necessary for Catalytic Activity or Substrate Binding in a Xylanase. Biochem J., 269: 261-264.

73. Fiedler U., Conrad U. (1995) High-Level Production and Long-Term Storage of Engineered Antibodies in Transgenic Tobacco Seeds. Biotechnology, 13: 10901093.

74. Fink D.J., Poliani P.L., Oligino Т., Krisky D.M., Goins W.F. and Glorioso J.C. (1997) Development of an HSV-Based Vector for the Treatment of Parkinson's Disease. Exp Neurol., 144: 103-112.

75. Fodor, S.P., Read, J.L., Pirrung, M.C., Stryer, L., Lu, A.T., Solas, D., 1991. Light-Directed, Spatially Addressable Parallel Chemical Synthesis. Science, 251: 767.

76. Fradkov A.F., Chen Y., Ding L., Barsova E.V., Matz M.V., Lukyanov S.A. (2000) Novel Fluorescent Protein from Discosoma Coral and Its Mutants Possesses a Unique Far-Red Fluorescence. FEBSLett., 479: 127-130.

77. Frank, R. (1992). SPOT Synthesis: an Easy Technique for the Positionally Addressable, Parallel Chemical Synthesis on a Membrane Support. Tetrahedron, 48,9217.228

78. Fukumori F., Kudo T. and Horikoshi K. (1987) Truncation Analysis of Alkaline Cellulase from an Alkalophilic Bacillus, Species. FEMS Microbiol. Lett., 40: 311314.

79. Gatesy J., Hayashi C., Motriuk D., Woods J., & Lewis R. (2001). Extreme Diversity, Conservation, and Convergence of Spider Silk Fibroin Sequences. Science, 291: 2603-26054.

80. George S.E., Bungay P.J. and Naylor L.H. (1997) Evaluation of a CRE-Directed Luciferase Reporter Gene Assay as an Alternative to Measuring cAMP Accumulation. JBiomol Screen., 2: 235-240.

81. George S.E., Bungay P.J. and Naylor L.H. (1998) Functional analysis of the D2L dopamine receptor expressed in a cAMP-responsive luciferase reporter cell line. Biochem Pharmacol., 56: 25-30.

82. George S.E., Bungay P.J. and Naylor L.H., (1997) Functional Coupling of Endogenous Serotonin (5-HT1B) and Calcitonin (CIa) Receptors in CHO Cells to a Cyclic AMP-Responsive Luciferase Reporter Gene. J Neurochem., 69: 1278— 1285.

83. Geysen H.M., Tainer J.A., Rodda S.J., Mason T.J., Alexander H., Getzoff E.D., Lerner R.A. (1987) Chemistry of Antibody Binding to a Protein. Science, 235: 1184.

84. Geysen H.M., Rodda S.J., Mason T.J., Tainer J.A., Alexander H., Getzoff E.D., Lerner R.A. (1988). Antigenicity of Myohemerythrin. Science, 238: 1584.

85. Gibbs M.D., Reeves R.A., Farrington G.K., Anderson P., Williams D.P., Bergquist P.L. (2000) Multidomain and Multifunctional Glycosil Hydrolases from Extreme Thermophile Caldicellulosiruptor Isolate Tok7B.l. Curr. Microbiology. 40: 333-340.

86. Gilkes N.R., Warren R.A.J., Miller R.C. and Kilburn D.G. (1988) Precise Excision of the Cellulose Binding Domains from Two Cellulomonas jimi Cellulases by a Homologous Protease and the Effect on Catalysis. J. Biol. Chem., 263:1040110407.

87. Gilkes N.R., B.Henrissat, D.G. Kilburn, R.C. Miller, and R.A.J. Warren (1991) Domains in Microbial 3-1,4-Glycanases Sequence Conservation, Function, and Enzyme Families. Micro biol. Rev., 55 (2): 303-315.

88. Glazkova D.V., Efimenko I.G., Legchilina S.P., Bornhold D., Grzheshek K.H., Arman I.P. (2000) TAR Cloning the Short Arm of Human Chromosome 7 in Yeast and Search Terminus Sequences. Genetika (Russian) 472: 622-629.

89. Goegan P., Vincent R., Kumarathasan P. and Brook J. (1998) Sequential in vitro Effects of Airborne Particles in Lung Macrophages and Reporter CAT-Gene Cell Lines. Toxicol In Vitro., 12: 25-37.229

90. Goldberg S.B., Hoffmann N.L., Woo S.C. (1983) Expression of Bacterial Genes in Plant Cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80: 4803-4806.

91. Gordon T. (2002). Multipin Peptide Libraries for Antibody and Receptor Epitope Screening and Characterization. J. Immunol. Methods, 267: 27-35.

92. Gorman C. (1985) DNA cloning II-A Practical Approach (Glover D.M., Ed.): 143-190.

93. Gosline J., Guerette P.,Ortlep C.,Savage K. (1999). The Mechanical Design of Spider Silks: from Fibroin Sequence to Mechanical Function. J. Exp. Biol., 302: 3295-3303.

94. Graf R., Schachman H. K. (1996) Random Circular Permutation of Genes and Expressed Polypeptide Chains: Application of the Method to the Catalytic Chains of Aspartate Transcarbamoylase. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 1159111596.

95. Granell A., Petero J.G., Schindler U., Cashmore A.R. (1992) Nuclear Factors Binding to the Extensin Promoter Exhibit Differential Activity in Carrot Protoplasts and Cells. PlantMol. Biol., 18: 739-748.

96. Green L.A., Tischler A. (1976) Establishment of a Nonadrenergic Clonal Line of Rat Adrenal Pheochromocytoma Cells which Respond to Nerve Growth Factor. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 73: 2424-2428.

97. Grepinet O. and Beguin P. (1986) Sequence of the Cellulase Gene of Clostridium thermocellum Coding for Endoglucanase B. Nucleic Acids Res., 14: 1791-1799.

98. Guerrette, P. A., Ginzinger, D. G., Weber, В. H. F., Gosline, J. M. (1996) Silk Properties Determined by Gland-Specific Expression of Spider Fibroin Gene Family. Science, 272: 112-115.

99. Guivarc'h A., Caissard J.C., Azmi A., Elmayan Т., Chriqui D., Tepfer M. (1996) In situ Detection of Expression of the gus Reporter Gene in Transgenic Plants: Ten Years of Blue Genes. Transgenic Research, 5: 281-288.

100. Hahn M., Piotukh K., Borriss R., Heinemann U. (1994) Native-Like in vivo Folding of a Circularly Permuted Jellyroll Protein Shown by Crystal Structure Analysis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91: 10417-10421.

101. Hahn M., Pons J., Planas A., Querol E., Heinemann U. (1995a) Crystal Structure of Bacillus licheniformis l,3-l,4-beta-D-Glucan-4-Glucanohydrolase at 1.8 A Resolution. FEBSLett., 374(2): 221-224.230

102. Hall J., Hazlewood G.P., Barker P.J. and Gilbert H.J. (1988) Conserved Reiterated Domains in Clostridium thermocellum Endoglucanases are not Essential for Catalytic Activity. Gene, 69: 29-38.

103. Haseloff J., Sienering K.R., Prasher D.C., Hodge S. (1997) Removal of a Criptic Intron and Subcellular Localization of Green Fluorescent Protein are Required to Mark Transgenic Arabidopsis Plants Brightly. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94: 2122-2127.

104. Hayashi, C. Y., Lewis, R. V. (1998) Evidence from Flagelliform Silk cDNA for the Structural Basis of Elasticity and Modular Nature of Spider Silks. J. Mol. Biol. 275: 773-784.

105. Henrissat B. (1998) Enzymatic Cellulose Degradation. Cellulose Commun., 5: 84-90.

106. Henrissat В., Davies G. (1997) Structural and Sequence-Based Classification of Glycoside Hydrolases. Curr. Opin. Struct. Biol., 7: 637-644.

107. Herbers K., Sonnewald U. (1999) Production of New/Modified Proteins in Transgenic Plants. Curr. Opinion in Biotechnology, 10: 163-168.

108. Herrero A., Flores E. (1997) The nuiA Gene from Anabaena sp. Encoding an Inhibitor of the NucA Sugar-Non-Specific Nuclease. J. Mol. Biol., 268: 589598.

109. Hill D.R., Hladum S.L., Scherer S., Potts M. (1994) Water Stress Proteins of Nostoc commune (Cyanobacteria) Are Secreted with UV-A/B-Absorbing Pigments and Associate with 1,4-beta-D-Xylanxylanhydrolase Activity. J. Biol. Chem., 269: 7726-7734.

110. Hinman M.B., Jones J. A., Lewis R.V. (2000) Synthetic Spider Silk: a Modular Fiber. TIBTECH., 18: 374-379.

111. Hirsinger C., Parmentier Y., Durr A., Fleck J., Jamet E. (1997) Characterization of a Tobacco Extensin Gene and Regulation of Its Gene Family231in Healthy Plants and under Various Stress Conditions. Plant Mol. Biol., 33: 279289.

112. Hoiczyk E., Baumeister W. (1997) Oscillin, an Extracellular, Ca2+-Binding Glycoprotein Essential for the Gliding Motility of Cyanobacteria. Mol. Microbiol., 26: 699-708.

113. Houghten, R.A., Pinilla, C., Blondelle, S.E., Appel, J.R., Dooley, C.T., Cuervo, J.H., 1991. Generation and Use of Synthetic Peptide Combinatorial Libraries for Basic Research and Drug Discovery. Nature 354, 84.

114. Iturriaga G., Jefferson R.A., Bevan M.W. (1989) Endoplasmic Reticulum Targeting and Glycosylation of Hybrid Proteins in Transgenic Tobacco. Plant Cell, 1: 381-390.

115. Jacobson R.H., Zhang X.J., DuBose R.F., Matthews B.W. (1994) Three-Dimensional Structure of beta-Galactosidase from£. coli. Nature, 369: 761-766.

116. Jefferson R.A., Kavanagh T.A. and Bevan M.W. (1987b) GUS Fusions: beta-Glucuronidase as a Sensitive and Versatile Gene Fusion Marker in Higher Plants. EMBOJ., 6 (13): 3901-3907.

117. Jefferson R.A., Burgess S.M., Hirsh D. (1986) (3-Glucoronidase from Escherichia coli as a Gene-Fusion Marker. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83: 85578451.

118. Jefferson RA (1987b) Assaying Chimeric Genes in Plants: the GUS Gene Fusion System. Plant Molecular Biology Reporter, 5:387-405.

119. Jensen L.G., Olsen O., Kops O., Wolf N., Thomsen K.K., Von Wettstein D. (1996) Transgenic Barley Expressing a Protein-Engineered, Thermostable (1,3-1,4)-|3-Glucanase During Germination. Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 93: 34873491.

120. Joliff G., Beguin P. and J.-P. Aubert. (1986) Nucleotide Sequence of the Cellulase Gene celD Encoding Endoglucanase D of Clostridium thermocellum. Nucleic Acids Res., 14: 8605-8613.

121. Joyeux A., Balaguer P., Germain P., Boussioux A.M., Pons M. and Nicolas J.C. (1997) Engineered Cell Lines as a Tool for Monitoring Biological Activity of Hormone Analogs. Anal Biochem., 249: 119-130.

122. Kapitonov V.V., Jurka J. (1999) The Long Terminal Repeat of an Endogenous Retrovirus Induces Alternative Splicing and Encodes an Additional Carboxy-Terminal Sequence in the Human Leptin Receptor. J Mol. Evol. 48(2): 248-51.232

123. Kaplan D.L., Adams W.W., Viney C. & Farmer B.L.(eds). (1994). Silk Polymers: Materials Science and Biotechnology. 1-370. ACS Books, Washington.

124. Koster M., Bitter W., Tommassen J. (2000) Protein Secretion Mechanisms in Gram-Negative Bacteria. Int. J. Med. Microbiol., 290: 325-331.

125. Kozarov E., Kaliev A., Andrianov V., Piruzian E. (1988) Construction of Plant Expression Vector Active in Prokaryotic Cells. Dokl. Bulgarian Acad, of Sci., 41 (9): 117-118.

126. Krebbers E., Seurinck J., Herdies L., Cashmore R.A., Timko M.P. (1988) Four Genes in Two Diverged Subfamilies Encode the Ribulose-l,5-Bisphosphate Carboxylase Small Subunit Polypeptides of Arabidopsis thaliana. Plant Mol. Biol., 11: 745-759.

127. Kuroki R., Weaver L.H., Matthews B.W. (1995) Structure-Based Design of a Lysozyme with Altered Catalytic Activity. Nat. Struct. Biol., 2(11): 1007-1011.

128. Laemmli U.K. (1970) Cleavage of Structural Proteins during the Assembly of the Head of Bacteriophage T4. Nature, 227: 680-685.

129. Lake B.D., Goodwin H.J. (1976) Chromatographic and electrophoretic techniques, 1: 345-366.

130. Lam, K.S., Salmon, S.E., Hersh, E.M., Hruby, V.J., Kazmierski, W.M., Knapp, R.J., 1991. A New Type of Synthetic Peptide Library for Identifying Ligand-Binding Activity. Nature 354, 82.

131. Lamed R., Bayer E.A. (1988) Cellulosomes from Clostridium thermocellum. Methods Enzymol., 160: 472-4418.

132. Lane, D.P., Stephen, C.W., Midgley, C.A., Sparks, A., Hupp, T.R., Daniels, D.A., Greaves, R., Reid, A., Vojtesek, В., Picksley, S.M., 1996. Epitope Analysis of the Murine p53 Tumor Suppressor Protein. Oncogene. 12, 2461.

133. Lazo G.R., Stein P.A., Ludwig R.A. (1991) A DNA Transformation-Competent Arabidopsis Genomic Library in Agrobacterium. Biotechnology (NY), 9 (10): 963-967.

134. Linder M., Teeri T.T. (1997) The Role and Function of Cellulose-Binding Domains. J. Biotechnology, 57: 15-28.

135. Loi L., Barton P.A., Fincher G.B. (1987) Survival of Barley (1-3,1-4)-beta-Glucanase Isoenzymes during Kilning and Mashing. J. Cereal Sci., 5: 45-50.

136. Lorenz W.W., Cormier M.J., O'Kane D.J., Hua D., Escher A.A. and Szalay A. A. (1996) Expression of the Renilla reniformis Luciferase Gene in Mammalian Cells. JBiolumin Chemilumin., 11: 31-37.233

137. Luzi P., Victoria Т., Rafi M.A. and Wenger D.A. (1997) Analysis of the 59 Flanking Region of the Human Galactocerebrosidase (GALC) Gene. Biochem Mol Med., 62: 159-164.

138. MacLeod A.M., Lindhorst Т., Withers S.G. and Warren A.J. (1994) The Acid/Base Catalyst in the Exoglucanase/Xylanase from Cellulomonas fimi is Glutamic Acid 127: Evidence from Detailed Kinetic Studies of Mutants. Biochemistry, 33: 6371-6376.

139. Maeji, N.J., Bray, A.M., Geysen, H.M., 1990. Multipin Peptide Synthesis Strategy for T Cell Determinant Analysis. J. Immunol. Methods, 134, 23.

140. Manen D., Pougeon M., Damay P. and Geiselmann J. (1997) A Sensitive Reporter Gene System Using Bacterial Luciferase Based on a Series of Plasmid Cloning Vectors Compatible with Derivatives of pBR322. Gene, 186: 197-200.

141. Mascaronhas J.P., Hamilton D.A. (1992) Artifacts in the Localization of GUS Activity in Anthers of Petunia Transformed with a CaMV 35S-GUS Construct. Plant J., 2: 405-408.

142. Matthews B.W., Remington S.J. (1974) The Three-Dimensional Structure of Lysozyme from Bacteriophage T4. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 71: 4178-^4182.

143. Matz M.V., Fradkov A.F., Labas Yu.A., Savitsky A.P., Zaraisky A.G., Markelov M.L., Lukyanov S.A. (1999) Fluorescent Proteins from Nonbioluminescent Anthozoa Species. Nature Biotech., 17: 969-973.

144. McBee R.H. (1950) The Anaerobic Thermophilic Bacteria. Bacteriol. Rev., 14: 51-63.

145. McBee R.H. (1948) The Culture and Physiology of Thermophilic Cellulose-Fermenting Bacterium. J. Bacteriol. 56: 653-663.

146. McCarter J.D., Withers S.G. (1994) Mechanisms of Enzymatic Glycoside Hydrolysis. Current Opinion in Structural Biology, 4: 885-892.

147. McGavin M.J., Forsberg C.W., Bell В., Crosby A.W., Dignard D. and Thomas D.Y. (1989) Structure of the cel-3 Gene from Fibrobacter succinogenes S85 and Characteristics of the Encoded Gene Product, Endoglucanase 3. J. Bacteriol., 171: 5587-5595.

148. Michelet B. and Chua N. (1997) Improvement of Arabidopsis Mutant Screens Based Luciferase Imaging in Planta. Plant Mol Biol Rep., 14: 321-329.

149. Misteli T. and Spector D.L. (1997) Application of the Green Fluorescent Protein in Cell Biology and Biotechnology. Nat Biotechnol., 15: 961-964.234

150. Muro-Pastor A.M., Herrero A., Flores E. (1997) The nuiA Gene from Anabaena sp. Encoding an Inhibitor of the NucA Sugar-Non-Specific Nuclease. J. Mol Biol., 268: 589-598.

151. Nakamura Tsutomu and Iwakura Masahiro. (1999) Circular Permutation Analysis as a Method for Distinction of Functional Elements in the M20 Loop of Escherichia coli Dihydrofolate Reductase. J. Biol. Chemistry, 21A (27): 19041— 19047.

152. Naylor L.H. (1999) Reporter Gene Technology: The Future Looks Bright. Biochemical Pharmacology 58:749-757.

153. Olsen O., Thomsen K.K., Weber J., Duus J.O., Svendsen I., Wegener C., von Wettstein D. (1996) Transplanting Two Unique beta-Glucanase Catalytic Activities into One Multienzyme, which Forms Glucose. Biotechnology (NY), 14 (1): 71-76.

154. Olsen O., Borriss R., Simon O., Thomsen K.K. (1991) Hybrid Bacillus (1-3,l-4)-(3-Glucanases: Engineering Thermostable Enzymes by Construction of Hybrid Genes. Mol. Gen. Genet., 255: 117-185.

155. Orengo C.A., Jones D.T., Thornton J.M. (1994) Protein Superfamilies and Domain Superfolds. Nature, 372(6507): 631-634.

156. Pazzagli M., Devine J.H., Peterson D.O. and Baldwin Т.О. (1992) Use of Bacterial and Firefly Luciferases as Reporter Genes in DEAE-Dextran-Mediated Transfection of Mammalian Cells. Anal Biochem., 204: 315-323.

157. Peitsch M.C. (1995) Protein Modelling by E-Mail. Bio/Technology, 13: 658-660.

158. Piruzian E.S., Monzavi-Karbassi В., Darbinian N.S., Goldenkova I.V., Kobets N.S., Mochulsky A.V. (1998) The Use of a Thermostable p-Glucanase Gene from Clostridium thermocellum as a Reporter Gene in Plants. Mol. Gen. Genet., 257: 561-567.

159. Quaedvlieg N.E.M., Schlaman H.R.M., Admiraal P.C., Wijting S.E., Stougaard J., Spaink H.P. (1998) Fusions between Green Fluorescent Protein and beta-Glucuronidase as Sensitive and Vital Bifunctional Reporters in Plants. Plant Mol Biol, 38(5): 861-873.

160. Riedel K., Bronnenmeier K. (1998) Intramolecular Synergism in an Engineered exo-endo-l,4-(3-Glucanase Fusion Protein. Mol. Microbiology, 28: 767-775.

161. Rodda, S.J., 1996. T-cell Epitope Mapping with Synthetic Peptides and Peripheral Blood Mononuclear Cells. In: Morris, G.E. (Ed.), Epitope Mapping Protocols. Methods Mol. Biol., vol. 66. Humana Press, Totowa, NJ, p. 363, Chap. 30

162. Rossi F., Charlton C.A., Blau H.M. (1997) Monitoring Protein-Protein Interactions in Intact Eukaryotic Cells by (3-Galactosidase Complementation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94: 8405-8410.

163. Rutter G.A., Kennedy H.J., Wood C.D., White M.R.H., Tavare J.M. (1998) Real-Time Imaging of Gene Expression in Single Cells. Chemistry & Biology. 5: R285-R290.

164. Rutter G.A., White M.R.H. and Tavare J.M. (1995) Involvement of MAP Kinase in Insulin Signalling Revealed by Non-Invasive Imaging of Luciferase Gene Expression in Single Living Cells. Curr Biol., 5: 890-899.

165. Sambrook J., Fritch E.F., Maniatis T. Molecular Cloning A Laboratory Manual. 2nd Edition. (1989), Cold Spring Harbour Lab. Press. N.Y.

166. Saul D.J., Williams L.C., Grayling R.A., Chamles L.W., Love D.R. and Bergquist P.L. (1990) CelB, a Gene, Encoding for Bifunctional Cellulase from the Extreme Thermophile Caldocellum saccharolyticum. Appl.Environ.Microbiol., 56: 3117-3124.

167. Scheller J., Guhrs K.-H., Grosse F., Conrad U. (2001). Production of Spider Silk Proteins in Tobacco and Potato. Nature Biotechnol. 19: 573-577.236

168. Schimming S., Schwarz W.H., Staudenbauer W.L. (1991) Properties of a Thermoactive beta-l,3-l,4-Glucanase (Lichenase) from Clostridium thermocellum Expressed in Escherichia coli. Biochem. Biophys. Res. Com., Ill (1): 447-452.

169. Schwarz W. H. (2001) The Cellulosome and Cellulose Degradation by Anaerobic Bacteria. Appl Microbiol Biotechnol, 56:634-649.

170. Scott, J.K., Smith, G.P., 1990. Searching for Peptide Ligands with an Epitope Library. Science 249, 386.

171. Sergeyenko T.V., Los D.A. (2000) Identification of Secreted Proteins of the Cyanobacterium Synechocystis sp. Strain PCC6803. FEMS Microbiol. Lett. 193: 2113-216.

172. Sheehan J, Himmel M (1999) Enzymes, Energy, and the Environment: a Strategic Perspective on the U.S. Department of Energy's Research and Development Activities for Bioethanol. Biotechnol Prog., 15:817-827.

173. Silveman P.M. (1997) Towards a Structural Biology of Bacterial Conjugation. Mol. Microbiol., 23: 423-429.

174. Sniezko I., Dobson-Stone C., Klein A. (1998) The treA Gene of Bacillus subtilis is a Suitable Reporter Gene for the Archaeon Methanococcus voltae. FEMS Microbiol. Let., 164: 237-242.

175. Sode K., Tatara M., Takeyama H., Burgess J.G., Matsunaga T. (1992) Conjugative Gene Transfer in Marine Cyanobacteria: Synechococcus sp., Synechocystis sp. and Pseudanabaena sp. Appl. Microbiol. Biotechnol., 31: 369373.

176. Soni R., Carmichael J.P., Murray J.A. (1993) Parameters Affecting Lithium Acetate-Mediated Transformation of Saccharomyces cerevisiae and Development of a Rapid and Simplified Procedure. Curr. Genet., 24: 455-459.

177. Strathdee C.A., McLeod M.R., Underhill T.M. (2000) Dominant Positive and Negative Selection Using Luciferase, Green Fluorescent Protein and P-Galactosidase Reporter Gene Fusions. BioTechniques, 28: 210-214.237

178. Suto C.M. and Ignar D.M. (1997) Selection of an Optimal Reporter Gene for Cell-Based High Throughput Screening Assays. JBiomol Screen, 2: 7-9.

179. Sverdlov E.D. (1998) Perpetually Mobile Footprints of Ancient Infections in Human Genome. FEBSLetter. 428: 1-6.

180. Tauriainen S., Virta M., Chang W., Karp M. (1999) Measurement of Firefly Luciferase Reporter Gene Activity from Cells and Lysates Using Escherichia coli Arsenite and Mercury Sensors. Anal. Biochem., 272: 191-198.

181. Taylor C.B. (1997) Promoter Fusion Analysis: an Insufficient Measures of Gene Expression. Plant Cell, 9: 273-275.

182. Terskikh A., Fradkov A., Ermakova G., Zaraisky A., Tan P., Kajava A.V., Zhao X., Lukyanov S., Matz M., Kim S., Weissman I., Siebert P. (2000) "Fluorescent Timer": Protein that Changes Color with Time. Science, 290: 15851588.

183. Tokatlidis K., Salamitou S., Beguin P., Dhuijati P., Aubert J.P. (1991) Interaction of the Duplicated Segment Carried by Clostridium thermocellum Cellulases with Cellulosome Components. FEBS Lett., 291: 185-188.

184. Tomme P., Warren R.A., & Gilkes N.R. (1995) Cellulose Hydrolyses by Bacteria and Fungi. Adv. Microb. Physiol., 37: 1-81.

185. Topfer R., Matzeit V., Gronenborn В., Schell J., Steinbiss H.-H. (1987) A Set of Plant Expression Vectors for Transcriptional and Translational Fusions. Nucl. Acids Research, 15(14): 16.

186. Triantafyllou, В., Tribbick, G., Maeji, N.J., Geysen, H.M., 1992. Use of the Multipin Peptide Synthesis Technique for the Generation of Antipeptide Sera. Cell Biophys. 21, 33.

187. Tuka K., Zverlov V.V., Bumazhkin B.K., Velikodvorskaya G.A. (1992) Synergism between Clostridium thermocellum Cellulases Cloned in Escherichia coli. Appl. Biochem. Biotech., 37: 201-207.

188. Van Tilbeurgh H., Tomme P., Claeyssens M., Bhikhabhai R. and Pettersson G. (1986) Limited proteolysis of the cellobiohydrolase I from Trichoderma reesei. Separation of functional domains. FEBS Lett., 204: 223-227.

189. Vanniasinkam Т., Barton M.D., Heuzenroeder M.W. (2001). B-Cell Epitope Mapping of the VapA Protein of Rhodococcus equv. Implications for Early Detection of R. equi Disease in Foals. J. Clin. Microbiol. 39, 1633.

190. Verner K., Schatz G. (1988) Protein Translocation Across Membranes. Science, 241: 1307-1313.

191. Viljoen J.A., Fred E.B., Peterson W.H. (1926) The Fermentation of Cellulose by Thermophilic Bacteria. J. Agric. Sci., 16: 1-17.

192. Wall D., Kaiser D. (1999) Type IV Pili and Cell Motility. Mol. Microbiol., 32: 1-10.

193. Ward F.J., Knies J.E., Cunningham C., Harris W.J., Staines N.A. (1997). Natural Antibodies that React with V-Region Peptide Epitopes of DNA-Binding Antibodies are Made by Mice with Systemic Lupus Erythematosus as Disease Develops. Immunology, 92, 354.

194. Watson M.A., Darrow C., Zimonjic D.B., Popescu N.C. and Fleming T.P. (1998) Structure and Transcriptional Regulation of the Human Mammaglobin239

195. Gene, a Breast Cancer Associated Member of the Uteroglobin Gene Family Localized to Chromosome llql3. Oncogene, 16: 817-824.

196. Welsh S. and Kay S.A. (1997) Reporter Gene Expression for Monitoring Gene Transfer. Curr Opin Biotechnol., 8: 617-622.

197. White A., Rose D.R. (1997) Mechanism of Catalysis by Retaining p-Glycosyl Hydrolases. Current Opinion in Structural Biology, 7(5): 645-651.

198. White M.R.H., Masuko M., Amet L., Elliot G., Braddock M., Kingsman A.J. and Kingsman S.M. (1995) Real-Time Analysis of the Transcriptional Regulation of HIV and CMV Promoters in Single Mammalian Cells. J Cell Sci., 108: 441-445.

199. White W.B., Bird H.R., Sunde M.L., Marlett J.A. (1983) Viscosity of beta-D-Glucan as a Factor in the Enzymatic Improvement of Barley for Chicks. Poult. Sci., 62: 853-862.

200. Wildt S., Deuschle U. (1999) cobA, a Red Fluorescent Transcriptional Reporter for Escherichia coli, Yeast and Mammalian Cells. Nature Biotechnology, 17: 1175-1178.

201. Winkler, S. et al. (1999) Designing Recombinant Spider Silk Proteins to Control Assembly. Int. J. Biol. Macromol., 24: 265-270.

202. Wiznerowicz M., Fong A.Z.C., Mackiewicz A. and Hawley R.G. (1997) Double-Copy Bicistronic Retroviral Vector Platform for Gene Therapy and Tissue Engineering: Application to Melanoma Vaccine Development. Gene Ther., 4: 1061-1068.

203. Wong E.Y., Hironaka C.M., Fishholf D.A. (1992) Arabidopsis thaliana Small Subunit Leader and Transit Peptide Enhance the Expression of Bacillus thuringiensis Protein in Transgenic Plants. Plant Mol. Biol., 20: 81-93.

204. Wood T.M., Bhat K.M. (1988) Methods for Measuring Cellulase Activities.

205. Methods Enzymology, 160: 87-112.

206. Xu L. and Zheng C.-F. (1997) New Fusion Trans-Activation Plasmids for Studying Signal Transduction Pathways. Strategies, 10: 81-83.

207. Xu L., Sanchez T. and Zheng C.-F. (1997) In vivo Signal Transduction Pathway Reporting Systems. Strategies, 1: 1-3.

208. Xu L., Sanchez T. and Zheng C.-F. (1997) Signal Transduction Reporting Systems Using cis-Acting Enhancer Elements. Strategies, 10: 79-80.240

209. Yague E., Beguin P. and J.-P. Aubert. (1990) Nucleotide Sequence and Deletion Analysis of the Cellulase-Encoding Gene celH of Clostridium thermocellum. Gene, 89: 61-67.

210. Yuoderian P. (1998) Bacterial Mobility: Secretory Secrets of Gliding Bacteria. Curr. Biol., 8: 408-411.

211. Yura K., Toh H., Go M. (1999) Putative Mechanism of Natural Transformation as Deduced from Genome Data. DNA Res., 6: 75-82.