Рекомбинантная α-галактозидаза из супертермофильной бактерии Thermotoga maritima: исследование кинетических и структурных свойств тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.04, кандидат наук Бобров Кирилл Сергеевич

  • Бобров Кирилл Сергеевич
  • кандидат науккандидат наук
  • 2019, ФГБНУ «Институт экспериментальной медицины»
  • Специальность ВАК РФ03.01.04
  • Количество страниц 110
Бобров Кирилл Сергеевич. Рекомбинантная α-галактозидаза из супертермофильной бактерии Thermotoga maritima: исследование кинетических и структурных свойств: дис. кандидат наук: 03.01.04 - Биохимия. ФГБНУ «Институт экспериментальной медицины». 2019. 110 с.

Оглавление диссертации кандидат наук Бобров Кирилл Сергеевич

2 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1 Принятые классификации гликозидгидролаз

2.2 Механизмы действия гликозидгидролаз

2.3 Методы изучения механизмов ферментативных реакций

2.3.1 Спектрофотометрический метод определения скорости ферментативных реакций

2.3.2 Метод ЯМР-спектроскопии и его применение в биохимических исследованиях

2.3.3 Зависимость реакционной способности реагентов от их структуры

2.4 Ферментативный синтез гликозидной связи

2.4.1 Синтез гликозидной связи гликозилтрансферазами и гликозидгидролазами

2.4.2 Гликозилсинтазы

2.4.3 Региоселективность гликозидгидролаз и способы её изменения

2.5 Альфа-галактозиды - природные субстраты а-галактозидаз

2.6 Альфа-галактозидазы микроорганизмов

3 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

3.1 Материалы и реагенты

3.2 Субстраты

3.3 Штаммы и плазмиды

3.4 Трансформация плазмид

3.5 Выделение рекомбинантной а-галактозидазы дикого типа и её мутантных форм

3.6 Методы измерения гидролитической активности а-галактозидазы из Thermotoga maritima

3.7 Определение концентрации белка

3.8 Методы определения гомогенности и молекулярной массы ферментов

3.9 Определение кинетических характеристик реакции гидролиза и-НФГ, катализируемой а-галактозидазой

3.10 Определение кинетических характеристик реакции гидролиза мелибиозы, раффинозы и стахиозы, катализируемой ТтГалА-ДТ

3.11 Исследование влияния рН на гидролитическую активность и стабильность рекомбинантных ферментов

3.12 Исследование влияния температуры на гидролитическую активность и стабильность ТтГалА-ДТ

3.13 Анализ стереохимии продуктов ферментативного гидролиза и-НФГ, катализируемого рекомбинантными ферментами, методом ЯМР 1Н спектроскопии

3.14 Определение лимитирующей стадии реакции гидролиза, катализируемой рекомбинантными ферментами

3.15 Определение влияния внешних нуклеофилов на гидролитическую активность ферментных препаратов

3.16 Метод тонкослойной хроматографии

3.17 Выделение и идентификация w-НФ-дигалактозидов, полученных в реакции трансгликозилирования, катализируемой TmГалА-ДТ

3.18 Анализ реакций трансгликозилирования, катализируемых ферментными препаратами а-галактозидазы

3.19 Определение рН-оптимума реакций трансгликозилирования, катализируемых ферментными препаратами а-галактозидазы

4 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

4.1 Получение и характеристика рекомбинантной а-галактозидазы из T. maritima MSB8 и её мутантных форм D327G и D387G

4.2 Установление механизма реакции гидролиза, катализируемой ТмГалА

4.2.1 Сравнение первичных аминокислотных последовательностей ферментов, гомологичных ТмГалА

4.2.2 Стереохимический результат действия а-галактозидазы из T. maritima

4.2.3 Каталитические свойства исследуемых ферментов

4.2.3.1 Анализ кинетических параметров реакций гидролиза, катализируемых ТмГалА-ДТ, T.MraÄA-D327G и T.MraÄA-D387G

4.2.3.2 Влияние внешнего нуклеофила на скорость реакций гидролиза п-НФГ, катализируемых исследуемыми ферментами

4.2.3.3 Зависимость скорости реакции гидролиза п-НФГ, катализируемой исследуемыми ферментами, от рН

4.2.4 Определение скорость-лимитирующей стадии реакций гидролиза п-НФГ, катализируемых исследуемыми ферментами

4.4 Изучение реакции трансгликозилирования, катализируемой ТмГалА

4.4.1 Исследование трансгликозилирующей активности ТмГалА-ДТ

4.4.2 Рациональный дизайн и характеристика мутантных форм ТмГалА

5 ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ

6 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ПРИЛОЖЕНИЕ А. Сравнение первичных аминокислотных последовательностей а-галактозидаз GH36 семейства

Рекомендованный список диссертаций по специальности «Биохимия», 03.01.04 шифр ВАК

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Рекомбинантная α-галактозидаза из супертермофильной бактерии Thermotoga maritima: исследование кинетических и структурных свойств»

1 ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы исследования. Одним из наиболее перспективных направлений развития биотехнологии является использование биологических катализаторов химических реакций - ферментов. Это направление предполагает применение как очищенных природных белков, так и их рекомбинантных аналогов, свойства которых в настоящее время могут быть модифицированы в нужном направлении при помощи генно-инженерных подходов. В современной промышленности используется множество ферментов, в том числе гидролазы, обеспечивающие реакции расщепления различных природных субстратов до мономеров. Среди гидролаз гликозидгидролазы (гликозидазы, К.Ф. 3.2.1.-) являются одной из самых широко применяемых и изучаемых групп биокатализаторов.

Гликозидгидролазы - белки, катализирующие реакцию гидролиза гликозидной связи в гликозидах, гликанах и гликоконъюгатах. Гликозидная связь является одной из наиболее прочных связей, существующих в природе. Период её естественного распада составляет более 5 миллионов лет. Поэтому гликозидгидролазы, ферменты, способные ускорить реакцию гидролиза гликозидной связи более чем в 1017 раз, являются одними из наиболее эффективных из существующих биокатализаторов [108].

Данный тип ферментов широко распространён в природе. Около 1% генома любого организма кодирует гликозидгидролазы [86]; эти ферменты включены в различные жизнеобеспечивающие процессы. Так, к примеру, они участвуют в процессах клеточного узнавания. Углеводные фрагменты ковалентно связаны с пептидами и липидами, где они взаимодействуют с другими молекулами, являясь связующим звеном распознавания внутри клеток и между ними. Пост-обработка этих углеводных фрагментов путём добавления или отщепления отдельных звеньев углеводных единиц, осуществляемая гликозидгидролазами и гликозилтрансферазами, имеет решающее значение для процесса клеточного

распознавания [86]. Кроме того, гидролиз углеводных полимеров, таких как целлюлоза и крахмал, на более мелкие углеводные единицы обеспечивает организмы некоторыми из необходимых строительных блоков для построения биополимеров и получения энергии [86].

Широкое применение нашли гликозидгидролазы в промышленности и медицине. Так, любое современное целлюлозно-бумажное производство не обходится без участия этой группы ферментов [25]. Помимо этого, гликозидгидролазы активно используются в современной биотехнологической промышленности: например, для производства биоэтанола [103] В медицине гликозидгидролазы с успехом применяют при лечении различных заболеваний [58, 93]. В связи с вышесказанным интерес к реакциям ферментативного гидролиза природных полимеров обусловлен как фундаментальными, так и прикладными задачами.

Помимо гидролитической активности множество гликозидгидролаз обладают трансгликозилирующей активностью, которую можно рассматривать, как способность ферментов в результате катализируемой реакции переносить гликозильный остаток исходного субстрата (донора) не на молекулу воды, а на иной акцептор — молекулу, имеющую, по крайней мере, одну гидроксильную группу. В роли акцептора могут выступать алифатические спирты, гидроксиаминокислоты или сахара. Ферментативный синтез, основанный на данном свойстве некоторых гликозидгидролаз, имеет ряд несомненных преимуществ по сравнению с химическим. Метод органического синтеза представляет собой многостадийный процесс, затратный как в финансовом плане, так и в плане прилагаемых усилий для его осуществления. К тому же при его использовании часто происходит образование множества побочных продуктов, являющихся вредными с экологической точки зрения . Методом ферментативного синтеза возможно получать необходимые соединения практически в одну стадию. При использовании данного метода, как правило, не происходит образования побочных продуктов, загрязняющих окружающую среду, и не требуется создания

экстремальных условий для проведения реакции [90, 94]. При этом выход целевого продукта при ферментативном синтезе может достигать высоких значений [57, 74].

Таким образом, не вызывает сомнений важность получения информации о взаимосвязи строения активного центра белка и его ферментативных свойств, о влиянии отдельных аминокислот, находящихся как в активном центре, так и рядом с ним, на эти свойства. Полученная информация позволит в дальнейшем более эффективно использовать в промышленности и медицине как исходные ферменты, так и ферменты, свойства которых могут быть модифицированы методами генной инженерии.

Степень разработанности темы исследования. В настоящее время можно найти достаточно много работ, посвящённых выделению и характеристике а-галактозидаз из различных источников. Отдельно следует отметить большое количество работ по исследованию человеческих а-галактозидаз, поскольку данный фермент является ключевым в возникновении болезни Фабри. Большое количество ферментов были очищены до гомогенного состояния, были определены их физико-химические и кинетические характеристики, которые, однако, сильно варьировали в зависимости от организма, из которого были выделены. При этом относительно мало внимания было уделено исследованию активного центра этого типа ферментов, также как и изучению реакции трансгликозилирования. Несмотря на то, что трансгликозилирующая активность была найдена для галактозидаз из различных источников, влияние отдельных аминокислотных остатков как на общую эффективность реакции, так и на её региоселективность в научной литературе практически не обсуждается.

Цели и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось структурно-функциональное исследование рекомбинантной а-галактозидазы из термофильной бактерии Thermotoga maritima MSB8 (7mГалА).

Исходя из цели работы, были поставлены следующие задачи:

1. Выделение и очистка рекомбинантной а-галактозидазы и её мутантных форм.

2. Определение физико-химических свойств рекомбинантной а-галактозидазы и её мутантных форм.

3. Детальное исследование механизма действия ТmГалА, включающее:

1) определение стереохимии реакции гидролиза гликозидной связи, катализируемой а-галактозидазой;

2) установление каталитических аминокислот, принимающих участие в реакции гидролиза гликозидной связи;

3) анализ кинетических характеристик реакции гидролиза гликозидной связи, катализируемой изучаемым ферментом;

4) исследование реакции трансгликозилирования, катализируемой рекомбинантной а-галактозидазой;

5) изучение влияния аминокислотных остатков внутри/вблизи активного центра а-галактозидазы на её гидролитическую и трансгликозилирующую активности.

4. Определение положения аминокислотных остатков, расположенных вблизи активного центра фермента, замена которых способна привести к увеличению эффективности и изменению региоселективности реакции трансгликозилирования, катализируемой ТmГалА.

Научная новизна исследования. В данной работе впервые были получены физико-химические характеристики рекомбинантной а-галактозидазы из термофильной бактерии Thermotoga maritima MSB8, являющейся представителем 36 семейства гликозидгидролаз. Было показано, что данный фермент является «сохраняющей» гликозидгидролазой и гидролизует гликозидную связь по механизму двойного замещения с сохранением конфигурации при аномерном центре гликоновой части субстрата. Впервые для

этого фермента был проведён детальный анализ кинетических характеристик реакции гидролиза. Было показано, что в процессе гидролиза гликозидной связи два остатка аспарагиновой кислоты, D327 и D387, действуют в качестве нуклеофила и кислотно-основного катализатора. У изучаемого фермента была обнаружена и детально исследована трансгликозилирующая активность. Методом ЯМР-спектроскопии были получены характеристики структур продуктов трансгликозилирования. Впервые для этого фермента методами белковой инженерии были получены мутантные формы, трансгликозилирующая активность которых была модифицирована таким образом, чтобы выход продуктов реакции трансгликозилирования с типом связи а(1,2)- между галактозидными остатками существенно превышал выход других продуктов.

Теоретическая и практическая значимость исследования. Структурно-функциональное исследование рекомбинантной а-галактозидазы из Thermotoga maritima, проведённое в данной работе, дополнило современное представление о строении активного центра представителей 36 семейства гликозидгидролаз, а также о роли отдельных аминокислот в реакциях гидролиза и трансгликозилирования, катализируемых данными ферментами. Полученные в ходе исследования данные подтвердили возможность направленного изменения свойств фермента на основе теоретических расчётов, выполненных с использованием методов молекулярного моделирования, что, в свою очередь, даёт возможность создать эффективный инструмент для направленного синтеза а-галактосодержащих соединений с высокими выходами .

Методология и методы исследования. В ходе данной работы был использован широкий спектр методов, включающий в себя: химическую трансформацию плазмидной ДНК в бактериальные клетки; выделение и очистку белков и низкомолекулярных продуктов реакций гидролиза и трансгликозилирования методом жидкостной хроматографии; оценку

гомогенности очищенных ферментных препаратов методом денатурирующего гель-электрофореза; количественный анализ белков и низкомолекулярных соединений в растворах и реакционных смесях спектрофотометрическим методом; качественный анализ продуктов реакции трансгликозилирования методом тонкослойной хроматографии.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Рекомбинантная альфа-галактозидаза из Thermotoga maritima MSB8 катализирует реакцию гидролиза гликозидной связи по механизму с сохранением аномерной конфигурации первого углеродного атома;

2. Подтверждено, что в катализе, осуществляемом рекомбинантной а-галактозидазой, принимают участие два остатка аспарагиновой кислоты в 327 и 387 положениях;

3. Рекомбинантная а-галактозидаза дикого типа катализирует реакцию трансгликозилирования;

4. Замена пролина в 402 положении на аспарагиновую кислоту приводит к четырёхкратному увеличению выхода продукта реакции трансгликозилирования с типом связи а-1,2;

5. Замена фенилаланина в 328 положении на аланин приводит к увеличению выхода продукта реакции трансгликозилирования с типом связи а-1,2 в шестнадцать раз и общего выхода продуктов реакции трансгликозилирования в три раза.

Степень достоверности и апробация работы.

Достоверность полученных в ходе данной работы результатов подтверждается применением современных методов исследования, их хорошей воспроизводимостью и согласованностью.

По теме диссертации опубликовано 3 статьи. Материалы диссертации были представлены на 2-й Санкт-Петербургской международной конференции по

нанобиотехнологиям «Нанобио-2008» (Санкт-Петербург, 2008г.), на семинаре по двухстороннему научному сотрудничеству «Beta-xylosidases, xylanases and other Plant Polysaccharide Degrading Enzymes» (Гент, Бельгия, 2008г.), на 14-ой международной Пущинской школе-конференции молодых учёных (Пущино, 2009г.), на конференции «Biomass derived pentoses: from biotechnology to fine chemistry» (Реймс, Франция, 2010г.), на первом вступительном симпозиуме BIT's по ферментам и биокатализу (Шанхай, Китай, 2010г.), на 10-м международном симпозиуме по биокатализу (Джардини-Наксос, Италия, 2011г.), на XVII-й международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных (Ломоносов, 2011г.), на 38-м конгрессе ФЕБС (Санкт-Петербург, 2013г.), на II-й всероссийской конференции «Фундаментальная гликобиология» (Саратов, 2014Г.), на 11-й конференции «Carbohydrate Bioengineering Meeting» (Эспоо, Финляндия, 2015г.) и на научных семинарах отделения молекулярной и радиационной биофизики НИЦ «КИ» - ПИЯФ.

2 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1 Принятые классификации гликозидгидролаз

Гликозидгидролазы - ферменты, катализирующие реакцию гидролиза гликозидной связи в гликозидах, гликанах и гликоконъюгатах. Согласно традиционной номенклатуре, различают три типа гликозидгидролаз: гликозидазы, эндо-гликаназы и экзо-гликаназы (Рисунок 1) [113]:

• Гликозидазы катализируют отщепление концевого остатка моносахарида от гликозидов, олигосахаридов, гликопептидов и гликопротеинов (а- и в-галактозидаза, а- и в-глюкозидаза и др.).

• Эндо-гликаназы катализируют реакцию гидролиза гликозидной связи в гомо- или гетерополисахаридах, которая удалена от начального и концевого остатков полимера (например, лизоцим, а-амилаза, эндо-ламинариназа, гиалуронидаза и др.).

• Экзо-гликаназы катализируют отщепление концевых остатков моно- или олигосахарида от гомополисахаридов (например, целлобиогидролазы, в-амилазы, глюкоамилазы и др.).

Гликозидная связь,

гидролизуемая гликозидазой

О

Гликозидная связь,

гидролизуемая экзо-гликаназой

О

О

Гликозидная связь,

гидролизуемая

эндо-гликаназой

О

О

Рисунок 1. Схема действия гликозидгидролаз.

В 1970-е годы, во времена, когда о трёхмерной структуре белков было известно немного, Hiromi с соавторами была предложена концепция о многосайтной структуре активных центров карбогидраз [49, 50]. Основой этой концепции является предположение, что активный центр ферментов, действующих на полимерные субстраты, можно рассматривать как состоящий из сайтов, или участков, каждый из которых связывает мономерный остаток полимера. Соответствующие сайты связывания обозначаются как +1, +2, .. , +п и -1, -2, .. , -п. Знак обозначает, с какого конца полимерной цепи, восстанавливающего или невосстанавливающего, находится данный участок. Катализ происходит между сайтами -1 и +1. Согласно номенклатуре Davies с соавторами [19], отражающей совокупность известных к настоящему времени субсайтных структур гликозидгидролаз, эндо-гликаназы имеют в активном центре несколько сайтов связывания как с невосстанавливающего, так и с восстанавливающего конца молекулы субстрата, обозначающихся, соответственно, -п, +п; гликозидазы содержат только два сайта связывания, -1 и +1; и экзо-гликаназы обладают структурой -1 или -2, +п (Рисунок 2, взят из статьи

[19]).

Число сайтов, энергия связывания каждого из них и константы скорости реакции гидролиза могут быть рассчитаны из экспериментальных данных [8].

В начале 1990-х была создана классификация, которая отражает структурные особенности и эволюционные взаимоотношения гликозидгидролаз. Данная классификация использует алгоритмические методы для отнесения аминокислотных последовательностей гликозидгидролаз к различным семействам. Гликозидгидролазы были сгруппированы в более чем 100 семейств [45], информация о которых собрана в базе данных CAZY: http://www.cazy.org/Glycoside-Hydrolases.html [71]. Каждое семейство содержит белки, родственные по аминокислотному составу и, следовательно, по пространственной структуре.

Рисунок 2. Схематичное изображение субстрат-связывающих сайтов гликозидгидролаз. Невосстанавливающий конец молекулы субстрата нарисован слева (обозначен КЯ), восстанавливающий конец молекулы субстрата (Я) нарисован справа. Место расщепления субстрата указано стрелкой. (а) раннее цифровое обозначение субсайтной структуры глюкоамилазы; (Ь) буквенное обозначение субсайтной структуры лизоцима куриного яичного белка; (с) современное обозначение субсайтной структуры лизоцима куриного яичного белка; (<$) субсайтная структура гликозидаз; (е) субсайтная структура ферментов, отщепляющих моносахарид с невосстанавливающего конца, например, глюкоамилазы; (/) субсайтная структура ферментов, отщепляющих дисахарид с невосстанавливающего конца, например, в-амилазы; субсайтная структура ферментов, отщепляющих дисахарид с восстанавливающего конца, например, целлобиогидролазы I.

Данная классификация позволяет сделать множество полезных предсказаний, так как давно было замечено, что каталитическая структура и молекулярный механизм сходен для подавляющего большинства семейств [37], так же как и геометрическая конфигурация аминокислотных остатков в активном центре фермента вокруг гликозидной связи (независимо от субстратной специфичности гликозидгидролаз) [47].

Как правило, механизм реакции гидролиза гликозидной связи (с сохранением или изменением аномерной конфигурации углеродного атома) одинаков для всех представителей одного семейства. Единственным на сегодняшний день исключением является 97 семейство гликозидгидролаз, которое содержит одновременно ферменты, действующие по обоим этим механизмам. Представители 4 и 109 семейств гидролизуют гликозидную связь по НАД-зависимому механизму действия, который проходит через анионное переходное состояние с последующим распадом и окислительно-восстановительным этапом [110]. Данный механизм позволяет ферментам расщеплять как а-, так и в-гликозидную связь.

По мере развития этой классификации было предложено объединить некоторые семейства в более крупные группы, названные «кланами» [46]. Клан -это группа семейств гликозидгидролаз, обладающих значительным сходством их третичной структуры, каталитических аминокислотных остатков и механизма реакции гидролиза. Семейства внутри кланов, как полагают, имеют общее эволюционное происхождение [20].

2.2 Механизмы действия гликозидгидролаз

Абсолютное большинство гликозидгидролаз по механизму действия разделяются на так называемые «сохраняющие» и «обращающие» ферменты, в зависимости от результата каталитической реакции: наличия или отсутствия

изменений аномерной конфигурации атома углерода в результате реакции (Рисунок 3).

ОН

Рисунок 3. Схематичное изображение реакции гидролиза гликозидной связи, катализируемой а-галактозидазами: А. с сохранением конфигурации при аномерном центре гликоновой части субстрата; Б. с обращением конфигурации при аномерном центре гликоновой части субстрата.

Элементарные механизмы действия обеих групп гликозидгидролаз были предложены Koshland в 1953 году [61]. Между устройствами активных центров обеих групп гликозидгидролаз существует значительное сходство, связанное со стабилизацией в похожих переходных состояниях. Как правило, активные центры обеих групп гликозидгидролаз содержат две карбоновые кислоты, играющие ключевую роль в процессе катализа. Однако в ферментах разных групп, как стало позже известно из исследований структур этих белков, каталитические аминокислотные остатки находятся на разных расстояниях между собой: у «обращающих» гликозидгидролаз расстояние между двумя каталитическими аминокислотами составляет порядка 0.95 нм, а у «сохраняющих» - около 0.55 нм [73]. Подобная разница в расстояниях вполне согласуется с механизмами катализа. «Обращающие» гликозидгидролазы действуют по механизму прямого

нуклеофильного SN2-замещения, в котором две карбоновые кислоты в активном центре расположены так, что кислотный каталитический аминокислотный остаток протонирует гликозидный кислород, в то время как основный каталитический аминокислотный остаток активирует входящую молекулу воды. Этот процесс характеризуется образованием промежуточного карбоксоний-ион подобного переходного состояния (Рисунок 4, взят из статьи [18]). Расстояние между аминокислотами размером 0.95 нм, по всей видимости, такое, чтобы субстрат и вода могли связываться одновременно.

Рисунок 4. Схема реакции гидролиза гликозидной связи, катализируемой «обращающими» гликозидгидролазами.

Что касается типичных «сохраняющих» гликозидгидролаз, то они действуют по механизму двойного SN2-замещения, состоящему из двух стадий: образования ковалентно связанного фермент-субстратного комплекса (гликозилирования) и его гидролиза (дегликозилирования). Обе эти стадии также проходят через образование промежуточного карбоксоний-ион подобного переходного состояния. В реакции задействованы два аминокислотных остатка, один из которых выполняет функции кислотно-основного катализатора, а второй является нуклеофилом. На первой стадии реакции карбоксильная группа

кислотной аминокислоты протонирует гликозидный кислород, в то время как нуклеофил атакует аномерный атом углерода сахара, что приводит к уходу агликоновой группы субстрата и образованию ковалентно связанного фермент-субстратного комплекса. На второй стадии реакции та же самая аминокислота, выполнявшая функции кислоты на первой стадии, действует как основание, активируя входящий акцептор, роль которого могут исполнять вода, спирт, сахарный остаток и другие соединения с гидроксигруппами. В результате образуется продукт, имеющий ту же самую аномерную конфигурацию первого углеродного атома, что и у субстрата (Рисунок 5, взят из статьи [18]). Более короткое расстояние между двумя каталитическими аминокислотами (около 0.55 нм) обусловлено необходимостью прямой нуклеофильной атаки.

Рисунок 5. Схема реакции гидролиза гликозидной связи, катализируемой «сохраняющими» гликозидгидролазами.

По одному из двух вышеописанных механизмов действует подавляющее большинство известных гликозидгидролаз. Однако существуют и исключения. Так, в некоторых случаях ферменты не содержат каталитического нуклеофила, а их функции выполняет ацетамидная группа, присоединённая к С-2 атому субстрата [101]. Также недавно был обнаружен совершенно неродственный механизм реакции гидролиза, по которому действуют гликозидгидролазы, относящиеся к двум различным семействам, и требующий участия НАД+ в качестве кофактора [69, 88].

Идентификация аминокислот, участвующих в катализе, является важной задачей для понимания каталитического механизма фермента.

2.3 Методы изучения механизмов ферментативных реакций

Для изучения механизмов ферментативных реакций используются разные методы. К классическим относятся манометрический, вискозиметрический и поляриметрический методы, к наиболее современным - ЯМР- и ЭПР-спектроскопия. Широко применяются спектрофотометрия, спектрофлуорометрия, автоматические титрование, а так же методы с использованием субстратов, меченных радиоактивными изотопами [3].

Более подробно об основных используемых в данной работе методах рассказано ниже.

2.3.1 Спектрофотометрический метод определения скорости ферментативных

реакций

Одним из необходимых условий проведения любого кинетического исследования является наличие удобного метода измерения скорости образования продуктов или скорости расходования субстратов. Наиболее часто используемым методом для подобных измерений является спектрофотометрия. Спектрофотометрически можно измерять накопление продуктов реакции гидролиза различных субстратов, как природных, так и синтетических. В частности, при использовании таких природных субстратов, как целлюлоза, ксилан или других поли- и олигосахаридов образование продуктов реакции определяют по увеличению количества восстанавливающих сахаров [95, 106, 109]. Для исследования гликозидаз широко применяются синтетические субстраты, в которых сахарный остаток связан с веществом, которое в свободном виде представляет собой хромофор или флюорофор. В ходе ферментативной реакции

связь в подобных субстратах гидролизуется, что приводит к образованию свободного сахара и хромо- или флюорофорной метки. Таким образом, за ходом ферментативной реакции гидролиза подобных субстратов также можно следить, используя спектрофотометрический или спектрофлуорометрический методы, в зависимости от типа агликона. В качестве таких меток используются п-нитрофенол (п-НФ), 4-метилумбеллиферил и многие другие соединения [12, 29, 30, 95, 106, 109].

2.3.2 Метод ЯМР-спектроскопии и его применение в биохимических

исследованиях

Использование метода ЯМР-спектроскопии в биохимических исследованиях основано на фундаментальном свойстве, состоящем в том, что физические параметры, характеризующие ЯМР спектр (химический сдвиг, константа спин-спинового взаимодействия) зависят от химического окружения наблюдаемого ядра. Поскольку наибольший вклад в величину химического сдвига оказывает строение молекулы, то можно считать ЯМР-спектр уникальной индивидуальной характеристикой молекулы. В биохимических исследованиях, в частности, в кинетических экспериментах, можно выделить сигналы, характерные для каждого компонента реакционной смеси, и, таким образом, количественно определить его концентрацию. Поскольку время, необходимое для регистрации, составляет 1-2 секунды, то, используя ЯМР-спектрометр, можно исследовать достаточно быстрые процессы.

Во многих своих применениях ЯМР используется как спектроскопический метод (подобно абсорбционной спектроскопии в инфракрасной, видимой и ультрафиолетовой областях). В спектроскопии ЯМР регистрируется энергия, поглощаемая при переходах ядер с одного уровня магнитной энергии на другой. При этом определяется зависимость энергии либо от внешнего магнитного поля, либо от частоты электромагнитного излучения. Эта зависимость поглощения от

напряжённости поля или от его частоты и представляет собой спектр ЯМР. Такие спектры оказываются весьма информативными, поскольку ядрам данного вида, входящим в состав молекулы, (например, ядрам водорода в различных положениях), всегда отвечают разные линии в спектре ЯМР. В спектрах ЯМР благодаря их очень высокой чувствительности к локальному окружению сигналы от различных ядер водорода часто оказываются хорошо разрешёнными. Поэтому спектры ЯМР служат своего рода «отпечатками пальцев» малых молекул: с их помощью удаётся выявить даже незначительные различия в структуре таких молекул [3].

Похожие диссертационные работы по специальности «Биохимия», 03.01.04 шифр ВАК

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Бобров Кирилл Сергеевич, 2019 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Бобров К.С. Повышение эффективности реакции трансгликозилирования, катализируемой альфа-галактозидазой из Thermotoga maritima, методами белковой инженерии / К. С. Бобров, А. С. Борисова, Е. В. Энейская, Д. Р. Иванен, К. А. Шабалин, А. А. Кульминская, Г. Н. Рычков // Биохимия - 2013. - Т. 78 - № 10 -1422-1435с.

2. Досон Р. Справочник биохимика / Р. Досон, Д. Эллиот, У. Эллиот, К. Джонс -Москва: Мир, 1991.- 544c.

3. Ионин Б.И. ЯМР-спектроскопия в органической химии. / Б. И. Ионин -Ленинград: Химия, 1983. Вып. 2-е изд., перераб.- 269c.

4. Корниш-Боуден Э. Основы ферментативной кинетики / Э. Корниш-Боуден -Москва: Мир, 1979.

5. Фершт Э. Структура и механизм действия ферментов / Э. Фершт / под ред. Б.И. Курганов. - - Москва: Мир, 1980.- 432c.

6. Ajisaka K. Regioselective transglycosylation in the synthesis of oligosaccharides: comparison of beta-galactosidases and sialidases of various origins / K. Ajisaka, H. Fujimoto, M. Isomura // Carbohydr. Res. - 1994. - Т. 259 - № 1 - 103-115с.

7. Ajisaka K. Control of the Regioselectivity in the Enzymatic Syntheses of Oligosaccharides Using Glycosidases / K. Ajisaka, Y. Yamamoto // Trends Glycosci. Glycotechnol. - 2002. - Т. 14 - № 75 - 1-11с.

8. Allen J.D. Subsite mapping of enzymes: Application to polysaccharide depolymerases Enzyme Kinetics and Mechanism - Part B: Isotopic Probes and Complex Enzyme Systems / / под ред. D.L. Purich. Academic Press, 1980. - 248-277с.

9. Barea-Alvarez M. Synthesis and Characterization of Isomaltulose-Derived Oligosaccharides Produced by Transglucosylation Reaction of Leuconostoc mesenteroides Dextransucrase / M. Barea-Alvarez, M. T. Benito, A. Olano, M. L. Jimeno, F. J. Moreno // J. Agric. Food Chem. - 2014. - T. 62 - № 37 - 9137-9144c.

10. Bauer M.W. The family 1 beta-glucosidases from Pyrococcus furiosus and Agrobacterium faecalis share a common catalytic mechanism / M. W. Bauer, R. M. Kelly // Biochemistry (Mosc.) - 1998. - T. 37 - № 49 - 17170-17178c.

11. Becker D. Engineering of a glycosidase Family 7 cellobiohydrolase to more alkaline pH optimum: the pH behaviour of Trichoderma reesei Cel7A and its E223S/ A224H/L225V/T226A/D262G mutant. / D. Becker, C. Braet, H. Brumer, M. Claeyssens, C. Divne, B. R. Fagerstrom, M. Harris, T. A. Jones, G. J. Kleywegt, A. Koivula, S. Mahdi, K. Piens, M. L. Sinnott, J. Stahlberg, T. T. Teeri, M. Underwood, G. Wohlfahrt // Biochem. J. - 2001. - T. 356 - № Pt 1 - 19-30c.

12. Borisova A.S. The method of integrated kinetics and its applicability to the exo-glycosidase-catalyzed hydrolysis of p-nitrophenyl glycosides / A. S. Borisova, S. K. Reddy, D. R. Ivanen, K. S. Bobrov, E. V. Eneyskaya, G. N. Rychkov, M. Sandgren, H. Stalbrand, M. L. Sinnott, A. A. Kulminskaya, K. A. Shabalin // Carbohydr. Res. - 2015. - T. 412 - 43-49c.

13. Bravman T. Glutamic acid 160 is the acid-base catalyst of beta-xylosidase from Bacillus stearothermophilus T-6: a family 39 glycoside hydrolase / T. Bravman, A. Mechaly, S. Shulami, V. Belakhov, T. Baasov, G. Shoham, Y. Shoham // FEBS Lett. -2001. - T. 495 - № 1-2 - 115-119c.

14. Bravman T. Identification of the catalytic residues in family 52 glycoside hydrolase, a beta-xylosidase from Geobacillus stearothermophilus T-6 / T. Bravman, V. Belakhov, D. Solomon, G. Shoham, B. Henrissat, T. Baasov, Y. Shoham // J. Biol. Chem. - 2003. -T. 278 - № 29 - 26742-26749c.

15. Bravman T. Detailed kinetic analysis of a family 52 glycoside hydrolase: a beta-xylosidase from Geobacillus stearothermophilus / T. Bravman, G. Zolotnitsky, V. Belakhov, G. Shoham, B. Henrissat, T. Baasov, Y. Shoham // Biochemistry (Mosc.) -2003. - T. 42 - № 35 - 10528-10536c.

16. Brouns S.J.J. Identification of a Novel a-Galactosidase from the Hyperthermophilic Archaeon Sulfolobus solfataricus / S. J. J. Brouns, N. Smits, H. Wu, A. P. L. Snijders, P. C. Wright, W. M. de Vos, J. van der Oost // J. Bacteriol. - 2006. - T. 188 - № 7 - 2392-2399c.

17. Choi K.-W. Modulation of the regioselectivity of a Thermotoga neapolitana beta-glucosidase by site-directed mutagenesis / K.-W. Choi, K.-M. Park, S.-Y. Jun, C.-S. Park, K.-H. Park, J. Cha // J. Microbiol. Biotechnol. - 2008. - T. 18 - № 5 - 901-907c.

18. Cobucci-Ponzano B. Glycosynthases as tools for the production of glycan analogs of natural products / B. Cobucci-Ponzano, M. Moracci // Nat. Prod. Rep. - 2012. - T. 29 - № 6 - 697-709c.

19. Davies G.J. Nomenclature for sugar-binding subsites in glycosyl hydrolases. / G. J. Davies, K. S. Wilson, B. Henrissat // Biochem. J. - 1997. - T. 321 - № Pt 2 - 557-559c.

20. Davies G.J. Sorting the diverse: the sequence-based classifications of carbohydrate-active enzymes / G. J. Davies, M. L. Sinnott // Biochem J - 2008. - T. 30 - 26-32c.

21. Delzenne N.M. Effects of fructans-type prebiotics on lipid metabolism / N. M. Delzenne, N. Kok // Am. J. Clin. Nutr. - 2001. - T. 73 - № 2 Suppl - 456S-458Sc.

22. Dey P.M. Characteristic features of an alpha-galactosidase from mung beans / P. M. Dey // Eur. J. Biochem. - 1984. - T. 140 - № 2 - 385-390c.

23. Dey P.M. Induction of alpha-galactosidase in Pénicillium ochrochloron by guar (Cyamopsis tetragonobola) gum / P. M. Dey, S. Patel, M. D. Brownleader // Biotechnol. Appl. Biochem. - 1993. - T. 17 ( Pt 3) - 361-371c.

24. Dion M. Modulation of the regioselectivity of a Bacillus alpha-galactosidase by directed evolution / M. Dion, A. Nisole, P. Spangenberg, C. André, A. Glottin-Fleury, R. Mattes, C. Tellier, C. Rabiller // Glycoconj. J. - 2001. - T. 18 - № 3 - 215-223c.

25. Dogaris I. Biotechnological production of ethanol from renewable resources by Neurospora crassa: an alternative to conventional yeast fermentations? / I. Dogaris, D. Mamma, D. Kekos // Appl. Microbiol. Biotechnol. - 2013. - T. 97 - № 4 - 1457-1473c.

26. Drone J. Thermus thermophilus Glycosynthases for the Efficient Synthesis of Galactosyl and Glucosyl ß-(1^-3)-Glycosides / J. Drone, H. Feng, C. Tellier, L. Hoffmann, V. Tran, C. Rabiller, M. Dion // Eur. J. Org. Chem. - 2005. - T. 2005 - № 10 - 1977-1983c.

27. Eneyskaya E.V. Transglycosylation activity of alpha-D-galactosidase from Trichoderma reesei. An investigation of the active site / E. V. Eneyskaya, A. M. Golubev, A. M. Kachurin, A. N. Savel'ev, K. N. Neustroev // Carbohydr. Res. - 1997. -T. 305 - № 1 - 83-91c.

28. Eneyskaya E.V. Enzymatic synthesis of beta-xylanase substrates: transglycosylation reactions of the beta-xylosidase from Aspergillus sp / E. V. Eneyskaya, H. Brumer, L. V. Backinowsky, D. R. Ivanen, A. A. Kulminskaya, K. A. Shabalin, K. N. Neustroev // Carbohydr. Res. - 2003. - T. 338 - № 4 - 313-325c.

29. Eneyskaya E.V. Biochemical and kinetic analysis of the GH3 family ß-xylosidase from Aspergillus awamori X-100 / E. V. Eneyskaya, D. R. Ivanen, K. S. Bobrov, L. S. Isaeva-Ivanova, K. A. Shabalin, A. N. Savel'ev, A. M. Golubev, A. A. Kulminskaya // Arch. Biochem. Biophys. - 2007. - T. 457 - № 2 - 225-234c.

30. Eneyskaya E.V. Chemo-enzymatic synthesis of 4-methylumbelliferyl beta-(1-->4)-D-xylooligosides: new substrates for beta-D-xylanase assays / E. V. Eneyskaya, D. R. Ivanen, K. A. Shabalin, A. A. Kulminskaya, L. V. Backinowsky, H. Brumer Iii, K. N. Neustroev // Org. Biomol. Chem. - 2005. - T. 3 - № 1 - 146-151c.

31. Eng C.M. Safety and efficacy of recombinant human alpha-galactosidase A replacement therapy in Fabry's disease / C. M. Eng, N. Guffon, W. R. Wilcox, D. P. Germain, P. Lee, S. Waldek, L. Caplan, G. E. Linthorst, R. J. Desnick, International Collaborative Fabry Disease Study Group // N. Engl. J. Med. - 2001. - T. 345 - № 1 -9-16c.

32. Fazekas E. Unexpected mode of action of sweet potato ß-amylase on maltooligomer substrates. / E. Fazekas, K. Szabó, L. Kandra, G. Gyémánt // Biochim. Biophys. Acta -2013. - T. 1834 - № 10 - 1976-1981c.

33. Feng H.-Y. Converting a (beta)-glycosidase into a (beta)-transglycosidase by directed evolution / H.-Y. Feng, J. Drone, L. Hoffmann, V. Tran, C. Tellier, C. Rabiller, M. Dion // J. Biol. Chem. - 2005. - T. 280 - № 44 - 37088-37097c.

34. Franková L. Biochemistry and physiological roles of enzymes that «cut and paste» plant cell-wall polysaccharides / L. Franková, S. C. Fry // J. Exp. Bot. - 2013. - T. 64 -№ 12 - 3519-3550c.

35. Gabius H.-J. Chemical biology of the sugar code / H.-J. Gabius, H.-C. Siebert, S. André, J. Jiménez-Barbero, H. Rüdiger // Chembiochem Eur. J. Chem. Biol. - 2004. -T. 5 - № 6 - 740-764c.

36. Ganter C. Production of thermostable, recombinant a-galactosidase suitable for raffinose elimination from sugar beet syrup / C. Ganter, A. Böck, P. Buckel, R. Mattes // J. Biotechnol. - 1988. - T. 8 - № 4 - 301-310c.

37. Gebler J. Stereoselective hydrolysis catalyzed by related beta-1,4-glucanases and beta-1,4-xylanases / J. Gebler, N. R. Gilkes, M. Claeyssens, D. B. Wilson, P. Béguin, W. W. Wakarchuk, D. G. Kilburn, R. C. Miller, R. A. Warren, S. G. Withers // J. Biol. Chem. - 1992. - Т. 267 - № 18 - 12559-12561с.

38. Ghazi S. Improvement of the nutritive value of soybean meal by protease and alpha-galactosidase treatment in broiler cockerels and broiler chicks / S. Ghazi, J. A. Rooke, H. Galbraith // Br. Poult. Sci. - 2003. - Т. 44 - № 3 - 410-418с.

39. Gieselmann V. Lysosomal storage diseases / V. Gieselmann // Biochim. Biophys. Acta BBA - Mol. Basis Dis. - 1995. - Т. 1270 - № 2 - 103-136с.

40. Green M.R.Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Fourth Edition): Three-volume set / M. R. Green, J. Sambrook - Cold Spring Harbor, N.Y: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2012. Вып. 4th edition- 2028c.

41. Grizard D. Non-digestible oligosaccharides used as prebiotic agents: mode of production and beneficial effects on animal and human health / D. Grizard, C. Barthomeuf // Reprod. Nutr. Dev. - 1999. - Т. 39 - № 5-6 - 563-588с.

42. Hancock S.M. Engineering of glycosidases and glycosyltransferases / S. M. Hancock, M. D. Vaughan, S. G. Withers // Curr. Opin. Chem. Biol. - 2006. - Т. 10 - № 5 - 509-519с.

43. Hata D.J. Blood group B degrading activity of Ruminococcus gnavus alpha-galactosidase / D. J. Hata, D. S. Smith // Artif. Cells. Blood Substit. Immobil. Biotechnol. - 2004. - Т. 32 - № 2 - 263-274с.

44. Hehre E.J. A fresh understanding of the stereochemical behavior of glycosylases: structural distinction of «inverting» (2-MCO-type) versus «retaining» (1-MCO-type) enzymes / E. J. Hehre // Adv. Carbohydr. Chem. Biochem. - 1999. - Т. 55 - 265-310с.

45. Henrissat B. A classification of glycosyl hydrolases based on amino acid sequence similarities / B. Henrissat // Biochem. J. - 1991. - T. 280 ( Pt 2) - 309-316c.

46. Henrissat B. Updating the sequence-based classification of glycosyl hydrolases / B. Henrissat, A. Bairoch // Biochem. J. - 1996. - T. 316 ( Pt 2) - 695-696c.

47. Henrissat B. Conserved catalytic machinery and the prediction of a common fold for several families of glycosyl hydrolases. / B. Henrissat, I. Callebaut, S. Fabrega, P. Lehn, J. P. Mornon, G. Davies // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. - 1995. - T. 92 - № 15 -7090-7094c.

48. Hinz S.W.A. Increasing the transglycosylation activity of alpha-galactosidase from Bifidobacterium adolescentis DSM 20083 by site-directed mutagenesis / S. W. A. Hinz, C. H. L. Doeswijk-Voragen, R. Schipperus, L. A. M. van den Broek, J.-P. Vincken, A. G. J. Voragen // Biotechnol. Bioeng. - 2006. - T. 93 - № 1 - 122-131c.

49. Hiromi K. Interpretation of dependency of rate parameters on the degree of polymerization of substrate in enzyme-catalyzed reactions. Evaluation of subsite affinities of exo-enzyme / K. Hiromi // Biochem. Biophys. Res. Commun. - 1970. - T. 40 - № 1 - 1-6c.

50. Hiromi K. Subsite affinities of glucoamylase: examination of the validity of the subsite theory / K. Hiromi, Y. Nitta, C. Numata, S. Ono // Biochim. Biophys. Acta -1973. - T. 302 - № 2 - 362-375c.

51. Honda Y. Alternative strategy for converting an inverting glycoside hydrolase into a glycosynthase / Y. Honda, S. Fushinobu, M. Hidaka, T. Wakagi, H. Shoun, H. Taniguchi, M. Kitaoka // Glycobiology - 2008. - T. 18 - № 4 - 325-330c.

52. Honda Y. The First Glycosynthase Derived from an Inverting Glycoside Hydrolase / Y. Honda, M. Kitaoka // J. Biol. Chem. - 2006. - T. 281 - № 3 - 1426-1431c.

53. Hosie L. Effects of deuterium substitution alpha and beta to the reaction centre, 18O substitution in the leaving group, and aglycone acidity on hydrolyses of aryl glucosides and glucosyl pyridinium ions by yeast alpha-glucosidase. A probable failure of the antiperiplanar-lone-pair hypothesis in glycosidase catalysis. / L. Hosie, M. L. Sinnott // Biochem. J. - 1985. - T. 226 - № 2 - 437-446c.

54. Jordan D.B. Rate-limiting steps of a stereochemistry retaining P-d-xylosidase from Geobacillus stearothermophilus acting on four substrates. / D. B. Jordan, J. D. Braker // Arch. Biochem. Biophys. - 2015. - T. 583 - 73-78c.

55. Katrolia P. Biotechnological potential of microbial a-galactosidases / P. Katrolia, E. Rajashekhara, Q. Yan, Z. Jiang // Crit. Rev. Biotechnol. - 2014. - T. 34 - № 4 - 307-317c.

56. Kempton J.B. Mechanism of Agrobacterium .beta.-glucosidase: kinetic studies / J. B. Kempton, S. G. Withers // Biochemistry - 1992. - T. 31 - № 41 - 9961-9969c.

57. Kim Y.-W. Directed evolution of a glycosynthase from Agrobacterium sp. increases its catalytic activity dramatically and expands its substrate repertoire / Y.-W. Kim, S. S. Lee, R. A. J. Warren, S. G. Withers // J. Biol. Chem. - 2004. - T. 279 - № 41 - 42787-42793c.

58. Kishnani P.S. New therapeutic approaches for Pompe disease: enzyme replacement therapy and beyond / P. S. Kishnani, A. A. Beckemeyer // Pediatr. Endocrinol. Rev. PER - 2014. - T. 12 Suppl 1 - 114-124c.

59. Knegtel R.M. Crystallographic studies of the interaction of cyclodextrin glycosyltransferase from Bacillus circulans strain 251 with natural substrates and products / R. M. Knegtel, B. Strokopytov, D. Penninga, O. G. Faber, H. J. Rozeboom, K. H. Kalk, L. Dijkhuizen, B. W. Dijkstra // J. Biol. Chem. - 1995. - T. 270 - № 49 -29256-29264c.

60. Konishi M. Biochemical synthesis of novel, self-assembling glycolipids from ricinoleic acid by a recombinant a-glucosidase from Geobacillus sp. / M. Konishi, T. Fukuoka, Y. Shimane, K. Mori, Y. Nagano, Y. Ohta, D. Kitamoto, Y. Hatada // Biotechnol. Lett. - 2011. - T. 33 - № 1 - 139-145c.

61. Koshland D.E. Stereochemistry and the Mechanism of Enzymatic Reactions / D. E. Koshland // Biol. Rev. - 1953. - T. 28 - № 4 - 416-436c.

62. Kruskall M.S. Transfusion to blood group A and O patients of group B RBCs that have been enzymatically converted to group O / M. S. Kruskall, J. P. AuBuchon, K. Y. Anthony, L. Herschel, C. Pickard, R. Biehl, M. Horowitz, D. J. Brambilla, M. A. Popovsky // Transfusion (Paris) - 2000. - T. 40 - № 11 - 1290-1298c.

63. Kurakake M. Synthesis of galactosyl glycerol from guar gum by transglycosylation of a-galactosidase from Aspergillus sp. MK14. / M. Kurakake, T. Okumura, Y. Morimoto // Food Chem. - 2015. - T. 172 - 150-154c.

64. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 / U. K. Laemmli // Nature - 1970. - T. 227 - № 5259 - 680-685c.

65. Lang M. Influence of ionic liquid cosolvent on transgalactosylation reactions catalyzed by thermostable beta-glycosylhydrolase CelB from Pyrococcus Furiosus / M. Lang, T. Kamrat, B. Nidetzky // Biotechnol. Bioeng. - 2006. - T. 95 - № 6 - 1093-1100c.

66. Lenny L.L. Transfusions to group O subjects of 2 units of red cells enzymatically converted from group B to group O / L. L. Lenny, R. Hurst, J. Goldstein, R. A. Galbraith // Transfusion (Paris) - 1994. - T. 34 - № 3 - 209-214c.

67. Li Y.-K. Identification of the general acid/base catalyst of a family 3 beta-glucosidase from Flavobacterium meningosepticum / Y.-K. Li, J. Chir, S. Tanaka, F.-Y. Chen // Biochemistry (Mosc.) - 2002. - T. 41 - № 8 - 2751-2759c.

68. Liebl W. Properties of an alpha-galactosidase, and structure of its gene galA, within an alpha-and beta-galactoside utilization gene cluster of the hyperthermophilic bacterium Thermotoga maritima / W. Liebl, B. Wagner, J. Schellhase // Syst. Appl. Microbiol. - 1998. - T. 21 - № 1 - 1-11c.

69. Liu Q.P. Bacterial glycosidases for the production of universal red blood cells / Q. P. Liu, G. Sulzenbacher, H. Yuan, E. P. Bennett, G. Pietz, K. Saunders, J. Spence, E. Nudelman, S. B. Levery, T. White, J. M. Neveu, W. S. Lane, Y. Bourne, M. L. Olsson, B. Henrissat, H. Clausen // Nat. Biotechnol. - 2007. - T. 25 - № 4 - 454-464c.

70. Liu S.-W. Identification of Essential Residues of Human a-l-Fucosidase and Tests of Its Mechanism / S.-W. Liu, C.-S. Chen, S.-S. Chang, K.-K. T. Mong, C.-H. Lin, C.-W. Chang, C. Y. Tang, Y.-K. Li // Biochemistry (Mosc.) - 2009. - T. 48 - № 1 - 110-120c.

71. Lombard V. The carbohydrate-active enzymes database (CAZy) in 2013 / V. Lombard, H. Golaconda Ramulu, E. Drula, P. M. Coutinho, B. Henrissat // Nucleic Acids Res. - 2014. - T. 42 - № Database issue - D490-495c.

72. Lowry O.H. Protein measurement with the Folin phenol reagent / O. H. Lowry, N. J. Rosebrough, A. L. Farr, R. J. Randall // J. Biol. Chem. - 1951. - T. 193 - № 1 - 265-275c.

73. Ly H.D. Mutagenesis of glycosidases / H. D. Ly, S. G. Withers // Annu. Rev. Biochem. - 1999. - T. 68 - 487-522c.

74. Mackenzie L.F. Glycosynthases: Mutant Glycosidases for Oligosaccharide Synthesis / L. F. Mackenzie, Q. Wang, R. A. J. Warren, S. G. Withers // J. Am. Chem. Soc. - 1998. - T. 120 - № 22 - 5583-5584c.

75. Malet C. Mechanism of Bacillus 1,3-1,4-beta-D-glucan 4-glucanohydrolases: kinetics and pH studies with 4-methylumbelliferyl beta-D-glucan oligosaccharides / C. Malet, A. Planas // Biochemistry (Mosc.) - 1997. - T. 36 - № 45 - 13838-13848c.

76. Martinez-Villaluenga C. Improved method to obtain pure alpha-galactosides from lupin seeds / C. Martinez-Villaluenga, J. Frias, K. Gulewicz, C. Vidal-Valverde // J. Agric. Food Chem. - 2004. - T. 52 - № 23 - 6920-6922c.

77. Martinez-Villaluenga C. Alpha-galactosides: antinutritional factors or functional ingredients? / C. Martinez-Villaluenga, J. Frias, C. Vidal-Valverde // Crit. Rev. Food Sci. Nutr. - 2008. - T. 48 - № 4 - 301-316c.

78. McCutchen C.M. Characterization of extremely thermostable enzymatic breakers (alpha-1,6-galactosidase and beta-1,4-mannanase) from the hyperthermophilic bacterium Thermotoga neapolitana 5068 for hydrolysis of guar gum / C. M. McCutchen, G. D. Duffaud, P. Leduc, A. R. Petersen, A. Tayal, S. A. Khan, R. M. Kelly // Biotechnol. Bioeng. - 1996. - T. 52 - № 2 - 332-339c.

79. Meier H. Reserve Polysaccharides Other Than Starch in Higher Plants Encyclopedia of Plant Physiology / Springer, Berlin, Heidelberg, 1982. - 418-471c.

80. Millqvist-Fureby A. Enzymatic transformations in supersaturated substrate solutions: I. A general study with glycosidases / A. Millqvist-Fureby, I. S. Gill, E. N. Vulfson // Biotechnol. Bioeng. - 1998. - T. 60 - № 2 - 190-196c.

81. Moracci M. Restoration of the activity of active-site mutants of the hyperthermophilic beta-glycosidase from Sulfolobus solfataricus: dependence of the mechanism on the action of external nucleophiles / M. Moracci, A. Trincone, G. Perugino, M. Ciaramella, M. Rossi // Biochemistry (Mosc.) - 1998. - T. 37 - № 49 -17262-17270c.

82. Nakai H. Aspergillus nidulans alpha-galactosidase of glycoside hydrolase family 36 catalyses the formation of alpha-galacto-oligosaccharides by transglycosylation / H. Nakai, M. J. Baumann, B. O. Petersen, Y. Westphal, M. A. Hachem, A. Dilokpimol, J. 0. Duus, H. A. Schols, B. Svensson // FEBS J. - 2010. - T. 277 - № 17 - 3538-3551c.

83. Namchuk M. Fluorinated Sugars as Probes of Glycosidase Mechanisms ACS Symposium Series / American Chemical Society, 1996. - 279-293c.

84. Nelson N. A Photometric Adaptation of the Somogyi Method for the Determination of Glucose / N. Nelson // J. Biol. Chem. - 1944. - T. 153 - № 2 - 375-380c.

85. Osanjo G. Directed evolution of the alpha-L-fucosidase from Thermotoga maritima into an alpha-L-transfucosidase / G. Osanjo, M. Dion, J. Drone, C. Solleux, V. Tran, C. Rabiller, C. Tellier // Biochemistry (Mosc.) - 2007. - T. 46 - № 4 - 1022-1033c.

86. Petersen L. Catalytic strategies of glycoside hydrolases / L. Petersen // Grad. Theses Diss. - 2010.

87. Plou F.J. Application of Glycosidases and Transglycosidases in the Synthesis of Oligosaccharides Springer, Dordrecht, 2007. - 141-157c.

88. Rajan S.S. Novel catalytic mechanism of glycoside hydrolysis based on the structure of an NAD+/Mn2+ -dependent phospho-alpha-glucosidase from Bacillus subtilis / S. S. Rajan, X. Yang, F. Collart, V. L. Y. Yip, S. G. Withers, A. Varrot, J. Thompson, G. J. Davies, W. F. Anderson // Struct. Lond. Engl. 1993 - 2004. - T. 12 - № 9 - 1619-1629c.

89. Rantwijk F. van Biocatalytic transformations in ionic liquids / F. van Rantwijk, R. Madeira Lau, R. A. Sheldon // Trends Biotechnol. - 2003. - T. 21 - № 3 - 131-138c.

90. Rastall R.A. Enzymatic Synthesis of Oligosaccharides / R. A. Rastall, C. Bucke // Biotechnol. Genet. Eng. Rev. - 1992. - T. 10 - № 1 - 253-282c.

91. Rauter A.P.Carbohydrate Chemistry: Chemical and Biological Approaches / A. P. Rauter, T. Lindhorst, Y. Queneau - Royal Society of Chemistry, 2017.- 276c.

92. Sakuraba H. Structural and immunocytochemical studies on alpha-N-acetylgalactosaminidase deficiency (Schindler/Kanzaki disease) / H. Sakuraba, F.

Matsuzawa, S. Aikawa, H. Doi, M. Kotani, H. Nakada, T. Fukushige, T. Kanzaki // J. Hum. Genet. - 2004. - Т. 49 - № 1 - 1-8с.

93. Schaefer R.M. Enzyme replacement therapy for Fabry disease: a systematic review of available evidence / R. M. Schaefer, A. Tylki-Szymanska, M. J. Hilz // Drugs - 2009. - Т. 69 - № 16 - 2179-2205с.

94. Seeberger P.H. Chemical and Enzymatic Synthesis of Glycans and Glycoconjugates / под ред. A. Varki, R.D. Cummings, J.D. Esko, H.H. Freeze, P. Stanley, C.R. Bertozzi, G.W. Hart, M.E. Etzler. Cold Spring Harbor (NY): Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2009. Вып. 2nd.

95. Seki Y. Enhancement of Cellulose Degradation by Cattle Saliva / Y. Seki, Y. Kikuchi, Y. Kimura, R. Yoshimoto, M. Takahashi, K. Aburai, Y. Kanai, T. Ruike, K. Iwabata, F. Sugawara, H. Sakai, M. Abe, K. Sakaguchi // PloS One - 2015. - Т. 10 - № 9 - e0138902c.

96. Shallom D. The identification of the acid-base catalyst of alpha-arabinofuranosidase from Geobacillus stearothermophilus T-6, a family 51 glycoside hydrolase / D. Shallom, V. Belakhov, D. Solomon, S. Gilead-Gropper, T. Baasov, G. Shoham, Y. Shoham // FEBS Lett. - 2002. - Т. 514 - № 2-3 - 163-167с.

97. Shallom D. Detailed kinetic analysis and identification of the nucleophile in alpha-L-arabinofuranosidase from Geobacillus stearothermophilus T-6, a family 51 glycoside hydrolase / D. Shallom, V. Belakhov, D. Solomon, G. Shoham, T. Baasov, Y. Shoham // J. Biol. Chem. - 2002. - Т. 277 - № 46 - 43667-43673с.

98. Sinnott M.L. Catalytic mechanism of enzymic glycosyl transfer / M. L. Sinnott // Chem. Rev. - 1990. - Т. 90 - № 7 - 1171-1202с.

99. Tarling C.A. Identification of the catalytic nucleophile of the family 29 alpha-L-fucosidase from Thermotoga maritima through trapping of a covalent glycosyl-enzyme

intermediate and mutagenesis / C. A. Tarling, S. He, G. Sulzenbacher, C. Bignon, Y. Bourne, B. Henrissat, S. G. Withers // J. Biol. Chem. - 2003. - T. 278 - № 48 - 47394-47399c.

100. Tayal A. Rheology and Microstructural Changes during Enzymatic Degradation of a Guar-Borax Hydrogel / A. Tayal, V. B. Pai, S. A. Khan // Macromolecules - 1999. -T. 32 - № 17 - 5567-5574c.

101. Terwisscha van Scheltinga A.C. Stereochemistry of chitin hydrolysis by a plant chitinase/lysozyme and x-ray structure of a complex with allosamidin evidence for substrate assisted catalysis / A. C. Terwisscha van Scheltinga, S. Armand, K. H. Kalk, A. Isogai, B. Henrissat, B. W. Dijkstra // Biochemistry (Mosc.) - 1995. - T. 34 - № 48 -15619-15623c.

102. Thananunkul D. Degradation of raffinose and stachyose in soybean milk by a-galactosidase from Mortierella vinacea. Entrapment of a-galactosidase within polyacrylamide gel / D. Thananunkul, M. Tanaka, C. O. Chichester, T.-C. Lee // J. Food Sci. - 1976. - T. 41 - № 1 - 173-175c.

103. Tiwari P. P -Glucosidases from the fungus trichoderma: an efficient cellulase machinery in biotechnological applications / P. Tiwari, B. N. Misra, N. S. Sangwan // BioMed Res. Int. - 2013. - T. 2013 - 203735c.

104. Viladot J.L. Probing the mechanism of Bacillus 1,3-1,4-beta-D-glucan 4-glucanohydrolases by chemical rescue of inactive mutants at catalytically essential residues / J. L. Viladot, E. de Ramon, O. Durany, A. Planas // Biochemistry (Mosc.) -1998. - T. 37 - № 32 - 11332-11342c.

105. Vocadlo D.J. Catalysis by hen egg-white lysozyme proceeds via a covalent intermediate / D. J. Vocadlo, G. J. Davies, R. Laine, S. G. Withers // Nature - 2001. - T. 412 - № 6849 - 835-838c.

106. Volokitina M.V. Xylan degradation improved by a combination of monolithic columns bearing immobilized recombinant P-xylosidase from Aspergillus awamori X-100 and Grindamyl H121 P-xylanase / M. V. Volokitina, K. S. Bobrov, K. Piens, E. V. Eneyskaya, T. B. Tennikova, E. G. Vlakh, A. A. Kulminskaya // Biotechnol. J. - 2015. -T. 10 - № 1 - 210-221c.

107. Weignerova L. Enzymatic synthesis of three pNP-a-galactobiopyranosides: application of the library of fungal a-galactosidases / L. Weignerova, Z. Hunkova, M. Kuzma, V. Kren // J. Mol. Catal. B Enzym. - 2001. - T. 11 - № 4 - 219-224c.

108. Wolfenden R. Spontaneous Hydrolysis of Glycosides / R. Wolfenden, X. Lu, G. Young // J. Am. Chem. Soc. - 1998. - T. 120 - № 27 - 6814-6815c.

109. Xu B. Molecular and Biochemical Characterization of a Novel Xylanase from Massilia sp. RBM26 Isolated from the Feces of Rhinopithecus bieti / B. Xu, L. Dai, J. Li, M. Deng, H. Miao, J. Zhou, Y. Mu, Q. Wu, X. Tang, Y. Yang, J. Ding, N. Han, Z. Huang // J. Microbiol. Biotechnol. - 2016. - T. 26 - № 1 - 9-19c.

110. Yip V.L.Y. Mechanism of GlvA from Bacillus subtilis: a detailed kinetic analysis of a 6-phospho-alpha-glucosidase from glycoside hydrolase family 4 / V. L. Y. Yip, J. Thompson, S. G. Withers // Biochemistry - 2007. - T. 46 - № 34 - 9840-9852c.

111. Zechel D.L. Mechanism, mutagenesis, and chemical rescue of a beta-mannosidase from cellulomonas fimi / D. L. Zechel, S. P. Reid, D. Stoll, O. Nashiru, R. A. J. Warren, S. G. Withers // Biochemistry - 2003. - T. 42 - № 23 - 7195-7204c.

112. Zeng X. Regioselective synthesis of p-nitrophenyl glycosides of beta-D-galactopyranosyl-disaccharides by transglycosylation with beta-D-galactosidases / X. Zeng, R. Yoshino, T. Murata, K. Ajisaka, T. Usui // Carbohydr. Res. - 2000. - T. 325 -№ 2 - 120-131c.

113. Enzyme Nomenclature 1992: Recommendations of the Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology and the Nomenclature and Classification of Enzymes / / под ред. E.C. Webb, W. Stalmans. — San Diego: Academic Press, 1992. Вып. 1 edition- 862c.

114. CAZy - Home [Электронный ресурс]. URL: http://www.cazy.org/.

Thermotoga maritima MSB8 Thermus sp. T2 Thermotoga neapolitana Streptomyces coelicolor Thermus brockianus Thermus thermophilus HB27 Thermus thermophilus

Thermotoga maritima MSB8 Thermus sp. T2 Thermotoga neapolitana Streptomyces coelicolor Thermus brockianus Thermus thermophilus HB27 Thermus thermophilus

Thermotoga maritima MSB8 Thermus sp. T2 Thermotoga neapolitana Streptomyces coelicolor Thermus brockianus Thermus thermophilus HB27 Thermus thermophilus

Thermotoga maritima MSB8 Thermus sp. T2 Thermotoga neapolitana Streptomyces coelicolor Thermus brockianus Thermus thermophilus HB27 Thermus thermophilus

1 70

(1) MEIFGKTFREGRFVLKEKNFTVEFAVEKIHLGWKISGRVKGSPGRLEVLRTKAPEKVLVNNWQSWGPCRV

( 1 ) ------------MRLVLGGLEVPLKAQG---VE VL E D GAL L W G S E VRVH AP F RAE AF F RH GWQ SWS L AAW

(1) MEIFKRPFREGSFVLKEKDYTVEFEVEKIHLGWKISGRVKGNPGRLEIFRTNAPKKLLVNNWQSWGPCRV

(1) ----------MAQLVELGGRTLAVELAGDAPPRAVEGGLLLPPGRTAVLHGLGDALFYRHGHNSWSPCGW

( 1 ) ------------MRVKVG S L E VAL EAE E---VKAAPGGLYLKGREVRVYPPFRGEAFFRHGWQSWSLASW

( 1 ) ------------MRLNLGGAEVFLRAEG---LEEAPGGVRLWGREVRVFPPFPAKGFFRHGWQSWSLAAW

( 1 ) ------------MRLNLGGAEVFLRAEG---LEEAPGGVRLWGREVRVFPPFPAKGFFRHGWQSWSLAAW

71 140

(71) VDAFSFKPPEIDPNWRYTASWPDVLERNLQSDYFVAEEGKVYGFLSSKIAHPFFAVEDGELVAYLEYFD

(56) VGFGSK-RPLLPPERRPQADDPFLLESEELWGSGLGALRQRE--------RVLLLGALD P GARVLGRE-G

(71) VDLPSFTPPEIDPNWQYTASWPDVIKNRLQSDYFVAEEGRVYGFLSSKIAHPFFAAENGELVAYLEYFD

(61) RRLSEAPLRIESAERRLTADDTVWDDPARHHSSAVAALEGPDG-------RVLLLGALGLDVPRLTADRD

(56) VSLSQPPVPLLPPERQPQADDPFLLRASEWWGSGSAPWRGPEG-------RVLLLGALGVGARVLGRP-D

(56) VDPAQAPTPLLPEARRPQADDPFLLEAGAWWGSGVGALRGPDG-------RALLLGALDLGARVLGRE-D

(56) VDPAQAPTPLLPEARRPQADDPFLLEAGAWWGSGVGALRGPDG-------RALLLGALDLGARVLGRE-D

141 210

(141) VEFDDFVPLEPLWLEDPNTPLLLEKYAELVGMENNARVPKHTPTGWCSWYHYFLDLTWEETLKNLKLAK

(116) LLLGRYAGEGGRWFLAVGQEEEVFAAYAERLPGRTQ----NPSPRVWCSWYSFYTRISQDLFLEILESLK

(141) VKFDDFVPIEPFWLEDPNTSLLLEKYAELVGKENSARIPERTPVGWCSWYHYFLDLTWEETLKNLELAG

(124) TLTGWCERDGAPWFLALGSEEEVFAAYARHLGDRLGR-SDKRAGNVWCSWYAYYESITEEQLTKDVTALR

(118) LLLGRMEGEEGGWFVAWGSEEEVFPAYARLLPRRLL----GKPPRVWCSWYAFYTNISEVRLLQVLEEVA

(118) LLLGRYAGEGGAWFLAHGPEEEVFAAYAQLLPRRLS----GRPPRVWCSWYSFYTRIGEDLLLRVLDEVA

(118) LLLGRYAGEGGAWFLAHGPEEEVFAAYAQLLPRRLS----GRPPRVWCSWYSFYTRIGEDLLLRVLDEVA

211 280

(211) NFPFEVFQIDDAYEKDIGDWLVTRGDFPSVEEMAKVIAENGFIPGIWTAPFSVSETSDVFNEHPDWWKE

(182) GFPFEVFQVDDGWQRALGDWEPNARFPQGMAYLAGQIRARGFRPGLWLAPFLVTEDSSLFQERPEWLLRD

(211) EFPFEVFQIDDAYEKDIGDWLVTKKDFPSVDEMARTIQEKGFVPGIWTAPFSVSETSDVFNSYPDWWKE

(193) GLPFDWQVDDGWERAVGDWEANDKFPSGMRALADRITDAGLRPGLWIAPFIVLPGSRTARQRPELLLRD

(184) SYPFEVFQVDDGWQRALGDWEANERFPHGMAYLAERIRAKGLRPGLWLAPFLVTADSPIVHARPEWLLRD

(184) AFSFEVFQIDDGWQRALGDWEPNDRFPRGMAFLAERIRERGLRPGLWFAPFLVTADSPLFQMRPDWVLRD

(184) AFSFEVFQIDDGWQRALGDWEPNDRFPRGMAFLAERIRERGLRPGLWFAPFLVTADSPLFQMRPDWVLRD

Я

о

Г5

ta

-S fa о со

M H fD

ta cr S

0

Г5 H fD

Яс

S

1

M

ta м К H о

W

S

ö M

W

О

я

o\

Г5 fD

fD

Яс

Г5 H

es

M

Я

S

и о Ы

и X

я

и >

о

V

Si

а s

fD

S

s

fD

a

fD

V

a s

X

s E

X Si

S

s

о К s

Г5

ta о H S

e

о

43

Thermotoga maritima MSB8 Thermus sp. T2 Thermotoga neapolitana Streptomyces coelicolor Thermus brockianus Thermus thermophilus HB27 Thermus thermophilus

Thermotoga maritima MSB8 Thermus sp. T2 Thermotoga neapolitana Streptomyces coelicolor Thermus brockianus Thermus thermophilus HB27 Thermus thermophilus

Thermotoga maritima MSB8 Thermus sp. T2 Thermotoga neapolitana Streptomyces coelicolor Thermus brockianus Thermus thermophilus HB27 Thermus thermophilus

Thermotoga maritima MSB8 Thermus sp. T2 Thermotoga neapolitana Streptomyces coelicolor Thermus brockianus Thermus thermophilus HB27 Thermus thermophilus

281 350

(281) N-GEPKMAYRNWNKKIYALDLSKDEVLNWLFDLFSSLR-KMGYRYFKIDFLFAGAVPGERKKNITPIQAF

(252) GEGRLIPAGFNWGKPLFALDSGQEEVLDWLEMLIRKW-AWGYDYLKLDFLYAGALPGAEGEAR-----Y

(281) N-GMPKMAYRNWNRKIYALDLSNKEVLDWLFDLFSSLK-KMGYRYFKIDFLFAGAIPGERKENITPVQAF

(263) GRGEPWAGHNWGVGYWTLDLTLPAAQEHLRETIRRWREWGFTYLKLDFVGAGAVPGVRFADVGREEAY

(254) REGRPLPAGFNWGKPLLALDAGKEEVLAWVEGLIRKVC-SWGYDYLKLDFLYAASLPGAEGEGR-----Y

(254) GEGRPVRAGFNWGRPLYALDAGNEEWEWAADLVRKAL-AWGYDYLKLDFLYAAALPGAEGEAR-----Y

(254) GEGRPVRAGFNWGRPLYALDAGNEEWEWAADLVRKAL-AWGYDYLKLDFLYAAALPGAEGEAR-----Y

351 420

(349) RKGIETIRKAVGEDSFILGCGSPLLPAVGCVDGMRIGPDTAPFWGEHIEDN-----GAPAARWALRNAIT

(316) RRALERIRRAAG-GTYLLFSGAPILASLGLADGLRVGPDVAPYWDNEDRSVHLGDPTGPGLRNALRSTLH

(349) RKGMEVIRKAVG-DLFILGCGSPLLPAVGYVDGMRIGPDTTPFWGDQIEDN-----GAPAARWALRNAIT

(333) RTGLSIVREAAGPDAYLLGSGAPLLPSLGLVDAIRSGPDVAPMWEHYAT----QDPSDALARNAWNTVH

(318) RVAMERIRQAAG-DAYLLFCGAPVLASLGLADGLRVGPDVAPYWDNEDRSTWLGDPTGPGLRNALRTTLH

(318) RRAMARLREAAG-EAYLLFCGAPVLASLGLADGLRVGPDVAPYWDNEERSFWLADPTGPGLRNALRSTLH

(318) RRAMARLREAAG-EAYLLFCGAPVLASLGLADGLRVGPDVAPYWDNEERSFWLADPTGPGLRNALRSTLH

421 490

(414) RYFMHDRFWLNDPDCLILREEKTDLTQKEKELYSYTCGVLDNMIIESDDLSLVRDHGKKVLKETLELLGG

(385) RLWLKRKVHV-DPDWYFRQRFNLLSPSEM--------RLQQAMAEITGFKATSDPPAWLAPEEKEALIR

(413) RYFMHDRLWLNDPDCLILREEKTELTPKERELYSYTCGILDNMIIESDDLSLVKEHGRKVLRETLDLLGG

(399) RLWQSPLLEV-DPDWYFRSRLNLLTEQQQ--------GLLRDLADVCGFRAVSDPPGWLLPEELKAMEA

(387) RLWLRENVQV-DPDWFFRTRFNLLSPETM--------RLQEVLARYTGFKATSDPPSWLLPEEEVRLRG

(387) RLWLMENVHV-DPDWYFRTRFNLLSPEEM--------RLQEALAHFTGFKATSDPPSWLLPEEKGRLEA

(387) RLWLMENVHV-DPDWYFRTRFNLLSPEEM--------RLQEALAHFTGFKATSDPPSWLLPEEKGRLEA

491 559

(484) RPRVQNIMSEDLRYEIVSSGTLSGNVKIWDLNSREYHLEKEGKSSLKKRWKREDGRNFYFYEEGERE

(446) FLGQDLPWPLAPYRFRVGEEEVDYAPFP----------------------------------------

(483) KPRVLNIMTEDLKYEIVSSGTISGNTRLWDLKNREYHLEKEGKSSLRKKWKREDGRNFYFYEEGERE

(460) YLTGRPEVRRLGRYRFALDGREVDFGAAVTPGDEQRYPLA-----------------------------

(448) FLTEEGGVERLGPYRFRFGEEVLDYAPLL----------------------------------------

(448) FLAREVPVRRLGPYRFRVGEEEVDYAPLL----------------------------------------

(448) FLAREVPVRRLGPYRFRVGEEEVDYAPLL----------------------------------------

Обратите внимание, представленные выше научные тексты размещены для ознакомления и получены посредством распознавания оригинальных текстов диссертаций (OCR). В связи с чем, в них могут содержаться ошибки, связанные с несовершенством алгоритмов распознавания. В PDF файлах диссертаций и авторефератов, которые мы доставляем, подобных ошибок нет.