Исследование кристаллической структуры и механизма действия α-галактозидазы из Trichoderma reesei и β-галактозидазы из Penicillium sp. методом дифракции синхротронного рентгеновского излучения тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 01.04.07, кандидат физико-математических наук Голубев, Александр Михайлович

• Голубев, Александр Михайлович
• кандидат физико-математических наук
• 2006

Оглавление диссертации кандидат физико-математических наук Голубев, Александр Михайлович

Список сокращений.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ГЛИКОЗИДГИДРОЛАЗЫ

1.1 Современная классификация гликозидгидролаз.

1.2 Каталитические механизмы действия гликозидгидролаз.

1.3 Гликозидгидролазы 27 семейства, а-галактозидазы.

1.4 Р-Галактозидазы.

ГЛАВА 2. МЕТОДЫ РЕНТГЕНОСТРУКТУРНОГО АНАЛИЗА

МАКРОМОЛЕКУЛ

2.1 Кристаллизация белка.

2.2 Синхротронное рентгеновское излучение.

2.3 Приборы и методы сбора данных в кристаллографии макромолекул.

2.4 Методы решения фазовой проблемы для макромолекул.

2.5 Недостатки метода изоморфного замещения: метод быстрой криодериватизации.

2.6 Краткий обзор компьютерных программ, применяемых в работе.

ГЛАВА 3. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 3.1 Очистка и кристаллизация а-галактозидазы из мицелярного гриба Тпскос1егта гее8е1.

3.2 Окислительная активация а-галактозидазы.

3.3 Очистка и кристаллизация Р-галактозидазы из гриба Pénicillium sp. w 3.4 Получение тяжелоатомных производных кристаллов белков и сбор дифракционных данных.

3.5 Решение фазовой проблемы и построение кристаллографической модели а-галактозидазы и ее комплекса с D-галактозой.

3.6 Решение структуры Р-галактозидазы и ее комплекса с D-галактозой. ф

ГЛАВА 4. КРИСТАЛЛОГРАФИЧЕСКИЕ МОДЕЛИ И МЕХАНИЗМ

ДЕЙСТВИЯ ИЗУЧАЕМЫХ ФЕРМЕНТОВ

4.1 Качество модели и описание структуры а-галактозидазы из T.reesei.

4.2 Сравнение структур а-галактозидазы и других гликозидгидролаз.

4.3 Связывание ингибитора и строение активного центра а-галактозидазы.

4.4 Каталитический механизм действия а-галактозидазы из T.reesei.

4.5 Описание структуры Р-галактозидазы из Pénicillium sp.

4.6 Сравнение структур Р-галактозидаз из Pénicillium sp.,

E.colin T.thermophilus.

4.7 Активный центр Р-галактозидазы.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Исследование кристаллической структуры и механизма действия α-галактозидазы из Trichoderma reesei и β-галактозидазы из Penicillium sp. методом дифракции синхротронного рентгеновского излучения»

Актуальность проблемы Развитие биотехнологии сегодня является приоритетной задачей не только для повышения эффективности технологии, но, не в последнюю очередь, для решения экологических проблем. В отличие от химического производства, сопровождаемого вредными и опасными выбросами, биотехнологические процессы используют, как правило, биологические катализаторы химических реакций - ферменты. Это направление предполагает применение, как природных ферментов, так и их аналогов, свойства которых могут быть изменены в нужном направлении при помощи методов белковой инженерии.

В современной биотехнологической промышленности используются различные ферменты, в том числе гидролазы, обеспечивающие реакции расщепления различных субстратов до мономеров. Среди гидролаз, гликозидгидролазы (гликозидазы, К.Ф. 3.2.1.), катализирующие расщепление гликозидных связей, относятся к одной из самых широко применяемых и изучаемых групп ферментов. Достаточно упомянуть, что ни одно современное целлюлозно-бумажное производство не обходится без применения гликозидгидролаз. Помимо этого, гликозидазы оказались чрезвычайно эффективным инструментом энзиматического синтеза многих соединений, используемых в фармацевтике и медицине. Такое их применение основан«} на способности, при определенных условиях, обращать реакции гидролиза и катализировать реакцию трансгликозилирования - образования новых гликозидных связей. На сегодняшний день описано более сотни различных экзо-гликозидаз (действующих на концевые углеводные остатки олиго- и полисахаридов), выделенных из широкого круга организмов и успешно примененных в ферментативном синтезе новых биологически активных веществ.

Энзиматический гидролиз и синтез имеют значительные преимущества перед традиционными методами органической химии, так. как позволяют получать необходимые соединения практически в одну стадию. Кроме того, при использовании реакций ферментативного синтеза удается получать строго определенные стереоизомеры с высоким выходом продуктов. Совокупность знаний о конкретном ферменте позволяет целенаправленно изменять его структуру и свойства в соответствие с научными или производственными задачами. Эффективное применение гликозидаз требует тщательного изучения их свойств, а также знаний пространственной трехмерной структуры их активного центра. Часто, информация о структуре белка и его комплекса с ингибиторами является необходимым условием для создания новых биологических препаратов и лекарств. Такой подход, от знания структуры белка - к созданию новых медицинских препаратов, названный рациональным конструированием лекарств (rational drug design), в последнее десятилетие послужил мощным стимулом для развития структурной биофизики.

Основным методом изучения трехмерной пространственной структуры ферментов и их активных центров является рентгеноструктурный анализ. Банк данных известных на сегодня белковых структур (Protein Data Bank) содержит около 12000 файлов с координатами атомов трехмерных структур белков и их комплексов с лигандами. Из них около 80% всех белковых структур получены методом дифракции рентгеновского излучения и только около 20% - методом ЯМР-спектроскопии высокого разрешения. Рентгеноструктурный анализ белка включает ряд необходимых стадий.

Первым этапом определения структуры является получение чистого препарата, выращивание кристаллов исследуемого белка и получение дифракционной картины рентгеновского рассеяния на кристаллах. Второй этап представляет собой поиск распределения электронной плотности в кристалле по дифракционной картине с применением разнообразных компьютерных математических методов. Конечный этап - это построение и уточнение кристаллографической атомной модели исследуемой структуры.

Интенсивность каждого отдельного дифракционного рефлекса пропорциональна квадрату модуля структурного фактора. Поэтому, измерив интенсивности рефлексов, можно получить значения модулей структурных факторов, но не фаз, необходимых для расчета электронной плотности. Принципиальная невозможность определения фаз из эксперимента является центральной проблемой в рентгеноструктурном анализе, как белков, так и малых молекул с неизвестной пространственной структурой. Основными методами решения фазовой проблемы для макромолекул в настоящее время являются:

• Метод множественного изоморфного замещения (Perutz, 1956;Blow& Crick, 1959)

• Метод молекулярного замещения (Rossmann, 1972)

• Метод мультиволновой аномальной дифракции (Hendrickson, 1991) Все три метода активно используются по отдельности или в комбинации одного с другим. Заметим, что метод молекулярного замещения требует наличия 3-х мерной структуры, гомологичного белка или, по-другому, поисковой модели структурно гомологичной исследуемому белку, причем, среднее расстояние между соответствующими атомами двух белков не должно быть большим. Метод мультиволновой аномальной дифракции требует съемки с изменением длины волны падающего рентгеновского излучения и введения в кристалл аномально рассеивающих атомов, что не всегда выполнимо.

Метод изоморфного замещения является в настоящее время основным для решения неизвестных белковых структур. Процесс расшифровки включает сбор дифракционных данных не только от кристалла нативной молекулы, но также от одного или нескольких кристаллов ее тяжелоатомных изоморфных производных. Кристаллы производных должны принадлежать той же пространственной группе, что и кристалл исходной белковой молекулы, а параметры элементарной ячейки не должны сильно различаться.

В случае успеха, положения тяжелых атомов в полученных кристаллах могут 8 быть определены, и фазовая проблема может быть решена из сравнения интенсивностей рефлексов от нативного кристалла и одной или нескольких тяжелоатомных производных. Часто, даже после получения белковых кристаллов, введение в кристалл тяжелых атомов является сложной проблемой из-за нарушения изоморфизма кристалла нативного белка и кристалла его тяжелоатомной производной. По сути, большинство используемых тяжелых атомов (Pt, Hg, U, Au и др.) при низкой концентрации и длительной экспозиции присоединяются к тем или иным реакционным группам белка и, таким образом, модифицируют исследуемую молекулу (Blundell & Jonson, 1976).

Метод быстрой криодериватизации (fast cryosoaking), предложенный

Дотером (Dauter et al., 2000), использует явление замещения молекул кристаллизационной воды на галоген (I, Вг) при непродолжительной экспозиции белкового кристалла в маточной жидкости с концентрированной солью галогена и криопротектором, препятствующим кристаллизации воды например, глицерином). В таких условиях, кристалл насыщается тяжелыми атомами галогенов, но реакция присоединения в белке пройти не успевает, а наличие криопротектора позволяет немедленно заморозить кристалл в токе холодного азота и использовать для сбора данных. При этом, если использовать рентгеновское излучение с длиной волны близкой к границе поглощения тяжелого атома, когда возможна регистрация аномального сигнала, то использование современных компьютерных методов позволяет локализовать до 50 (!) позиций связывания тяжелых атомов в макромолекуле. 9

Метод не свободен от недостатков, однако, значительно упрощает и ускоряет получение тяжелоатомных производных. В представленной работе модифицированный метод быстрой криодериватизации являлся основным средством, благодаря которому были решены две неизвестные структуры гликозидгидролаз из низших грибов T.reesei и Penicilium sp.

Цели и задачи исследования

Современная классификация всех гликозидгидролаз в 94 семейства, выполненная Хенриссатом (Henrissat, 1991) на основании гомологии их последовательностей и стереохимии катализируемой реакции оказалась весьма продуктивной. Дело в том, что ферменты из одного семейства, даже с разными каталитическими свойствами, оказались структурно гомологичными, то есть имеющими идентичный тип укладки полипептидной цепи, что было показано на примере нескольких близкородственных гликозидгидролаз, для которых известна трехмерная структура. Тем не менее, таблица Хенриссата все еще содержит много "белых пятен" в отношении структуры и детального каталитического механизма действия ферментов из отдельных семейств. Перед началом данной работы, отсутствовали данные о трехмерных структурах представителей 27-го и 35-го семейств гликозидгидролаз. Настоящая работа посвящена решению трехмерных структур а-галактозидазы из Trichoderma reesei (GHF 27) и (3галактозидазы из Pénicillium sp. (GHF 35), а также их комплексов с ингибиторами. Цель такого исследования - выяснение механизма работы

10 этих ферментов на молекулярном уровне с перспективой последующей модификации их свойств методами белковой инженерии. Интересный феномен окислительной активации, обнаруженный в а-галактозидазе из T.reesei, когда каталитическая активность фермента возрастала в 12 раз при химическом окислении, также мог быть объяснен только на основании решения трехмерной структуры.

Очевидно, что единственным методом, отвечающим на поставленные вопросы, является рентгеноструктурный анализ. Отсюда вытекают конкретные задачи данного исследования:

• Получить кристаллы а-галактозидазы из T. reesei и Р-галактозидазы из Pénicillium sp., а также комплексы ферментов с ингибиторами.

• Решить трехмерные пространственные структуры и на основании полученных данных выявить строение активных центров и объяснить механизм действия ферментов.

• Прояснить механизм окислительной активации а-галактозидазы из Trichoderma reesei.

• Сравнить структуры а- и Р-галактозидаз для выяснения аномерной специфичности этих ферментов.

• Изучить углеводную компоненту рассматриваемых ферментов.

• Получить информацию для последующей модификации ферментов методами сайт-направленного мутагенеза для белковой инженерии.

Научная новизна полученных результатов

• Впервые решены трехмерные пространственные структуры представителей 27-го и 35-го семейств гликозидгидролаз-а-галактозидазы из T.reesei и (3-галактозидазы из Pénicillium sp., а также структуры комплексов двух изучаемых ферментов с ингибиторами.

• Все полученные трехмерные структуры депонированы в Белковый Банк Данных (Protein Data Bank).

• На основании построенных кристаллографических моделей объяснен молекулярный механизм катализа двух ферментов.

• Определены причины интересного феномена - окислительной активации а-галактозидазы из T.reesei.

• В процессе решения структур двух описываемых ферментов успешно применен модифицированный метод быстрой криодериватизации с использованием эффекта аномального рассеяния для решения фазовой проблемы, впервые предложенный Дотером (Dauter et al., 2000)

• Впервые структура белка - а-галактозидазы из T.reesei - была решена комбинацией метода быстрой криодериватизации и метода SIRAS, используюшего всего одной катионную (Cs1+) тяжелоатомную производную.

• Впервые методом быстрой криодериватизации была решена фазовая проблема для структуры белка с массой более 120000 Да-(3-галактозидазы из Pénicillium sp.

• Качество рентгеноструктурных данных' позволило изучить структуру углеводной компоненты двух исследуемых гликопротеинов.

• На основании рентгеноструктурных данных показаны причины аномерной селективности двух гликозидаз.

Полученные результаты вносят существенный вклад в понимание особенностей структуры и механизма действия гликозидгидролаз.

Апробация работы

Материалы работы были представлены, на следующих международных семинарах и конференциях:

1. V Congresso Ibero-Americano de Biofísica, Rio de Janeiro, RJ, Brasil, 12 a 15 de outubro de 2003.

2. XVI Reuniao da SBCr, Campus da USP/Sao Carlos, 16 a 19 de mar?o 2003

3. VI Semenário Brasileiro de Tecnología Enzimática, ENZITEC 2004, Rio de Janeiro, 5 a 7 de abril de 2004.

4. 1st Latin American Protein Society Meeting, Angra dos Reis, RJ, November 812,2004.

По теме диссертации опубликовано 9 статей в рецензируемых научных журналах.

Основные положения, выносимые на защиту

Основные положения, выносимые на защиту, приведены в разделе «Заключение».

Благодарности

Я хочу выразить признательность и огромную благодарность своему научному руководителю, профессору Владимиру Петровичу Плахтию, одному из инициаторов рентгеноструктурных' исследований протеинов в ПИЯФ РАН, за постоянную поддержку и помощь в подготовке данной работы.

Я выражаю благодарность всем сотрудникам лабораторий энзимологии и биофизики макромолекул Отделения молекулярной и радиационной биофизики, а также сотрудникам лаборатории физики кристаллов Отделения нейтронных исследований ПИЯФ РАН за многолетнее плодотворное сотрудничество, дружескую поддержку и помощь в работе.

Отдельно хочу выразить особую благодарность моему трагически погибшему коллеге Кириллу Николаевичу Неустроеву и отметить его участие в работе.

Я приношу благодарность нашим заграничным коллегам профессору Игорю Владимировичу Поликарпову за сотрудничество и организацию работ в Бразильском центре синхротронного излучения, доктору Рональдо Наженю и сеньоре Адриане Рохас, (Институт физики Сан-Карлос, Университет Сан-Паулу, Бразилия), а также профессору Майклу Аранду (Институт токсикологии, Вюрцбургский Университет, Германия) за плодотворное сотрудничество по теме данной работы.

Работа выполнена при финансовой поддержке

• Программы фундаментальных исследований «Физико-химическая биология» Президиума РАН,

• Российского фонда фундаментальных исследований - РФФИ (проекты 0304-48756 и 03-04-49741),

• Национального совета по научному и технологическому развитию (Бразилия) - CNPq (Conselho Nacional de Desenvolmento Científico e Tecnologico), гранты 302125/02-7 и 300220/96-0,

• Фонда поддержки исследованиям в штате Сан-Паулу (Бразилия) -FAPESP (Funda?ao de Amparo á Pesquisa do Estado de Sao Paulo), гранты 99/03387-4, 02/14208-8 и 01/07014-0.

Заключение диссертации по теме «Физика конденсированного состояния», Голубев, Александр Михайлович

выводы:

1. Впервые показано, что метод быстрой криодериватизации может быть использован с применением катионов (Cs+) в качестве аномальных рассеивателей для решения фазовой проблемы в белковой кристаллографии.

Структура а-галактозидазы из Trichoderma reesei состоит из N-концевого домена типа (р/а)8-баррель и С-концевого домена типа Р-сэндвич.

Аминокислотные остатки а-галактозидазы Asp 132 и Asp 226 участвуют в катализе, причем первый в качестве нуклеофила, а второй — донора протонов, или кислотно-основного катализатора.

Эффект окислительной активации а-галактозидазы из Trichoderma reesei обусловлен перераспределением зарядов внутри активного центра фермента в результате окисления Met 258 в метионинсульфоксид. а-Галактозидаза из Trichoderma reesei является гликопротеином и содержит 4 N-связанных гликана маннозного типа, структура которых определена с атомным разрешением на основании полученных в работе дифракционных данных.

Структура Р-галактозидазы из Pénicillium sp. состоит из центрального домена типа (Р/а)8 баррель и четырех периферических доменов, содержащих Р-структуры.

7. Аминокислотные остатки Р-галактозидазы Glu 299 и Glu 200 участвуют в катализе, причем первый в качестве нуклеофила, а второй - донора протонов или кислотно-основного катализатора.

8. Р-Галактозидаза из Pénicillium sp. является гликопротеином и содержит 7 N-связанных гликанов маннозного типа, структура которых определена на основании полученных в работе дифракционных данных высокого разрешения.

9. Полученное в результате проведенного исследования знание о структурах и механизмах действия двух ферментов создает основу для изменения свойств изучаемых ферментов методами белковой инженерии.

По материалам работы были опубликованы 9 статей в рецензируемых # научных журналах:

1. Golubev, A.M. & Neustroev, K.N. (1993) Crystallization of a-galactosidase from Trichoderma reesei. J.Mol.Biol. 231, 933-934.

2. Качурин, A.M., Неустроев, K.H., Голубев, A.M., Ибатуллин, Ф.М. (1993) Химическая активация а-галактозидазы из Trichoderma reesei. Биохимия,58, 550 — 561.

Kachurin, A.M., Golubev, A.M., Geisow, M.M., Veselkina, O.S., Isaeva-Ivanova, L.S. & Neustroev, K.N. (1995) Role of methionine in the active site of a-galactosidase from Trichoderma reesei. Biochem. J. 308, 955964.

Eneyskaya, E.V., Golubev, A.M., Kachurin, A.M., Savel'ev, A.N. & Neustroev, K.N. (1997). Transglycosylation activity of a-D-galactosidase from Trichoderma reesei. An investigation of the active site. Carbohydr. Res. 305, 83-91.

Savel'ev, A.N., Eneyskaya, E.V., Isaeva-Ivanova, L.S., Shabalin, K.A., Golubev, A.M. & Neustroev, K.N. (1997) The carbohydrate moiety of a-galactosidase from Trichoderma reesei. Glycoconj. J. 14, 897-905.

Качурин, A.M, Протасеня, C.B, Шабалин, K.A., Исаев-Иванов, B.B., Голубев, A.M., Неустроев, K.H. (1998). Остатки триптофана в а-галактозидазе из Trichoderma reesei. Биохимия,63, 1391-1399.

Neustroev, K.N., de Sousa, E.A., Golubev, A.M., Brandao Neto, J.R., Eneyskaya, E.V., Kulminskaya, A.A. & Polikarpov, I. (2000). Purification, crystallization and preliminary diffraction study of beta-galactosidase from Pénicillium sp. Acta Cryst. D, 56, 1508-1509.

8. Golubev, A.M., Nagern, R.A.P. Brandäo Neto, J.R., Neustroev, K.N., Eneyskaya, E.V., Kulminskaya, A.A., Shabalin, K.A., Savel'ev, A.N. & Polikarpov, I. (2004) Crystal structure of a-galactosidase from Trichoderma reesei and its complex with galactose: Implications to catalytic mechanism. J.Mol.Biol. 339, 413-422.

9. Rojas, A.L., Nagern, R.A.P., Neustroev, K.N., Arand, M., Adamska, M., Eneyskaya, E.V., Kulminskaya, A.A. Garratt, R.C., Golubev, A.M., & Polikarpov, I. (2004) Crystal structures of ß-galactosidase from Pénicillium sp. and its complex with galactose J.Mol.Biol. 345, 923-934.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате проведенного исследования были решены трехмерные структуры а-галактозидазы из Trichoderma reesei (GHF 27) и Р-галактозидазы из Pénicillium sp. (GHF 35), а также их комплексов с ингибиторами. Четыре трехмерные структуры высокого разрешения, полученные в результате работы, депонированы в Белковый Банк Данных (Protein Data Bank, http://www.rcsb.org/pdb/) и могут быть востребованы под следующими номерами:

1SZN - а-галактозидаза из Trichoderma reesei;

1ТОО - а-галактозидаза из Trichoderma reesei, комплекс с D-галактозой; 1TG7 - Р-галактозидаза из Pénicillium sp.;

1ХС6 - Р-галактозидаза из Pénicillium sp., комплекс с D-галактозой.

На основании выполненного исследования могут быть сделаны следующие

Список литературы диссертационного исследования кандидат физико-математических наук Голубев, Александр Михайлович, 2006 год

1. Abrahams, J.P. & Leslie, A.G.W. (1996) Methods used in the structure determination of bovine mitochondrial Fl ATPase. Acta Crystallog. D, 52, 30-42.

2. Amemiya, Y., Matsushita, T., Nakagawa, A., Satow, Y., Miyahara, J. & Chikawa, J-I. (1988) Design and performance of an imaging platesystem for X-ray diffraction study. Nuc. Instrum. Meth. Phys. Res. A, 266, 645 653.

3. Bagnis, C., Chabannon, C. & Mannoni, P. (1999) Beta-galactosidase marker genes to tag and track human hematopoietic cells. Cancer Gene Ther. 6, 3 — 13.

4. Baker, P.J., Farrants, G.W., Stillman, T.J., Britton, K.L., Helliwell, J.R. & Rice, D.W.(1990) Isomorphous replacement with optimized anomalous scattering applied to protein crystallography. Acta Cryst. A, 46, 721 725.

5. Blow, D.M. & Crick, F.H.C. (1959) The Treatment of Errors in the Isomorphous Replacement Method. Acta Cryst. 12, 1195 1202.

6. Blundell, T.L. & Jonson, L.N. (1976) Protein crystallography, Academicpress, New York, London, San Francisco.103

7. Blundell, T.L. (2005) Advances in the uses of synchrotron X-ray and proton beams in structural biology. Progress Biophys. Mol. Biol. 89, 121 — 123.

8. Bourne, Y. & Henrissat, B. (2001) Glycoside hydrolases and glycosyltransferases: families and functional modules. Curr. Opin. Struct. Biol. 11, 593-600.

9. Brady, R.O., Gal, A.E., Bradley, R.M., Martensson, E., Warshaw, A.L. & Laster, L. (1967) Enzymatic defect in Fabry's disease. Ceramide trihexosidase deficiency. N. Engl. J. Med. 276, 1163 1167.

10. Briinger , A.T.(1992) Free R value: a novel statistical quantity for assessing the accuracy of crystal structures. Nature, 1992, 355, 472-475.

11. Coutinho, P.M. & Henrissat, B. (2000) CAZy — Carbohydrate-Active enZYmes (http://afmb.cnrs-mrs.fr/CAZY/).r

12. Dauter, Z., Dauter M. & Rajashankar, K.R. (2000) Novel approach to phasing proteins: derivatization by short cryo-soaking with halides. Acta Crystallogr D, 56, 232 237.

13. Dauter, Z. & Dauter, M. (2001) Entering a new phase: using solvent halide ions in protein structure determination. Structure, 9, 21 26.

14. Desnick, R.J., Ioannou, Y.A., & Eng, C.M. (2001) a-Galactosidase A deficiency: Fabry disease. In The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease, Eighth Edition, C.S. Scriver eds., New York, McGraw-Hill, pp. 3733 3774.

15. Enzyme Nomenclature. Recommendations of the Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology on the Nomenclature and Classification of Enzymes. (1992) San Diego: Academic Press;, pp 862 880.

16. Elgavish, S. & Shaanan, B. (1998) Structures of the Erythrina corallodendron lectin and of its complexes with mono- and disaccharides. J.Mol.Biol 277, 917 932.

17. Eng, C.M., Guffon, N., Wilcox, W.R., Germain, D.P., Lee, P., Waldek, S., Caplan, L., Linthorst, G.E., & Desnick, R.J. (2001) Safety and efficacy of recombinant human a-galactosidase. A replacement therapy in Fabry's disease. N. Engl J. Med. 345, 9-16.

18. Fabry, J. (1898) Ein Beitrag Zur Kenntnis der Purpura haemorrhagica nodularis (Purpura papulosa hemorrhagica Habrae) Arch. Dermatol Syph. 43, 187.

19. Feher, G & Kam, Z. (1985) Nucleation and growth of protein crystals: general principles and assays. Methods Enzymol. 114, 77 112.

20. Fujimoto, Z., Kaneko, S., Momma, M., Kobayashi, H. & Mizuno, H. (2003) Crystal structure of rice a-galactosidase complexed with D-galactose. J. Biol Chem. 278, 20313-20318.

21. Garman, S.C., Hannick, L., Zhu, A. & Garboczi, D.N. (2002) The 1.9 A structure of a-N-acetylgalactosaminidase: molecular basis of glycosidase deficiency diseases. Structure, 10, 425 -434.

22. Goldstein, J., Lenny, L., Davies, D., & Voak, D. (1989) Further evidence for the presence of A antigen on group B erythrocytes exthrough the use of specific exoglycosidases. Vox Sang. 57,142 146.

23. Gruner, S.M. (1994) X-ray detectors for macromolecular crystallography. Curr. Opin. Struct. Biol 4, 765 769.

24. Haas, D.J. & Rossman, M.G. (1970) Crystallographic studies on lactate dehydrogenase at -75°C . Acta. Cryst. B, 26, 998 1004.

25. Harker, D. (1956.) The determination of the phases of the structure factors of non-centrosymmetric crystals by the method of double isomorphous replacement Acta. Cryst. 9, 1 -9.

26. Hashimoto, H., Katayama, G., Goto, M., Okinaga, T. & Kitahata, S. (1991) Purification and some properties of a-galactosidase from Pseudomonasfluorescens H-601, Agric. Biol. Chem. 55, 2831 -2838.

27. Helliwell, J.R. (1992) Chapter 5: SR instrumentation. In Macromolecular

28. Crystallography with Synchrotron Radiation., Cambridge University Press, Cambridge, pp. 136 243.

29. Hendrickson, W. A. (2000) Synchrotron crystallography. TIBS, 25, 637 643.

30. Henrissat, B. (1991) A classification of glycosyl hydrolases based on amino acid sequence similarities. Biochem. J. 280, 309 — 316.

31. Holm, L. & Sander, C. (1996) Mapping the protein universe. Science, 273, 595-602.

32. Hope, H., (1990) Crystallography of biological macromolecules at ultra-low temperature. Ann. Rev. Biphys. Chem. 19, 107- 126.

33. Jacobson, R.H., Kuroki, R., Weaver, L.H., Zhang, X.-J. & Matthews, B.W. (1995) Enzymatic degradation of insoluble carbohydrates, Saddler & J.N., Penner M.H. Eds., ACS Symposium Series, Vol. 618, American Chemical Society, Washington, pp. 38 45.

34. Jacobson, R. H., Zhang, X-J. , DuBose, R. F. & Matthews, B. W. (1994) Three-dimensional structure of P-galactosidase from E. coli. Nature, 369, 761 -766.

35. Jancaric, J., & Sung-Hou, K. (1991) Sparse matrix sampling: a screening method for crystallization of proteins. J.Appl. Cryst. 24, 409 -411.

36. Kachurin, A.M., Golubev, A.M., Geisow, M.M., Veselkina, O.S., Isaeva-Ivanova, L.S. & Neustroev, K.N. (1995). Role of methionine in the active site of a-galactosidase from Trichoderma reesei. Biochem. J. 308, 955 — 964.

37. Karle, J. & Hauptman, H. (1956) A theory of phase determination for the four types of non-centrosymmetric space groups 1P222, 2P22, 3P12, 3P22 Acta Cryst. 9, 635-651.

38. Knight, S.D. (2000) RSPS version 4.0: a semiinteractive vector-search program for solving heavy atom derivatives. Acta Crystallog. D, 56, 42-47.

39. Kolatkar, A.R., Leung, A.K., Isecke, R., Brossmer, R., Drickamer, K. & Weis, W.I. (1998) Mechanism of N-acetylgalactosamine binding to a C-type animal lectin carbohydrate-recognition domain. J. Biol. Chem. 273, 19502- 19508.

40. Koshland, D.E. (1953) Stereochemistry and the mechanism of enzymatic reactions. Biol. Revs. Cambridge. Phil. Soc. 28, 416-436.

41. Kraulis, P.J. (1991) MOLSCRIPT: a program to produce both detailed and schematic plots of protein structures. J. Appl. Crystallog. 24, 946 950.

42. Laemmli, U.K. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, 227, 680 685.

43. Laskowslci, R.A., MacArthur, M.W., Moss, D.S. & Thornton, J.M.1993) PROCHECK: a program to check the stereochemical quality ofprotein structures. J. Appl. Crystallog. 283, 291 -302.1.l

44. Lenny, L.L., Hurst, R., Zhu, A., Goldstein, J., & Galbraith, R.A. ; q (1995) Multiple-unit and second transfusions of red cells enzymaticallyconverted from group B to group O: report on the end phase 1 trials. Transfusion, 35, 899 902.

45. Leparoux, S., Padrines, M., Placier, G. & Colas, B. (1997) Characterization ^ of a strictly specific acid P-galactosidase from Achatina achatina. BBA,1336, 522-532.

46. Ly, H.D. & Withers, S.G. (1999) Mutagenesis of glycosidases. Annu. Rev. Biochem. 68,487 522.

47. Margolles-Clark, E., Tenkanen, M., Luonteri, E. & Penttila, M. (1996) Three a-galactosidase genes of Trichoderma reesei cloned by expression in yeast. Eur. J. Biochem. 240,104 -111.

48. McCarter, J. D. &Withers, S. G. (1994) Mechanisms of enzymatic glycosidase hydrolysis. Curr. Opin. Struct. Biol. 4, 885 892.

49. McPherson, A. (1998) Crystallization of Biological Macromolecules, Cold Spring Harbor Laboratory Press.

50. McRee, D.E. (1999) XtalView/Xfit—a versatile program for manipulating atomic coordinates and electron density. J. Struct. Biol. 125, 156- 165.

51. Miller, R. Gallo, S.M., Khalak, H.G. & Weeks, C.M. (1994) SnB¡Crystal structure determination via Shake-and-Bake. J.Appl.Cryst. 27, 613 621.

52. Mizuguchi, K., Deane, C.M., Blundell, T.L. & Overington, J.P. ^ (1998) HOMSTRAD: a database of protein structure alignments forhomologous families. Protein Science, 7, 2469 2471.t'

53. Murray, J. & Garman, E. (2002) Investigation of possible free-radical cavengers and metrics for radiation damage in protein cryocrystallography. J. Synchrotron. Radiat. 9, 347 54.

54. Murshudov, G.N., Vagin, A.A. & Dodson, E.J. (1997) Refinement of macromolecular structures by the maximum-likelihood method. Acta Crystallog. D, 53, 240 255.

55. Nagern, R.A.P., Dauter, Z. & Polikarpov, I. (2001) Protein crystal structure solution by fast incorporation of negatively and positively anomalous scatterers. Acta Crystallogr. D, 57, 996 1002.

56. Navaza, J. (1994) AMoRe: an automated package for molecular replacement. Acta Crystallog. A, 50, 157 163.- ^ 67. Otwinowski, Z. & Minor, W. (1997) Processing of X-ray diffraction datacollected in oscillation mode. Methods Enzymol. 276, 307 326.

57. Perrakis, A., Morris, R.J.H. & Lamzin, V.S. (1999) Automated proteinf'model building combined with iterative structure refinement" Nature Struct. Biol. 6 458-463.0 71. Perutz, M.E. (1956) Isomorphous Replacement and Phase Determination in

58. Noncentrosymmetric Space Groups. Acta Cryst. 9, 867 873.114

59. Phillips, J.C. ,Wlodawer, A., Yevitz, M.M. & Hodgson, K.O. (1976) Applications of synchrotron radiation to protein crystallography: preliminary results. Proc. Natl Acad. Sci. U. S. A. 73, 128 132.

60. Pivarnik, L.F., Senecal, A.G., & Rand, A.G. (1995) Hydrolytic and transgalactosylic activities of commercial (3-galactosidase (lactase) in food processing. Adv Food Nutr Res. 38, 1 -102.

61. Polikarpov, I., Oliva, G., Castellano, E.E., Garratt, R., Arruda, P., Leite, A. & Craievich, A. (1997) The protein crystallography beamline at LNLS, the Brazilian National Synchrotron Light Source. Nucl Instrum. Methods A, 405, 159-164.

62. Qin, G., Takenaka, T., Telsch, K., Kelley, L., Howard, T., Levade, T., Deans, R., Howard, B.H., Malech, H.L., Brady, R.O. & Medin, J.A. (2001) Preselective gene therapy for Fabry disease. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 3428-3433.

63. Read, R.J. (1986) Improved Fourier coefficients for maps using phases from partial structures with errors. Acta Cryst. A, 42, 140-149.

64. Reid, J.S.G. (1995) Galactomannan. Biochemistry of storage carbohydrates in green plants., P.M. Dey & R.A. eds., Dixon. London. Academic Press.

65. Ren, Z., Bourgeois, D., Helliwell, J.R., Moffat, K., Srajer, V. & Stoddard, B.L. (1999) Laue crystallography: coming age. J. Synchrotron Rad. 6, 891 — 917.

66. Rosenbaum, G., Holmes, K.C. & Witzet, J. (1971) Synchrotron radiation as a source for X-ray diffraction. Nature, 230, 434 437.

67. Rossmann, M.G. (1972) The Molecular Replacement Method., Gordon & Breach eds.; New York, London, Paris.

68. Rye, C.S. & Withers, S.G. (2000) Glycosidase mechanisms. Curr. Opin. Chem Biol 4, 573 580.

69. Schiffmann, R., Kopp, J.B., Austin, H.A.,III, Sabnis, S., Moore, D.F., Weibel, T., Balow, J.E. & Brady, R.O. (2001) Enzyme replacement therapy in Fabry disease: a randomized controlled trial. JAMA, 285, 2743 2749.

70. Shindyalov, I.N. & Bourne, P.E. (1998) Protein structure alignment by incremental combinatorial extension (CE) of the optimal path. Protein Eng. 11,739-747.

71. Sinnott, M.L. (1990) Catalytic mechanism of enzymic glycosyl transfer.• Chem. Rev. 90, 1171 1202.

72. Stirk, HJ., Woolfson, D.N., Hutchinson, E.G. & Thornton, J.M. (1992) Depicting topology and handedness in jelly roll structures. FEBS Letters, 308, 1-3.

73. Strohmeier, M., Hrmova, M., Fischer, M., Harvey, A.J., Fincher, G.B. & Pleiss, J. (2004) Molecular modeling of family GH16 glycoside hydrolases:s