Трансгликозилирование природных и модифицированных нуклеозидов термостабильными нуклеозидфосфорилазами Geobacillus Stearothermophilus тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.06, кандидат химических наук Таран, Сергей Анатольевич

• Таран, Сергей Анатольевич
• кандидат химических наук
• 2011

Оглавление диссертации кандидат химических наук Таран, Сергей Анатольевич

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. НУКЛЕОЗИДЫ И НУКЛЕОЗИДФОСФОРИЛАЗЫ: 10 СТРУКТУРА, ФУНКЦИЯ, ПРИМЕНЕНИЕ (ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР)

1-1 Природные и модифицированные нуклеозиды

1 -2 Нуклеозидфосфорилазы. Структура и механизмы катализа

1.2.1 Общие характеристики и особенности нуклеозидфосфорилаз

1.2.2 Бактериальные пуриннуклеозидфосфорилазы

1.2.3 Пиримидинспецифичные нуклеозидфосфорилазы

1.2.4 Тимидинфосфорилаза и пиримидиннуклеозидфосфорилаза 34 1-3 Биотехнология нуклеозидов

1.3.1 Использование нуклеозидфосфорилаз в синтезе 43 модифицированных нуклеозидов

1.3.2 Ферментативное трансгликозилирова!те нуклеозидов

1.3.3 Технологические подходы в биосинтезе нуклеозидов 49 1-4 Заключение

ГЛАВА 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

2.1 Материалы

2.1.1 Реактивы и ферменты

2.1.2 Олигодезоксирибонуклеотиды

2.1.3 Бактериальные штаммы и плазмиды

2.1.4 Лабораторное оборудование

2.1.5 Буферы и растворы

2.2 Методы

2.2.1 Приготовление компетентных клеток и трансформация

2.2.2 Выделение и очистка плазмидной ДНК методом щелочного 68 лизиса

2.2.3 Выделение и очистка хромосомной ДНК С?.$1еаго1\1егторЫ1и$

2.2.4 Амплификация фрагментов генов с хромосомной ДНК 70 ОМеаго^егторЫЫз

2.2.5 Выделение фрагмента ДНК из агарозного геля

2.2.6 Молекулярное клонирование

2.2.7 Электрофоретическое разделение белков

2.2.8 Экспрессия нуклеозидфосфорилаз & 81еагоШегторЫ1ш

2.2.9 Выделение нуклеозидфосфорилаз & ^МеагоЖегторИИт

2.2.10 Определение концентрации белка

2.2.11 Иммобилизация нуклеозидфосфорилаз С7. 81еаго1кегторЫ1ш

2.2.12 Синтез природных и модифицированных нуклеозидов

2.2.13 Спектрофотометрическое определение активности нуклеозидфосфорилаз

ГЛАВА 3. ТРАНСГЛИКОЗИЛИРОВАНИЕ ПРИРОДНЫХ И

МОДИФИЦИРОВАННЫХ НУКЛЕОЗИДОВ ТЕРМОСТАБИЛЬНЫМИ

НУКЛЕОЗИДФОСФОРИЛАЗАМИ вЕОВАСШ иБ Б ТЕ А Я О ТНЕЯМОРШЬ Ш

3.1 Клонирование генов, экспрессия и выделение пуриннуклеозидфосфорилазы II и пиримидиннуклеозидфосфоралазы О. stearothermophilus В

3.2 Иммобилизация рекомбинантных нуклеозидфосфорилаз СМеагоНпегторЫЫв В-2194, исследование их свойств и использование в реакциях фосфоролиза и трансгликозилирования природных и модифицированных нуклеозидов

3.3 Синтез модифицированных нуклеозидов медицинского назначения. Синтез 2-хлор — 2 '-дезоксиаденозина (Кладрибина) ферментативным трансгликозилированием с использованием препаратов термостабилъных нуклеозидфосфорилаз ОМеагоШегторкИт ВКМ

3.3.1 Оптимальная схема синтеза 2-хлор-2 '-дезоксиаденозина

3.3.2 Выбор источника модифицированного основания

3.3.3 Подбор оптимальных количеств донора дезоксирибозо-1-фосфата и проведение синтеза 2-хлор-2 '-дезоксиаденозина

3.3.4 Выделение и очистка 2-хлор-2 '-дезоксиаденозина

3.3.5 Анализ и сертификация целевого 2-хлор-2 '-дезоксиаденозина

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Трансгликозилирование природных и модифицированных нуклеозидов термостабильными нуклеозидфосфорилазами Geobacillus Stearothermophilus»

Природные нуклеозиды и их модифицированные аналоги находят широкое применение в составе химиотерапевтических препаратов для лечения ряда вирусных, онкологических, аутоиммунных и других заболеваний. Кроме того, их используют для синтеза и поиска новых соединений, представляющих интерес в различных областях фармакологии, а также в качестве предшественников при синтезе олигонуклеотидов, применяемых в диагностических и терапевтических целях.

Традиционно для получения нуклеозидов и их модифицированных производных используется многостадийный химический синтез. Во многих случаях ключевой стадией процесса является формирование Ы-гликозидной связи. Химические способы образования этой связи дают удовлетворительные результаты в случае получения нуклеозидов рибо-ряда. Однако при синтезе 2'-дезоксирибонуклеозидов и Р-£)-арабинофуранозилнуклеозидов, как правило, образуются смеси регио- и стереоизомеров разделение которых требует использования дорогостоящих носителей, больших затрат сырья и реагентов, а также утилизации токсических отходов производства, что не отвечает экологическим требованиям современной биоиндустрии. Альтернативным способом образования М-гликозидной связи при получении природных нуклеозидов и их модифицированных аналогов является биосинтетический процесс, катализируемый Ы-дезоксирибозилтрансферазами (КФ 2.4.2.6) или нуклеозидфосфорилазами микроорганизмов [пуриннуклезидфосфорилаза (РиТч1Р; КФ 2.4.2.1), тимидинфосфорилаза (ТР; КФ 2.4.2.4) уридинфосфорилаза (ЦР; КФ 2.4.2.3)]. Из них, благодаря широкой субстратной специфичности, более подходящими биокатализаторами для промышленного применения признаны нуклеозидфосфорилазы.

В присутствии ортофосфата нуклеозидфосфорилазы катализируют обратимый фосфоролиз рибо-, арабино- и дезоксирибонуклеозидов до пентозо-1 -фосфата и соответствующих оснований, а также фосфатзависимый перенос пентозы между пуриновыми и пиримидиновыми основаниями или нуклеозидами (трансгликозилирование) с образованием нуклеозидов, отличных от исходных, по схеме:

Нуклеозид + Пентозо-1-фосфат + Основание

Основным преимуществом биоконверсии перед химическим синтезом является абсолютная регио- и стереоспецифичность катализируемых нуклеозидфосфорилазами процессов. Кроме того, эти ферменты не требуют никаких кофакторов, и реакции могут протекать в простых экологически и технологически безопасных водных буферах.

Известные на сегодняшний день биотехнологические способы синтеза модифицированных нуклеозидов позволяют успешно получать целевые продукты при использовании ферментов или суспензий целых клеток мезофильных бактерий, но не лишены недостатков. Применение целых клеток приводит к тому, что конечный продукт может быть загрязнен бактериальным содержимым и требует тщательной очистки и мониторинга качества получаемой субстанции фармпрепарата. При том, что нуклеозидфосфорилазы мезофильных бактерий имеют температурный оптимум в районе 55-65°С, они не могут продолжительное время сохранять ферментативную активность при такой температуре вследствие низкой термостабильности. Такие функциональные ограничения биокатализаторов могут играть отрицательную роль в случаях, когда требуются особые условия реакции. Например, для обеспечения высокой концентрации малорастворимых пуриновых оснований, нуклеозидов и их модифицированных аналогов при проведении процессов трансгликозилирования в условиях повышенной температуры и/или экстремальных значений рН. Эти условия обычно приводят к дестабилизации четвертичной и третичной структур белка и, в конечном итоге, к потере ферментативной активности. Поэтому актуальной научно-практической задачей для разработки методологии синтеза нуклеозидов и их производных является изучение ферментов термофильных микроорганизмов, в том числе, стабилизированных иммобилизацией, поскольку они могут обеспечивать целый ряд преимуществ по сравнению с ферментами мезофильных микроорганизмов или их целыми клетками при использовании в качестве биокатализаторов:

• ферментативная реакция может протекать длительное время при высокой температуре;

• проведение реакции при повышенной температуре обеспечивает большую концентрацию слаборастворимых в водных буферах производных нуклеозидов и оснований;

• термостабильные рекомбинантные ферменты могут быть легко очищены от термолабильных белков штамма-хозяина простым прогреванием клеточных лизатов;

• интерферирующие ферментативные активности ингибируются высокой температурой реакции, что позволяет использовать грубые или обогащенные ферментные препараты термостабильных нуклеозидфосфорилаз;

• биореакторы, работающие на основе термостабильных ферментов, устойчивы к бактериальной контаминации.

Основной целью настоящего исследования являлась разработка эффективного биокаталитического процесса, основанного на ферментативном трансгликозилировании ряда природных, а также модифицированных нуклеозидов, с использованием ферментных препаратов генно-инженерных нуклеозидфосфорилаз из термофильных бактерий ОеоЬасШиБ stearothermophilus штамма В-2194.

Для достижения основной цели в ходе работы решались следующие задачи:

1. Клонирование генов пуриннуклеозидфосфорилазы II (РиМРН) и пиримидиннуклеозидфосфорилазы (РуИР) из С. 51еагойгегторЫ1и8ь оптимизация генетических конструкций, создание рекомбинантных штаммов-продуцентов и разработка методов получения ферментных препаратов нуклеозидфосфорилаз, в том числе иммобилизованных.

2. Сравнение каталитических свойств полученных ферментных препаратов нуклеозидфосфорилаз С^еагоНъегторкИт и родственных ферментов Е.соИ в реакциях трансгликозилирования и фосфоролиза нуклеозидов.

3. Разработка методов получения комбинированных ферментных препаратов термостабильных нуклеозидфосфорилаз, подбор соотношений активностей и количества ферментов, условий иммобилизации. Изучение условий трансгликозилирования природных и модифицированных гетероциклических оснований и нуклеозидов в различных температурных режимах с использованием полученных ферментных препаратов нуклеозидфосфорилаз С^еаго^егторкИш.

4. Разработка способа синтеза (регламентов и технологических схем) 2-хлор-2'-дезоксиаденозина (Кладрибина) с использованием ферментных препаратов термостабильных нуклеозидфосфорилаз.

Работа выполнена в Группе технологии синтеза нуклеиновых кислот и компонентов нуклеиновых кислот филиала Института Био органической химии имени академиков М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН, в Пущинском научном центре РАН. Автор выражает искреннюю благодарность всем кто помогал и поддерживал его в выполнении и представлении диссертационной работы: А.И.Мирошникову и С.А.Феофанову — за руководство настоящей работой, организацию исследований и биотехнологического применения нуклеозидфосфорилаз и других ферментов нуклеинового обмена; К.Н.Верёвкиной за помощь в проведении экспериментов и отдельных технологических операций; P.C. Есипову за предоставленные препараты нуклеозидфосфорилаз E.coli, В.Б. Берзину за синтез 2С1-аденозина, 2Р-аденозина и К.В. Антонову за синтез 1-ß-D-арабинофуранозил-урацила, необходимых для выполнения экспериментальных работ; Г.В.Микулинской и Ю.С.Скоблову за плодотворное обсуждение результатов работы и помощь в оформлении. Отдельная благодарность И.Д. Константиновой и И.С.Музыка за получение части данных по синтезу рибавирина, помощь в проведении экспериментов и информационную поддержку. Спасибо всем моим соавторам, без Вашего участия эта работа была бы невозможна.

Работа выполнена при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (проекты РФФИ 08-04-12143, 08-04-01842) и Федерального агентства по образованию (Тематический план №1.1.09).

По результатам диссертационной работы опубликовано четыре статьи в рецензируемых научных журналах, включённых в список ВАК. Получен Патент РФ № 2230118 от 10.07.2004. Результаты исследования были представлены на российских и международных конференциях: VIII чтениях памяти академика Ю.А.Овчинникова, (Москва-Пущино, 2006), Всероссийской научной конференции с международным участием «Физиология и генетика микроорганизмов в природных и экспериментальных системах», (Москва, 2009), VII Всероссийской конференция "Химия и медицина, ОРХИМЕД-2009" (Уфа, 2009) и Международной научной конференции по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвященной 75-летию со дня рождения академика Ю.А.Овчинникова (Москва-Пущино, 2009).

Заключение диссертации по теме «Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)», Таран, Сергей Анатольевич

ВЫВОДЫ

1. Проведено клонирование и оптимизация последовательностей генов пуриннуклеозидфосфорилазы II (РиКРП) и пиримидиннуклеозидфосфорилазы (Ру1\ГР) из ОеоЬасШш ^еагоШегторЫЫх В-2194. Созданы рекомбинантные продуценты нуклеозидфосфорилаз на основе штаммов Е. соИ ВЬ21(БЕЗ) и Е. соИ С41(БЕЗ).

2. Разработаны методы ферментации штаммов-продуцентов с уровнем продукции растворимых целевых ферментов до 40-60% от суммарного количества клеточных белков и получения ферментных препаратов нуклеозидфосфорилаз.

3. Показано, что ферментные препараты рекомбинантных нуклеозидфосфорилаз 0.81еагоИаегторЫ1и8, ковалентно иммобилизованные на аминопропилированном макропористом стекле АР-СРв-170, сохраняют высокую активность и стабильность при 20-кратном использовании в реакциях трансгликозилирования нуклеозидов при температуре 70°С. Выход целевых продуктов достигает 96%.

4. Впервые показано преимущество использования ферментных препаратов термостабильных нуклеозидфосфорилаз по сравнению с ферментами или целыми клетками мезофильных микроорганизмов, что позволяет проводить синтез нуклеозидов при повышенной температуре (70-75°С), в широком диапазоне значений рН (6.5-11.5) и с высокими концентрациями субстратов.

5. Показана возможность эффективного применения ферментных препаратов термостабильных нуклеозидфосфорилаз для биотехнологического получения ряда фармацевтических субстанций: 2-хлор-2'-дезоксиаденозина (Кладрибин), 9-Р-£>-арабинофуранозил-2-фтораденина (Флударабин), 1 -(3-£)-рибофуранозил-1,2,4-триазол-З -карбоксамида (Рибавирин), а также природных нуклеозидов.

6. Разработан лабораторный регламент синтеза 2-хлор-2'-дезоксиаденозина (Кладрибин) и его выделения методом хроматографии на сорбентах Бо\уех2х8 и АВ17х2 с использованием экологически и технологически безопасных элюентов и реактивов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящей работе проведен анализ современных представлений о нуклеозидфосфорилазах микроорганизмов и их использовании в технологиях получения модифицированных нуклеозидов ферментативным трансгликозилированием. В экспериментальной части работы впервые показан ряд преимуществ использования ферментных препаратов термостабильных нуклеозидфосфорилаз С. 81еаго1кегторЫ1и8 по сравнению с ферментами мезофильных микроорганизмов и/или целых клеток, применяемых в известных ферментативных технологиях получения нуклеозидов. В ходе работы проведены исследования по клонированию генов и получению штаммов-продуцентов пуриннуклеозидфосфорилазы II и пиримидиннуклеозидфосфорилазы из & 81еаго(кегторЫ1и$ В-2194. Разработан способ получения ферментных препаратов из созданных штаммов-продуцентов и охарактеризована их активность в реакциях фосфоролиза и трансгликозилирования природных и модифицированных нуклеозидов. Показана возможность эффективного применения ферментных препаратов иммобилизованных нуклеозидфосфорилаз для биотехнологического получения ряда фармацевтических субстанций: 2-хлор-2'-дезоксиаденозина (субстанция препарата "Кладрибин"); 9-Р-£)-арабинофуранозил-2-фтораденина (субстанция препарата "Флударабин"); 1-Р-£>-рибофуранозил-1,2,4-триазол-З-карбоксамида (субстанция препарата "Рибавирин"), а также природных нуклеозидов. Разработаны методики и лабораторный регламент биотехнологического синтеза и выделения 2-хлор-2'-дезоксиаденозина из реакционной смеси ионообменной хроматографией на сорбентах отечественного и импортного производства (Бо\уех2х8, АВ17х2) с использованием экологически и технологически безопасных элюентов и реактивов. Наработаны опытные партии препарата 2-хлор-2'-дезоксиаденозина (суммарно более 200 г) в соответствии с разработанным лабораторным регламентом и требованиями, предъявляемыми к субстанциям фармацевтических препаратов. Создан "биотехнологический инструментарий", который может использоваться для получения широкого спектра как уже исследованных, так и новых препаратов нуклеозидной природы для нужд медицины и других целей.

Список литературы диссертационного исследования кандидат химических наук Таран, Сергей Анатольевич, 2011 год

1. Бокуть СБ., Барай В. Н., Зинченко А. И. // Прикл. биохим. и микробиол. 1995. Т. 31, № 3. С. 308-310.

2. Галегов Г.А., Львов Н.Д., Петрова КГ., Флорентов В.Л. Рибавирнн как антивирусный химиопре парат: химия, молекулярный механизм действия, возможность практического применения // Вопр. мед. химии. 1986; 32(1):10-19.

3. Гуревич A.M., Качалина Т.А., Каюшин А.Л., Коростелева М.Д., Мирошников А.И. Клонирование повторяющейся последовательности гена окситоцина // Биоорган, химия. 1993; 19:629-32.

4. ДудчикН. В.: Автореф. дис. канд. биол. наук. Мн., 1992.

5. Брошевская Л. А., Барай ВН., Зинченко А. И. и др. // Антибиотики и мед. битехнол. 1986. Т. 31, № 3. С. 174-178.

6. Зинченко А. И., Барай ВН., Брошевская Л. А., Михайлопуло И. А.// Биополимеры и клетка. 1988. Т. 4, № 6. с. 298-302.

7. Зинченко A.M., Брошевская Л.А., Барай В.Н. Увеличение операционной стабильности клеток Escherichia coli катализирующих реакцию синтеза аденинарабинозида, в помощью глутарового альдегида//Биотехнология. 1990; 5:36-9.

8. Зинченко AM., Барай В.Н., Брошевская Л.А., Бельгельман Л.Н., Михайлов С.Н., Карпейский М.Я., Михайлопуло И.А. 2'-,3'- и 5'-С-Метилпроизводные уридина в реакции микробиологического трансгликозилирования // ДАН АН СССР. 1987; 297(3):731-4.

9. Зинченко А. И., Барай В. Н., Брошевская Л. А // Пробл. микробиол. и биотехнол.: Материалы междунар. конф. Мн., 1998. С. 118-120.

10. Константинова И.Д., Леонтьева H.A., Галегов Г.А., Рыжова О.И., Чувиковский Д.В., Антонов К.В., Есипов P.C., Таран С.А., Веревкина К.Н., Феофанов С.А., Мирошников А.И. Биотехнологический способ13,14,15,16,17,18,19,20