Исследование реакций трансгликозилирования, катализируемых гликозидгидролазами экзо- и эндодействия тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.04, кандидат биологических наук Шишлянников, Сергей Михайлович

• Шишлянников, Сергей Михайлович
• кандидат биологических наук
• 2007

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Шишлянников, Сергей Михайлович

Список сокращений.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ГЛИКОЗИДГИДРОЛАЗЫ

1.1 Классификация гликозидгидролаз.

1.2 Каталитический механизм гликозидгидролаз.

1.3 Трансгликозилирование.

1.4. (З-О-Галактозидаза.

1.5. Ламинариназа и 16 семейство гликозидгидролаз.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1 Ферменты.

2.2 Физико-химические методы.

2.3 Субстраты.

2.4 Измерение ферментативных активностей.

2.5 Кинетические параметры изучаемых гликозидгидролаз.

2.6 Исследования трансгликозилирующей активности изучаемых гликозидгидролаз.

2.7. Характеристика структур продуктов трансгликозилирования методом ЯМР.

2.8. Характеристика структуры продуктов трансгликозилирования методом масс-спектрометрии.

2.9. Метод определения показателей сродства позиций связывания активного центра ламинариназы из R. marinus.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1 Физико-химические характеристики использованных в работе ферментов.

3.2. Исследование гидролитической активности P-D-галактозидазы из Penicillium sp.

3.3. Исследование трансгликозилирующей активности p-D-галактозиды из Penicillium sp. в реакциях с использованием AcetylG al

MethylG al.

3.3. Структура продуктов реакции трансгликозилирования с участием в качестве субстратов AcetylG al и MethylG al.

3.5. Эндо-гликозидгидролазы в ферментативном синтезе модифицированных (З-глюкоолигосахаридов.

3.5. Использование модифицированных (3-1,3-глюколигосахаридов для измерения активности и картирования активного центра ламинариназы из Rhodothermus marinus.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Исследование реакций трансгликозилирования, катализируемых гликозидгидролазами экзо- и эндодействия»

Актуальность проблемы

Углеводы - биомолекулы, стоящие в одном ряду по биологической значимости вместе с белками, липидами и нуклеиновыми кислотами. В последние несколько лет показано, что олигосахариды выполняют не только роль энергетического источника и структурной компоненты клетки, но обладают и другими ключевыми биологическими функциями (P. Sears, (1999)). Присутствие углеводных единиц в различных биологических структурах влияет на их физические, химические и биологические свойства. Широкое разнообразие углеводных компонент в гликопротеинах отражает их функциональное многообразие. Например, в качестве маркеров в межклеточном взаимодействии О- и N-гликозилированные лектины обуславливают вирулентность от микроорганизмов (Sharon, N.; Lis, Н. Essays Biochem. (1995)); играют важную роль в воспалительных процессах (Lasky, L. А. (1995); Weis, W. I.; Drickamer, К. (1996) и в иммунных ответах (Varki, А. (1993); Rudd, Р. М.; Elliot, et al. (2001)). К тому же так называемое «правильное» гликозилирование белков имеет важное значение в процессе их экспрессии и укладки (Helenius, А. (1994); Trombetta, Е. S.; Helenius, А. (1998); Helenius, A.; Aebi, М. (2001)), а также увеличивает их термо- и протеолетическую стабильности (Opdenakker, G.; Rudd, P. М. et al. (1993)). Существенна роль гликоконьюгатов и в медицине. Например, глюкозилирование и галактозилирование гелдамицина улучшает его антираковую активность (Cheng Н, Cao X, et al. (2005)).

Большинство биологически важных гликоконьюгатов (олигосахариды, гликопротеины и гликолипиды) и их производные трудно получить в больших количествах из природных источников. Синтез различных олигосахаридов и углеводных компонент гликоконьюгатов может быть выполнен химически или ферментативно. Химические методы синтеза предполагают использование реакций блокирования и деблокирования реакционно-способных групп, что приводит к трудоемким и дорогостоящим многостадийном процессам (К. Igarashi (1977)). В результате, синтез олигосахаридов с длиной цепи более 3 гликозидных остатков является экономически невыгодным. Альтернативным решением этой проблемы остается ферментативный синтез с использованием ферментов, способных катализировать перенос гликозильных групп (Singh, S.; Scigelova, М. et al. (1996)). Такой способностью обладают две группы ферментов: гликозилтрансферазы (К.Ф 2.4.Х.) и гликозидгидролазы (К.Ф. З.2.1.Х.), обладающие трансгликозилирующей активностью

In vivo гликозидтрансферазы осуществляют образование гликозидной связи с высокой региоселективностью. Однако существенным недостатком гликозидтрансфераз является их относительно низкая стабильность и необходимость в использовании in vitro в большом количестве дорогих кофакторов (например, уридин дифосфат).

В отличие от гликозидтрасфераз, гликозидгидролазы, относящиеся к классу гидролаз, катализируют образование олигосахаридов с абсолютной стереоспецифичностью без применения кофакторов. К тому же, они продуцируются микроорганизмами в больших количествах, термостабильны и устойчивы в широких диапазонах рН, что важно для их использования в производственных целях. На сегодняшний день описано более сотни различных гликозидгидролаз, способных не только катализировать расщепление гликозидных связей, но также осуществлять перенос гликозильного остатка на другую молекулу (реакция трансгликозилирования). Выделяемые из широкого круга микроорганизмов и растений, они успешно применяются в ферментативном синтезе новых биологически активных веществ (V. Kren and L. Martmkova, (2001); Kathryn

М. Koeller and Chi-Huey Wong, (1999)). Основными недостатками использования большинства ранее полученных траснгликозидаз является их относительно низкая региоселективность и низкий выход продуктов реакции трансгликозилирования. Таким образом, перед исследователями стоит задача выделения гликозидгидролаз с трансгликозилирующей активностью для использования их в реакциях ферментативного синтеза с целью получения строго определенных стереоизомеров с высокой региоселективностью и высоким выходом продуктов реакции. Для этого используются различные приемы. Во-первых, проводят поиск и выделение новых гликозидгидролаз из природных источников, обладающих высокой трансгликозилирующей способностью. Во-вторых, увеличение выхода продуктов реакций трансгликозилирования можно достичь подбором и синтезом новых субстратов, используемых в качестве доноров реакций ферментативного синтеза, катализируемых гликозидгидролазами. В представленной работе, на примере трех гликозидгидролаз ((3-галактозидаза из Penicillium sp., ламинариназа из Oerskovia sp., ламинариназа Spisula sachalinensis), обладающих трансгликозилирующей активностью, продемонстрированы различные стратегии получения олигосахиродов с высокой региоселективностью и высоким выходом. Полученные данные о способности ферментов к проведению трансгликозилирующей реакции и строении их активных центров дают возможность не только эффективно использовать гликозидгидролазы в энзиматическом синтезе, но и получать новую информацию о механизме действия гликозидгидролаз в целом. Цели и задачи исследования

Целью данной работы является исследование реакций трансгликозилирования, катализируемых гликозидгидролазами экзо- и эндодействия, для дальнейшего их использования в синтезе олигосахаридов Исходя из цели работы, были поставлены следующие задачи: 1. Выделить и очистить до гомогенного состояния следующие гликозидгидролазы, обладающие трансглкозилирующей активностью: (З-галактозидазу из Penicillium sp. (фермент экзо-действия) и (3-1.3-глюканазу (ламинариназу) из Oerskovia sp. и |3-1.3-глюканазу из Spisula sachalinensis (ферменты эндо-действия).

2. Исследовать трансгликозилирующие активности изучаемых Р-галактозидазы и р-1.3-глюканаз и идентифицировать спектр продуктов реакций трансгликозилирования методами ЯМР и масс-спектрометрии.

3. Изучить влияние синтетических субстратов, в том числе, 1-0-ацетил-Р-Э-галактопиранозида на выход продуктов реакций трансгликозилирования, катализируемых Р-галактозидазой из Penicillium sp.

4. Использовать реакцию трансгликозилирования, катализируемую ламинариназами, для получения новых флуорофорных и хромофорных субстратов, необходимых для изучения кинетических параметров эндо-глюканаз, в частности, ламинариназы из Rhodothermus marinus.

Научная новизна полученных результатов

В настоящей работе впервые установлено, что Р-галактозидаза из Penicillium sp. является - ферментом, сохраняющим конфигурацию аномерного центра в результате реакции гидролиза субстрата, и обладает трансгликозилирующей активностью. Показано, что впервые синтезированное соединение 1-0-ацетил-р-галактопиранозид является субстратом для реакций гидролиза и трансгликозилирования, катализируемых р-галактозидазой, более эффективным по сравнению с другими субстратами.

Впервые разработаны схемы ферментативного синтеза с использованием ламинариназ бактериального и животного происхождения и получены новые субстраты для ламинариназ, а именно, шра-нитрофенил- и 4-метилумбеллиферил-Р-1,3-глюкоолигосахариды со степенью полимеризации от 2 до 6. Структуры продуктов реакций трансгликозилирования были установлены методами 'Н и |3С ЯМР спектроскопии и масс-спектрометрического анализа. Впервые на основе кинетического анализа гидролиза новых (3-1,3-глюкоолигосахаридов с различной степенью полимеризации обнаружены четыре позиции связывания в гликоновой части активного центра ламинариназы из R. marinus.

Теоретическое и практическое значение работы.

Подробное исследование реакций трансгликозилирования, катализируемых экзо- и эндогликозидгидролазами имеет большое значение для решения как фундаментальных, так и прикладных задач, так как дает возможность эффективно использовать эти ферменты в синтезе различных гликоконьюгатов, а также получать новую информацию о механизме действия гликозидгидролаз экзо- и эндодействия в целом. Основные положения, выносимые на защиту.

1. Новое соединение, 1-О-ацетил-р-О-галактопиранозид, является субстратом для P-D-галактозидазы из Penicillium sp. Использование 1-0-ацетил-(3-0-галактопиранозида в реакции трансгликозилирования позволяет увеличить выход продуктов реакции ферментативного синтеза.

2. Для препаративного ферментативного синтеза PNP и MU-Р-1,3-глюкоолигосахаридов со степенью полимеризации от 2 до 6 целесообразно использовать ламинариназы из Oerskovia sp. и из S. sachalinensis.

3. Впервые полученные PNP- и М/-Р-1,3-глюкоолигосахариды с различной степенью полимеризации эффективны для изучения механизма действия эндо-глюканаз, что показано на примере исследования ламинариназы из R. marinus.

Апробация работы.

Материалы работы были представлены на следующих семинарах и конференциях:

• 2-й Немецко-польско-российский Симпозиум по бактериальным углеводам (Москва, сентябрь 10-12, 2002).

• Политехнический симпозиум «Молодые ученые промышленности Северо-западного региона». (Санкт-Петербург, январь 2005).

• Четвертый Московский международный конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, март 2007 г.).

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Шишлянников, Сергей Михайлович

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате проведенного исследования были изучены гликозидгидролазы экзо- и эндодействия различного биологического происхождения, обладающие трансгликозилирующей активностью. Разработаны эффективные схемы синтеза биологически значимых углеводных структур с помощью Р-галактозидазы из Penicillium sp., ламинариназ из Oerskovia sp. и из Spisula sachalinensis. Это позволяет существенно раздвинуть рамки использования ферментативного синтеза в различных областях фармакологии и биотехнологии и исключить вредные и экологически опасные технологические процессы.

На основании выполненного исследования могут быть сделаны следующие выводы:

1. р-Галактозидаза из Penicillium sp. гидролизует новое соединение, 1 -О-ацетил-(3-0-галактопиранозид, с сохранением конфигурации аномерного центра.

2. Выход продуктов реакции трансгликозилирования при использовании 1-0-ацетил-(3-О-галактопиранозида увеличивается до 25% по сравнению с использованием других субстратов. Основным продуктом реакции является D-Gal-p-( 1,6)-D-Gal-P-^cefv/.

3. Продуктами реакции трансгликозилирования ламинариназ из Oerskovia sp. и S. sachalinensis с использованием в качестве субстратов природных Рглюканов, а в качестве акцепторов PNP- и MU-p-глюкопиранозидов, являются линейные р1,3-глюкоолигосахариды со степенью полимеризации

97 от 2 до 6, модифицированные соответствующей хромофорной или флуоресцентной меткой.

4. Полученные модифицированные глюкоолигосахариды являются эффективными субстратами для измерения глюканазной активности, что показано на примере исследования механизма реакции, катализируемой ламинариназой из Rhodothermus marinus

5. Анализ значений каталитической эффективности гидролиза модифицированных р1,3-глюкоолигосахаридов со степенью полимеризации от 2 до 6 предполагает наличие четырех позиций связывания в гликоновой части активного центра ламинариназы из Rhodothermus marinus.

Список опубликованных работ по теме

1. Zinin, A.V., Shabalin, К.A., Kulminskaya, A.A., Shishlyannikov, S.M., Neustroev, K.N. (2002) 1-O-Acetyl-beta-D-galactopyranose: A novel substrate for the transglycosylation reaction catalyzed by the beta-galactosidase from Penicillium sp. Carbohydr. Res. 337(7): 635-642.

2. M. Arand, A.M. Golubev, J.R. Brandao Neto, I. Polikarpov, R. Wattiez, O.S. Korneeva, E.V. Eneyskaya, A.A. Kulminskaya, K.A. Shabalin, S.M. Shishliannikov, O.V. Chepurnaya and K.N. Neustroev (2002) Purification, characterisation, gene cloning, and preliminary X-ray data of the exo-inulinase from Aspergillus awamori, Biochem J. 362(1): 131-135.

3. Borriss, R., Krah, M., Brumer III, H., Kerzhner, M.A., Elyakova, L.A., Ivanen, D.R., Eneyskaya, E.V., Shishlyannikov, S.M., Shabalin, K.A., and Neustroev, K.N. (2003)Enzymatic synthesis of 4-methylumbelliferyl (l->3)-beta-D-glucooligosaccharides-new substrates for beta-l,3-l,4-D-glucanase.Car£o/2ydr Res. Jul 4;338(14):1455-67

4. Шишлянников C.M., Неустроев K.H. Трансгликозилирующая активность гликозидгидролаз. Политехнический симпозиум «Молодые ученые промышленности Северо-западного региона» стр. 42 (2005)

5. К. N. Neustroev, A.M. Golubev, М. L. Sinnott, R. Borriss, M. Krah, H. Brumer III, E. V. Eneyskaya, S.Shishlyannikov, K.A. Shabalin, V. T. Peshechonov, V. G. Korolev, A. A. Kulminskaya. Transferase and Hydrolytic Activity of the (3-l,3(4)-Glucanase from Rhodothermus marinus and its mutant forms. Glycoconj. journal v.23. p 499-509 (2006).

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Шишлянников, Сергей Михайлович, 2007 год

1. P. Sears, С. Н. Wong, 1998. Enzyme action in glycoprotein synthesis. Cell. Mol. Life Sci. 54:223.

2. Sharon, N.; Lis, H. 1995. Lectins-proteins with a sweet tooth: functions in cell recognition. Essays Biochem. 3: 59

3. Lasky, L. A. 1995. Selectin-carbohydrate interactions and the initiation of the inflammatory response, Annu. Rev. Biochem 64: 113.

4. Weis, W. I.; Drickamer, K. 1996. Structural basis of lectin-carbohydrate recognition, Annu. Rev. Biochem. 65: 441.

5. A. Varki, 1993. Biological roles of oligosaccharides: all of the theories are correct. Glycobiology 3: 97.

6. Rudd P. M., T. Elliott, P. Cress well, I. A. Wilson, R. A. Dwek. 2001. Glycosylation and the immune system. Science. 291: 2370-2376.

7. Helenius, A.How 1994. N-linked oligosaccharides affect glycoprotein folding in the endoplasmic reticulum. Mol. Biol Cell, 5: 253.

8. Trombetta, E. S.; Helenius, A. 1998. Lectins as chaperones in glycoprotein folding Curr. Opin. Struct. Biol, 8: 587.

9. Helenius, A.; Aebi, M. 2001. Intracellular Functions of N-Linked Glycans, Science, 29: 2364.

10. Opdenakker, G.; Rudd, P. M.; Ponting, C. P.; Dwek, R. A. 1993. Concepts and principles of glycobiology FASEBJ., 7: 1330.

11. Cheng H, Cao X, Xian M, Fang L, Cai ТВ, Ji JJ, Tunac JB, Sun D, Wang PG., 2005. Synthesis and enzyme-specific activation of carbohydrate-geldanamycin conjugates with potent anticancer activity. J Med Chem:,48(2): 645-52.

12. K. Igarashi, 1977. The Koenigs-Knorr reaction. Adv. Carbohydr. Chem. Biochem 34: 243.

13. Kathryn M. Koeller and Chi-Huey Wong. 1999. Synthesis of Biologically Active Glycopeptides, J. Chin. Chem. Soc., 46 (5): 659-686.

14. V. Kren and L. Martfnkova. 2001. Glycosides in Medicine: "The Role of Glycosidic Residue in Biological Activity", Current Medicinal Chemistry, 8: 1313-1338.

15. G. Reuter and H.-J. Gabius. 1999. Eukaryotic glycosylation: whim of nature or multipurpose tool?. Cell. Mol. Life Sci. 55: 368-422.

16. Voragen, A.G.J, and Pilnik, W. 1989. ACS Symposium Series 389, Eds. Whitaker, J.R. and Sonnet, Ph. E.: 93-115.

17. Hidaka, H., Eida, Т., Hashimoto, K., and Nakazawa, T. 1987. Eur. Patent, 0,133,547.

18. Davies GJ, Wilson KS, Henrissat B. 1997. Nomenclature for sugar-bindingsubsites in glycosyl hydrolases. Biochem J. 321 ( Pt 2): 557-9.

19. Henrissat, В. 1991. A classification of glycosyl hydrolases based on amino acid sequence similariries. Biochem. J. 280: 309-316.

20. Henrissat B, Callebaut I, Fabrega S, Lehn P, Mornon J-P & Davies G 1995. Conserved catalytic machinery and the prediction of a common fold for several families of glycosyl hydrolases. Proc Natl Acad Sci USA 92: 7090-7094.

21. Henrissat В & Davies G 1997. Structural and sequence-based classification of glycoside hydrolases. Curr Opin Struct Biol 7: 637-644.

22. Henrissat В & Davies G. 2000. Glycoside hydrolases and glycosyltransferases. Families, modules, and implications for genomics. Plant Physiol 124: 1515-1519.

23. Bourne Y & Henrissat B. 2001. Glycoside hydrolases and glycosyltransferases: families and functional modules. Curr Opin Struct Biol 11 : 593-600.

24. Henrissat В & Romeu A. 1995. Families, superfamilies and subfamilies of glycosyl hydrolases. Biochem J. 311: 350-351.

25. Henrissat В & Davies G. 2000. Glycoside hydrolases and glycosyltransferases. Families, modules, and implications for genomics. Plant Physiol 124: 1515-1519.

26. Gebler J, Gilkes NR, Claeyssens M, Wilson DB, Beguin P, Wakarchuk WW, Kilburn DG, Miller RC Jr, Warren RA, Withers SG. 1992. Stereoselective hydrolysis catalyzed by related beta-l,4-glucanases and beta-l,4-xylanases. J Biol Chem. 267(18): 12559-61.

27. Henrissat В, Bairoch A. 1996. Updating the sequence-based classification of glycosyl hydrolases. Biochem J. 316: 695-6.

28. Davies G, Henrissat B. 1995. Structures and mechanisms of glycosyl hydrolases. Structure. 3(9): 853-9.

29. Henrissat B, Davies G. 1997. Structural and sequence-based classification of glycoside hydrolases. Curr Opin Struct Biol. 7(5): 637-44.

30. Wolfenden R., Lu X., and Young G., 1998. Spontaneous hydrolysis of glycosides. J. Am. Soc. 120: 7532-7533.

31. Koshland, D.E. 1953. Stereochemistry and the mechanism of enzymatic reactions E.Biol.Rev., 28: 416.

32. Sinnott, M.S. 1990. Stereochemistry and the mechanisms of enzymatic glycosyl transfer. Chem. rev., 90: 1171-1202.

33. C.B. Post, M.Karplus. 1986. Does lysozyme follow the lysozyme pathway? An alternative based on dynamic, structural and stereoelectronic considerations. J.Am.Chem.Soc. 108: 1317.

34. Markovic-Housley Z, Miglierini G, Soldatova L, Rizkallah PJ, Muller U, Schirmer T. 2000. Crystal structure of hyaluronidase, a major allergen of bee venom., Structure. 8(10): 1025-35.

35. Watts AG, Damager I, Amaya ML, Buschiazzo A, Alzari P, Frasch AC, Withers SG. 2003. Trypanosoma cruzi trans-sialidase operates through a covalent sialyl-enzyme intermediate: tyrosine is the catalytic nucleophile, J Am Chem Soc. 125 (25): 7532-3.

36. McCarter J.D., and S.G. Withers. 1994. Mechnism of enzymatic glycoside hydrolysis. Curr. Opin. Struct. Biol. 4: 885-892.

37. Withers S.G. 2001. Mechanism of glycosyltransferase and hydrolase. Carbohydr. Poly. 44: 325-337.

38. Usui T, Kubota S, Ohi H. 1993. A convenient synthesis of beta-D-galactosyl disaccharide derivatives using the beta-D-galactosidase from Bacillus circulans. Carbohydr Res. 244(2):315-23.

39. Zeng X, Yoshino R, Murata T, Ajisaka K, Usui T. 2000. Regioselective synthesis of p-nitrophenyl glycosides of beta-D-galactopyranosyl-disaccharides by transglycosylation with beta-D-galactosidases. Carbohydr Res. 325(2): 120-31.

40. Нага К, Fujita К, Kuwahara N, Tanimoto T, Hashimoto H, Koizumi К, Kitahata S., 1994. Galactosylation of cyclodextrins and branched cyclodextrins by alpha-galactosidases. Biosci Biotechnol Biochem. 58(4): 652-9.

41. Fujimoto, H., Nishida, H., and Ajisaka, K. 1988. Agric. Biol. Chem. 52: 1345-1351

42. Nikolov, Z. L., Meagher, M. M., and Reilly, P. J. 1989. Biotechnol. Bioeng. 34, 694-704.

43. P.J.Halling. 1994. Thermodynamic predictions for biocatalysis in nonconventional media: Theory, tests, and recommendations for experimental design and analysis Enzyme Microb. Technol. 16: 178.

44. Oikawa T, Tsukagawa Y, Chino M, Soda K. 2001. Increased transglycosylation activity of Rhodotorula glutinis endo-beta-glucanase in media containing organic solvent, Biosci Biotechnol Biochem.65(8): 1889-92.

45. S.W.M. Kengen, E.J. Luesink, A.J.M. Stams, A.J.B. Zehn- der. 1993. Eur. J. Biochem. 213:305.

46. Eun-Su Ji, Nyun-Ho Park and Deok-Kun Oh. 2005. Galacto-oligosaccharide production by a thermostable recombinant b-galactosidase from Thermotoga maritima, World Journal of Microbiology & Biotechnology 21:759-764.

47. Spencer J. Williams, Stephen G. Withers. 2000. Glycosyl fluorides in enzymatic reactions, Carbohydr. Res. 327: 27-46.

48. C. Andre, P. Spangenberg, E. Gentil and C. Rabiller. 2001. Study by means of in situ 19F NMR of the enzymatic transglycosylation reactions using 1-fluoro-a-glycosides as donors and acceptor Tetrahedron, Asymmetry, 12: 779.

49. S. Komba and Y. Ito. 2001. Tetrahedron Lett., 42: 8501.

50. P. Spangenberg, C. Andre, V. Langlois, M. Dion and C. Rabiller. 2002. Alpha-galactosyl fluoride in transfer reactions mediated by the green coffee beans alpha-galactosidase in ice. Carbohydr. Res., 337: 221.

51. Mariko Miyasato and Katsumi Ajisaka. 2004. Regioselectivity in |3-Galacosidase-catalyzed Transglycosylation for the Enzymatic Assembly of D-galactosyl-D-mannose. Biosci. Biotechnol. Biochem., 68: 2086-2090.

52. Xiaoxiong Zeng, Rika Yoshino, Takeomi Murata, Katsumi Ajisaka, Taichi Usui. 2000. Regioselective synthesis of p-nitrophenyl glycosides of p-D-galactopyranosyl-disaccharides by transglycosylation with b-D-galactosidases. Carbohyd. Res. 325: 120-131.

53. L.F. Mackenzie, Q.P. Wang, R.A.J. Warren, S.G. Withers. 1998 J. Am. Chem. Soc. 120: 5583-5584.

54. Kim YW, Lee SS, Warren RA, Withers SG. 2004. Directed evolution of a glycosynthase from Agrobacterium sp. increases its catalytic activity dramatically and expands its substrate repertoire. J Biol Chem. 279(41): 42787-93.

55. Fujimoto H, Miyasato M, Ito Y, Sasaki T, Ajisaka K. 1998. Purification and properties of recombinant beta-galactosidase from Bacillus circulans. Glycoconj J. 15(2): 155-60.

56. Mozdziak, Paul E; Pophal, Simone; Borwornpinyo, Suparerk; Petitte, James 2003. Transgenic chickens expressing beta.-galactosidase hydrolyze lactose in the intestine 1. Journal of Nutrition, 133: 3076.

57. Frost RG, Holmes EW, Norden AG, O'Brien JS. 1978. Characterization of purified human liver acid beta-D-galactosidases A2 and A3 .Biochem J. 175(1): 181-8.

58. Chinchetru MA, Cabezas J A, Calvo P. 1983. Characterization and kinetics of beta-D-gluco/fuco/galactosidase from sheep liver. Comp Biochem Physiol B. 75(4):719-28.

59. C. Scheckermann, F. Wagner. 1997. Galactosylation of antibiotics using the b-galactosidase from Aspergillus oryzae, L. Fischer Enzyme and Microbial Technology, 20 (8): 629-634.

60. R.E. Mouton, M.E. Venable. 2000. Ceramide induces expression of the senescence histochemical marker, b-galactosidase, in human fibroblasts. Mechanisms of Ageing and Development, 113:169-181.

61. Hartz PA, Wilson PD. 1997. Functional defects in lysosomal enzymes in autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD): abnormalities in synthesis, molecular processing, polarity, and secretion, Biochem Mol Med. 60(l):8-2.

62. F. Morgan, D. Molle, G. Henry, J. Leonil, Y. Le Graet, S.S. Bouhallab. 1999. Resistance of b-lactoglobulin-bound lactose to the hydrolysis by b-galactosidase, International Dairy Journal, 11:813-816.

63. Vetere A, Paoletti S. 1998. Separation and characterization of three beta-galactosidases from Bacillus circulans. Biochim Biophys Acta. 1380(2):223-31.

64. Ogawa T, Kitajima T, Nukada T. 1983. Synthesis of a nonahexosyl unit of a complex type of glycan chain of a glycoprotein. Carbohydr. Res. 123(1): C8-1.

65. Nilsson, K. G. I. 1987. Carbohydr. Res., 167: 95-103.

66. Hedbys L, Johansson E, Mosbach K, Larsson PO, Gunnarsson A, Svensson

67. S, Lonn H. 1989. Synthesis of Gal beta l-3GlcNAc and Gal beta l-3GlcNAc beta

68. SEt by an enzymatic method comprising the sequential use of beta-galactosidasesfrom bovine testes and Escherichia coli., Glycoconj J.;6(2): 161-8.108

69. Cantacuzene D, Attal S, Bay S. 1991. Synthesis of alpha and beta-glycopyranosyl-serine derivatives by enzymic transglycosylation, Biomed BiochimActa. 50(10-11): S231-6.

70. Bay, S.; Namane, A.; Cantacuzene, D. 1993. Carbohydr. Res., 248: 317-325

71. Maeda M, Nisizawa K. 1968. Laminaran of Ishige okamurai. Carbohydr. Res. 7: 94-97.

72. Usui T, Toriyama T, Mizuno T. 1979. Structural investigation of laminaran of Eisenia bicyclis. Agric Biol Chem 43: 603-611.

73. Elyakova LA, Zvyagintseva TN. 1974. A study of the laminarins of some Far-Eastern, brown seaweeds. Carbohydr. Res. 34: 241-248.

74. Rouhier P, Kopp M, Begot V, Bruneteau M, Fritig B. 1995. Structural features of fungal beta-D-glucans for the efficient inhibition of the initiation of virus infection on Nicotiana tabacum., PhytochemisrteyL 39(1): 57-62.

75. Sasaki T, Takasuka N, Chihara G, Maeda YY. 1976. Antitumor activity of degraded products of lentinan: its correlation with molecular weight, Gann. 67(2):191-5.

76. Reagents for immunology. \99§.Nature. 346: 591.

77. Lepagnol-Descamps V, Richard С, Lahaye M, Potin P, Yvin JC, Kloareg B. 1998. Purification and determination of the action pattern of Haliotis tuberculata laminarinase, Carbohedr. Res;310(4):283-9.

78. Barbeyron T, Gerard A, Potin P, Henrissat B, Kloareg B. 1998. The kappa-carrageenase of the marine bacterium Cytophaga drobachiensis. Structural and phylogenetic relationships within family-16 glycoside hydrolases., Mol Biol Evol. 15(5):528-37.

79. Hoj PB, Fincher GB. 1995. Molecular evolution of plant beta-glucan endohydrolases, Plant J. 7(3):367-79.

80. S.H Shen, P. Chretien, L. Bastian, and S.N. Slilaty. 1991. Primary sequence of the glucanase gene from Oerskovia xanthineolytica, J. Mol. Biol., 266: 10581063.

81. Michel C, Chantalat L, Duee E, Barbeyron T, Henrissat B, Kloareg B, Dideberg O. 2001. The (3-carrageenanase of P. carrageenovora features a tunnel-shaped active site: a novel insight in the evolution of clan В glycoside hydrolases, Structure 9:513-525.

82. Allouch J, Jam M, Helbert W, Barbeyron T, Kloareg B, Henrissat B, Czjzek M. 2003. The three-dimensional structures of two (3-agarases, J. Biol. Chem., 278: 47171-47180.

83. Planas A. 2000.Bacterial l,3-l,4-f3-glucanases: structure, function and protein engineering, Biochim. Biophys. Acta, 1543:361-382.

84. Gueguen, Y., Voorhorst, W. G. В., van der Oost, J. & de Vos, W. 1997. Molecular and biochemical characterization of an endo-/?-l,3-glucanase of the hyperthermophilic archaeon Pyrococcus furiosus, J. Biol Chem. 272: 3125831264.

85. Т. Маниатис, Э. Фрич, Дж. Сэмбрук. Молекулярное клонирование. Мир. 1984, стр. 240-241.

86. Laemmli UK., 1970. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227(5259):680-5.

87. Lowry, O.H; Rosenbrough, N.J.; Farr, A.L.; Randall, R.J. 1951. Protein measurement with the Folin phenol reagent, J. Biol Chem. 193: 265-275.

88. Somogyi, M. 1952. Notes on sugar determination. J Biol Chem. 195:19-23.

89. Lloyd, J. В.; Whelan, W. J. 1969. An improved method for enzymic determination of glucose in the presence of maltose, Anal Biochem. 30: 467-470.

90. Dixon, M., 1953. The determination of enzyme inhibitor constants, Biochem. J., 55:170-171.1.l

91. Hiromi, K., Ohnishi, M., and Tanaka, A. 1983. Subsite structure and ligand binding mechanism of glucoamylase. Mol. Cell. Biochem. 51: 79-95.

92. Nagy Z, Kiss T, Szentirmai A, Biro S. 2001. Beta-galactosidase of Penicillium chrysogenum: production, purification, and characterization of the enzyme Protein Expr Purif. 21(1): 24-9.

93. Gebler, J.; Gilkes, N. R.; Claeyssens, M.; Wilson, D. В.; Beguin, P.; Wakarchuk, W. W.; Kilburn, D. G.; Miller, R. C., Jr.; Warren, R. A. J.; Withers, S. G. 1992. J. Biol. Chem. 267: 12559-12561.

94. Brumer, H. Ill; Sims, P. F. G.; Sinnott, M. L. 1999. Lignocellulose degradation by Phanerochaete chrysosporium: purification and characterization of the main alpha-galactosidase. Biochem. J. 339: 43-53.

95. Abel, M.; Planas, A.; Christensen, U. 2001. Biochem. J., 357:195-202.

96. Savel'ev, A. N.; Ibatullin, F. M.; Eneyskaya, E. V. Kachurin, A. M.;

97. Neutroev, K. N. 1996.Carbohydr. Res. 296: 261-273.

98. Konstantinidis, A.; Sinnott, L. 1991. The interaction of 1-fluoro-D-glucopyranosyl fluoride with glucosidases. Biochem. J. 279:587-593.

99. Williams, S. J.; Withers, S. G. 2000. Glycosyl fluorides in enzymatic reactions. Carbohydr. Res., 327: 27-46.

100. Spangenberg, P.; Andre, C.; Dion, M.; Rabiller, C.; Mattes, R. 2000. Comparative study of new alpha-galactosidases in transglycosylation reactions. Carbohydr. Res. 329:65-73.

101. Nilsson, K. G. 1987. A simple strategy for changing the regioselectivity of glycosidase-catalysed formation of disaccharides. Carbohydr. Res. 167: 95-103.

102. Van Laere, К. M. J.; Hartemink, R.; Beldman, G.; Pitson, S.; Dijkema, C.; Schols, H. A.; Voragen, A. G. 1999. Transglycosidase activity of Bifidobacterium adolescentis DSM 20083 alpha-galactosidase. Appl. Microbiol. Biotechnol, 52: 681-688.

103. M. Arand, A.M. Golubev, J.R. Brandao Neto, I. Polikarpov, R. Wattiez, O.S.

104. Korneeva, E.V. Eneyskaya, A.A. Kulminskaya, K.A. Shabalin, S.M.113

105. Shishliannikov, O.V. Chepurnaya and K.N. Neustroev. 2002. Purification, characterisation, gene cloning, and preliminary X-ray data of the exo-inulinase from Aspergillus awamori. Biochem. J. 362(1): 131-135.

106. Zvyagintseva, T.N.; Makar'eva, T.N.; Ermakova, S.P.; Elyakova, L.A. 1998. Synthesis of p-nitrophenyl laminarioligosides via transglycosylation reaction catalyzed by endo-l,3-beta-D- glucanase from marine mollusk Russian J. Bioorg. Chem. 24:219-223.

107. Wong, C.H.; Whitesides, G.M.; Baldwin, J.E.; Magnus, P.D. 1994. Enzymes in Synthetic Organic Chemistry, Tetrahedron Organic Chemistry Series, Pergamon, Oxford 5: 252-311.

108. Stowell, C.P.; Lee, Y.C. 1980. Neoglycoproteins: the preparation and application of synthetic glycoproteins. Adv. Carbohyd. Chem. Biochem., 37: 225281.

109. Malet, C.; Validot, J.L.; Ochoa, A.; Gallego, В.; Brosa, C.; Planas, A. 1995.

110. Synthesis of 4-methylumbelliferyl-beta-D-glucan oligosaccharides as specific114chromophoric substrates of (1—»3),(1—>4)-beta-D-glucan 4-glucanohydroIases. Carbohydr. Res., , 274: 285-301.

111. Нед, P. В.; Rodriguez,E. В.; Stick, R. V.; Stone, B. A. 1989. J. Biol. Chem. 264: 4939-4947.

112. Wood, P. J. 1981. Carbohydr. Res. 94: 35-39.

113. J. van Lieshout, M. Faijes, J. Nieto, J. van der Oost and A. Planas. 2004. Hydrolase and glycosynthase activity of endo-l,3-(3-glucanase from the thermophile Pyrococcus furiosus, Archaea 1: 285-292.

114. Abel, M.; Planas, A.; Christensen, U. 2001. Biochem J. 357: 195-202.