Термостабильная лихеназа Clostridium thermocellum для фундаментальных и прикладных исследований тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.03, кандидат биологических наук Комахин, Роман Александрович

• Комахин, Роман Александрович
• кандидат биологических наук
• 2005

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Комахин, Роман Александрович

ГЛАВА 1. ТЕРМОСТАБИЛЬНАЯ ЛИХЕНАЗА Clostridium thermocellum КАК ПРЕДСТАВИТЕЛЬ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ГЛИКОЗИЛГИДРОЛАЗ:

СВОЙСТВА И СТРУКТУРА.

ГЛАВА 2. ГЛИКОЗИЛГИДРОЛАЗЫ В ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПРИКЛАДНЫХ ИССЛЕДОВАНИЯХ.

2.1. Современные направления белковой инженерии: рациональный дизайн и направленная эволюция ферментов и белков.

2.2. Изучение молекулярных основ термостабильности и фолдинга белков с использованием ферментов термофильных организмов.

2.3. Термостабильные гликозилгидролазы в прикладных исследованиях.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Термостабильная лихеназа Clostridium thermocellum для фундаментальных и прикладных исследований»

Впервые термофильная анаэробная бактерия Clostridium thermocellum была описана Viljoen в 1926 году [МсВЕЕ, 1954]. С. thermocellum секретирует белки, объединяющиеся в высокомолекулярные мультиферментные комплексы, структура которых способствует быстрому гидролизу кристаллической целлюлозы.

Изучением ферментов целлюлолитического комплекса С. thermocellum занимаются во многих странах мира: В Израиле в Вейцмановском институте и в Биотехнологическом центре Тель-Авивского Университета, во Франции в Институте им. Пастера, в Германии в Институте Микробиологии Мюнхенского технологического университета, в Англии в Институте животноводства (Кембридж). В России эти работы были начаты в начале 80-х годов под руководством профессора Э.С. Пирузян со штаммом Ф7 С. thermocellum и далее продолжены в лаборатории молекулярной генетики анаэробов в Институте молекулярной генетики РАН и в лаборатории функциональной геномики Института общей генетики РАН [Пирузян и др., 1985; Пирузян и др., 1990; Bumazkin В.К. et al., 1990; Tuka et al., 1992; Голденкова, 2002].

Актуальность темы диссертационной работы. В последние годы уделяется много внимания использованию термостабильных ферментов, особенно гликозилгидролаз, в биотехнологии. Помимо этого, гликозилгидролазы термофильных бактерий являются удобными моделями и для изучения многих фундаментальных проблем: молекулярных основ термостабильности, укладки (фолдинга) белковых молекул, функциональных элементов каталитических и некаталитических модулей ферментов и ряда других. Ранее в нашей лаборатории был клонирован ген, кодирующий термостабильную 0-1,3; 1,4-глюканазу (лихеназу) С. thermocellum, и было показано, что ген термостабильной лихеназы является удобным репортерным геном для клеток про- и эукариотических организмов. Ген термостабильной лихеназы транзиентно и стабильно экспрессируется в клетках бактерий, цианобактерий, дрожжей, растений и млекопитающих с образованием активного и термостабильного фермента, а уровень экспрессии бактериального гена лихеназы зависит от регуляторного элемента, контролирующего его экспрессию. Активность термостабильной лихеназы может быть определена простыми, быстрыми, чувствительными качественными и количественными методами, которые не требуют дорогостоящего оборудования и реактивов.

Области использования термостабильной лихеназы для фундаментальных и прикладных исследований могут быть расширены, поскольку она обладает уникальными свойствами - высокой удельной активностью и термостабильностью. Поэтому изучение структуры и свойств термостабильной лихеназы, модификация ее последовательности, а также конструирование на ее основе гибридных белков и белков-носителей являются перспективными направлениями исследований.

Цель исследования: изучить возможности использования гена термостабильной лихеназы в качестве транскрипционного, трансляционного репортера и репортерного белка-носителя случайных или антигенных пептидов. Исходя из цели работы, были поставлены следующие задачи:

Изучить возможность использования гена термостабильной лихеназы в качестве транскрипционного репортера для изучения функциональной значимости некодирующих последовательностей геномов, для этого:

- разработать дрожжевую векторную конструкцию, содержащую два противоположно ориентированных репортерных гена (термостабильной лихеназы и p-глюкуронидазы) и некодирующую последовательность генома человека (LTR HERV-K);

- изучить экспрессию репортерных генов, находящихся под контролем LTR HERV-K, в клетках низших эукариот - дрожжах Saccharomyces cerevisiae. Изучить возможность использования термостабильной лихеназы в качестве трансляционного репортерного белка для клеток про- и эукариот, для этого:

- сконструировать гибридные гены, в которых последовательность гена лихеназы слита в рамки считывания с последовательностями бактериальных генов сгуЪг. и сгуЪъМ Bacillus thuringiensis, а также гесА и гесРЛ E.coli;

- провести сравнительный анализ экспрессии нативных и гибридных генов в клетках про- и эукариот.

Изучить возможность использования термостабильной лихеназы в качестве репортерного белка-носителя случайных и антигенных пептидов, для этого:

- провести анализ трехмерной структуры термостабильной лихеназы и выбрать в молекуле лихеназы петлевые участки, которые могли бы использоваться для интеграции последовательностей пептидов;

- провести молекулярный дизайн последовательности гена термостабильной лихеназы, на основе которого сконструировать модифицированные варианты фермента, у которых в области петлевых участков добавлен линкер, и «циклически перестановленные» варианты, у которых С- и N-концевые области нативного фермента соединены линкером, а новые С- и N-концевые участки сформированы в петлевых участках; провести сравнительный анализ биохимических свойств модифицированных и «циклически перестановленных» вариантов лихеназы; сконструировать гибридные гены, в которых последовательность, кодирующая случайный пептид (EGFP), встроена в последовательности модифицированных и «циклически перестановленных» вариантов лихеназы как внутренний гетерологичный модуль фермента; провести сравнительный анализ биохимических свойств гибридных белков.

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Комахин, Роман Александрович

выводы

1. Термостабильная лихеназа успешно использована как транскрипционный репортер в составе оригинальной дрожжевой векторной системы для изучения регуляторных функций некодирующих последовательностей генома эукариот.

2. Сравнительный анализ экспрессии сконструированных гибридных генов, в которых последовательность гена лихеназы слита в рамки считывания с последовательностями бактериальных генов сгуЗа и сгуЪгМ В. thuringiensis, а также reck и recA\ E.coli, показал, что термостабильная лихеназа может быть использована в качестве трансляционного репортерного белка, поскольку в составе гибридных белков как лихеназа, так и слитые с ней белки (Cry За и RecA) сохраняют свои свойства, и присутствие лихеназы в составе гибридных белков облегчает анализ их экспрессии в трансгенных организмах.

3. Делеционный вариант термостабильной лихеназы (LicBM3) сохраняет основные биохимические свойства нативного фермента (температурный и рН оптимумы, стабильность, активность).

4. Сравнительный биохимический анализ основных свойств четырех модифицированных и четырех «циклически перестановленных» вариантов лихеназы позволил установить, что область в районе 53 а.о. в большей степени важна для термостабильности и в меньшей степени для активности фермента, область в районе 99 а.о. в большей степени важна для активности, чем термостабильности лихеназы, область в районе 141 а.о. является критической как для проявления активности, так и для термостабильности фермента, а область в районе 106 а.о. (^-структура) необходима для активности фермента.

5. Показано, что два модифицированных и два «циклически перестановленных» варианта лихеназы могут выдерживать значительные внутренние достройки с сохранением основных свойств фермента: активности и термостабильности. На основании этих свойств термостабильная лихеназа предлагается в качестве удобного репортерного белка-носителя для случайных и антигенных пептидов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, представленные результаты исследований позволяют заключить, что лихеназа может использоваться как в фундаментальных исследованиях, в качестве транскрипционного и трансляционного репортера, так в прикладных исследованиях, в качестве репортерного белка-носителя для случайных и антигенных пептидов.

Для изучения регуляторных функций некодирующих последовательностей разработана оригинальная дрожжевая векторная система, которая содержит два противоположно ориентированных репортерных гена. Эта система обладает рядом преимуществ, поскольку позволяет одновременно получить ответ на ряд вопросов о регуляторных функциях изучаемой последовательности, а именно, определить, обладает ли она промоторной активностью, сравнимы ли уровни промоторной активности в зависимости от ориентации последовательности к репортерным генам, способна ли управлять экспрессией двух репортеров одновременно. Помимо этого, разработанная нами векторная система позволяет получать данные о регуляторных функциях некодирующих последовательностей с использованием простых, быстрых, чувствительных качественных и количественных методов, которые не требуют дорогостоящего оборудования и реактивов, а также значительных временных затрат исследователя.

Полученные результаты по изучению экспрессии гибридных генов, содержащих репортерный ген термостабильной лихеназы, позволяют заключить, что присутствие лихеназы в составе гибридных белков облегчает анализ их экспрессии в трансгенных организмах. Метод энзимограмм позволяет точно определять молекулярные массы гибридных белков, в состав которых входит лихеназа. Следует отметить высокую чувствительность этого метода: он позволяет выявить активность лихеназы в гибридных белках при использовании образцов с суммарным содержанием белка от 300 до 600 нг, по сравнению с методом Вестерн-блоттинга, для которого необходимо использовать от 5 до 20 мкг суммарного белка и специфические антитела к исследуемому белку. Метод энзимограмм предлагается вместо Вестерн-блоттинга при использовании лихеназы в качестве трансляционного репортерного белка.

Термостабильная лихеназа может использоваться как репортерный белок-носитель, поскольку выдерживает значительные внутренние достройки с сохранением основных свойств фермента: активности и термостабильности.

По активности фермента можно судить о его сохранности. Достаточный уровень термостабильности может быть использован для очистки рекомбинантных белков.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Комахин, Роман Александрович, 2005 год

1. Голденкова И.В. (2002) Репортерные системы: возможности для изучения различных аспектов регуляции экспрессии генов.// Успехи современной биологии.- Т. 122(6).- С.515-526.

2. Голденкова И.В. (2002а) Новые репортерные систему для изучения регуляции экспрессии генов// Дисс. док. биол. наук. ИОГен РАН. Москва.

3. Голденкова И.В., Мусийчук К.А., Пирузян Э.С. (2003) Бифункциональные репортерные гены: конструирование и экспрессия в клетка про- и эукариотП Молекулярная биология.- Т.37(2).- С. 1-9.

4. Евстратова В.В., Калиев А.Б., Андрианов В.М., Пирузян Э.С. (1988) Использование векторных плазмид Agrobacterium для переноса в растения генов делта-эндотоксина из Bacillus thuringiensis Н Вестник с.х. науки.-Т.384.- С.71-77.

5. Зверлов В.В. (1993) Изучение структуры гена лихеназы Clostridium thermocellum Ф7 и характеристика продукта данного гена.// Дисс. канд. биол. наук. ИМГ РАН, Москва.

6. Мусийчук К.А., И.В.Голденкова., P.M. Абдеев, Н.С. Кобец, Пирузян Э.С. (2000) Получение и свойства делеционных вариантов лихеназы Clostridium thermocellum и создание на их основе бифункциональных гибридных белков.// Биохимия.- Т.65(12).- С.1659-1665.

7. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Д. (1984) Молекулярное клонирование, М., Мир.

8. Патрушев Л.И. Экспрессия генов (2000) М.: Наука. 527с.

9. Ю.Патрушев Л.И. Искусственные генетические системы (2004) М.: Наука.

10. Пирузян Э.С., Могутов М.А., Великодворская Г.А., Акименко В.К. (1985)

11. Клонирование и экспрессия структурного гена целлюлазы се17целлюлолитического комплекса Clostridium thermocellum в клетках Escherichia coli.il Докл. АН СССР.- Р.963-965.

12. Пирузян Э.С., Могутов М.А Великодворская Г.А., Зверлов В.В., Лаптев Д.А., Метт В.Л. (1990) Клонирование и некоторые свойства гена lihl, кодирующего новую эндоглюканазу Clostridium thermocellum Ф1Н Биотехнология.- N4.- С. 18-19.

13. Попов Е.М. Структура и функция белка. (2000) Т.4. М.: Наука.,

14. Салехи Джузани Г.Р., Комахин Р.А., Пирузян Э.С. (2005) Сравнительный анализ экспрессии нативного и модифицированного генов сгуЪг. Bacillus thuringiensis в прокариотических и эукариотических клетках.// Генетика. Т.41(2). С.171-177.

15. П.Свердлов Е.Д. (1999) Ретровирусные регуляторы экспрессии генов в геноме человека как возможные факторы его эволюции.// Биоорг. химия.-Т.25(11).- С.821-827.

16. Янике Р. (1998) Что можно узнать о стабилизации ультрастабильных глобулярных белков.//Биохомия.- Т.63,- С.370-380.

17. Aguilar C.F., Sanderson I., Moracci M. (1998) Crystal structure of the |3-glycosidase from the hyperthermophilic Archaeon Sulfolobus solfataricus: resilience as a key factor in thermostability// J. Mol. Biol.- V.271.- P.789-802.

18. Alam J., Cook J.L. (1990) Reporter genes: application to the study of mammalian gene transcription// Analytical Biochemestry.- VI88.- P.245-254.

19. Atassi M.Z., Lee C.L. (1978) The precise and entire antigenic structure of native lysozyme.// Biocheem. J.-V.171.- P.429.

20. Atassi M.Z., Saplin B.J. (1968) Immunochemistiy of sperm whale myoglobin: I. The specific interaction of some tiyptic peptides and of peptides containing all the reactive regions of the antigen.// Biochemistry- V.7.-P.688.

21. Atassi M.Z., Singhal R.P. (1970) Immunochemistry of sperm whole myoglobin: 8. Specific interaction of peptides obtained by cleavage at proline peptide bonds// Biochemistry- V.9.-P.3854.

22. Ay J., GO F., Borriss R., Heinemann U. (1998) Structure and function of the Bacillus hybrid enzyme GluXyn-l:Native-like jellyroll fold preserved after insertion of autonomous globular domain// Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- V.95.-P.6613-6618.

23. Bamberger A.M., Erdmann I., Bamberger C.M., Jenatschke S.S., Schulte H.M. (1997) Transcriptional regulation of the human 'leukemia inhibitory factor' gene: modulation by glucocorticoids and estradiol.// Mol Cell Endocrinol.-V.127(l).- P.71-79.

24. Bayer E.A., Chanzy H.R., Lamed R., Shoham Y. (1998) Cellulose, Cellulases and Cellulosome.// Current Opinion in Structural Biology.- V.8.- P.548-557.

25. McBEE R.H. (1954) The characteristics of Clostridium thermocellum./I J Bacteriol.- V.67(4).- P.505-506.

26. Bradford M.M. (1976) A rapid sensitive method for the action of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding// Anal Biochem.- V.72.- P.248-254.

27. Вгактапп E.S., Johnsson K. Directed evolution of proteins, or how to improve enzymes for biocatalysis. (2002) N. Y.: Wiley.

28. Brandes C., Plautz J.D., Stanewsky R., Jamison C.F., Straume M., Wood K.V., Kay S.A., Hall J.C. (1996) Novel features of drosophila period transcription revealed by real-time luciferase reporting.// Neuron.-VЛ 6(4).- P.687-692.

29. Brauner-Osborne H., Brann M.R. (1996) Pharmacology of muscarinic acetylcholine receptor subtypes (ml-m5): high throughput assays in mammalian cells.// Eur J Pharmacol.- V.295(l).- P.93-102.

30. Bryant F.R. (1988) Construction of a recombinase-deficient mutant recA protein that retains single-stranded DNA-dependent ATPase activity.// J Biol Chem.- V.263(18).- P.8716-8723.

31. Brejc K.A., Sixma Т.К., Kitts P.A., Kain S.R., Tsein R.Y., Ormo M., Remington S.J. (1997) Structural basis for dual excidation and photoisomerization of the Aequorea victoria green fluorescent protein.// Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- V.94.- P.2306-2311.

32. Bumazkin B.K., Velikodvorskaya G.A., Тика K., Mogutov M.A., Strongin A.Ya. (1990) Cloning of Clostridium thermocellum endoglucanase genes in Escherichia coli.ll Biochem Biophys Res Commun.AI. 167(3).- P. 1057-1064.

33. Burton J., Wood S.G., Pedyczak A. and Siemion I.Z. (1989) Conformation Preferences of Sequential Fragments of the Hinge Region of Human IgAl Immunoglobulin Molecule. II.// Biophis. Chem.- V.33.- P.39-45.

34. Bushuev V.N., Gudkov A.T., Liljas A. and Sepetov N.F. (1989) The Flexible Region of Protein L12 from Bacterial Ribosome Studied by Nuclear Magnetic Resonance.// J. Biol. Chem.- V.264.- P.4498-4505.

35. Chalfie M., Tu Y., Euskirchen G., Ward W.W., Prasher D.C. (1994) Green fluorescent protein as a marker for gene expression.// Science.- V.263(5148).-P.802-805.

36. Cody C.W., Prasher D.C., Westler W.M., Prendergast F.G., Ward W.W. (1993) Chemical structure of the hexapeptide chromophore of the Aequorea green-fluorescent protein.//-S/oc/jem/sfrj.- V.32.- P.1212-1218.

37. Crabb D.W., Dixon J.E. (1987) A method for increasing the sensitivity of chloramphenicol acetyltransferase assays in extracts of transfected cultured cells Л Anal. Biochem.- V.163(l).- P.88-92.

38. Craig F.F, Simmonds A.C., Watmore D., McCapra F., White M.R.H. (1991) Membrane permeable luciferin esters for assay of firefly luciferase in living eels.// Biochem. J.- V.276.- P.637-641.

39. Cubitt A.B., Heim R., Adams S.R., Boyd A.E., Gross L.A., Tsien R.Y. (1995) Understanding, improving and using green fluorescent proteins.// Trends Biochem. Sci.- V.20.- P.448-455.

40. Davies J.M. (2000) Introdaction: Epitope Mimicry as a Component of Autoimmune Disease// Cellular and Molecular Life Sciences- V.57.- P.523-526.

41. Domansky A.N., Kopantzev E.P., Snezhkov E.V., Lebedev Y.B., Leib-Mosch C., Sverdlov E.D. (2000) Solitary HERV К LTRs possess bi-directional promoter activity and contain a negative regulatory element in the U5 region.// FEBSLetters.- V.472.- P.191-195.

42. Endebrecht J., Silverman M. (1984) Identification of genes and gene products necessary for bacterial bioluminescence.// Proc. Natl. Acad. Sci. USA.-V.81(13).- P.4154-4158.

43. Eastman E.M., Durland R.H. (1998) Manufacturing and quality control of plasmid-based gene expression systems.// Adv Drug Deliv Rev.- V.30(13).-P.33-48.

44. Farris A.D., Keech C.L., Gordon T.P., McGluskey J. (2000) Epitope Mimics and Determinant Spreading: Pathways to Autoimmunity// Cellular and Molecular Life Sciences- V.57.- P.569-578.

45. Ferrari S., Moro E., Pettenazzo A., Behr J.P., Zacchello F., Scarpa M. (1997) ExGen 500 is an efficient vector for gene delivery to lung epithelial cells in vitro and in vivo.// Gene Ther.- V.4(10).- P. 1100-1106.

46. Ferreira L.M.A., Durrant A.J., Hall J., Hazlewood G.P. and Gilbert H.J. (1990) Spatial Separation of Protein Domains is not Necessary for Catalyc Activity or Substrate Binding in a XylanaseJI Biochem. J.- V.269.- P.261-264.

47. Fodor S.P., Read J.L., Pirrung M.C., Stryer L., Lu A.T., Solas D. (1991) Light-Directed, Spatially Adressable Parallel Chemical Synthesis// Science- V.251 .-P.767.

48. Fradkov A.F., Chen Y., Ding L., Barsova E.V., Matz M.V., Lukyanov S.A. (2000) Novel fluorescent protein from Discosoma coral and its mutants possesses aunique far-red fluorescence.// FEBS Lett-V.479(3).- P.127-130.

49. Frank R. (1992) SPOT Synthesis: an Easy Technique for the Positionally Addressable, Parallel Chemical Synthesis on a Membrane Support// Tetrahedron-V A&.~ P.9217.

50. Geysen H.M., Tainer J.A., Rodda S.J., Mason T.J, Alexander H., Getzoff E.D., Lerner R.A. (1987) Chemistry of Antibody Biding to a Protein// Science-V.235.- P.1184.

51. Geysen H.M., Rodda S.J., Mason T.J, Tainer J.A., Alexander H., Getzoff E.D., Lerner R.A. (1988) Antigenesity of Myohemeiythrin// Science-V.238.- P.1584.

52. Gordon T. (2000) Multipin Peptide Libraries for Antiboby and Receptor Epitope Screening and Characterization// J. Immunol. Methods- V.267.- 27-35.

53. Gorman C. (1985) DNA cloning II-A Practical Approach (Glover D.M., Ed.): 143-190.

54. Gurskaya N.G., Savitsky A.P., Yanushevich Y.G., Lukyanov S.A., Lukyanov K.A. (2001) Color transitions in coral's fluorescent proteins by site-directed mutagenesis.// BMCBiochem.- V.2(l).- P.6.

55. Le Grice S.F., Matzura H. (1980) Localisation of the transcription initiation site of the chloramphenicol resistance gene on plasmid pAC184.// FEBS Lett.-V.l 13(1).- P.42-46.

56. Guivarc'h A., Caissard J.C., Azmi A., Elmayan Т., Chriqui D., Tepfer M. (1996) In situ detection of expression of the gus reporter gene in transgenic plants: Ten years of blue genes.// Transgenic Research.- V.5.- P.281-288.

57. Hahn M., Pons J., Planas A., Querol E., Heinemarin U. (1995) Crystal Structure of Bacillus lichenoformis l,3;l,4-p-D-Glucan-4-Glucanohydrolase at 1.8 A Resolution.// FEBS Lett- V.374(2).- P.221-224.

58. Hahn M., Piotukh K., Borriss R., Heinemann U. (1994) Native-like in vivo folding of a circularly permuted jellyroll protein shown by crystal structure analysis.// Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- V.91.- P. 10417-10421.

59. Hough D.W., Danson M.J. (1999) Extremozymes// Curr. Opin. Chem. Biol.-V.3.-P.39-46.

60. Houghten R.A., Pinilla C., Blondelle S.E., Appel J.R., Dooley C.T., Cuervo J.H. (1991) Generation and Use of Synthetic Peptide Combinatorial Libraries for Basic Research and Drug Discovery// Nature- V.357.- P.84.

61. Hughes J.F., Coffin J.M. (2001) Evidence for genomic rearrangements mediated by human endogenous retroviruses during primate evolution.// Nature Genetics. V.9.- P.487-489.

62. Hughes J.F., Coffin J.M. (2002) A Novel Endogenous Retrovirus-Related Element in the Human Genome Resembles a DNA Transposon: Evidence for Evolutionary Link?// Genomics,.- V.80.- P.453-455.

63. Jacobson R.H., Zhang X.J., DuBose R.F., Matthews B.W. (1994) Three-dimensional structure of beta-galactosidase from E. coli.ll Nature.- V.369.-P.761-766.

64. Jefferson R.A. (1989) The GUS reporter gene system.// Nature.- V.342(6251).-P.837-838.

65. Jefferson R.A. (1987) Assaying chimeric genes in plants: the GUS gene fusion system.// The Plant Molecular Biology Reporter.- V.4(4).- P.387-405.

66. Jefferson R.A., Bevan M., Kavanagh T. (1987a) The use of the Escherichia coli beta-glucuronidase as a gene fusion marker for studies of gene expression in higher plants.// Biochem Soc Trans.-V Л5(\).- P.17-18.

67. Jefferson R.A., Burgess S.M., Hirsh D. (1986) p-glucoronidase from Escherichia coli as a gene-fusion marker.// Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- V.83.-P.8551-8557.

68. Jefferson R.A., Kavanagh T.A. and Bevan M.W. (19876) GUS fusions: beta-glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants.// EMBOJ.- V.6(13).- P.3901-3907.

69. Jensen L.G., Olsen О., Kops О., Wolf N., Thomsen K.K., von Wettstein D. (1996) Transgenic barley expressing a protein-engineered, thermostable (1,3-l,4)-beta-glucanase during germination.// Proc Natl Acad Sci USA.- V.93(8).-P.3487-3491.

70. Joshi M.D., Sidhu G., Pot I., Brayer G.D., Withers S.G. and Mcintosh L.P. (2000) Hydrogen Bonding and Catalysis: A Novel Explanation for How a Single Amino Acid Substitution Can Change the pH Optimum of a Glycosidase//./ Mol. Biol- V.299.- P.255-279.

71. Kapitonov V.V., Jurka J. (1999) The long terminal repeat of an endogenous retrovirus induces alternative splicing and encodes an additional carboxy-terminal sequence in the human leptin receptor.// J Mol. Evol.- V.48.- P.248-251.

72. LaemmIi U.K. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.// Nature. V.227.-P.680-685.

73. Lam K.S., Salmon S.E., Hersh E.M., Hruby V.J., Kazmierski W.M., Knapp R.J. (1991) A New Type of Syntetic Peptide Library for Identifing Ligand-Binding Activity// Nature-V .354.- P.82.

74. Lane D.P., Stephen C.W., Midgley C.A., Sparks A., Hupp T.A., Danieks D.A., Greaves R., Reid A., Vojtesek В., Piccksley S.M. (1996) Epitope Analysis of the Murine p53 Tumor Suppressor Protein// Oncogene- V. 12.- P.2461.

75. Li-Chu Tsai, Lie-Fen Shyur, Shu-Hua Lee, Su-Shiang Lin and Hanna S. Yuan (2003) Crystal Structure of a Natural Circularly Permuted Jellyroll Protein: 1,3-1,4-b-D-GIucanase from Fibrobacter succinogeneslt J. Mol. Biol.- V.330.-P.607-620.

76. Loi L., Barton P.A., Fincher G.B. (1987) Survival of Barley (1-3,1-4)-beta-Glucanase Isoenzymes during Kilning and Mashing.// J. Cereal Sci.- V.5.-P.45-50.

77. Luzi P., Victoria Т., Rafi M.A., Wenger D.A. (1997) Analysis of the 5' flanking region of the human galactocerebrosidase (GALC) gene.// Biochem Mol Med.-V.62(2).- PI59-164.t 84.Maeji N.G., Bray A.M., Geysen H.M. (1990) Multipin Peptide Syntesis

78. Strategy for T-Cell Determinant Analysis/Л/. Immunol. Methods- V.134.- P.23.

79. Manen D., Pougeon M., Damay P., Geiselmann J. (1997) A sensitive reporter gene system using bacterial luciferase based on a series of plasmid cloning vectors compatible with derivatives of pBR322.// Gene.- V.186(2).- P.197-200.

80. Matz M.V., Fradkov A.F., Labas Y.A., Savitsky A.P., Zaraisky A.G., Markelov M.L., Lukyanov S.A. (1999) Fluorescent proteins from nonbioluminescent

81. Anthozoa species.//Nat Biotechnol.-V. 17(10).- P.969-973.

82. Misteli Т., Spector D.L. (1997) Applications of the green fluorescent protein in <- cell biology and biotechnology.// Nat Biotechnol- V.15(10).- P.961-964.

83. Pazzagli M., Devine J.H., Peterson D.O., Baldwin Т.О. (1992) Use of bacterial and firefly luciferases as reporter genes in DEAE-dextran-mediated transfection of mammalian cells Л Anal Biochem.- V.204(2).- P.315-323.

84. Perlak F.J., Deaton R.W., Armstrong T.A., Fuchs R.L., Sims S.R., Greenplate J.T., Fischhoff D.A. (1990) Insect resistant cotton plants.// Biotechnology.-V.8(10).- P.939-943.

85. Petsko G.A. (2000) Enzyme evolution: Design by necessity// NatureV.403.-P.606-607.

86. Piruzian E.S., Monzavi-Karbassi В., Darbinian N.S., Goldenkova I.V., Kobets N.S., Mochulsky A.V. (1998) The use of a thermostable p-glucanase gene from Clostridium thermocellum as a reporter gene in plants.// Mol Gen. Genet.-V.257.- P.561-567.

87. Planas A. (2000) Bacterial 1,3-1,4-L-glucanases: structure, function and protein engineering// Biochimica et Biophysica Acta V.1543.- P.361-382.

88. Reiss В., Klemm M., Kosak H., Schell J. (1996) RecA protein stimulates homologous recombination in plants // Proc Natl Acad Sci USA.- V.93(7).-P.3094-3098.

89. Rodda S.J. (1996) T-cell Epitope Mapping with Synthetic Peptides and Peripheral Blood Mononuclear Cells. In: Morris, G.E. (Ed.), Epitope Mapping Protocols.// Mehtods Mol. Biol.-V.66(3Q).- P.363. Humana Press, Totowa, NJ.

90. Rossi F., Charlton C.A., Blau H.M. (1997). Monitoring protein-protein interactions in intact eukaryotic cells by P-galactosidase complementation.// Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- V.94.- P.8405-8410.

91. Russel R.J.M., Gerike U., Danson M.J. (1998) Structural adaptations of the cold-active citrate synthase from an Antartic bacterium// Structure.- V.6.-P.351-361.

92. Rutter G.A., Kennedy H.J., Wood C.D., White M.R.H., Tavare J.M. (1998) Real-time imaging of gene expression in single cells.// Chemistry & Biology.- V.5.- P.285-290.

93. Rutter G.A., White M.R., Tavare J.M. (1995) Involvement of MAP kinase in insulin signalling revealed by non-invasive imaging of luciferase gene expression in single living cells.// Curr Biol.- V.5(8).- P.890-899.

94. Sambrook J., Fritch E.F., Maniatis T. (1989) Molecular cloning A laboratory manual. 2nd Edition. Cold Spring Harbour Lab. Press. N.Y.

95. Scott J.K., Smith G.P. (1990) Searching for Peptide Ligands with an Epitope Library// Science- V.249.- P.386.

96. Sheehan J., Himmel M. (1999) Enzymes, Energy, and the Environment: a Strategic Perspective on the U.S. Department of Energy's Research and Development Activities for Bioethanol.// Biotechnol. Prog.- V.l 5.- P.817-827.

97. Sniezko I., Dobson-Stone C., Klein A. (1998) The trek gene of Bacillus subtilis is a suitable reporter gene for the archaeon Methanococcus voltae.ll FEMSMicrobiol. Lett.- V.164.- P.237-242.

98. Solon D.N., Voigt C.A., Mayot S.L. (2002) De novo design of biocatalysts// Curr. Opin. Chem. Biol.- V.6.- PI25-129.

99. Strathdee C.A., McLeod M.R., Underhill T.M. (2000) Dominant positive and negative selection using luciferase, green fluorescent protein and 0-galactosidase reporter gene fusions.// BioTechniques.- V.28.- P.210-214.

100. Sugimoto J., Nobuo M., Kinjo Y., Takasu N., Oda Т., Jinno Y. (2001) Transcriptionally Active HERV К Genes: Identification, Isolation and Chromosomal Mapping.// Genomics.- V.72.- P.137-144.

101. Sverdlov E.D. (2000) Retroviruses and primate evolution.// BioEssays.-V.22.- P.161-171.

102. Tauriainen S., Virta M., Chang W., Karp M. (1999) Measurement of firefly luciferase reporter gene activity from cells and lysates using Escherichia coli arsenite and mercury sensors.// Anal. Biochem.- V.272.- P.191-198.

103. Terskikh A.V., Fradkov A.F., Zaraisky A.G., Kajava A.V., Angres B. (2002) Analysis of DsRed Mutants. Space around the fluorophore accelerates fluorescence development.// J Biol Chem.- V.277(10).- P.7633-7636.

104. Tissier A.F., Marillonnet S., Klimyuk V., Patel K., Torres M.A., Murphy G., Jones J.D. (1999) Multiple independent defective suppressor-mutator transposon insertions in Arabidopsis: a tool for functional genomics. Plant Cell., 11(10): 1841-1852.

105. Topell S., Henneckel J., Glockshuber R. (1999) Circularly permuted variants of the green fluorescent proteinI/ FEBS Letters.- V.457.- P.283-289.

106. Triantafyllou В., Tribbick G., Maeji N.J., Geysen H.M. (1992) Use of the Multipin Peptide Syntesis Tecchnique for the Generation of Antipeptide Sera// Cell Biophys.- V.21.- P.33.

107. Van de Burg В., Vriend G., Veltman O.R. (1998) Engieneering an enzyme to resist boiling/I Proc. Nat. Acad. Sci. USA- V.95.- P.2056-2060.

108. Vanniasinkam Т., Barton M.D., Heuzenroeder M.W. (2001) B-cell Epitope Mapping of the VapA Protein of Rhodococcus equi: Implications for Early Detection of R. equi Desiase in Foals// J. Clin. Microbiol V.39.-P.1633.

109. Verkhusha V.V, Lukyanov, K.A. (2004) The molecular properties and applications of Anthozoa fluoreczent proteins and chromoproteins// Nature Biotechnol.- V.22.- P.289-296.

110. Watson A., Mazumder A., Stewart M., Balasubramanian S. (1998) Technology for microarray analysis of gene expression. Current Opinion in Biotechnology.- V.9.- P.609-614.

111. White A., Rose D.R. (1997) Mechanism of catalysis by retaining p-glycosyl hydrolases.// Current Opinion in Structural Biology.- V.7(5).- P.645-651.

112. White K.A., Skuzeski J.M., Li W., Wei N. Morris T.J. (1995) Immunodetection, expression strategy and complementation of turnip crinkle virus p28 and p88 replication components.// Virology. V.211(2).- P.525-534.

113. White W.B., Bird H.R., Sunde M.L., Marlett J.A. (1983) Viscosity of beta-D-Glucan as a Factor in the Enzymatic Improvement of Barley for Chicks.// Poult. Sci.- V.62.- P.853-862.

114. Wildt S., Deuschle U. (1999) cobA, a red fluorescent transcriptional reporter for Escherichia coli, yeast and mammalian cells.// Nature Biotechnology.- V.17.- P.l 175-1178.

115. Wiznerowicz M., Fong A.Z., Mackiewicz A., Hawley R.G. (1997) Double-copy bicistronic retroviral vector platform for gene therapy and tissue engineering: application to melanoma vaccine development.// Gene Ther V.4(10).- P.1061-1068.

116. Wood T.M., Bhat K.M. (1988) Methods for measuring cellulase activities.// Methods Enzymology. V.160.- P.87-112.

117. Yip K.S.P., Britton K.L., Stillman T.J. (1998) Insights into the molecular basis of thermal stability from the analisis of ion-pair networks in the glutamate dehydrogenase familyИ Eur op. J. Biochem.-V.255.- P.336-346.