Исследование распространенности штаммов Mycobacterium tuberculosis с множественной лекарственной устойчивостью в Новосибирской области тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.03, кандидат биологических наук Сивков, Антон Юрьевич

• Сивков, Антон Юрьевич
• кандидат биологических наук
• 2008

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Сивков, Антон Юрьевич

ПЕРЕЧЕНЬ СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР "ИЗУЧЕНИЕ ЭПИДЕМИОЛОГИИ

ТУБЕРКУЛЕЗА МЕТОДАМИ ГЕНОТИПИРОВАНИЯ".

Общая характеристика микобактерий туберкулеза.

Применение генотипирования микобактерий.

Генотипирование на основе изучения полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ).

Генотипирование по IS6110.

PGRS-генотипирование.

Двойная ПЦР повторяющихся элементов (double - repetitive - element PCR).

GTG)5-THnnpoBaHHe.

AFLP.

IS6110 ПЦР.

Полугнездовая IS6110 ПЦР.

VNTR.

Сполиготипирование.

Сравнительная характеристика различных методов генотипирования.

Филогенетический анализ результатов генотипирования.

Методы кластерного анализа.

Меры расстояния между нзолятами.

Методы определения расстояния между кластерами.

Методы кластеризации данных.

Интерпретация результатов генотипирования.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Исследование распространенности штаммов Mycobacterium tuberculosis с множественной лекарственной устойчивостью в Новосибирской области»

Актуальность проблемы

На сегодняшний день около трети населения инфицировано микобактериями туберкулеза (WHO, 2008). Особенно опасными являются микобактерии с множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ), устойчивые к двум самым мощным противотуберкулезным препаратам - изониазиду и рифампицину. Появляются такие штаммы как следствие неправильного употребления противотуберкулезных препаратов в ходе лечения заболевания (WHO, Nov. 2007). Каждый год во всем мире заболевают МЛУ-формами туберкулеза около 400 тыс. лиц (WHO, June 2007). Для лечения туберкулеза с множественной лекарственной устойчивостью требуется более длительная терапия препаратами второй линии, которые стоят дороже и вызывают больше побочных эффектов (WHO, 2008).

При неправильном лечении больных МЛУ-формами туберкулеза противотуберкулезными препаратами второй линии у них могут быть отселектированы штаммы М. tuberculosis с широкой лекарственной устойчивостью (ШЛУ) (WHO, 2008). Такие штаммы устойчивы не только к рифампицину и изониазиду, но и ко всем фторхинолонам и, как минимум, к одному из трех инъекционных препаратов второй линии (капреомицину, канамицину или амикацину). Они способны распространяться воздушно-капельным путем в популяции и с трудом поддаются лечению (WHO, June 2007). Особенно опасно то, что течение заболевания после инфицирования ШЛУ или МЛУ штаммами не отличается от обычного туберкулеза. В развитых странах с наилучшими на сегодня системами диагностики и лечения туберкулеза удалось добиться излечения больных ШЛУ-туберкулезом лишь в 30% случаев (WHO, 2008).

По данным ВОЗ, на конец 2007 года уже в 35 странах были обнаружены ШЛУ-штаммы М. tuberculosis (WHO, Nov. 2007). В России, по-видимому, эти штаммы также получили распространение. Только в Томской области в течение 2002-2005 гг. было выявлено 30 ШЛУ-штаммов среди исследованных 458 МЛУ-изолятов (6,6%) (WHO, 2008). Дальнейшее распространение ШЛУ- и МЛУ-штаммов угрожает, по мнению ВОЗ, возникновением эпидемии туберкулеза, для лечения которого доступных на сегодняшний день лекарственных средств будет недостаточно (WHO, 2008).

В ВОЗ была принята программа борьбы с распространением МЛУ- и ШЛУ-туберкулеза в мире. Программа начала осуществлятся с 2008 года. Общий бюджет на 2008-2009 гг. сотавляет около 2,15 млрд долларов США (WHO, June 2007). Среди важнейших целей программы находятся усиление и расширение надзора за МЛУ- и ШЛУ-туберкулезом; и поддержка исследований, направленных на создание новых тест-систем для быстрого выявления лекарственно-устойчивого туберкулеза (WHO, June 2007).

Цели и задачи исследования

Целью данной работы являлось исследование распространенности МЛУштаммов М. tuberculosis в Новосибирской области.

Для достижения поставленной цели планировалось решение следующих задач.

1. Оценить возможность определения устойчивости микобактерий туберкулеза к рифампицину с помощью биочипа.

2. Определить доминирующие механизмы возникновения и распространения М Л У-штам мов.

3. Выявить очаги заболеваемости лекарственно-устойчивыми формами туберкулеза на территории Новосибирской области.

Научная новизна

• При параллельном исследовании лекарственной устойчивости к рифампицину чистых культур микобактерий туберкулеза бактериологическим методом и с помощью биочипа было установлено, что результаты совпадают в 86% случаев.

• Одной из возможных причин несовпадения результатов может быть присутствие в клинических изолятах смеси устойчивых и чувствительных штаммов. Следовательно, положительный результат определения лекарственной устойчивости может быть использован при принятии решения о выборе противотуберкулезных препаратов, а отрицательный -нет. Если биочипом изолят определяется, как чувствительный, необходимы дополнительные исследования его лекарственной устойчивости.

• Продемонстрирована на примере штаммов, циркулирующих в Новосибирской области, возможность использования биочипа, определяющего только устойчивость к рифампицину, для выявления МЛУ-изолятов М. tuberculosis, поскольку в 91% случаев устойчивость к рифампицину ассоциирует с множественной лекарственной устойчивостью.

• Показано, что в Новосибирской области доминируют штаммы Пекинского семейства. Их доля составляет не менее 48%.

• Показано, что Пекинские штаммы, циркулирующие в Новосибирской области, генетически неоднородны. Впервые комбинацией двух методов генотипирования - IS6110 и MIRU - среди Пекинских штаммов выявлены две генетических группы, в которых доминировали МЛУ-изоляты (89 и 100% соответственно).

• Впервые молекулярно-генетическими методами были исследованы причины распространения лекарственно-устойчивых штаммов в регионе. Установлено: МЛУ-штаммы возникают в специализированных противотуберкулезных учреждениях, оттуда они попадают в популяцию, где и формируют очаги заболевания МЛУ-формами туберкулеза. Очаги МЛУ-туберкулеза не совпадают с очагами заболевания лекарственно-чувствительным туберкулезом.

Практическая значимость

Разработан и запатентован способ регенерации полинуклеотидных биочипов, который с успехом был применен и для регенерации объемных полиакриламидных чипов. С его помощью удалось до восьми раз регенерировать полинуклеотидные биочипы.

Удалось усовершенствовать методику применения биочипа для определения устойчивости к рифампицину путем совмещения двух стадий ПЦР в одной пробирке. Разработанная методика может быть использована при массовых скрининговых исследованиях устойчивости к рифампицину и выявлении МЛУ-штаммов М. tuberculosis.

Использование разработанного нами усовершенствованного метода определения устойчивости к рифампицину с помощью биочипа поможет снизить вероятность кросс-контаминации при проведении массовых исследований, значительно удешевляет стоимость анализа и резко повышает его производительность. Предложенная нами методика может быть использована при массовом мониторинге штаммов с множественной лекарственной устойчивостью и изучения их географического распространения в регионе.

Положения, выносимые на защиту

1. Использование ТБ-Биочипа позволяет определять устойчивость микобактерии туберкулеза к рифампицину.

2. Предложенный метод наработки одноцепочечного меченого фрагмента ДНК позволяет совместить две стадии ПЦР в одной пробирке без изменений в специфичности и чувствительности анализа мутаций с помощью биочипа.

3. Полиакриламидные биочипы могут быть регенерированы до 8 раз.

4. Среди изолятов М. tuberculosis, циркулирующих в г. Новосибирске и Новосибирской области, преобладают штаммы, относящиеся к Пекинскому семейству.

5. Среди Пекинских штаммов выделяются генетические группы, в которых встречаемость МЛУ выше, чем в среднем по семейству.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 152 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, главы «Материалы и методы», главы «Результаты и обсуждение», заключения, выводов и списка литературы. Библиография включает 160 работ: 18 - отечественных авторов и 142 - зарубежных. Работа иллюстрирована 55 рисунками и включает 6 таблиц.

Апробация работы и публикации

Полученные результаты исследований были представлены: на «Межрегиональной научной конференции, посвященной 100-летию со дня рождения академика АМН СССР С.П. Карпова» (Томск, Россия, 2003), XIV научной конференции-конкурсе молодых ученых ГНЦ ВБ «Вектор» (Новосибирск, Россия, 2003), симпозиуме «Интегративная медицина в XXI веке» (Судак, Украина, 2004), международной конференции «Развитие международного сотрудничества в области изучения инфекционных заболеваний» (Новосибирск, Россия, 2004), 8

Российской научно-практической конференции «Генодиагностика инфекционных болезней», (Новосибирск, Россия, 2005), «26lh Annual Congress of the European Society of Mycobacteriology», (Istanbul, Turkey, 2005), Российской школе-конференции молодых ученых «Экотоксикология: современные биоаналитические системы, методы и технологии» (Пущиио, Россия, 2006), III Российской конференции с международным участием «Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера» (Новосибирск, Россия, 2006), конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, Россия, 2007), II Российско-Германской конференции форума Коха-Мечникова (Томск, Россия, 2007).

Работа «Оценка вклада генотипа Beijing в формирование лекарственной устойчивости микобактерий туберкулеза в Новосибирской области» была представлена на конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, Россия, 2007) и награждена медалью Конгресса.

По материалам диссертации был получен патент № 2270870 от 25.12.2003 «Способ регенерации нуклеотидных биочипов» Болдырев А.Н. Сивков А.Ю. Татьков С.И.

По материалам диссертации было опубликовано 5 статей, все в журналах, рекомендованных ВАК для кандидатских диссертаций.

Личный вклад соискателя

Диссертационная работа была выполнена соискателем в 2002-2006 гг. в лаборатории разработки новых методов диагностики заболеваний человека ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора в рамках выполнения проектов МНТЦ №2019 и №1980, а также госпрограммы РФ (договор № 03/2512/1).

На разных этапах в работе принимали участие Татьков С.И., Болдырев А.Н., Боднев С.А., Туманов Ю.В., Кузьмичева Г.А., Азаев М.Ш., Ивлев-Дунтау А.П., Филипенко М.Л., Рот М.А., Цильковская И. Всем им автор приносит искреннюю благодарность.

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Сивков, Антон Юрьевич

Выводы:

1. Как было установлено, в 86% образцов чистых культур М. tuberculosis результаты определения устойчивости биочипом совпадают с результатами определения микробиологическим методом. В 10% чистых культур, выделенных из мокроты больных, биочип детектировал смесь устойчивых и чувствительных штаммов, вследствие чего результаты определения лекарственной устойчивости не совпадали с полученными на среде Левенштейна-Йенсена.

122

2. «ТБ-биочип» может быть использован для выявления МЛУ-штаммов, так как 91% изолятов, устойчивых к рифампицину, также резистентен и к изониазиду,

3. Усовершенствование методики использования биочипа - совмещение двух последовательных стадий ПЦР в одной пробирке и многократная регенерация биочипа - позволяет значительно удешевить применение биочипа и использовать его для скрининга больших популяций.

4. В ходе изучения механизмов возникновения и распространения МЛУ-штаммов М. tuberculosis молекулярно-генегическими методами было установлено, что устойчивые изоляты, хотя и селектируются в ходе лечения, уже к 2001-2003 гг получили значительное распространение среди населения Новосибирской области, где к этому времени уже были сформированы очаги заболевания МЛУ-формами туберкулеза.

5. Различными методами типирования установлено, что в Новосибирской области доминируют штаммы Пекинского семейства. Их доля составляет не менее 48%.

6. Пекинские штаммы, циркулирующие в Новосибирской области, генетически неоднородны. Впервые комбинацией двух методов генотипирования - IS6110 и VNTR - среди Пекинских 'штаммов выявлены две генетических группы, в которых частота встречаемости МЛУ (89 и 100% соответственно) была достоверно выше, чем в среднем по выборке.

7. Показано, что для выявления эпидемиологических связей между больными недостаточно использовать только один из методов генотипирования. Необходимо применять как минимум два. Комбинация IS6110 и MIRU дает очень высокое разрешение и может быть использована для изучения эпидемиологических связей между конкретными больными.

Заключение

Итак, изучение распределения новых случаев заболевания по районам Новосибирской области позволило выявить очаги эпидемии туберкулеза. В четырех районах области (Венгеровском, Колыванском, Коченевском и Тогучинском) уровень заболеваемости туберкулезом превысил 200 случаев на сто тысяч населения в 2000-2005 гг.

Также неравномерно были распределены случаи заболевания туберкулезом с множественной лекарственной устойчивостью. В Сузунском и Северном районах доля МЛУ-туберкулеза среди впервые выявленных больных, составила 25-30%. Очевидно, в Новосибирской области существуют два типа очагов заболевания туберкулезом. В первом доминируют штаммы, чувствительные к противотуберкулезным препаратам или имеющие спектр лекарственной устойчивости, не относящийся к МЛУ. Во втором - преобладают МЛУ-штаммы. Таким образом, в Новосибирской области к 2004 году уже сформировались очаги с заболеваемостью туберкулезом с множественной лекарственной устойчивостью.

Большинство впервые выявленных больных туберкулезом относилось к категориям неработающих (62,8%) и рабочих (23,2%).

В нашем регионе устойчивость к рифампицину является надежным признаком наличия множественной лекарственной устойчивости, и выявление устойчивости к рифампицину любым экспресс-методом с вероятностью 91% поможет быстро определить МЛУ-штаммы М. tuberculosis.

Как нами было установлено, одним из эффективных методов определения лекарственной устойчивости М. tuberculosis является биочиповый метод. Особенно эффективен этот метод для определения устойчивости к рифампицину, поскольку обе стадии полимеразной цепной реакции могут быть проведены в одной пробирке, а биочип после анализа может быть многократно регенерирован. Использование разработанного нами усовершенствования метода определения устойчивости к рифампицину снижает вероятность кросс-контаминаций, значительно удешевляет стоимость анализа и резко повышает его производительность. Предложенная нами методика может быть использована при массовом мониторинге штаммов с множественной лекарственной устойчивостью и изучения их географического распространения в регионе.

Вместе с тем было установлено, что биочип приблизительно в 10% случаев дает иные значения лекарственной устойчивости к рифампицину, чем микробиологический метод. Согласно нашим наблюдениям, причиной такого разночтения является присутствие в анализируемых культурах смеси резистентных и чувствительных штаммов. В этой связи важно подчеркнуть, что результат определения лекарственной чувствительности с помощью биочипа следует принимать во внимание тогда, когда биочип выявляет лекарственную устойчивость. В противном же случае необходимо дополнительные исследования, например, с помощью ПЦР реального времени, которая может выявлять присутствие в смеси культур 1% лекарственно-устойчивого штамма.

Исследование генетического многообразия популяции М. tuberculosis в

Новосибирской области выявило доминирование штаммов, относящихся к

Пекинскому семейству. По нашим данным, на их долю приходится не менее 48%.

Штаммы Пекинского семейства, выявленные на территории Новосибирской области, также неоднородны. Среди них методами генетического тппированпя

121 были выявлены как в Новосибирске, так и в области, высоко гомологичные группы, которые ассоциируют с высокой встречаемостью среди них МЛУ. Другие группы Пекинских штаммов не ассоциированы с наличием множественной лекарственной устойчивости. Полученные данные позволяют предположить, что генетические особенности некоторых близкородственных групп штаммов благоприятствуют приобретению ими множественной лекарственной устойчивости. В дальнейшем, представляется крайне интересным исследовать более подробно генетические свойства этих штаммов, их вирулентность, трансмиссивность и фитнес, чтобы понять причины, почему именно среди них так часто встречаются штаммы с множественной лекарственной устойчивостью.

Среди генетических причин возникновения устойчивости к рифампицину оказался тот же набор мутаций, который был описан в литературе. Также как и в других регионах, наиболее часто выявлялась мутация Ser531Leu.

Применение для анализа гетерогенности популяции Новосибирской области одновременно нескольких методов типирования показало, что для надежного определения эпидемиологических связей между больными молекулярно-генетнческими методами одного метода генотипирования недостаточно. Кластеры, выделяемые методом ПДРФ-186110, или MIRU-VNTR, при совместном использовании обоих методов для типирования разрешаются на индивидуальные штаммы или малочисленные кластеры (2 изолята). Таким образом, поскольку в нашем регионе широкое распространение получили штаммы Пекинского семейства, которые образуют хотя и дивергентную, но генетически однородную группу, для выявления эпидемиологических связей необходимо применять не менее двух методов генотипирования, использующих разные системы маркеров.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Сивков, Антон Юрьевич, 2008 год

1. Болдырев А.Н., Сивков А.Ю., Татьков С.И. // Способ регенерации одноразовых нуклеотидных биочипов, используемых в анализах с флуоресцентными метками. Патент РФ №2270870 от 25 декабря 2003 г.

2. Генерозов Э.В., Акопиан Т.А., Говорун В.М. и др. // Генодиагностика в современной медицине. Материалы 3-ей всероссийской конференции.-2000.-С.273-274.

3. Генерозов Э.В., Т.А. Акопян, М.А. Владимирский, Л.К. Шипина, О.А. Пртуганова, В.М. Говорун. Прямой генетический анализ резистентности к рифампицину изолятов М. tuberculosis в образцах мокроты. // Проблемы туберкулеза и болезни легких.-2003.-№4.-С.49-52.

4. Краснов В. А. Состояние противотуберкулезной помощи населению Сибирского и Дальневосточного федеральных округов // 2004.

5. Литвинов В.И., Сельцовский П.П. Туберкулез: проблемы и перспективы. // Сборник.: Туберкулез сегодня: проблемы и перспективы.-2000.-№9-С.13.

6. Нарвская О.В., Мокроусов И.В., Лимещенко Е.В. . Молекулярно-генетическая характеристика микобактерий туберкулеза, выделенных в северо-западном регионе России. // В сб.: Туберкулез сегодня: проблемы и перспективы.-2000.-С.210-211.

7. Нарвская О.В., Мокроусов И.В., Огген Т.Ф., Вишневский Б.И. Генетическое маркирование полирезистентных штаммов М. tuberculosis, выделенных на северо-западе России. // Проблемы туберкулеза.-1999.-№3.-С.39-41.

8. Норкина О.В., Филипенко М.Л., Никонова А.А., Татьков С.И. и др. Молекулярно-генетическая характеристика устойчивых к рифампицину изолятов М. tuberculosis, выделенных в Новосибирске. // Проблемы туберкулеза и болезни легких.-2003.-№12.-С.22-26.

9. Самойлова А.Г., А.О. Марьяндышев. Лекарственная устойчивость микобактерий туберкулеза актуальная проблема фтизиатрии. // Проблемы туберкулеза и болезни легких.-2005.-№7.-С.3-9.

10. Тунгусова О.С., А.О. Марьяндышев. Молекулярная генетика туберкулеза. // Проблемы туберкулеза и болезни легких.-2003.-№11.-С.39-42.

11. Тунгусова О.С., А.О. Марьяндышев. Использование математических моделей для интерпретации эпидемеческой ситуации по туберкулезу. // Проблемы туберкулеза и болезни легких.-2006.-№9.-С.23-26.

12. Урсов И.Г. Эпидемиология туберкулёза. // Эпидемиология туберкулёза.-1997.-С.170.

13. Шагинян И.А., Гинцбург А.Л. ПЦР-генетическое типирование патогенных микроорганизмов // Генетика.-1995, № 5.-С.600-610.

14. Шемякин И.Г., Степаншина В.Н., Манзенюк О.Ю. и др. Использование молекулярно-биологических методов для индивидуальной характеристики штаммов Mycobacterium tuberculosis. // Журн. микробиол.-2000.-№2.-С.6-11.

15. Albert H., Trollip A. P., Mole R. J., Hatch S. J., Blumberg L. Rapid indication of multidrug-resistant tuberculosis from liquid cultures using FASTPlaqueTB-RIF, a manual phage-based test. // Int J Tuberc Lung Dis.-2002.-Vol.6.-P.523-8.

16. Avkan Oguz V., C. Eroglu, S. Guneri, N. Yapar, A. Oztop, A. Sanic, A. Yuce. RpoB gene mutations in rifampin-resistant Mycobacterium tuberculosis strains isolated in the Aegean region of Turkey. 11 J Chemother.-2004.-Vol.l6.-P.442-5.

17. Billington О. J., Т. D. McHugh, S. H. Gillespie. Physiological Cost of Rifampin Resistance Induced In Vitro in Mycobacterium tuberculosis. // Antimicrob. Agents Chemother.-1999.-Vol.43 .-P. 1866-1869.

18. Bottger E. С., M. Pletschette, D. Andersson. Drug resistance and fitness in Mycobacterium tuberculosis infection. // J Infect Dis.-2005.-Vol. 191.-P.823-4.

19. Bottger EC Springer B, Pletschette M, Sander P. Fitness of antibiotic-resistant microorganisms and compensatory mutations. // Nat Med.-1998.-VoI.Dec;4(12).-P.1343-4.

20. Breese P. E., Burman W. J., Hildred M., Stone В., Wilson M. L., Yang Z., Cave M. D. The effect of changes in laboratory practices on the rate of false-positive cultures for Mycobacterium tuberculosis. // Arch Pathol Lab Med.-2001.-Vol.125.-P.1213-1216.

21. Zaman, F. Portaels, N. Rastogi C. Sola. Mycobacterium tuberculosis complex genetic diversity: mining the fourth international spoligotyping database (SpolDB4) for classification, population genetics and epidemiology. // BMC Microbiol.-2006.-Vol.6.-P.23.

22. Burgos M.V., A. S. Pym. Molecular epidemiology of tuberculosis. // Eur Respir J Suppl.-2002.-Vol.36.-P.54-65.

23. Cave M. D., K. D. Eisenach, P. F. McDermott, J. H. Bates, J. T. Crawford. IS6110: conservation of sequence in the Mycobacterium tuberculosis complex and its utilization in DNA fingerprinting. // Mol Cell Probes.-1991.-Vol.5.-P.73-80.

24. Cave M. D., K. D. Eisenach, G. Templeton, M. Salfinger, G. Mazurek, J. H. Bates, J. T. Crawford. Stability of DNA fingerprint pattern produced with IS6110 in strains of Mycobacterium tuberculosis. // J Clin Microbiol.-1994.-Vol.32.-P.262-6.

25. Chaves F., M. Alonso-Sanz, M. J. Rebollo, J. C. Tercero, M. S. Jimenez, A. R. Noriega. RpoB mutations as an epidemiologic marker in rifampin-resistant Mycobacterium tuberculosis. // Int J Tuberc Lung Dis.-2000.-Vol.4.-P.765-70.

26. Cole S. T. Comparative mycobacterial genomics. // Curr. Opin. Microbiol.-1998.-Vol.l.-P.567-571.

27. Collins D. M., D. M. Stephens. Identification of an insertion sequence, IS 1081, in Mycobacterium bovis. // FEMS Microbiol Lett.-1991.-Vol.67.-P.l 1-5.

28. Cummings M. P., M. R. Segal. Few amino acid positions in rpoB are associated with most of the rifampin resistance in Mycobacterium tuberculosis. // BMC Bioinformatics.-2004.-Vol.5.-P. 137.

29. Dahle U. R., P. Sandven, E. Heldal, D. A. Caugant. Continued low rates of transmission of Mycobacterium tuberculosis in Norway. // J Clin Microbiol.-2003.-Vol.41.-P.2968-73.

30. Dahle U. R., P. Sandven, E. I-Ieldal, T. Mannsaaker, D. A. Caugant. Deciphering an outbreak of drug-resistant Mycobacterium tuberculosis. // J Clin Microbiol.-2003.-Vol.41.-P.67-72.

31. Dale J. W., R. M. Nor, S. Ramayah, Т. H. Tang, Z. F. Zainuddin. Molecular epidemiology of tuberculosis in Malaysia. // J Clin Microbiol.-1999.-Vol.37.-P.1265-8.

32. Deng J. Y., X. E. Zhang, Y. Mang, Z. P. Zhang, Y. F. Zhou, Q. Liu, H. B. Lu, Z. J. Fu. Oligonucleotide ligation assay-based DNA chip for multiplex detection of single nucleotide polymorphism. // Biosens Bioelectron.-2004.-Vol.l9.-P.1277-83.

33. El-Hajj H., Salvatore A. E., Marras S., Tyagi F., R. Krame, D. Alland. Detection of Rifampin Resistance in Mycobacterium tuberculosis in a Single Tube with Molecular Beacons. //J. Clin. Microbiol.-2001.-Vol.39.-P.4131-4137.

34. Fang Z., N. Morrison, B. Watt, C. Doig, K. J. Forbes. IS6110 transposition and evolutionary scenario of the direct repeat locus in a group of closely related Mycobacterium tuberculosis strains. // J Bacteriol.-1998.-Vol.l80.-P.2102-9.

35. Fredricks D. N., D. A. Relman. Application of polymerase chain reaction to the diagnosis of infectious diseases. // Clin Infect Dis.-1999.-Vol.29.-P.475-86.

36. Friedman C. R., M. Y. Stoeckle, W. D. Johnson, Jr.L. W. Riley. Double-repetitive-element PCR method for subtyping Mycobacterium tuberculosis clinical isolates. // J Clin Microbiol.-1995.-Vol.33.-P. 1383-4.

37. Frothingham R., H. G. Hills, К. H. Wilson. Extensive DNA sequence conservation throughout the Mycobacterium tuberculosis complex. // J Clin Microbiol.-1994.-Vol.32.-P. 1639-43.

38. Frothingham R.W., A. Meeker-O'Connell. Genetic diversity in the Mycobacterium tuberculosis complex based on variable numbers of tandem DNA repeats. // Microbiology.-1998.-Vol. 144.-P. 1189-96.

39. Gagneux S., C. D. Long, P. M. Small, T. Van, G. K. Schoolnik, B. J. Bohannan. The competitive cost of antibiotic resistance in Mycobacterium tuberculosis. // Science.-2006.-Vol.312.-P. 1944-6.

40. Garcia de Viedma D., Marin M., Ruiz M. J., Bouza E. Analysis of clonal composition of Mycobacterium tuberculosis isolates in primary infections in children. // J Clin Microbiol.- 2004.-Vol.42.-P.3415-3418.

41. Godfrey-Faussett P., N. G. Stoker, J. A. Scott, G. Pasvol, P. Kelly, L. Clancy. DNA fingerprints of Mycobacterium tuberculosis do not change during the development of rifampicin resistance. // Tuber Lung Dis.-l993.-Vol.74.-P.240-3.

42. Goguet de la Salmoniere У. О., H. M. Li, G. Torrea, A. Bunschoten, J. van Embden, B. Gicquel. Evaluation of spoligotyping in a study of the transmission of Mycobacterium tuberculosis. // J Clin Microbiol.-1997.-Vol.35.-P.2210-4.

43. Gordon S. V., B. Heym, J. Parkhill, B. Barrell, S. T. Cole. New insertion sequences and a novel repeated sequence in the genome of Mycobacterium tuberculosis H37Rv. // Microbiology.-1999.-Vol.l45(Pt 4).-P.881-92.

44. Greifinger R., Grabau J., Quinlan A. et al. . Transmission of multidrug-resistant tuberculosis among immunocompromised persons in a correctional system. New York. 1991. //Morbid. Mortal.Weekly Rep.-1992.-Vol.V.41.-P.507-509.

45. Horgen L., C. Sola, A. Devallois, K. S. Goh, N. Rastogi. Follow up of Mycobacterium tuberculosis transmission in the French West Indies by IS6110-DNA fingerprinting and DR-based spoligotyping. // FEMS Immunol Med Microbiol.-1998.-Vol.21 .-P.203-12.

46. Huitric E., J. Werngren, P. Jureen, S. Hoffner. Resistance levels and rpoB gene mutations among in vitro-selected rifampin-resistant Mycobacterium tuberculosis mutants. // Antimicrob Agents Chemother.-2006.-Vol.50.-P.2860-2.

47. Ichiyama S., K. Suzuki. Clinical application of testing methods on acid-fast bacteria. // Kekkaku.-2005.-Vol.80.-P.95-111.

48. Jin D. J., C. A. Gross. Mapping and sequencing of mutations in the Escherichia coli rpoB gene that lead to rifampicin resistance. // J Mol Biol.-1988.-Vol.202.-P.45-58.

49. Jones W. D. Bacteriophage typing of Mycobacterium tuberculosis cultures from incidents of suspected laboratory cross-contamination // Tubercle.-1988.-Vol.69.-P.43-46

50. Mani C., N. Selvakumar, S. Narayanan, P. R. Narayanan. Mutations in the rpoB gene of multidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis clinical isolates from India. // J Clin Microbiol.-2001.-Vol.39.-P.2987-90.

51. Mariam D. II., Y. Mengistu, S. E. Hoffner, D. I. Andersson. Effect of rpoB mutations conferring rifampin resistance on fitness of Mycobacterium tuberculosis. //Antimicrob Agents Chemother.-2004.-Vol.48.-P. 1289-94.

52. Mikhailovich V. M., S. A. Lapa, D. A. Gryadunov, B. N. Strizhkov, A. Y. Sobolev, О. I. Skotnikova, O. A. Irtuganova, A. M. Moroz, V. I. Litvinov, L. K.

53. Miller L. P., J. T. Crawford, Т. M. Shinnick. The rpoB gene of Mycobacterium tuberculosis. // Antimicrob. Agents Chemother.-1994.-Vol.38.-P.805-811.

54. Mokrousov I., E. Limeschenko, A. Vyazovaya, O. Narvskaya. Corynebacterium diphtheriae spoligotyping based on combined use of two CRISPR loci. // Biotechnol J.-2007.-Vol.2.-P.901-6.

55. Mokrousov I., T. Otten, B. Vyshnevskiy, O. Narvskaya. Allele-Specific rpoB PCR Assays for Detection of Rifampin-Resistant Mycobacterium tuberculosis in Sputum Smears. //Antimicrob. Agents Chemother.-2003.-Vol.47.-P.2231-2235.

56. Morlock G. P., В. B. Plikaytis, J. T. Crawford. Characterization of spontaneous, In vitro-selected, rifampin-resistant mutants of Mycobacterium tuberculosis strain H37Rv. // Antimicrob Agents Chemother.-2000.-Vol.44.-P.3298-301.

57. Murray M. Sampling bias in the molecular epidemiology of tuberculosis. // Emerg Infect Dis.-2002.-Vol.8.-P.363-9.

58. Murray M. Determinants of cluster distribution in the molecular epidemiology of tuberculosis. // Proc Natl Acad Sci U S A.-2002.-Vol.99.-P. 1538-43.

59. Murray M.D. Alland. Methodological problems in the molecular epidemiology of tuberculosis. //Am J Epidemiol.-2002.-Vol.l55.-P.565-71.

60. Murray M. B. Molecular epidemiology and the dynamics of tuberculosis transmission among foreign-born people. // Cmaj.-2002.-Vol.l67.-P.355-6.

61. Narvskaia О. V., I. V. Mokrousov, E. V. Limeshchenko, N. Steklova, T. F. Otten, В. I. Vishnevskij Characterization of Mycobacterium tuberculosis strains prevalent in North-West of Russia by spoligotyping. // Probl Tuberk.-2002.-Vol.44-8.

62. Otal I., S. Samper, M. P. Asensio, M. A. Vitoria, M. C. Rubio, R. Gomez-Lus, C. Martin. Use of a PCR method based on IS6110 polymorphism for typing Mycobacterium tuberculosis strains from BACTEC cultures. // J Clin Microbiol.-1997.-Vol.35.-P.273-7.

63. Patel S., S. Wall, N. A. Saunders. Heminested inverse PCR for IS6110 fingerprinting of Mycobacterium tuberculosis strains. // J Clin Microbiol.-1996.-Vol.34.-P. 1686-90.

64. Pym A.S., P. Domenech, N. Honore, J. Song, V. Deretic, S.T. Cole. Regulation of catalase-peroxidase (KatG) expression, isoniazid sensitivity and virulence by furA of Mycobacterium tuberculosis. // Molecular Microbiology.-2001.-Vol.40.-P.879-889.

65. Pym A.S., B. Saint-Joanis, S.T. Cole. Effect of katG Mutations on the Virulence of Mycobacterium tuberculosis and the Implication for Transmission in Humans. // Infect. Immun.-2002.-Vol.70.-P.4955-4960.

66. Ramos de, H. Soini, G. C. Roscanni, M. Jaques, M. C. Villares, J. M. Musser. Extensive cross-contamination of specimens with Mycobacterium tuberculosis in a reference laboratory. // J Clin Microbiol.-1999.-Vol.37.-P.916-9.

67. Raviglione M.C., Snider D.R.jr., Kochi A. Global epidemiology of tuberculosis: morbidity and mortality of a worldwide epidemic. // JAMA.-1995.-Vol.273.-P.220-226.

68. Rigouts L., F. Portaels. DNA fingerprints of Mycobacterium tuberculosis do not change during the development of resistance to various antituberculous drugs. // Tuber Lung Dis.-1994.-Vol.75.-P.160.

69. Ritacco V., Lopez В., Paul R., Reniero A., Di Lonardo M., Casimir L., Togneri A., Kaufman S., Barrera L. False-positive cultures due to cross contamination in tuberculosis laboratories. // Rev Argent Microbiol.- 2002.-Vol.34.-P. 163-166

70. Ross В. С., K. Raios, K. Jackson, B. Dwyer. Molecular cloning of a highly repeated DNA element from Mycobacterium tuberculosis and its use as an epidemiological tool. // J Clin Microbiol.-1992.-Vol.30.-P.942-6.

71. Ross В. С., B. Dwyer. Rapid, simple method for typing isolates of Mycobacterium tuberculosis by using the polymerase chain reaction. // J Clin Microbiol.-1993.-Vol.31.-P.329-34.

72. Sharma M., S. Sethi, B. Mishra, C. Sengupta, S. K. Sharma. Rapid detection of mutations in rpoB gene of rifampicin resistant Mycobacterium tuberculosis strains by line probe assay. // Indian J Med Res.-2003.-Vol.117.-P.76-80.

73. Small P., van Embden J. Molecular epidemiology of tuberculosis. // In: B. Bloom (Ed.) Tuberculosis: Pathogenesis, Protection and Control. ASM press. Washington D.C.-1994.-P.569- 582.

74. Soini H., X. Pan, A. Amin, E. A. Graviss, A. Siddiqui, J. M. Musser. Characterization of Mycobacterium tuberculosis isolates from patients in Houston, Texas, by spoligotyping. //J Clin Microbiol.-2000.-Vol.38.-P.669-76.

75. Sola C., A. Devallois, L. Horgen, J. Maisetti, I. Filliol, E. Legrand, N. Rastogi. Tuberculosis in the Caribbean: using spacer oligonucleotide typing to understand strain origin and transmission. // Emerg Infect Dis.-1999.-Vol.5.-P.404-14.

76. Southern E. Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis. //Mol. Biol.-1975.-Vol.98.-P.503-517.

77. Surikova О. V., Voitikh D. V., Kurnov I., Filipenko M. L. Clinical application of VNTR-typing of Mycobacteria tuberculosis strains: monitoring of ^treatment quality and of laboratory service. // Mol Gen Mikrobiol Virusol 2005.;Vol.2.-P.21-24

78. Taniguchi H., H. Aramaki, Y. Nikaido, Y. Mizuguchi, M. Nakamura, T. Koga, S. Yoshida. Rifampicin resistance and mutation of the rpoB gene in Mycobacterium tuberculosis. //FEMS Microbiol Lett.-1996.-Vol.144.-P. 103-8.

79. Telenti A., P. Imboden, F. Marchesi, D. Lowrie, S. Cole, M. J. Colston, L. Matter, K. Schopfer, T. Bodmer. Detection of rifampicin-resistance mutations in Mycobacterium tuberculosis. // Lancet.-1993.-Vol.341.-P.647-50.

80. Thierry D., A. Brisson-Noel, V. Vincent-Levy-Frebault, S. Nguyen, J. L. Guesdon, B. Gicquel. Characterization of a Mycobacterium tuberculosis insertion sequence, IS6110, and its application in diagnosis. // J Clin Microbiol.-1990.-Vol.28.-P.2668-73.

81. Troesch A., H. Nguyen, C. G. Miyada, S. Desvarenne, T. R. Gingeras, P. M. Kaplan, P. Cros, C. Mabilat. Mycobacterium species identification and rifampin resistance testing with high-density DNA probe arrays. // J Clin Microbiol.-1999.-Vol.37.-P.49-55.

82. Tungusova О. S., А. О. Mar'iandyshev, D. A. Kaugant, P. Sandven, G. Bjeune. Impact of drug resistance on the fitness of Mycobacteruim tuberculosis of the genotype W-Beijing. // Probl Tuberk Bolezn Legk.-2005.-Vol.2.-P.46-50.

83. Vos P., R. Hogers, M. Bleeker, M. Reijans, T. van de Lee, M. Homes, A. Frijters, J. Pot, J. Peleman, M. Kuiperet al. AFLP: a new technique for DNA fingerprinting. //Nucleic Acids Res.-1995.-Vol.23.-P.4407-14.

84. W. Takayuki, S. Maeda, A. Tamaru, S. Imai, A. Hase, K. Kobayashi. Dual-Probe Assay for Rapid Detection of Drug-Resistant Mycobacterium tuberculosis by Real-Time PCR. // J. Clin. Microbiol.-2004.-Vol.42.-P.5277-5285.

85. Werngren J.S., E. Hoffner. Drug-susceptible Mycobacterium tuberculosis Beijing genotype does not develop mutation-conferred resistance to rifampin at an elevated rate. // J Clin Microbiol.-2003.-Vol.41.-P. 1520-4.

86. Wiid I. J., С. Werely, N. Beyers, P. Donald, P. D. van Helden. Oligonucleotide (GTG)5 as a marker for Mycobacterium tuberculosis strain identification. // J Clin Microbiol.-1994.-Vol.32.-P. 1318-21.

87. World Health Organization. Emergence of Mycobacterium tuberculosis with Extencive Resistance to Second-Line Drugs Worldwide, 2000-2004. // Morbid. Mortal. Weekly Rep.-2006.-Vol.55.-P.301-306.

88. World Health Organization. XDR tuberculosis. // 2007.-Nov.

89. World Health Organization. 2007-2008 XDR and MDR Tuberculosis Global Responce Plan. // 2007 .-June.

90. World Health Organization. Anti-tuberculosis drug resistance in the world. // 2008.-Fourth Global Report.

91. Wu X., J. Zhang, Y. Zhuang, X. Zhang, G. Li, X. He. Molecular mechanisms of drug resistance in Mycobacterium tuberculosis clinical isolates. // Chin Med J (Engl).-1999.-Vol.l 12.-P.524-8.

92. Yeh R. W., Hopewell P. C., Daley C. L. Simultaneous infection with two strains of Mycobacterium tuberculosis identified by restriction fragment length polymorphism analysis. // Int J Tuberc Lung Dis.- 1999.-VoI.3.-P.537-539f