Активность промотора гена пататина класса I картофеля в условиях гомологичной и гетерологичной экспрессии тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.12, кандидат биологических наук Наумкина, Елена Михайловна

• Наумкина, Елена Михайловна
• кандидат биологических наук
• 2007

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Наумкина, Елена Михайловна

Список условных сокращений

Введение

Литературный обзор

I. Генетическая инженерия растений: достижения практического применения и значение для фундаментальных исследований

1.1 Проблема биобезопасности трансгенных растений

1.2 Основные методы трансформации растений

1.2.1 Способы генетической трансформации растений с использованием Agrobacterium tumefaciens

1.3 Стратегия и методология создания трансгенных растений

1.4 Назначение и практическое применение репортерных генов

1.4.1. Репортерный ген GUS

И. Регуляторная зона гена

II. 1 Промоторы трансгенов

II.2 Экспрессия чужеродных генов в трансгенных растениях

II.3 Специфическое метилирование промотора как регуляция активности гена

II.4 Регуляция активности генов сахарами

III. Главный запасной белок клубней картофеля - пататин

III. 1 Основные функции белка пататина

III.2 Мультикопийное семейство генов, кодирующих пататины

III.3 Особенности экспрессии основных классов генов пататина

III.4 Структурные особенности промотора гена пататина класса I

Материалы и методы исследований

1. Реактивы

2. Объекты исследований

2.1 Модельная система на основе трансгенного картофеля

2.2 Модельная система на основе трансгенного арабидопсиса

2.3 Размножение и поддержание коллекции трансформантов картофеля

3. Выделение и анализ ДНК

3.1 Выделение растительной ДНК

3.1.1 Дополнительная очистка растительной ДНК

3.2 Проверка качества выделенной ДНК

3.3 Определение концентрации ДНК в образцах

3.4 Проведение полимеразной цепной реакции

3.5 Метод идентификации на олигонуклеотидном биочипе

3.6 Получение плазмидной ДНК

3.6.1 Получение компетентных клеток

3.6.2 Трансформация Е. coli

3.6.3 Микровыделение плазмидной ДНК

3.6.4 Макровыделение плазмидной ДНК

4. Анализ метилирования цитозина ВЗЗ-промотора у картофеля

4.1 Проведение полимеразных цепных реакций

4.2 Подбор и использование рестриктаз

4.3 Подбор количества контрольной ДНК для рестрикционного анализа

4.4 Рестрикционный анализ пататинового промотора в составе растительной ДНК

4.4.1 Анализ степени метилирования сайтов GCGG методом R-ПЦР

4.4.2 Анализ степени метилирования сайтов GCGG методом Southern-блоттинга

5. Определение активности гена GUS

5.1 Гистохимическое окрашивание органов картофеля и проростков арабидопсиса с помощью X-Gluc

5.2 Флюориметрический метод

6. Определение количества белка методом Bradford

7. Световая микроскопия

8. Определение органной специфичности работы промотора

9. Исследование влияния различных условий выращивания на функционирование пататинового промотора

10. Изучение влияния экзогенных Сахаров на активность промотора ВЗЗ

11. Анализ действия фитогормонов

12. Статистическая обработка данных

Результаты

I. Анализ работы пататинового промотора на модели трансгенного картофеля

1. Доказательство трансгенности растений

2. Анализ специфичности функционирования промотора ВЗЗ

2.1 Органная специфичность

2.2 Тканевая специфичность

2.3 Зависимость от возраста

2.3.1 Влияние возраста листьев

2.3.2 Влияние возраста растений

3. Анализ влияния условий выращивания трансформантов картофеля на активность пататинового промотора

3.1 Влияние световых условий выращивания

3.2 Влияние сахарозы

3.2.1 Выращивание трансформантов на свету

3.2.2 Выращивание в темновых условиях

4. Анализ влияния экзогенных Сахаров на активность пататинового промотора в изолированных листьях

4.1 Влияние сахарозы

4.2 Сравнение влияния сахарозы, глюкозы и фруктозы

II. Анализ возможных молекулярных механизмов органной специфичности ВЗЗ-промотора. Роль метилирования промоторной ДНК

1 Анализ степени метилирования ВЗЗ-промотора методом ПЦР

1.1 Подбор и анализ рестриктаз

1.2 Подбор условий ПЦР на контрольной ДНК и рестрицированной ДНК

1.3 Сравнительный анализ доступности ДНК из разных органов картофеля

1.4 Рестрикция ВЗЗ-промотора метилчувствительной рестриктазой Acil

2 Анализ степени метилирования сайтов GCGG методом Southern-блотинга

III. Анализ работы пататинового промотора на модели трансгенного арабидопсиса

1. Определение органной специфичности работы промотора ВЗЗ

2. Влияние света и темноты на активность пататинового промотора

3. Изучение влияния экзогенных Сахаров на активность пататинового промотора

3.1 Анализ действия сахарозы

3.2 Гистохимический анализ действия сахарозы на активность пататинового промотора

3.3 Анализ влияния глюкозы и фруктозы

3.4 Кинетика ответной реакции на сахара

4. Исследование возможного влияния фитогормонов на активность пататинового промотора

Обсуждение

Выводы

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Активность промотора гена пататина класса I картофеля в условиях гомологичной и гетерологичной экспрессии»

Картофель входит в число важнейших продовольственных культур. За последние годы картофель стал одной из тех культур, на которых интенсивно применяются методы генной инженерии. Это связано с разработкой достаточно надежных методов его трансформации, с высокой регенерационной способностью картофеля, а также с тем, что практически любую биоинженерную форму картофеля можно сохранить и размножить вегетативно. Экономически важной частью картофеля является запасающий орган - клубень, содержащий большое количество питательных веществ: крахмала и белка. В связи с этим очень важным являются исследования, направленные на изучение различных аспектов процесса клубнеобразования и накопления ценных ингредиентов в клубнях. Одним из подходов является использование трансгенных форм, полученных методами генетической инженерии.

Генетическая инженерия растений базируется на знании важнейших принципов функционирования гена, открытых благодаря фундаментальным биологическим дисциплинам. В свою очередь, генетическая инженерия растений способствует обогащению фундаментальных биологических наук новыми знаниями о структурно-функциональных механизмах работы генов в растительной клетке. Одним из современных подходов исследования функциональных особенностей промоторов является анализ их активности в условиях гетерологичной экспрессии. Обычно для этих целей промотор объединяют с кодирующей последовательностью какого-либо репортерного белка, заметно не влияющего на метаболизм клетки и развитие растения. При гетерологичной экспрессии, особенно у филогенетически отдаленных видов, проявляются как высококонсервативные универсальные системы регуляции генной активности, так и механизмы регуляции, свойственные отдельной группе растений или данному виду. Изучение структурно-функциональных особенностей промоторов генов является важной задачей современной биологии и имеет большое практическое значение, а именно, создание трансгенных растений с определенными хозяйственно-ценными признаками. Так, изучение и использование тканеспецифичных промоторов позволяет проводить целенаправленное улучшение именно хозяйственно-ценных частей растений. Для картофеля - это клубнеспецифичные промоторы гена пататина класса I и промотор GBSS.

В связи с этим, актуальным вопросом является изучение особенностей функционирования промотора гена пататина класса I картофеля. Данный промотор в настоящее время широко используется в различных биотехнологических работах, для решения самых разнообразных задач.

Так, пататиновый промотор был использован (Ефименко и др., 1996) для обеспечения тканеспецифичной экспрессии бактериального гена гомосеринкиназы (HSK) в трансгенных растениях картофеля. Гомосеринкиназа является ключевым ферментом в биосинтезе трех незаменимых аминокислот - треонина, метионина и изолейцина. То есть существует реальная возможность создания трансгенных растений картофеля с улучшенным составом белков. Экспрессия под контролем пататинового промотора гена циклодекстрин-гликозилтрансферазы (CGT) - фермента, расщепляющего крахмал до декстринов - позволяет получать трансформанты с повышенной пищевой ценностью клубней, из-за повышенной растворимости крахмала (Oakes et al., 1991).

Пататиновый промотор широко используется в работах, имеющих научное значение, для изучения различных аспектов роста и развития растений. Данный промотор применяется для изучения биохимических и молекулярных аспектов клубнеобразования; гормональной и углеводной регуляции клубнеобразования; для выяснения функций и механизмов действия сахарозы в процессе развития и жизнедеятельности высших растений.

Таким образом, пататиновый промотор используют в гениоинженерных работах как для создания трансгенных растений картофеля с улучшенными качествами, так и в работах, целью которых является изучение различных процессов, происходящих в течении их роста и клубнеобразования, а также в работах, направленных на изучение различных аспектов регуляции генной экспрессии. Поэтому оценки степени активности данного промотора в разных органах и тканях и при различных условиях выращивания растений представляют большой теоретический и практический интерес.

Целью данного исследования являлось изучение особенностей функционирования промотора гена пататина класса I картофеля в условиях гомологичной и гетерологичной экспрессии, анализ влияния различных факторов на промоторную активность и выяснение возможных молекулярных механизмов органной специфичности его функционирования.

В соответствии с целью были поставлены следующие задачи: провести сравнительное исследование органоспецифичности пататинового промотора при гомо- и гетерологичной экспрессии;

- исследовать влияние различных факторов, включая временные и световые условия выращивания растений, а также уровень сахарозы в культуральной среде, на активность пататинового промотора;

- охарактеризовать реакцию пататинового промотора в ранний период действия углеводов и фитогормонов;

- выяснить, может ли участвовать метилирование ДНК в механизмах органоспецифичности пататинового промотора.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

I. Генетическая инженерия растений: достижения практического применения и значение для фундаментальных исследований

Развитие генетической науки привело к появлению новой области человеческой деятельности, связанной с изменением генетического материала про- и эукариот с помощью новых подходов и технологий, объединяемых под названием генетическая (генная) инженерия. Совокупность методов манипулирования генетическим материалом позволяет конструировать искусственные генетические структуры в виде так называемых рекомбинантных (гибридных) молекул ДНК, и переносить их в организмы, с целью придания им новых полезных свойств (Пирузян, 1988; Лутова, 2000). Для измененных генноинженерным путем живых организмов существует особое название - генетически модифицированные (трансгенные) организмы. Трансгенные организмы - это растения, микроорганизмы и животные, которые несут в своем геноме чужеродную ДНК, введенную при помощи методов генетической трансформации. Появление трансгенных организмов связано как с развитием методов собственно генной инженерии, так и с разработкой методов введения реконструированной ДНК в живые клетки (Кучук и др., 1990; Бурьянов, 1999).

Блестящие открытия 20 века создали теоретические предпосылки генной инженерии. Начало этого направления в молекулярной биологии было положено в 1972 году, когда Пол Берг с сотрудниками опубликовали первую работу о получении in vitro рекомбинантной молекулы ДНК, состоящей из фрагментов фаговой, бактериальной и вирусной ДНК (Jackson et al., 1972). Открытие молекулярных механизмов матричного синтеза ДНК, обнаружение в бактериальных клетках внехромосомных маленьких кольцевых молекул ДНК - плазмид, выделение ферментов-рестриктаз обусловили возможность переноса отдельных генов или их функциональных элементов из одних организмов в другие (Лещинская, 1996). Три выдающихся достижения физиологии растений создали основу для интеграции технологии рекомбинантных ДНК в генноинженерную биотехнологию растений. Во-первых, это открытие фитогормонов, регулирующих рост и развитие растений. Во-вторых, это разработка методов культивирования клеток и тканей растений in vitro на средах, содержащих макро- и микроэлементы, сахара, витамины и фитогормоны - клеточная инженерия. Клеточная инженерия позволяет выращивать клетки, ткани и целые растения в стерильных условиях и проводить их селекцию на специфических средах (Бурьянов, 1999). В-третьих, это установление феномена тотипотентности соматических растительных клеток. В культуре in vitro возможна регенерация растений из недифференцированных соматических тканей с получением нормальных, фертильных растений.

В 1983 году были опубликованы первые работы по получению трансгенных растений (Herrera-Estrella et al., 1983; Barton et al., 1983). В результате были получены растения табака, содержащие гены устойчивости к антибиотикам. Такие растения приобрели устойчивость к антибиотику канамицину, ингибирующему рост (Лещинская, 1996). Это открыло перспективы для создания растений с улучшенными свойствами путем переноса в них соответствующих генов из других видов. В настоящее время только в компании Monsanto получено более 45 тысяч независимых линий трансгенных растений и сотни коммерческих фирм во всем мире занимаются получением и испытанием генетически модифицированных растений.

На сегодняшний день генетическая инженерия располагает большим арсеналом знаний и методов для эффективного переноса генов из одних организмов в другие.

Достижения практического применения генетической инженерии растений

Технологии с использованием рекомбинантных ДНК играют важную роль в развитии генотерапии наследственных заболеваний, создании лекарственных препаратов нового поколения, производстве фармакологических и косметических средств и получении технического сырья. В генноинженерной биотехнологии растений можно выделить несколько специализированных направлений. Основное направление ориентировано на решение селекционно-генетических проблем повышения продуктивности сельскохозяйственных растений и их защиты от различных биотических и абиотических стрессовых факторов (Бурьянов, 1999). Наиболее широкое применение генная инженерия нашла в сфере производства новых линий сортов сельскохозяйственных растений, обладающих принципиально новыми свойствами (Hammond et al., 1999; Кузнецов, Куликов, 2005). Появилась возможность создавать трансгенные растения, продуцирующие новые вещества для медицины и технической промышленности, приспособленные для роста в полевых условиях.

Получение трансгенных растений, устойчивых к различным биотическим и абиотическим факторам - Устойчивость к гербицидам

К настоящему времени растения, трансформированные генами устойчивости к гербицидам, применяются в сельскохозяйственной практике многих стран. Для создания трансгенных растений, устойчивых к гербицидам, используют следующие приемы: применение генов бактериального или растительного происхождения, кодирующих мутантные белки-мишени с сильно пониженной чувствительностью к гербицидам; увеличение уровня экспрессии растительных генов, кодирующих нормальные белки-мишени; использование бактериальных генов, кодирующих ферменты деградации и детоксикации гербицидов (Бурьянов,

1999). Для создания растений, устойчивых к гербициду глифосат, наиболее часто используют конструкции на основе одного из двух генов: EPSPS (5-енолпирувилшикимат-3-фосфат-синтаза) и GOX (глифосат-оксидоредуктаза). Устойчивость трансгенных растений к действию гербицида атразина обеспечивается встраиванием в геном гена цитохрома CYP1A1, представителя класса цитохромов Р-450 (Кузнецов, Куликов, 2005). К настоящему времени получены трансгенные растения важнейших сельскохозяйственных культур, таких как соя, кукуруза, хлопчатник, рис и многие другие. Генномодифицированные растения характеризуются повышенной устойчивостью к широкому ряду гербицидов: глифосату, биалофосу, атразину, фосфинотрицину, хлорсульфуроновым и имидазолиноновым гербицидам (Кучук, Глеба, 1997). - Устойчивость к насекомым и другим вредителям

В настоящее время довольно остро стоит вопрос о получении растений, устойчивых к вредителям сельского хозяйства. Сейчас освоено достаточное количество приемов, позволяющих получать трансгенные растения, устойчивые к насекомым. Наибольшее предпочтение отдается переносу в растения генов 8-эндотоксинов из бактерии Bacillus thuringiensis. Эта группа белков характеризуется широким разнообразием инсектицидной специфичности (Бурьянов, 1999). Белок 8-эндотоксин (CRY-белок) протеолитически расщепляется в кишечнике насекомых, образуя активизированный токсин. Активизированный белок специфично связывается с рецепторами в средней кишке насекомых, что приводит к образованию пор и лизису клеток кишечного эпителия. Взаимодействие токсина с рецепторами строго специфично, что усложняет подбор комбинации токсин-насекомое (Глеба, 1998). При создании трансгенных растений, устойчивых к конкретным насекомым-вредителям, осуществляют подбор необходимых штаммом В. thuringiensis и создают генноинженерные конструкции, которые дают наибольший эффект для конкретных классов насекомых. В настоящее время конструкции для трансформации растений содержат модифицированные гены с сохранением доменов, кодирующих активные части 5-токсина (Глеба, 1998). В природе существует большое количество штаммов Bacillus thuringiensis, чьи токсины действуют на определенные виды насекомых. Кроме того, найдены новые классы белков Bacillus thuringiensis, которые токсичны не только для насекомых, но и для других вредителей, таких как нематоды, клещи и одноклеточные паразитирующие микроорганизмы (Бурьянов, 1999). В настоящее время так называемые ifr-растения хлопка и кукурузы занимают основную долю в общем объеме генетически модифицированных растений этих культур, которые выращивают на полях США. Кроме того, фирмы "Monsanto" и "Ciba-Geigy" предлагают для практического использования трансгенные формы томатов и картофеля, устойчивые к насекомым (Кучук, Глеба, 1997).

Другой подход к созданию трансгенных растений, устойчивых к вредителям и фитопатогенным грибам - это экспрессия в клетках растений генов-ингибиторов протеиназ. Многие растения содержат в своих тканях, плодах и семенах ингибиторы протеиназ, специфически настроенных против протеиназ насекомых и грибов (Бурьянов, 1999). - Устойчивость к вирусам

Для создания растений, устойчивых к вирусам, применяют несколько подходов. Один из них основан на конструировании антисмысловых ("antisense") конструкций. В таких конструкциях кДНКовая копия вирусной РНК ставится под промотор таким образом, чтобы в результате транскрипции образовалась последовательность РНК, комплементарная вирусной. При заражении вирусом трансгенной растительной клетки, и накоплении вирусной РНК образуются РНКовые дуплексы с конститутивно синтезируемой антисмысловой РНК. Такие дуплексы разрушаются специфическими РНКазами, в результате не происходит новообразование вирусных частичек и развития болезни. Другая стратегия создания трансгенных растений, устойчивых к вирусам состоит в клонировании и встраивании в геном растений вирусных генов белка оболочки (coat-protein). Активный синтез такого белка, обладающего большим сродством к РНК вируса, не дает возможности последней активно реплицироваться в клетке хозяина, что приводит к достаточно высокой устойчивости трансформантов к вирусам (Кучук, Глеба, 1997). Для защиты растений от вирусной инфекции также используются кДНК вирусных сателлитных РНК, гены вирусных репликаз и другие элементы вирусного генома (Бурьянов, 1999). Третий подход объединяет работы по получению трансгенных растений, устойчивых к вирусам, путем встраивания в геном растений генов, кодирующих специфические антитела, узнающие вирусные белки; последовательностей ДНК, кодирующих нетранслируемые последовательности РЖ вирусов (Кучук, Глеба, 1997); использование мутантных нефункциональных генов транспорта вирусов из зон репликации в неинфицированные клетки растений, с целью блокировки межклеточного транспорта инфицирующего вируса; использование собственных растительных генов устойчивости (Бурьянов, 1999).

- Устойчивость к фитопатогенным грибам и микроорганизмам

На первых этапах работ по конструированию трансгенных растений, устойчивых к фитопатогенам, наиболее широко использовали гены гидролитических ферментов, разрушающих клеточные стенки фитопатогенных микроорганизмов. В первую очередь это бактериальные, грибные и индуцибельные растительные гены хитиназы. Были получены трансгенные растения табака, устойчивые к грибковой инфекции, путем встраивания в растительный геном гена хитиназы риса совместно с геном глюканазы люцерны (Кучук, Глеба, 1997). Другой подход для создания трансгенных растений, устойчивых к фитопатогенам заключается в использовании генов, участвующих в синтезе фитоалексинов. Первым успешным примером применения этой стратегии является получение растений табака, в которые был введен ген стилбенсинтазы из винограда (Кучук, Глеба, 1997). Полученные растения синтезировали фитоалексин резвератрол, олигомерная форма которого, винеферин, токсична для фитопатогенных грибов (Бурьянов, 1999). Трансформанты обладали повышенной устойчивостью к грибному патогену Botrytis cinerea. Еще один подход для защиты растений от грибных патогенов заключается в создании трансгенных растений с искусственной гиперчувствительной реакцией, приводящей к некрозу инфицированных тканей растений. Для этой цели использовали генетические конструкции, содержащие ген бактериальной рибонуклеазы (барназы) под контролем промотора индуцибельного гена картофеля ргр-1, ответственного за быстрый локальный ответ на инфицирование патогеном. Так был получен трансгенный картофель, устойчивый к фитофторе. В условиях заражения экспрессия гена барназы приводит к быстрой гибели инфицированной клетки. Для сведения к минимуму некротического эффекта барназы на соседние неинфицированные ткани, а также чтобы исключить спонтанную экспрессию этого гена в геноме растений, в трансформантах конститутивно экспрессировался также ген барстар. Продуктом этого гена является специфический ингибитор барназы (Бурьянов, 1999).

Устойчивые к патогенам растения накапливают такие химические соединения, как перекись водорода, салициловая кислота (SA), фитоалексины. Примером, доказывающим важную роль салициловой кислоты в иммунном ответе растений, являются трансгенные растения табака, содержащие бактериальный ген, контролирующий синтез салицилат гидролазы (фермента, разрушающего SA) и неспособные к иммунному ответу. Изменение генноинженерным путем уровня салициловой кислоты или выработки в растениях в ответ на патоген перекиси водорода является перспективным для создания устойчивых трансгенных растений (Лутова, 2000). Так, в компании "Monsanto" был разработан способ, позволяющий получать трансгенные растения, устойчивые к бактериальной и грибковой инфекции. Для этой цели использовали ген грибного происхождения, продуктом которого является фермент, осуществляющий реакцию окисления глюкозы с образованием перекиси водорода. Полученные трансформанты картофеля обладали устойчивостью к фитофторе, а также были устойчивыми к мягкой гнили, вызываемой бактериями из рода Erwinia (Кучук, Глеба, 1997).

- Устойчивость к абиотическим стрессам

Использование методов генетической инженерии позволяет создавать растения, устойчивые к абиотическим стрессам. Один из подходов для создания растений, устойчивых к абиотическим стрессам, основан на том, что в растениях при стрессовых условиях происходит накопление окислительных радикалов. Использование генов супероксидцисмутазы позволяет получать устойчивые к стрессам растения. Так были получены трансгенные растения табака с повышенным содержанием супероксиддисмутазы, характеризующиеся повышенной устойчивостью к гербицидам окислительного действия и к озону. Трансгенные растения люцерны, несущие дополнительный ген супероксиддисмутазы из N. plumbaginifolia, были более устойчивы к водному дефициту и характеризовались большей продуктивностью по сравнению с обычными растениями (Кучук, Глеба, 1997). Для создания холодоустойчивых растений используют методы, базирующиеся на изменении соотношения насыщенных и ненасыщенных жирных кислот в мембранах растительных клеток (Попов и др., 2005). Техногенное загрязнение окружающей среды, в частности, накопление тяжелых металлов в почве, стало причиной развития направления генетической инженерии с целью создания растений с повышенной устойчивостью к таким элементам. Примером такого подхода является встраивание в геном растения гена белка животного происхождения

- металлотионеина, способного связывать многие тяжелые металлы (Кучук, Глеба, 1997).

Улучшение хозяйственно-ценных признаков сельскохозяйственных растений и создание растений-продуцентов

Современная биотехнология в состоянии манипулировать многими важными признаками, в частности, это относится к признакам, которые влияют на качество получаемой продукции. Генноинженерная биотехнология растений позволяет получать трансгенные растения с измененным составом жирных кислот, со сбалансированным аминокислотным составом белков. Открывается возможность получения крахмала с заданными физико-химическими свойствами, а также регулирования сроков созревания плодов.

- Получение растений с измененным составом жирных кислот

Убедительной демонстрацией успехов генноинженерной биотехнологии растений является получение трансгенных растений с измененным составом жирных кислот. Жирные кислоты - основной компонент растительного масла - являются важнейшим сырьем для получения разного рода химических веществ. Методами генной инженерии осуществляют элонгацию и терминацию длины цепи жирных кислот, а также такие потенциальные модификации, как введение в углеводородную цепь ненасыщенных связей ее гидроксилирование и разветвление. Первые работы были направлены на получение семян рапса с измененным составом жирных кислот. Семена рапса характеризуются высоким содержанием масла, однако его питательные и вкусовые качества довольно низки, из-за высокой доли в нем (более 50%) длинноцепочечной эруковой кислоты. Селекционно-генетическими методами удалось получить сорта с низким содержанием (менее 2%) эруковой кислоты. С помощью методов генетической инженерии стало возможным дальнейшее изменение состава жирных кислот (Бурьянов, 1999).

В 1995 году в США разрешили выращивание и коммерческое использование трансгенных растений рапса с измененным составом растительного масла, включающего вместе с обычными 16- и 18-членными жирными кислотами также и до 45% 12-членной жирной кислоты - лаурата для пищевых и технических целей. Для этого был клонирован ген специфической тиоэстеразы калифорнийского лавра (Umbellularia californica), где содержание лаурата в жире семян достигало 70%. Структурная часть этого гена под контролем промотора и терминатора гена белка, специфического для ранней стадии семяобразования, была встроена в геном рапса, что и привело к увеличению содержания лаурата в масле (Глеба, 1998). Жирные кислоты со средней длиной цепи углеродных атомов используются в пищевой промышленности при получении диетического маргарина, кондитерских кремов, в косметике при получении шампуней, а также для технических целей как сырье при получении детергентов и смазочных масел.

Практический интерес представляют также масличные культуры, продуцирующие масла с высоким содержанием жирных кислот с очень длинной углеродной цепью. Такие жирные кислоты применяются в качестве сырья для синтеза полимеров, добавок к смазочным маслам и для получения дизельного топлива (Бурьянов, 1999). Кроме того, получены трансгенные растения рапса, в семенах которых содержание стеарата увеличено по сравнению с нормальными растениями в 25 раз. Эти растения экспрессируют в антисмысловой ориентации под промотором гена запасного белка напина семян Brassica гара кДНК гена 9-стероил-АСР-десатуразы этого же растения. В результате в семенах таких растений за счет снижения количества десатуразы накапливалось до 40% стеариновой кислоты. Твердое масло таких семян с высоким содержанием стеарата можно использовать в качестве заменителя масла бобов какао (Бурьянов, 1999).

- Получение растений с измененным аминокислотным составом белков для сбалансированного питания

К настоящему времени клонированы уже многие гены запасных белков таких растений, как соя, горох, фасоль, кукуруза, картофель. Во многих лабораториях ведутся работы по модификации генов этих белков с целью получить более полноценный продукт для кормления животных. Одним из подходов для создания более полноценного запасного белка у зернобобовых культур, дефицитного по серусодержащим аминокислотам, является использование гена 2S белка из бразильского ореха Bertholletia excelsa, содержащего большое количество метионина. К настоящему времени получены трансгенные растения Vicia narbonensis с введенным синтетическим геном 2S белка. Аналогичная работа была проведена австралийскими учеными по созданию трансгенных растений клевера Trifolium subterraneum L., несущих ген синтеза белка из подсолнечника с повышенным накоплением серусодержащих аминокислот (Кучук, Глеба, 1997).

- Изменение состава и свойств углеводов в запасающих органах

Растения являются важнейшим источником Сахаров и продуктов на их основе. Наиболее важными продуктами являются целлюлоза, крахмал, пищевые моно- и дисахариды. Активно ведутся работы по созданию трансгенных растений картофеля, в которых крахмал находится только в виде амилопектина. Такой крахмал, вероятно, будет иметь спрос на рынке производителей различных питательных смесей, где в качестве наполнителя используется модифицированный крахмал (Глеба, 1998). Большое внимание уделяется клонированию генов, участвующих в синтезе и транспортировке сахара, и изучению функционирования этих генов в трансформантах картофеля. Используя технологию антисмысловых РЖ, были получены трансгенные растения картофеля с подавленным синтезом ключевого фермента биосинтеза крахмала АДФ-глюкозопирофосфорилазы и, как следствие, блокированием биосинтеза крахмала. Клубни таких растений характеризовались низким содержанием крахмала и сухих веществ (Бурьянов, 1999). Получены различные трансгенные растения, несущие бактериальные гены Bacillus subtilis и Erwinia amylovora, кодирующие фермент биосинтеза леванов - левансахаразу. Ген левансахаразы из Erwinia amylovora был экспрессирован в трансгенном картофеле под промотором запасного белка клубней пататина с N-концевой вакуолярной сигнальной последовательностью этого гена или без нее. Клубни трансформантов с вакуолярной локализацией левансахаразы характеризовались повышенным синтезом и накоплением фруктана (Бурьянов, 1999). - Регуляция сроков созревания

В последние годы ученые используют такой подход для получения трансгенных растений как "antisense RNA" (антисмысловой РНК). В трансгенном растении образуются как нормальная молекула мРНК конкретного гена, так и комплементарная ей РНК, которые образуют двуспиральный комплекс и закодированный белок не синтезируется. Такой подход позволил получить трансгенные растений томатов с улучшенным качеством плодов. Для этой цели использовали к-ДНК гена PG, контролирующего синтез полигалактуроназы - фермента, участвующего в разрушении пектина, основного компонента межклеточного пространства растительных тканей. Продукт гена PG синтезируется в период созревания плодов томатов, а увеличение его количества приводит к тому, что томаты становятся более мягкими, что значительно сокращает срок их хранения. Выключение этого гена в трансгенных растениях позволило получить растения томатов с новыми свойствами плодов, которые не только значительно дольше сохранялись, но и сами растения были более устойчивы к грибным заболеваниям. Кроме того, для регулирования сроков созревания томатов использовали различные этапы биосинтеза этилена - гормона, регулирующего созревание плодов. Антисмысловая последовательность к

ДНК гена АЦК-оксидазы ингнбирует биосинтез фермента и благодаря этому тормозит образование в клетках этилена. Трансформация растений к-ДНК гена АЦК-синтазы полностью блокирует синтез этилена в плодах и их созревание, но его можно вызвать в нужный момент обработкой этилен-продуцентом (Кулаева, 2004). В последние годы стали широко применять такой подход, как использование комбинации определенных бактериальных гормональных генов. Плоды трансгенных растений с геном iaaM, находящимся под промотором гена Def (ген, который экспрессируется только в плодах), являются партенокарпическими, то есть сформировавшимися без опыления. Партенокарпические плоды характеризуются почти полным отсутствием семян, что позволяет получать плоды без косточек. Уже получены трансгенные растения кабачков, которые в целом не отличаются от контрольных, но практически не содержат семян (Лутова, 2000).

- Получение трансгенных растений с измененными декоративными свойствами

Большое внимание уделяется созданию декоративных растений с измененной пигментной окраской цветков. Один из примеров - это получение растений петунии с измененной пигментацией цветков от пурпурного до кирпично-красного за счет введения генов дегидрофлавонол-4-редуктазы из кукурузы или герберы. С использованием техники введения антисмысловой ДНК получен ряд растений петунии, герберы, хризантемы и розы с измененной пигментацией цветков. На очереди создание голубых роз, гвоздик, хризантем с геном, контролирующим синтез голубого пигмента -дельфинидина (Кучук, Глеба, 1997).

- Получение растений-продуцентов целевых белков медицинского и иного назначения

Трансгенные растения можно использовать как продуценты чужеродных белков, различных вакцин и антител (Herbers, Sonnewald, 1999). Ценные биологически активные пептиды можно получать, вводя их в состав запасных белков семян. Так, с целью получения пентапептидного нейрогормона животных лейэнкефалина, кодирующая его последовательность ДНК была встроена в ген 2S альбумина запасного белка семян Arabidopsis thaliana. В результате, такие растения давали семена с высоким содержанием рекомбинантного белка. С помощью специфического протеолитического расщепления целевой пептид можно легко выделить из рекомбинантного белка. На основе трансгенных растений возможно получение «съедобных» вакцин. На примере антигена HbsAg вируса гепатита В показано, что трансгенные растения способны синтезировать молекулы антигена, которые в растительных клетках правильно гликозилируются и собираются в нативные иммуногенные частицы, идентичные по различным свойствам коммерческим вакцинным препаратам (Бурьянов, 1999). Разработаны методы выращивания растений с бактериальными антигенами, что в значительной степени облегчает приготовление вакцин. Ярким примером является картофель, экспрессирующий белки - фрагменты токсина холеры. Иммунизация такой антихолерной вакциной вполне эффективно происходит путем преорального приема. Трансгенные растения можно использовать для крупномасштабного производства рекомбинантного иммуноглобулина А. Несомненный интерес для медицины вызывает получаемый из растений человеческий интерферон. Такой способ получения этого иммуномодулирующего агента оказался гораздо эффективнее и дешевле, чем при использовании микробиологических методов. Способность растений синтезировать специфические антитела широко используется как в исследованиях фундаментальных проблем клеточной биологии растений, так и в практической генноинженерной биотехнологии растений.

Белки паутины, благодаря своим структурным особенностям, являются уникальным по прочности и эластичности биоматериалом. Недавно были получены трансгенные растения табака, экспрессирующие синтетические гены белков паутины (Пирузян и др., 2003). Судя по уровню экспрессии данных белков, растения могут быть подходящими продуцентами белков шелка паутины с заранее заданными свойствами.

Заключение диссертации по теме «Физиология и биохимия растений», Наумкина, Елена Михайловна

выводы

1. На двух независимых трансформантах картофеля ВЗ3::GUS и линии ВЗЗ::GUS трансгенного арабидопсиса проведен детальный анализ влияния различных внешних условий на активность промотора гена пататина класса I (ВЗЗ-промотор), ее возрастной, видовой, органной и тканевой специфичности.

2. Разработан, испытан на линиях B33::GUS картофеля и запатентован новый специализированный биочип для идентификации генетически модифицированных источников растительного происхождения и доказательства трансгенности растений. Использование биочипа сочетает преимущества таких высокочувствительных и специфичных методов, как ПЦР и ДНК-ДНК гибридизация.

3. Подтверждена органная и тканевая специфичность функционирования ВЗЗ-промотора при гомо- и гетерологичной экспрессии, выявлены новые черты сходства и различий этой экспрессии у разных видов растений. У картофеля in vitro основным органом экспрессии ВЗЗ-промотора являлся клубень, а в отсутствие клубня - стебель или лист, тогда как у проростков арабидопсиса в неиндуктивных условиях таким основным органом был корень, за которым следовал гипокотиль.

4. Свет и сахароза активировали ВЗЗ-промотор как в растениях картофеля, так и в проростках арабидопсиса. В семядолях арабидопсиса сахароза может активировать ВЗЗ-промотор в сотни раз и гораздо сильнее, чем свет. Активирующее действие моносахаридов (глюкозы, фруктозы) заметно слабее по сравнению с действием сахарозы.

5. На системе ВЗЗ::GUS проростков арабидопсиса активации сахарами ВЗЗ-промотора предшествовал лаг-период длительностью около 6 ч, что служит указанием на то, что пататиновый промотор не является первичной мишенью для сахарозного сигнала. В отличие от сахарозы и ее производных, фитогормоны ауксин, цитокинин и гиббереллин не оказали существенного влияния на активность ВЗЗ-промотора у трансгенного арабидопсиса.

6. У растений картофеля степень метилирования сайтов GCGG в проксимальной области ВЗЗ-промотора тканеспецифична: уровень метилирования минимален в клубнях и максимален в стеблях и корнях. Тем самым обнаружена обратная корреляция между степенью метилирования GCGG-сайтов ВЗЗ-промотора в органах растений и уровнем его активности.

7. Выявленные новые закономерности работы ВЗЗ-промотора in planta способствуют лучшему пониманию его базовых функциональных характеристик и позволяют точнее прогнозировать его поведение при гомо- и гетерологичной экспрессии.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Наумкина, Елена Михайловна, 2007 год

1. Аксенова Н. П, Константинова Т. Н, Голяновская С. А. Коссманн Й, Вилльмитцер Л, Романов Г. А. (2000) Генетические трансформанты картофеля как модель изучения гормональной и углеводной регуляции клубнеобразования. Физиология растений, 47, 3: 420-430

2. Аксенова Н. П, Константинова Т. Н, Голяновская С. А. Гукасян И. А, Гатс К, Романов Г. А. (2002) Клубнеобразование и рост в культуре in vitro трансгенного картофеля с суперпродукцией фитохрома В. Физиология растений, 49, 4: 535-540

3. Бурьянов Я. И. (1999) Успехи и перспективы генно-инженерной биотехнологии растений. Физиология растений, 46, 6: 930-944

4. Бутенко Р. Г. (1999) Биология клеток высших растений in vitro и биотехнология на их основе. М: ФБК-ПРЕСС. 160с.

5. Ванюшин Б. Ф. (2005) Энзиматическое метилирование ДНК -эпигенетический контроль за генетическими функциями клетки. Биохимия, 70:598-611

6. Ванюшин Б. Ф. (2006) Метилирование ДНК и эпигенетика. Генетика, 42, 9: 114

7. Глеба Ю. Ю. (1998) Биотехнология растений. Соросовский образовательный журнал, 6:3-8

8. Гвоздев В. А. (1999) Регуляция активности генов, обусловленная химической модификацией (метилированием) ДНК. Соросовский образовательный журнал, 10: 11-17

9. Гуо Г. (2000) Влияние различных сочетаний промотор/экзон/интрон на экспрессию чужеродного гена и эффективность отбора протопластов пшеницы-однозернянки, трансформированных при посредстве полиэтиленгликоля. Физиология растений, 47,3:390-396

10. Дейнеко Е. В., Новоселя Т. В., Загорская А. А., Филиппенко Е. А., Шумный В. К. (2000) Нестабильность экспрессии маркерного гена nptll у трансгенных растений табака. Физиология растений, 47, 3: 390-396

11. Дерфлер В. (2005) О биологическом значении метилирования ДНК. Биохимия, 70: 618-640

12. Даниленко Н. Г., Давыденко О. Г. (2003) Мир геномов органелл. Минск: Технология. 494с.

13. Жимулев И.Ф. (2000) Современные представления о структуре гена у эукариот. Соросовский образовательный журнал, 6, 7: 17-24

14. Ефименко И. М., Медведева Т. В. и др. (1996) Клубнеспецифическая экспрессия гомосеринкиназы Е. coli в трансгенных растениях картофеля. Материалы международной конференции, посвященной памяти ак. Баева А.А.; с. 11-14

15. Зверева С. Д., Романов Г. А. (2000) Репортерные гены для генетической инженерии растений: характеристика и методы тестирования. Физиология растений, 47, 3: 479-488

16. Кучук Н. В., Шаховский А. М., Камарницкий И. К., Глеба Ю. Ю. (1990) Получение генетически трансформированных клеточных клонов сои путем электропорации протопластов. Биотехнология, 5: 30-31

17. Кучук Н. В., Глеба Ю. Ю. (1997) Применение трансгенных растений для целей практической селекции. Цитология и генетика, 31,4: 102-114

18. Кузнецов Вл. В., Куликов А. М. (2005) Генетически модифицированные организмы и полученные из них продукты: реальные и потенциальные риски. Рос. хим. ж., XLIX, 4: 70-83

19. Лутова JI. А. (2000) Генетическая инженерия растений: свершения и надежды. Соросовский образовательный журнал, 6, 10: 10-17

20. Лутова Л. А., Проворов Н. А., Тиходеев О. Н., Тихонович И. А., Ходжайова Л. Т., Шишкова С. О. (2000) Генетика развития растений. Санкт-Петербург: Наука: 429-431

21. Лещинская И. Б. (1996) Генетическая инженерия. Соросовский образовательный журнал, 1: 32-39

22. Ли А., Тинланд Б. (2000) Интеграция Т-ДНК в геном растений: прототип и реальность. Физиология растений, 47, 3: 354-359

23. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбук Дж. (1984) Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. М.: Мир: 162 с.

24. Патрушев Л.И. (2000) Экспрессия генов. М.: Наука, 527 с.

25. Пирузян Э. С. (1988) Основы генетической инженерии растений. М.: Наука, 304 с.

26. Романов Г.А. (2000) Генетическая инженерия растений и пути решения проблемы биобезопасности. Физиология растений, 47, 3: 343-353

27. Романов Г. А., Ванюшин Б. Ф. (1980) Метилирование ДЖ у эукариотов. Научные доклады высшей школы. Биологические науки, 11: 5-20

28. Омельянчук Н. А., Филипкова Г. И., Гуревич В. В. и др. (1991) Трансформация пыльцы методом пыльцевых трубок. Новые методы биотехнологии растений, Пущино; с. 33-34

29. Сингер М., Берг П. (1998) Гены и геномы. М.: Мир (в двух томах)

30. Чесноков Ю. А., Король А. Б. (1993) Перенос чужеродных генов в растения посредством опыления оплодотворения. Генетика, 29, 8: 1345-1355

31. Чайлахян М. X. (1984) Фотопериодическая и гормональная регуляция клубнеобразования у растений. М.: Наука, с. 6-17

32. Barton K., Binns A., Matzke A., Chilton M.-D. (1983) Regeneration of intact tobacco plants containing full length copies of genetically engineered T-DNA to R1 progeny. Cell, 32:1033-1043

33. Bevan M., Barker R., Goldsbrough A., Jarvis M., Kavanagh Т., Iturriaga G. (1986) The structure and transcription start site of a major potato tuber protein gene. Nucleic Acids Research, 14, 11:4625-4638

34. Blundy K. S., Blundy M.A., Carter D., Wilson F., Park W. D., Burrell M. M. (1991) The expression of class I patatin gene fusions in transgenic potato varies with both gene and cultivar. Plant Mol. Biol., 16, 1: 153-160

35. Bradford M. (1976) A rapid and sensitive method for the quantitation of microgramm quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem., 2: 248-254

36. Barker L., Kuhn C., Weise A., Schulz A., Gebhardt C., Hirner В., Hellmann H., Schulze W., Ward J.M., Frommer W.B. (2000) SUT2, a putative sucrose sensor in sieve elements. Plant Cell, 12,7:1153-1164

37. Banerji S., Flieger A. (2004) Patatin-like proteins: a new family of lipolytic enzymes present in bacteria? Microbiology, 150: 522-525

38. Burke Т. V., Kadonaga J. T. (1997) The downstream core promoter element, DPE, is conserved from Drosophila to humans and is recognized by TAFII60 of Drosophila. Genes & Dev., 11: 3020-3031

39. Birch R. G. (1997) Plant transformation: problems and strategies for practical application. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 48: 297-326

40. Barreto G., Schafer A., Marhold J., Stach D., Swaminathan S. K., Handa V., Doderlein G., Maltry N., Wu W., Lyko F., Niehrs C. (2007) Gadd45a promotesepigenetic gene activation by repair-mediated DNA demethylation. Nature, 445: 671-675

41. Chan S.W.-L., Henderson I. R., Jacobsen S. E. (2005) Gardening the genome: DNA methylation in Arabidopsis thaliana. Nature, 6: 351-360

42. Chiou T.-J., Bush D. R. (1998) Sucrose is a signal molecule in assimilate partitioning. Proc Natl. Acad. Sci. USA, 95, 8: 4784-4788

43. Cangelosi G. A., Martinetti G., Leigh J. A., Lee С. C., Theines C., Nester E. W. (1989) Role for corrected. Agrobacterium tumefaciens ChvA protein in export of beta-l,2-glucan. J. Bacterid., 171, 3:1609-1615

44. Cosma M. P. (2002) Ordered recruitment: gene-specific mechanism of transcription activation. Mol Cell., 10,2: 227-236

45. Chakraborty C. (2007) Potentiality of small interfering RNAs (siRNA) as recent therapeutic targets for gene-silencing. Curr Drug Targets., 8, 3: 469-482

46. Czernilofsky A. P., Hain R., Herrera-Estrella L., Goyvaerts E., Baker B.J., Schell J. (1986) Fate of selectable marker DNA integrated into the genome of Nicotiana tabacum. DNA, 5: 101-113

47. Cazzonelli С. I., McCallum E. J., Lee R., Botella J. R. (2005) Characterization of a strong, constitutive Mung Bean (Vigna radiata L.) promoter with a complex mode of regulation in planta. Transgen. Res., 14: 941-967

48. Danilova S. A., Teixeira da Silva J. A., Kusnetsov V. V. (2006) Novel approaches for Agrobacterium-mQdiated transformation of maize and ornamental grasses. Floriculture, Ornamental and Plant Biotechnology, II: 66-69

49. Ewing E. E. (1995) The role of hormones in potato (Solarium tuberosum L.) tuberization. P. J. Davies (ed.), Plant Hormones, Physiology, Biochemistry and Molecular Biology. Dordrecht: Kluwer Acad. Publ: 698-724

50. El Ouakfaoui S., Miki B. (2005) The stability of the Arabidopsis transcriptome in transgenic plants expressing the marker genes nptll and uidA. Plant J., 41, 6: 791800

51. Frommer W.B., Mielchen С., Martin Т. (1994) Metabolic control of a class I patatin promoter from potato in transgenic tobacco and tomato plants. Plant Physiol., 13: 329-334.

52. Gibson S. I. (2005) Control of plant development and gene expression by sugar signaling. Curr. Opin. Plant Biol., 8: 93-102

53. Galliard Т., Dennis S. (1974) Isoenzymes of lipolytic acyl hydrolase and esterase in potato tuber. Phytochemistry, 13: 2463-2468

54. Grierson C., Du J. S., Zabala M. D. T, Beggs K., Smith C., Holdsworth M., Bevan M. (1994) Separate cis sequences and trans factors direct metabolic and developmental regulation of a potato tuber storage protein gene. The Plant Journal, 5, 6:815-826

55. Gilissen L. J., Metz P. L., Stiekema W. J., Nap J. P. (1998) Biosafety of E. coli beta-glucuronidase (GUS) in plants. Transgenic Res., 7,3: 157-163

56. Ganal M. W., Bonierbale M. W., Roeder M. S., Park W. D, Tanksley S. D. (1991) Genetic and physical mapping of the patatin genes in potato and tomato. Mol.Gen.Genet., 225,3: 501-509

57. Gnatt A. (2002) Elongation by RNA polymerase II: structure-function relationship. Biochim Biophys Acta., 1577,2:175-190

58. Gonzali S., Loreti E., Solfanelli C., Novi G., Alpi A., Perata P. (2006) Identification of sugar-modulated genes and evidence for in vivo sugar sensing in Arabidopsis. J Plant Res., 119:115-123

59. Gruenbaum Y., Naveh-Many Т., Cedar H., Razin A. (1981) Sequence specifity of methylation in higher plant DNA. Nature, 292: 860-862

60. Gross P., Oelgeschlager T. (2006) Core promoter-selective RNA polymerase II transcription. Biochem. Soc. Symp., 73: 225-236.

61. Herrera-Estrella L., Depicker A., Van Montagu M., Schell J. (1983) Expression of chimeric genes transferred into plant cell using a Ti-plasmid-derived vector. Nature, 303:209-213

62. Herbers К., Sonnewald U. (1999) Production of new/modified proteins in transgenic plants. Cur. Opin. Biotech., 10:163-168

63. Huang S., Cerny R. E., Bhat D. S., Brown S. M. (2001) Cloning of an arabidopsis patatin-like gene, sturdy, by activation T-DNA tagging. Plant Physiol., 125, 2: 573-584

64. Cazzonelli С. I., McCallum E. J., Lee R., Botella J. R. (2005) Characterization of a strong, constitutive mung bean (Vigna radiate L.) promoter with a complex mode of regulation in planta. Transgen. Res., 14: 941-967

65. Hannapel D. J., Miller J. C., Park W. D. (1985) Regulation of potato tuber protein accumulation by gibberellic acid. Plant Physiol., 78: 700-703

66. Hellmann H., Funck D., Rentsch D., Frommer W.B. (2000) Hypersensitivity of an Arabidopsis sugar signalling mutant toward exogenous proline application. Plant Physiol., 123: 779-789

67. Hammond J. et al. (eds) (1999) Plant Biotechnology. Berlin: Springer, 198 p.

68. Hirschberg H. J. H. В., Simons J. F. A., Dekker N., Egmond M. R. (2001) Cloning, expression, purification and characterization of patatin, a novel phospholipase A. Eur.J.Biochem., 268, 19: 5037-5044

69. Herr J., Jensen M. В., Dalmay Т., Baulcombe D. C. (2005) RNA Polymerase IV Directs Silencing of Endogenous DNA. Science, 308, 5718: 118-120

70. Horsch R. В., Fry J. E., Hoffman N. L., Eichholtz D., Rogers S. C., Fraley R. T. (1985) A simple and general method for transferring genes into plants. Science, 227:1229-1231

71. Jang J.-C., Sheen J. (1994) Sugar Sensing in Higher Plants. The Plant Cell, 6: 1665-1679

72. Jefferson R. A., Goldsbrough A., Bevan M (1990) Transcriptional regulation of a patatin-1 gene in potato. Plant Mol. Biol., 14: 995-1006

73. Jefferson R. A. (1987) Assaying chimeric genes in plants: the GUS gene fusion system. Plant Mol.Biol. Report, 5: 387-405

74. Jefferson R. A., Kavanagh T. A., Bevan M. W. (1987) GUS fusions: p-glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants. The EMBO Journal, 6,13:3901-3907

75. Kim S.Y., May G.D., Park W.D. (1994) Nuclear protein factors binding to a class I patatin promoter region are tuber-specific and sucrose-inducible. Plant Mol.Biol., 26,2: 603-615

76. Koster-Topfer M., Frommer W. В., Rocha-Sosa M., Rosahl S., Schell J., Willmitzer L. (1989) A class II patatin promoter is under developmental control in both transgenic potato and tobacco plants. Mol. Gen. Genet., 219: 390-396

77. Kel О. V., Romaschenko A. G., Kel A. E., Wingender E., Kolchanov N. A. (1995) A compilation of composite regulatory elements affecting gene transcription in vertebrates. Nucleic Acids Res., 23, 20: 4097-4103

78. Kumpatla S. P., Teng W., Buchholz W. C., Hall Т. C. (1997) Epigenetic transcriptional silencing and 5-Azacytidine-mediated reactivation of a complex transgene in Rice. Plant Physiology, 115: 361-373

79. Koch К. E. (1996) Carbohydrate-modulated gene expression in plants. Annu. Res. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 47: 509-540

80. Mouras A, Wildenstein C, Salesse G. (1986) Analysis of karyotype and C-banding pattern of Nicotiana plumbaginifolia using two techniques. Genetica, 68: 197-202

81. Martin T, Hellmann H, Schmidt R, Willmitzer L, Frommer W.B. (1997) Identification of mutants in metabolically regulated gene expression. The Plant Journal, 11: 53-62

82. Mignery G. A, Pikaard C. S, Park W. D. (1988) Molecular characterisation of the patatin multigene family on potato. Gene, 62:27-41

83. Mignery G. A, Pikaard C. S, Hannapel D. J, Park W. D. (1984) Isolation and sequence analysis of cDNAs for the major potato tuber protein, patatin. Nucleic Acids Research, 12,21: 7987-8000

84. McElroy D, Chamberlain D. A, Moon E, Wilson K. J. (1995) Development of gusA reporter gene constructs for cereal transformation: availability of plant transformation vectors from the cambia molecular genetic resource service. Molecular Breeding, 1:27-37

85. Muller-Rober В., Kopmann J., Hannah L. C., Willmitzer L. (1990) One of two different ADP-glucose pyrophosphorylase genes from potato responds strongly to elevated levels of sucrose. Mol. Gen. Genet., 224: 136-146

86. Meyer P., Niedenhof I., ten Lohuis M. (1994) Evidence for cytosine methylation of non-symmetrical sequences in transgenic Petunia hybrida. EMBO J., 13: 20842088

87. Makarevitch I., Svitashev S. K., Somers D.A. (2003) Complete sequence analysis of transgene loci from plants transformed via microprojectile bombardment. Plant Molecular Biology, 52: 421-432

88. Mansoor S, Amin I, Hussain M, Zafar Y, Briddon R. W. (2006) Engineering novel traits in plants through RNA interference. Trends Plant Sci., 11, 11: 559-565.

89. Nikolov D. В., Burley S. K. (1997) RNA polymerase II transcription initiation: a structural view. Proc Natl Acad Sci USA. 94,1:15-22

90. Nakamura K., Ohto M.-A., Yoshida N., Nakamura K. (1991) Sucrose-induced accumulation of (3-amylase occurs concomitant with the accumulation of starch and sporamin in leaf-petiole cuttings of sweet potato. Plant Physiol., 96:902-909

91. Oakes J. V., Shewmaker С. K., Stalker D. M. (1991) Production of cyclodextrins, a novel carbohydrate, in the tubers of transgenic potato plants. Biotechnology, 9: 982-986

92. Osborne Т. В., Campbell G.F. (1896) The proteides of the potato. Journal of the American Chemical Society, 18: 575-582

93. Perl A., Aviv D., Willmitzer L., Galun E. (1991) In vitro tuberization in transgenic potatoes harbouring (^-glucuronidase linked to a patatin promoter: effects of sucrose levels and photoperiods. Plant Science, 73: 87-95

94. Pikaard C. S., Brusca J., Hannapel D.J., Park W. D. (1987) The two classes of genes for the major potato tuber protein, patatin, are differentially expressed in tubers and roots. Nucleic Acids Research, 15: 1979-1994

95. Pikaard С. S., Mignery G. A., Ma D. P., Stark V. J., Park W. D. (1986) Sequence of two apparent pseudogenes of the major potato tuber protein, patatin. Nucleic Acids Research, 14,13: 5564-5566

96. Park W. D., Hannapel D. J., Mignery G. A., Pikaard C. S. (1985) Molecular approaches to the study of the major tuber proteins. In: Potato Physiology, ch.8: 261-277

97. Park W.D. (1990) Molecular approaches to tuberization in potato. The molecular and cellular biology of the potato, chapter 4, Vayda M. E., Park W. D. (Eds). Melksam (UK): C.A.B. Int. Redwood Press: 43-56

98. Paiva E., Lister R. M., Park W. D. (1983) Induction and accumulation of major tuber proteins of potato stems and petioles. Plant Physiology, 71: 161-168

99. Pots A. M., Harmen H. J., Jongh D., Gruppen H., Hamer R. J., Voragen A. G. J. (1998) Heat-induced conformational changes of patatin, the major potato tuber protein. Eur. J. Biochem., 252: 66-72

100. Pots A. M., Gruppen H., Hessing M., van Boekel M. A., Voragen A. G. J. (1999) Isolation and characterization of patatin isoforms. J Agric Food Chem., 47, 11: 4587-4592

101. Patikoglou G. A., Kim J. L., Sun L., Yang S. H., Kodadek Т., Burley S. K. (1999) TATA element recognition by the TATA box-binding protein has been conserved throughout evolution. Genes Dev., 13,24: 3217-3230

102. Racusen D., Foote M. (1980) A major soluble glycoprotein of potato tubers. Journal of Food Biochemistry, 4: 43-52

103. Rocha-Sosa M., Sonnewald U., Frommer W., Stratmann M., Schell J., Willmitzer L. (1989) Both developmental and metabolic signals activate the promoter of a class I patatin gene. The EMBO Journal, 8: 23-29

104. Romanov G.A., Kieber J.J., Schmulling T. (2002) A rapid cytokinin response assay in Arabidopsis indicates a role for phospholipase D in cytokinin signaling. FEBS Letters, 515: 39-43

105. Rosahl R., Schell J., Willmitzer L. (1987) Expression of a tuber-specific storage protein in transgenic tobacco plants: demonstration of an esterase activity. The EMBO Journal, 6, 5:1155-1159

106. Rolland F., Baena-Gonzalez E., Sheen J. (2006) Sugar sensing and signaling in plants: conserved and novel mechanisms. Annu. Rev. Plant Biol., 57:675-709.

107. Rook F, Gerrits N, Kortstee A, van Kampen M, Borrias M, et al. (1998). Sucrose-specific signalling represses translation of the Arabidopsis ATB2 bZIP transcription factor gene. Plant J., 15:253-63

108. Rasco-Gaunt S., Barcelo P. (1999) Immature inflorescence culture of cereals. A highly responsive system for regeneration and transformation. Methods Mol. Biol., 111:71-81

109. Sambrook J., Russell D. W. (2000) Molecular cloning. 3-d edition. CSHL Press. Cold Spring Harbor, New York

110. Strickland J. A., Orr G. L., Walsh T. A. (1995) Inhibition of Diabrotica larval growth by patatin, the lipid acyl hydrolase from potato tubers. Plant Physiol., 109: 667-674

111. Soni R., Murray J.A.H. (1994) Isolation of intact DNA and RNA from plant tissues. Anal. Biochemistry, 218:474-476

112. Smeekens S. (2000) Sugar-induced signal transduction in plants. Plant Mol.Biol., 51:49-81

113. Shewry P. R. (2003) Tuber storage proteins. Annals of Botany, 91: 755-769

114. Song D. G., Zhou J., Huang D. Q., Ma H., Situ J. F., Wang G. Q., Wang X. M. (2001) 1.4 kb 5' flanking region of class I patatin directs tuber-specific gus expression in potato (Solanum tuberosum L). Shi Yan Sheng Wu Xue Bao., 34, 1: 5-10

115. Stupar R. M., Beaubien K. A., Jin W., Song J., Lee M.-K., Wu C., Zhang H.-B., Han В., Jiang J. (2006) Structural diversity and differential transcription of the patatin multicopy gene family during potato tuber development. Genetics, 172: 1263-1275

116. Stegemann H., Francksen H., Macko V. (1973) Potato proteins: genetic and physiological changes, evaluated by one- and two-dimensional PAA-gel-techniques. Z Naturforsch, 28: 722-732

117. Schell J. St. (1987) Transgenic plants as tools to study the molecular organization of plant genes. Science, 237:1176-1181

118. Stiekema W. J., Keidekamp F., Dirske W. G., van Beckum J., de Haan P., ten Bosch C., Louwerse J. D. (1988) Molecular cloning and analysis of four potato tuber mRNAs. Plant Mol. Biol., 11: 255-269

119. Sonnewald U., Studer D., Rocha-Sosa M., Willmitzer L. (1989a) Immunocytochemical localization of patatin, the major glycoprotein in potato (Solarium tuberosum L.) tubers. Planta, 178:176-183

120. Sonnewald U., Sturm A., Chrispeels M. J., Willmitzer L. (1989b) Targeting and glycosylation of patatin, the major tuber protein in leaves of transgenic tobacco. Planta, 179: 171-180

121. Senda K., Yoshioka H., Doke N., Kawakita K. (1996) A cytosolic phospholipase A2 from potato tissues appears to be patatin. Plant Cell Physiol., 37, 3:347-353

122. Swartzberg D., Dai N., Gan S., Amasino R. Granot D. (2006) Effects of cytokinin production under two SAG promoters on senescence and development of tomato plants. Plant Biol., 8: 579-586

123. Sheen J. (1994) Feedback-control of gene-expression. Photosynth. Res., 39: 42738

124. Twell D., Ooms G. (1988) Structural diversity of the patatin gene family in potato cv. Desiree. Mol.Gen.Genet., 212,2: 325-336

125. Vancanneyt G., Sonnewald U., Hofgen R., Willmitzer L. (1989) Expression of a patatin-like protein in the anthers of potato and sweet pepper flowers. Plant Cell, 1, 5: 533-540

126. Vreugdenhil D., Sergeeva L. I. (1999) Gibberellins and tuberization in potatoes. Potato Res., 42: 192-201

127. Vazquez-Ortiz G., Pina-Sanchez P., Salcedo M. (2006) Great potential of small RNAs: RNA interference and microRNA. Rev. Invest Clin., 58,4: 335-349

128. Visser R.G.F., Stolte A., Jacobsen E. (1991) Expression of a chimaeric granule-bound starch synthase-GUS gene in transgenic potato plants. Plant Mol.Biol., 17: 691-699

129. Wenzler H., Migneiy G., Fisher L., Park W. (1989) Sucrose-regulated expression of a chimeric potato tuber gene in leaves of transgenic tobacco plants. Plant Mol.Biol., 13, 4: 347-354

130. Wray G. A. (2003) Transcriptional regulation and the evolution of development. Int. J. Dev. Biol., 47, 7-8: 675-684

131. Ye G.-N., Stone D., Pang S.-Z., Creely W., Gonzalez K., Hinchee M. (1999) Arabidopsis ovule is the target for Agrobacterium in planta vacuum infiltration transformation. The Plant Journal, 19: 249-257

132. Zourelidou M., Zabala M. D. Т., Smith C., Bevan M. (2002) Storekeeper defines a new class of plant-spesific DNA-binding proteins and is a putative regulator of patatin expression. The Plant Journal, 30:489-497

133. Выражаю признательность проф. Hanjo Hellmann г. Берлин (Германия) за предоставленные семена трансгенного арабидопсиса и высказанные замечания.