Разработка молекулярных маркеров для эпидемиологического анализа клинических штаммов Mycobacterium Tuberculosis тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.03, кандидат биологических наук Лихошвай, Екатерина Юрьевна

• Лихошвай, Екатерина Юрьевна
• кандидат биологических наук
• 2006

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Лихошвай, Екатерина Юрьевна

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Общая характеристика микобактерий.

1.2. Молекулярно-биологические методы, используемые в эпидемиологических исследованиях возбудителей туберкулеза.'.

1.3. Анализ филогенетических взаимоотношений среди представителей комплекса микобактерий туберкулеза.

1.4. Характеристика эпидемиологически значимой группы микобактерий W/Beijing.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Штаммы микобактерий, используемые в исследовании.

2.2. Выделение ДНК из культур микобактерий.

2.3. Праймеры, используемые для ПЦР амплификации и секвенирования.

2.4. Приготовление гибридизационных зондов.

2.5. Реактивы для гибридизации по Саузерну.

2.6. Методика RFLP гибридизации.

2.7. Секвенирование фрагментов ДНК.

2.8. Методика гибридизации с молекулярными бикэнами

ГЛАВА 3. РАЗРАБОТКА МЕТОДИКИ БЫСТРОЙ

ИДЕНТИФИКАЦИИ W-BEIJING ШТАММОВ.

3.1. Анализ результатов гибридизации клинических штаммов с W- Beijing зондом.

3.1.1. dnaA-dnaN межгенный район хромосомы микобактерий.

3.1.2. DR-область хромосомы М. tuberculosis.

3.1.3. Хромосомный локус NTF, (регион В).

3.2. Интерпретация результатов гибридизации с многокомпонентным W-Beijing зондом.

ГЛАВА 4. АНАЛИЗ ХРОМОСОМНЫХ ДЕЛЕЦИЙ TBD1, RD6, PKS15/1 КЛИНИЧЕСКИХ ШТАММОВ

М. TUBERCULOSIS.

4.1. Гибридизация хромосомных ДНК с TbDl зондом

4.2. Гибридизация с RD6 зондом.

4.3. Гибридизация с зондамиpks 15/1.

ГЛАВА 5. ХАРАКТЕРИСТИКА ДЕЛЕЦИЙ, СПЕЦИФИЧНЫХ

ДЛЯ ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ W-BEIJING ГРУППЫ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Разработка молекулярных маркеров для эпидемиологического анализа клинических штаммов Mycobacterium Tuberculosis»

Туберкулез по-прежнему остается одной из актуальных проблем практического здравоохранения во всем мире. По данным ВОЗ, глобальная среднегодовая смертность, обусловленная туберкулезом, составляет около 2 млн. случаев. В Российской Федерации показатели заболеваемости и смертности от туберкулеза в несколько раз превышают значения по странам Западной Европы (база данных Европейского регионального комитета ВОЗ, <http://data.euro.who.int/hfadb/>). Россия входит в число стран с высокими уровнями заболеваемости (85,4 на 100 тысяч населения -2004 г.) и смертности (21,4 на 100 тысяч населения - 2004 г.) по туберкулезу. Сложные социально-экономические условия жизни населения, военные конфликты, миграция, увеличение числа штаммов возбудителя заболевания, устойчивых к действию противотуберкулезных препаратов, являются одними из основных причин напряженной эпидемической ситуации в России (Перельман, 2001; Шевченко, 2000). Заболеваемость туберкулезом среди населения стала нарастать быстрыми темпами за период 1990-2001 гг. (с 34,2 до 90,7 на 100 тысяч населения соответственно), отмечалось утяжеление клинических форм туберкулеза с реверсией распространенных, генерализованных, остро прогрессирующих случаев, сопровождавшихся обильным бактериовыделением, деструктивным характером поражений, снижением эффективности лечебных мероприятий (Шилова, 1999). Следует отметить, что после 1999 года темпы роста основных эпидемиологических показателей снизились, по сравнению с 1991-1995 гг. Однако тенденции к продолжению накопления резервуара инфекции остаются и по сей день (Шилова, 2001). Особо настораживает увеличение распространенности случаев заболевания с первичной лекарственной устойчивостью (Балабанова с соавт., 2005).

Иркутск является одним из неблагополучных городов по туберкулезу, основные показатели такие, как заболеваемость и смертность превышают среднестатистические показатели по России и составляют 84,9 на 100 ООО и 22,6 на 100 ООО населения соответственно (данные на 2004 г.) (Губанова, 2005). Серьезная эпидемиологическая ситуация в регионе объясняется низким (по сравнению с Европейской частью России) благосостоянием населения, высокой концентрацией мест лишения свободы, ростом числа лиц без определенного места жительства и беспризорных детей, активизацией неконтролируемых миграционных процессов (особенно из эпидемически неблагополучных регионов с высокой распространенностью туберкулеза с МЛУ).

В условиях сложившейся эпидемической ситуации развитие и использование новых методов в клинической диагностике и эпидемиологических исследованиях приобретает особое значение. В качестве наиболее перспективных, следует выделить молекулярно-биологические методы, особенно комплексное сочетание нескольких методов, что позволит более точно выявлять звенья эпидемиологических цепочек распространения инфекции и своевременно локализовать очаги туберкулеза.

Актуальность проблемы

Особенности природы заболевания, в частности длительность инкубационного периода, лекарственная устойчивость и отсутствие надежных методов идентификации штаммов возбудителя затрудняют диагностику и лечение туберкулеза, а также эпидемиологические исследования в очагах. Последние достижения молекулярной биологии в сочетании с успехами в области молекулярной генетики микобактерий позволили разработать способы надежной дифференцировки штаммов Mycobacterium tuberculosis (М tuberculosis) на уровне хромосомной ДНК, которые существенно повышают эффективность микробиологической диагностики и эпидемиологических исследований при туберкулезе. Однако подавляющее большинство методов, используемых для молекулярного типирования туберкулеза, отличается многоступенчатостью проведения, недостаточной дискрими-нативной способностью, высокой стоимостью. Проведение исследований, направленных на поиск молекулярных маркеров специфичных для отдельных эпидемиологически значимых групп микобактерий, особенно имеющих лекарственную устойчивость, и разработка простых в исполнении, точных и недорогих методов идентификации групп штаммов М. tuberculosis, а также применение этих методов в комплексе являются необходимым условием успешной организации противоэпидемических мероприятий, направленных на снижение заболеваемости и смертности от туберкулеза.

Цели и задачи исследования

Целью исследования являлась разработка молекулярных маркеров и оптимизация методик их использования для идентификации отдельных групп особо вирулентных штаммов М. tuberculosis, в том числе представителей W-Beijing филогенетической линии, среди клинических изолятов микобактерий.

Основные задачи:

• Используя данные ранее проводимых исследований, разработать од-ноэтапный метод для идентификации W-Beijing штаммов среди клинических изолятов М. tuberculosis:

- учитывая структуру геномных локусов, подобрать соответствующие специфичные праймеры для амплификации фрагментов ДНК;

- создать многокомпонентный гибридизационный зонд для последующего RFLP-анализа;

- применить полученный гибридизационный зонд для идентификации представителей различных кластеров в коллекции PHRI ТВС клинических штаммов М. tuberculosis-, - оценить специфичность и практические преимущества предлагаемого метода.

• Разработать молекулярные маркеры, специфичные для интактного и измененного, в связи с микроделецией, фрагмента гена pks 15/1, отвечающего за продукцию фенолгликолипидов - факторов вирулентности М. tuberculosis, с применением метода RT-PCR с зондами -«molecular beacons».

• Разработать гибридизационные зонды, специфичные для фрагментов TbDl, RD6, pks 15/1.

• Провести анализ делеций TbDl, RD6, pks 15/1 с использованием ПЦР амплификации, RFLP гибридизации и метода RT-PCR с зондами - «molecular beacons» клинических изолятов М. tuberculosis.

• Провести исследование, базирующееся на секвенировании фланкирующих последовательностей различных по локализации и размеру делеций, представленных в геноме для дифференциации различных кластеров W-Beijing штаммов, а также представителей других филогенетических линий М. tuberculosis.

Научная новизна и практическая значимость работы

На сегодняшний день в литературных источниках описано множество молекулярно-биологических методов для генотипирования штаммов М. tuberculosis. Наиболее широко используемыми методами, относящимися к «золотому стандарту» являются IS5770-RFLP (Restriction fragment length polymorphism - полиморфизм длин рестрикционных фрагментов ДНК) генотипирование и сполиготипирование (spoligotyping), определение точечных мутаций ассоциированных с лекарственной устойчивостью, а также MIRU-VNTR (полиморфизм тандемов повторяющихся фрагментов и

ДНК) анализ. Учитывая особенности некоторых эпидемиологически значимых групп возбудителей, таких как W-Beijing штаммы: широкую распространенность, высокий уровень смертности при заражении данными штаммами и часто встречающуюся лекарственную устойчивость, идентификация изолятов W-Beijing филогенетической линии имеет большое практическое значение. Только единичные лаборатории имеют возможность применения нескольких методов генотипирования в виду высокой стоимости проведения исследований. Проведение типирования с использованием нескольких методов занимает в лучшем случае 5-10 дней. Больной с активной формой туберкулеза способен заразить в течение месяца от 15 до 100 человек.

Исходя из этого, возникает необходимость в разработке быстрого недорогого и эффективного метода, способного определить микобактерии, принадлежащие к W-Beijing группе. В настоящем исследовании впервые разработан метод генотипирования штаммов W-Beijing, с применением техники RFLP гибридизации, основанный на комплексном использовании нескольких специфичных апробированных маркеров. Метод высокочувствительный, быстрый и удобный для выделения различных групп представителей W-Beijing, в том числе обладающих лекарственной устойчивостью среди любых штаммов микобактерий. Проведен анализ хромосомных де-леций TbDl, RD6, pksl5/l при сопоставлении результатов с данными IS<5//0-RFLP типирования у анализируемых клинических штаммов М. tuberculosis, выделенных в различных регионах мира. Впервые описан IS6//0-RFLP кластерный состав предковой («ancestral» - не имеющих TbDl делецию) группы штаммов. Показано распределение исследуемых штаммов по выявленным и ранее известным признакам. Помимо этого, метод детекции штаммов с делетированным pksl5/l фрагментом с использованием методики оценки кинетики ПЦР (RT-PCR, real-time PCR) со специфическими молекулярными зондами - «molecular beacons», позволяет выделить особо вирулентные микобактерии туберкулеза. В работе показаны перспективы совместного комплексного применения простых и апробированных методик для более точного выявления путей распространения инфекции. Описаны делеции, характерные для представителей W-Beijing филогенетической линии. Использование полученных данных в дальнейших исследованиях позволит разработать специфичные молекулярные маркеры. Применение которых, в совокупности с другими методами типи-рования, даст возможность идентифицировать различные подгруппы W-Beijing филогенетической линии, тем самым ускорить выявление эпидемиологических очагов заболевания и с большей достоверностью выявлять цепочки распространения инфекции.

Основные защищаемые положения:

1. Метод гибридизации с многокомпонентным зондом W-Beijing прост, удобен в применении и способен эффективно идентифицировать W-Beijing штаммы среди любых клинических изолятов М. tuberculosis.

2. Распределение делеций TbDl, RD6,pfo75/7 у клинических штаммов М. tuberculosis различных генетических групп и кластеров позволяет выяснить связь возникновения данных делеций с другими маркерными генетическими событиями.

3. Идентификация М. tuberculosis с интактными генами pks 15/1 позволяет выделить группу потенциально высоко вирулентных штаммов среди клинических изолятов.

4. Штаммы линии W-Beijing характеризуются наличием специфических делеций, которые могут использоваться в качестве молекулярных маркеров для выявления отдельных групп микобактерий W-Beijing.

Личный вклад соискателя

В основу диссертации положены исследования, выполненные автором в лаборатории молекулярной эпидемиологии, в Научно-исследовательском институте здравоохранения (PHR1 ТВС, г. Ньюарк, Нью-Джерси, США) в период 2002-2004 г.г. Разработка молекулярных маркеров велась автором самостоятельно под руководством сотрудников лаборатории: Натальи Ку-репиной и Елены Шашкиной, Бэрри Крэйсвирта и научным руководством Беликова Сергея Ивановича (Лимнологический институт СО РАН, г. Иркутск).

Апробация результатов диссертации и публикации

Результаты работы были представлены на конференции в Кейстоуне, 2-7 апреля, 2005 г. (Keystone, США ) и Всероссийской научно-практической конференции в г. Санкт-Петербурге, 21-23 апреля, 2005 г. Основные результаты диссертации опубликованы в 5 печатных работах.

Структура и объем диссертации

Работа состоит из введения, пяти глав, выводов, списка литературы, содержащего 124 источника и 5 приложений. Диссертация изложена на 137 страницах, содержит 6 таблиц, 4 схемы, иллюстрирована 10 рисунками.

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Лихошвай, Екатерина Юрьевна

ВЫВОДЫ

1. Разработана методика генотипирования с использованием многокомпонентного W-Beijing гибридизационного зонда для прямой идентификации W-Beijing штаммов среди клинических изолятов, ранее типиро-ванных IS<5/i0-RFLP методом.

2. Проведен анализ делеций TbDl, RD6, pks 15/1 с использованием ПЦР амплификации, RFLP гибридизации и метода RT-PCR с зондами-«molecular beacons» 460 клинических изолятов М. tuberculosis. По результатам анализа этих делеций выявлены распределение и филогенетические взаимоотношения анализируемых штаммов микобактерий.

3. Разработаны молекулярные маркеры "molecular beacons", специфичные для интактного и измененного в связи с микроделецией фрагмента генов pks 15/1, отвечающих за продукцию ФГЛ - факторов вирулентности М. tuberculosis.

4. Выявлены и локализованы делеции, характерные для представителей W-Beijing филогенетической линии. Получены нуклеотидные последовательности фланкирующих некоторые делеции фрагментов.

5. Использование разработанных молекулярных маркеров в практике позволяет увеличить скорость и эффективность выявления эпидемиологически значимых штаммов М. tuberculosis.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В ходе проводимой работы были проанализированы многие участки генома М. tuberculosis. Была создана методика идентификации W-Beijing штаммов, основанная на использовании многокомпонентного W-Beijing гибридизационного зонда (комбинации трех зондов) для регибридизации мембран ранее типированных IS6770-RFLP методом. Мишенями этих зондов являются различные специфичные геномные локусы уникальные для W-Beijing штаммов; предлагаемые маркеры хорошо изучены, дают эффективную и просто интерпретируемую картину регибридизационных профилей и позволяют выделить представителей W-Beijing филогенетической линии, W-Beijing семейства, а также штаммы с множественной лекарственной устойчивостью, такие как NYC MDR, вызвавший вспышку лекарственно устойчивого туберкулеза в г. Нью-Йорке в 90-х годах.

Техническими преимуществами разработанной методики являются:

• регибридизация с W-Beijing - полизондом может проводиться с мембранами, ранее использованными для рутинного 1S6170-RFLP гено-типирования, проводимого согласно стандартному протоколу, и не требует дополнительного этапа отмывания блотов;

• гибридизация W-Beijing-полизонда с мембранами, хранившимися при комнатной температуре, дает хорошо читаемый и интерпретируемый результат вне зависимости от сроков хранения (до 4-8 лет);

• процедура регибридизации может быть ограничена 4 часами, W-Beijing-зонд в ECL буфере может быть повторно использован для гибридизации как минимум дважды, при хранении при -20°С.

Достоинства методики:

• обладает высокой дискриминативной способностью;

• основана на специфических генетических характеристиках, не лимитирована референтной панелью 1S61 ifl-RFLP профайлов;

• дает однозначную интерпретацию полученных результатов;

• может использоваться для идентификации редких вариантов штаммов микобактерии туберкулеза, не имеющих IS6770 элемента (определяются как «не W-Beijing штаммы»);

• W-Beijing многокомпонентный зонд специфичен для представителей МТК (М africanum, М. bovis, М. canettii, М. microti и М. tuberculosis) и не дает положительной гибридизации с другими видами микобактерий (М avium, М. fortuitum, М. xenopi, М. intracellular, М. marinum, М. phlei).

Разработанная методика на сегодняшний день успешно применяется в лаборатории молекулярной эпидемиологии Научно-исследовательского института здравоохранения (PHRI ТВС, г. Ньюарк, штат Нью Джерси, США) для идентификации представителей W-Beijing группы микобактерии, среди клинических изолятов, поступающих для рутинного типирования. В течение одного рабочего дня по результатам типирования с W-Beijing зондом можно определить принадлежность исследуемых образцов к W-Beijing филогенетической линии. Гибридизация с W-Beijing полизондом также проводится в спорных случаях, когда по данным IS6770-RFLP типирования сложно дать однозначный ответ о степени сходства исследуемых штаммов, принадлежащих одной предполагаемой цепочке передачи. Данная методика, помимо этого, может быть использована для ретроспективного анализа имеющихся гибридизационных блотов, при эпидемиологических исследованиях и выяснении филогенетических взаимоотношений среди микобактерий. Разработанная методика быстро выполнима, надежна и удобна в применении, позволяет сэкономить время и средства и получить необходимую информацию и может быть рекомендована для использования в различных лабораториях, владеющих техникой RFLP гибридизации.

По результатам анализа локусов TbDl, RD6, pks 15/1 методом RFLP гибридизации с разработанными зондами были выявлены штаммы М. tuberculosis, как имеющие делеции в исследуемых локусах, так и с ин-тактными регионами. При сопоставлении полученных данных с результатами типирования исследуемых штаммов по IS6110 элементу, принадлежности к sSNPs кластерам и основным генетическим группам было обнаружено, что все штаммы М. tuberculosis, имеющие интактным TbDl фрагмент являются представителями sSNPs кластера 1, основной генетической группы 1. Таким образом, была охарактеризована группа предшествующих «ancestral type» штаммов М. tuberculosis. Также было показано, что возникновение данной делеции предшествует мутациям, определяющим принадлежность штаммов к 2 и 3 основным генетическим группам и sSNPs кластерам II, X первой основной генетической группы, что подтверждает и дополняет результаты ранее проводимых исследований.

RD6 регион имеет сложную структуру, характеризующуюся наличием вставочных элементов и множественных повторов, свойственных РЕ-РРЕ группам генов. Данный регион очень интересен тем, что делеции в этой области могут быть связаны с проявлением вирулентных свойств микобак-териями (Manabe 2004). По результатам проводимого исследования было выявлено, что делеция данного фрагмента встречается у М. tuberculosis, относящихся к различным кластерам по 1S6110-RFLP, sSNPs анализам. Отдельные кластеры представлены штаммами только с делецией или с интактным регионом, а другие включают как штаммы с делецией, так и штаммы без нее. Однако утверждать о связи RD6 делеции с другими генетическими событиями, определяющими принадлежность к IS6770-RFLP, sSNPs кластерам преждевременно. Так среди высоко вирулентных штаммов W-Beijing филогенетической линии встречались изоляты как с делецией данного фрагмента, так и с интактным регионом. Полученные в ходе исследования данные по некоторым кластерам дают только предварительное представление, т.к. выборка штаммов недостаточна для характеристики всей группы. Таким образом, наличие RD6 делеции у исследуемых штаммов не является строгой характеристикой какой-либо определенной группы М. tuberculosis, выделенной IS6/70-RFLP и sSNPs методами. Однако, для выяснения роли RD6 делеции и вариантов ее локализации и размеров в проявлении вирулентных свойств необходимы дальнейшие исследования данного региона ДНК.

Идентификация штаммов с интактными генами pksl5/l позволяет выделить группу потенциально высоко вирулентных изолятов, в том числе и представителей W-Beijing семейства. Что может быть использовано в эпидемиологических исследованиях и своевременном выявлении вспышек туберкулеза, вызванных наиболее опасными вариантами микобактерий.

В представленной работе были описаны предполагаемые делеции, характерные для различных групп W-Beijing филогенетической линии. Как было сказано ранее, геномные перестройки являются основным механизмом эволюции микобактерий в отсутствии внутри- и межвидового генетического обмена. Штаммы, выделенные от больных туберкулезом в различных эпидемиологических условиях и различных географических регионах, могут существенно отличаться друг от друга, вплоть до потери порядка 10% генома. В связи с этим, исследование генетических делеций клинических изолятов может дать ценную информацию, как в отношении эволюционного родства штаммов, так и в определении наличия генов, детерминирующих патогенные свойства возбудителя. Анализ делеций у представителей W-Beijing семейства позволит более точно определить место этих штаммов в рамках структуры генетической популяции видов комплекса микобактерии туберкулеза, а так же выяснить роль данной группы М. tuberculosis в распространении заболевания.

В дальнейшем полученные в ходе проводимой работы данные могут быть использованы для проведения более объемного исследования с использованием полученных ПЦР продуктов в качестве гибридизационных зондов, а также для проведения скринингового исследования с целью выявления возможных специфических характеристик именно для определенных кластеров микобактерий W-Beijing.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Лихошвай, Екатерина Юрьевна, 2006 год

1. Перельман М. И. Ситуация с туберкулезом в России и выполнение Федеральной программы по борьбе с ним // Проблемы туберкулеза. 2001. - № 8. - С. 3.

2. Шевченко Ю. Л. Борьба с туберкулезом в России на пороге XXI века // Проблемы туберкулеза. -2000. №3. - С.2-6.

3. Шилова М. В. Эпидемиология туберкулеза в Российской Федерации // Вестник научно-исследовательского института фтизиопульмонологии. -1999.-№ 1.-С. 14.

4. Шилова М. В. Туберкулез в России в конце XX века // Проблемы туберкулеза. 2001. - № 5. - С. 8.

5. Banu S., Honore N., Saint-Joanis В., Philpott D., Prevost M. C., Cole S. T. Are the PE-PGRS proteins of Mycobacterium tuberculosis variable surface antigens? // Mol. Microbiol. 2002. - V. 44, № 1. - P. 9-19.

6. Barnes P. F., Yang Z., Preston-Martin S., Pogoda J. M., Jones В. E., Otaya M., Eisenach K. D., Knowles L., Harvey S., Cave M. D. Patterns of tuberculosis transmission in Central Los Angeles // Jama. 1997. - V. 278, № 14.-P. 1159-1163.

7. Bauer J., Andersen А. В., Kremer K., Miorner H. Usefulness of spoligotyping to discriminate IS6110 low-copy-number Mycobacterium tuberculosis complex strains cultured in Denmark // J. Clin. Microbiol. 1999. -V. 37, № 8. - P. 2602-2606.

8. Beggs M. L., Eisenach K. D., Cave M. D. Mapping of IS6110 insertion sites in two epidemic strains of Mycobacterium tuberculosis // J. Clin. Microbiol. -2000. V. 38, № 8. - P. 2923-2928.

9. Behr M. A., Wilson M. A., Gill W. P., Salamon H., Schoolnik G. K., Rane S., Small P. M. Comparative genomics of BCG vaccines by whole-genome DNA microarray // Science. 1999. - V. 284, № 5419. - P. 1520-1523.

10. Bifani P. J., Mathema В., Kurepina N. E., Kreiswirth B. N. Global dissemination of the Mycobacterium tuberculosis W-Beijing family strains // Trends. Microbiol. 2002. - V. 10, № 1. - P. 45-52.

11. Bifani P. J., Shopsin В., Alcabes P., Mathema В., Kreiswirth B. N., Liu Z., Driscoll J., Frothingham R., Musser J. M. Molecular epidemiology and tuberculosis control // Jama. 2000. - V. 284, № 3. - P. 305-307.

12. Brosch R., Pym A. S., Gordon S. V., Cole S. T. The evolution of mycobacterial pathogenicity: clues from comparative genomics // Trends. Microbiol. 2001. - V. 9, № 9. - P. 452-458.

13. Cave M. D., Eisenach K. D., Templeton G., Salfinger M., Mazurek G., Bates J. H., Crawford J. T. Stability of DNA fingerprint pattern produced with IS6110 in strains of Mycobacterium tuberculosis // J. Clin. Microbiol. 1994. -V. 32, № 1.- P.262-266.

14. Clark-Curtiss J. E., Haydel, Sh. E. Molecular Genetics of Mycobacterium tuberculosis Pathogenesis // Annu. Rev. Microbiol. 2003. - № 57. - P. 517-49.

15. Cole S. Т. Comparative mycobacterial genomics // Curr. Opin. Microbiol. -1998.-V. 1, № 5. P. 567-571.

16. Cole S. T. Comparative and functional genomics of the Mycobacterium tuberculosis complex // Microbiology. 2002. - V. 148, - P. 2919-2928.

17. Driscoll J. R., McGarry M. A., Taber H. W. DNA typing of a nonviable culture of Mycobacterium tuberculosis in a homeless shelter outbreak // J. Clin. Microbiol. 1999. - V. 37, № 1. - P. 274-275.'

18. Eisenach K. D., Crawford J. Т., Bates J. H. Repetitive DNA sequences as probes for Mycobacterium tuberculosis // J. Clin. Microbiol. 1988. - V. 26, № 11.-P. 2240-2245.

19. Fang Z., Forbes K. J. A Mycobacterium tuberculosis IS6110 preferential locus (ipl) for insertion into the genome // J. Clin. Microbiol. 1997. - V. 35, №2.-P. 479-481.

20. Fang Z., Morrison N., Watt В., Doig C., Forbes K. J. IS6110 transposition and evolutionary scenario of the direct repeat locus in a group of closely related

21. Mycobacterium tuberculosis strains // J. Bacteriol. 1998. - V. 180, № 8. -P. 2102-2109.

22. Frothingham R., Hills H. G., Wilson К. H. Extensive DNA sequence conservation throughout the Mycobacterium tuberculosis complex // J. Clin. Microbiol. 1994. - V. 32, № 7. - P. 1639-1643.

23. Frothingham R., Meeker-O'Connell W. A. Genetic diversity in the Mycobacterium tuberculosis complex based on variable numbers of tandem DNA repeats // Microbiology. 1998. - V.144, Pt 5. - P. 1189-96.

24. Glynn J. R., Whiteley J., Bifani P. J., Kremer K., van Soolingen D. Worldwide occurrence of Beijing/W strains of Mycobacterium tuberculosis: a systematic review // Emerg. Infect. Dis. 2002. - V. 8, № 8. - P. 843-849.

25. Goguet de la Salmoniere Y. O., Kim С. C., Tsolaki A. G., Pym A. S., Siegrist M. S., Small P. M. High-throughput method for detecting genomic-deletion polymorphisms // J. Clin. Microbiol. 2004. - V. 42, - P. 2913-2918.

26. Gordon S. V., Brosch R., Billault A., Gamier Т., Eiglmeier K., Cole S. T. Identification of variable regions in the genomes of tubercle bacilli using bacterial artificial chromosome arrays // Mol. Microbiol. 1999. - V. 32, № 3. -P. 643-655.

27. Hancock J. The contribution of slippage-like processes to genome evolution // J. Mol. Evol. 1995. - V. 41, № 6. - P. 1038-1047.

28. Hirsh A. E., Tsolaki A. G., DeRiemer K., Feldman M. W., Small P. M. Stable association between strains of Mycobacterium tuberculosis and their human host populations // PNAS. 2004. - V. 101. - P. 4871-4876.

29. Huard R. C., Lazzarini L. C., Butler W. R., van Soolingen D., Ho J. L. PCR-Based Method To Differentiate the Subspecies of the Mycobacterium tuberculosis Complex on the Basis of Genomic Deletions // J. Clin. Microbiol. -2003.-V. 41.-P. 1637-1650.

30. Kapur V., Whittam T. S., Musser J. M. Is Mycobacterium tuberculosis 15,000 years old? //J. Infect. Dis. 1994. - V. 170, № 5. - P. 1348-1349.

31. Soolingen. A marked difference in pathogenesis and immune response induced by different Mycobacterium tuberculosis genotypes. // Clin. Exp. Immunol. -2003.-V. 133.-P. 30-37.

32. Mahairis G. G., Sabo, P. J., Hickey, M. J., Singh, D. C., Stover, С. K. Molecular analisis of genetic differences between Mycobacterium bovis BCG and virulent M. bovis // J. Bacteriol. 1996. - № 178. - P. 1274-1282.

33. Marras S. A., Kramer F. R., Tyagi S. Multiplex detection of single-nucleotide variations using molecular beacons // Genet. Anal. 1999. - V. 14, №5-6.-P. 151-156.

34. Maus С. E., В. В. Plikaytis, and Т. М. Shinnick Mutation of tlyA confers capreomycin resistance in Mycobacterium tuberculosis // Antimicrob. Agents Chemother. 2005. - V. 49. - P. 571-577.

35. McAdam R. A., Hermans P. W., van Soolingen D., Zainuddin Z. F., Catty D., van Embden J. D., Dale J. W. Characterization of a Mycobacterium tuberculosis insertion sequence belonging to the IS3 family // Mol. Microbiol. -1990. V. 4, № 9. - P. 1607-1613.

36. Mostowy S., Cousins D., Brinkman J., Aranaz A., Behr M. A. Genomic Deletions Suggest a Phylogeny for the Mycobacterium tuberculosis Complex // J. Infect. Dis. 2002. - V. 186, № 1. - P. 74-80.

37. Munsiff S. S., B. Nivin, G. Sacajiu, B. Mathema, P. Bifani, and B. N. Kreiswirth Persistence of a highly resistant strain of tuberculosis in New York City during 1990-1999. // J. Infect. Dis. 2003. - V. 188. - P. 356-363.

38. Musser J. M., Amin A., Ramaswamy S. Negligible genetic diversity of mycobacterium tuberculosis host immune system protein targets: evidence of limited selective pressure // Genetics. 2000. - V. 155, № 1. - P. 7-16.

39. Plikaytis В. В., Marden J. L., Crawford J. Т., Woodley C. L., Butler W. R., Shinnick Т. M. Multiplex PCR assay specific for the multidrug-resistant strain W of Mycobacterium tuberculosis // J. Clin. Microbiol. 1994. - V. 32, № 6. -P. 1542-1546.

40. Ramaswamy S., Musser J. M. Molecular genetic basis of antimicrobial agent resistance in Mycobacterium tuberculosis: 1998 update // Tuber. Lung. Dis. 1998. - V. 79, № 1. - P. 3-29.

41. Reed M. В., Domenech, P., Manca, C., Su, H., Barczak, A.K., Kreiswirth, B.N., Kaplan, G., Вапу, C.E. // Nature. 2004. - V. 431. - P. 84-87.

42. Rengarajan J., С. M. Sassetti, V. Naroditskaya, A. Sloutsky, B. R. Bloom, Rubin E. J. The folate pathway is a target for resistance to the drug para-aminosalicylic acid (PAS) in mycobacteria // Mol. Microbiol. 2004. - V. 53. -P. 275-282.

43. Rhee J. Т., Tanaka M. M., Behr M. A., Agasino С. В., Paz E. A., Hopewell P. C., Small P. M. Use of multiple markers in population-based molecularepidemiologic studies of tuberculosis // Int. J. Tuberc. Lung. Dis. 2000. - V. 4, № 12. - P. 1111-1119.

44. Ross В. C., Raios K., Jackson K., Dwyer B. Molecular cloning of a highly repeated DNA element from Mycobacterium tuberculosis and its use as an epidemiological tool //J. Clin. Microbiol. 1992. - V. 30, № 4. - P. 942-946.

45. Salamon H., Kato-Maeda M., Small P. M., Drenkow J., Gingeras T. R. Detection of deleted genomic DNA using a semiautomated computational analysis of GeneChip data // Genome. Res. 2000. - V. 10, № 12. - P. 20442054.

46. Sampson S. L., Warren R. M., Richardson M., van der Spuy G. D., van Helden P. D. Disruption of coding regions by IS6110 insertion in Mycobacterium tuberculosis // Tuber. Lung. Dis. 1999. - V. 79, № 6. - P. 349359.

47. Skuce R. A., McCorry T. P., McCarroll J. F., Roring S. M. M., Scott A. N., Brittain D., Hughes S. L., Hewinson R., Glyn N. D. S. Discrimination of

48. Mycobacterium tuberculosis complex bacteria using novel VNTR-PCR targets //Microbiology. -2002. -V. 148, №2. P. 519-528.

49. Smith I. Mycobacterium tuberculosis Pathogenesis and Molecular Determinants of Virulence // Clin. Microbiol. Rev. 2003. - V. 16. - P. 463496.

50. Stead W. W. Pathogenesis of the sporadic case of tuberculosis // N. Engl. J. Med. 1967. - V. 277, № 19. - P. 1008-1012.

51. Supply P., Mazars, E., Lesjean, S., Vincent, V., Gicquel, В., Locht, C. Variable human minisatellite-like regions in the Mycobacterium tuberculosis genome // Mol. Microbiol. 2000. - V. 36, № 3. - P. 762-771.

52. Supply P., Warren R. M., Banuls A. L., Lesjean, S., Van Der Spuy G. D., Lewis L. A., Tibayrenc, M., Van Helden, P. D., Locht, C. Linkage disequilibrium between minisatellite loci supports clonal evolution of

53. Mycobacterium tuberculosis in a high tuberculosis incidence area // Mol. Microbiol. 2003. - V. 47. - P. 529-538.

54. Thierry D., Cave, M. D., Eisenach, K. D., Crawford, J. Т., Bates, J. H., Gicquel, В., Guesdon, J. L. IS6110, an IS-like element of Mycobacterium tuberculosis complex // Nucleic. Acids. Res. 1990. - V. 18, № 1. - P. 188.

55. F., Qing H. Z., Enkhsaikan D., Nymadawa P., van Embden J. D. Predominance of a single genotype of Mycobacterium tuberculosis in countries of east Asia // J. Clin. Microbiol. 1995. - V. 33, № 12. - P. 3234-3238.

56. Warren R. M., Victor, T.C., Streicher, E.M., Richardson, M., van der Spuy,

57. G.D., Johnson, R., Chihota, V.N., Locht, C., Supply, P., van Helden, P.D. Clonal expansion of a globally disseminated lineage of Mycobacterium tuberculosis with low IS6110 copy numbers // J. Clin. Microbiol. 2004. - V. 42. - P. 5774-5782.

58. Yang Z. H., Bates,J. H., Eisenach, K. D., Cave, M. D. Secondary typing of Mycobacterium tuberculosis isolates with matching IS6110 fingerprints from different geographic regions of the United States // J. Clin. Microbiol. 2001. -V. 39.-P. 1691-1695.

59. Yeh R. W., Ponce de Leon, A., Agasino, C.B., Hahn, J.A., Daley, C.L., Hopewell, P.C., Small, P.M. Stability of Mycobacterium tuberculosis DNA genotypes// J. Infect. Dis. 1998. - V. 177, № 4. - P. 1107-1 111.

60. Zainuddin Z. F., Dale J. W. Polymorphic repetitive DNA sequences in Mycobacterium tuberculosis detected with a gene probe from a Mycobacterium fortuitum plasmid // J. Gen. Microbiol. 1989. - V. 135, № 9. - P. 2347-2355.

61. Zainuddin Z. F., Dale J. W. Does Mycobacterium tuberculosis have plasmids? // Tubercle. 1990. - V. 71, № 1. - P. 43-49.

62. Zhang M., Gong J., Yang Z., Samten В., Cave M. D., Barnes P. F. Enhanced capacity of a widespread strain of Mycobacterium tuberculosis to grow in human macrophages // J. Infect. Dis. 1999. - V. 179, № 5. - P. 12131217.