Проблемы лекарственной устойчивости Mycobacterium tuberculosis: ускоренное культуральное выявление, контроль адекватности химиотерапии, вирулентность тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.07, доктор биологических наук Маничева, Ольга Алексеевна

• Маничева, Ольга Алексеевна
• доктор биологических наук
• 2009

Оглавление диссертации доктор биологических наук Маничева, Ольга Алексеевна

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1.ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1.Проблема быстрого определения лекарственной устойчивости Mycobacterium tuberculosis.

1.2. Проблема лабораторного контроля адекватности химиотерапии.

1.3. Проблема оценки вирулентности Mycobacterium tuberculosis.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Метод биохимической индикации роста МБТ.

2.2. Метод ускоренного определения ЛУ МБТ с помощью полужидкой среды.

2.3. Методы определения бактериостатической активности крови.

2.3.1. Метод серийных разведений сыворотки с использованием стандартной среды Левенштейна-Йенсена.

2.3.2. Метод вертикальной диффузии.

2.3.3. Метод ускоренного определения БАК с помощью полужидкой среды.

2.4. Методы исследования вирулентности МБТ in vitro.

2.4.1.Определение скорости роста (размножения) МБТ в питательной среде.

2.4.2. Определение скорости роста (размножения) МБТ в макрофагах.

2.4.3. Исследование индукции клеточной гибели (цитотоксичности)

2.4.4. Исследование продукцие цитокинов.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Глава 3. РАЗРАБОТКА МЕТОДА УСКОРЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЛЕКАРСТВЕННОЙ УСТОЙЧИВОСТИ МБТ.

3.1. Индикация роста МБТ и определение ЛУ МВТ по восстановлению трифенилтетразолийхлорида.

3.2. Определение лекарственной устойчивости МБТ с помощью полужидкой питательной среды с разным содержанием лошадиной сыворотки.

3.3. Определение чувствительности МБТ к этамбутолу с помощью полужидкой среды.

3.4. Определение лекарственной устойчивости МБТ к стрептомицину, изониазиду, рифампицину, этамбутолу с помощью полужидкой среды в сравнении со стандартным методом.

Глава 4. ИССЛЕДОВАНИЕ БАКТЕРИОСТАТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ КРОВИ С ПОМОЩЬЮ ПЛОТНОЙ СРЕДЫ.

4.1. Исследование БАК у больных туберкулезом с помощью метода вертикальной диффузии в среде Левенштейна-Йенсена.

4.2. Изучение с помощью метода вертикальной диффузии фармакокинетики изониазида в крови и тканях больных туберкулезом органов мочеполовой системы.

Глава 5. ИССЛЕДОВАНИЕ БАКТЕРИОСТАТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ

КРОВИ БОЛЬНЫХ ТУБЕРКУЛЕЗОМ ОРГАНОВ ДЫХАНИЯ УСКОРЕННЫМ МЕТОДОМ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ПОЛУЖИДКОЙ ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЫ.

5.1. Разработка ускоренного метода определения БАК.

5.2. Исследование БАК у больных туберкулезом органов дыхания, сопоставление с клиническими и бактериологическими данными.

Глава 6. ИССЛЕДОВАНИЕ IN VITRO ВИРУЛЕНТНОСТИ МБТ РАЗЛИЧНЫХ ГЕНОТИПОВ.

6.1. Скорость роста МБТ в жидкой питательной среде Middlebrook 7Н9.

6.2. Скорость роста МБТ в макрофагах клеточной линии ТНР -1.

6.3. Индукция клеточной гибели в культурах макрофагов, зараженных МВТ различных генотипов.

6.4. Продукция цитокинов клетками ТНР-1, зараженными МБТ разных генотипов.

6.5. Характеристика больных туберкулезом органов дыхания и биологических свойств МБТ различных генотипов.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Проблемы лекарственной устойчивости Mycobacterium tuberculosis: ускоренное культуральное выявление, контроль адекватности химиотерапии, вирулентность»

Возбудитель туберкулеза Mycobacterium tuberculosis — один из наиболее "успешных" патогенных микроорганизмов, так как, несмотря на достижения медицины, проблема туберкулеза остается актуальной для большинства стран. "Успешность" патогена подтверждается данными ВОЗ: палочкой Коха инфицирована треть населения Земли, ежегодно от туберкулеза умирает 3 млн. человек. Высокую адаптивную способность вида М. tuberculosis доказывает и очень быстрое его приспособление к новым условиям в эру применения антибактериальных препаратов - селекция и распространение лекарст-венноустойчивых штаммов. Наблюдающийся в последние годы подъем лекарственной устойчивости М. tuberculosis (микобактерий туберкулеза, МВТ), а также утяжеление ее структуры за счет роста множественной лекарственной устойчивости (Алексеева Г.И., Кравченко А.Ф., 2007; Вишневский Б.И. и др., 1997; Вишневский Б.И., Вишневская Е.Б., 2003; Дорожкова И.Р. и др., 2000; Ильина Т.Я. и др., 2003; Хоменко А.Г., Голышевская В.И., 1999) значительно усложняет задачу подбора средств химиотерапии. Последняя остается основным методом лечения больных туберкулезом, который обеспечивает прекращение бактериовыделения и прерывает распространение возбудителя. Широкое распространение в последние годы штаммов МБТ, принадлежащих к семейству Beijing, которое часто ассоциировано с высокой трансмиссивно-стью, множественной лекарственной устойчивостью и более тяжелыми и распространенными формами туберкулезного процесса (Нарвская О.В., 2003), еще более актуализирует задачу быстрого выявления наиболее эпидемиологически опасных штаммов возбудителя. В этих условиях возрастает роль бактериологических лабораторных методов определения резистентности МБТ и контроля адекватности лечения.

В связи с изложенным, сегодня как никогда раньше, клиницисты заинтересованы в быстром получении результатов определения лекарственной устойчивости. Учет результатов определения лекарственной устойчивости МБТ стандартным методом абсолютных концентраций на плотной яичной среде Левенштейна-Иенсена производится на 21 сутки после посева культуры. По данным J.-SJoh и соавторов (2007) интервал между началом лечения пациентов с бактериоскопически положительной мокротой и получением результатов определения лекарственной устойчивости МБТ достигает в среднем 80,5 дней. В связи с этим чрезвычайно актуальной проблемой является разработка простых и доступных для лабораторий любого уровня методов ускоренного определения лекарственной устойчивости МБТ и бактериоста-тической активности крови (БАК), или туберкулостатической пробы, так как это позволит клиницистам в короткие сроки выработать оптимальную тактику химиотерапии туберкулеза в зависимости от свойств возбудителя.

Известный метод ускоренного определения лекарственной устойчивости микобактерий по нитратредуктазной активности (Корнеев А.А., 1997; Голы-шевская В.И. и др., 20016) применим только для M.tuberculosis и неприменим для M.bovis. Кроме того, некоторые штаммы МБТ с устойчивостью к большинству противотуберкулезных препаратов показывают отрицательный результат в данном тесте.

В настоящее время для быстрого определения лекарственной устойчивости разработаны и используются системы, основанные на радиометрической, манометрической, колориметрической или флуоресцентной индикации роста МБТ в жидких средах - ВАСТЕС, МВ-ВАСТ, BBL-MGIT, Versa Trek System (Иртуганова О.А. и др., 2000, 2001 а, б.; Palomino J.C. et al., 1999; Sid-diqi S.H. et al., 1981; Tortoli E. et al., 1998; Zwolska Z. et al., 1999). С помощью этих систем спектр устойчивости может быть определен на 5-16 сутки после прямого посева патологического материала, и на 3-10 сутки непрямым методом, то есть при посеве изолята. Существующие микрометоды определения лекарственной устойчивости МБТ или минимальной ингибирующей концентрации требуют дополнительного оснащения реактивами, питательными средами и расходными материалами. Молекулярно-генетические методы позволяют определить устойчивость к рифампицину, изониазиду, стрептомицину, этамбутолу, пиразинамиду по наличию мутаций в ДНК МБТ, по сути, в день поступления патологического материала (Михайлович В.М. и др., 2001; Скотникова О.И. и др., 2004; Скрягина Е.М. и др., 20016). Но перечисленные выше методы требуют хорошего дорогостоящего аппаратурного оснащения и значительного финансирования и потому доступны лишь большим централизованным референс-лабораториям. Кроме того, наличие мутаций в генах не всегда проявляется фенотипически и на сегодняшний день выявлены не все мутации. Таким образом, остается актуальной проблема разработки быстрого, недорогого и доступного для любой практической фтизиобактериологи-ческой лаборатории способа определения лекарственной устойчивости МВТ, а также контроля адекватности химиотерапии с помощью определения бак-териостатической активности крови.

Широкое распространении штаммов генотипа Beijing, для которых характерна высокая частота поли- и мультирезистнтности (Нарвская О.В., 2003; Drobniewski F. et al., 2005; Park Y.K. et al., 2005), поднимает вопрос о соотношении лекарственной устойчивости и вирулентности МВТ, тем более, что эта проблема до сих пор остается дискуссионной. Сложность изучения факторов вирулентности МВТ, обусловлена, в частности, тем, что экспрессия генов, кодирующих эти факторы, происходит только в адекватных условиях внутренней среды макроорганизма-хозяина, а рост бактерий на искусственных питательных средах в отсутствие атак иммунной системы не требует реализации действия этих генов (Сидоренко C.B., 1999). Кроме того, изучение факторов вирулентности в основном проводится при сравнении вирулентных и авирулентных (лабораторных или мутантных, полученных с помощью делеции генов) штаммов, сильно отличающихся друг от друга по степени патогенности. Все клинические изоляты безусловно вирулентны, коль скоро вызвали болезнь, однако, различия между штаммами, принадлежащими к генетическим кластерам разных объемов, могут быть менее отчетливы. В связи с этим актуальной является проблема адекватной оценки вирулентности МВТ разных генотипов. Существующие методы исследования вирулентности МВТ на различных моделях с использованием животных или молекулярно-генетических методов и их комбинации очень дороги, длительны, доступны очень немногим лабораториям, оснащенным высокотехнологичным оборудованием, и не позволяют провести исследование достаточно большого числа штаммов различных генотипов с целью их сравнительной оценки. Использование тканевой культуры макрофагоподобных клеток человека в качестве модели для изучения некоторых факторов вирулентности МБТ помогает решить проблему в трех планах. Во-первых, исследовать достаточно большое число клинических штаммов, во-вторых, уменьшить влияние видовой и индивидуальной генетической гетерогенности, которое весьма существенно влияет на оценку вирулентности при использовании животных и макрофагов ex vivo, и, в-третьих, количественно оценить, образно говоря в "чистом виде", вирулентность клинических штаммов МБТ различных генотипов и различной лекарственной чувствительности. Оценить пригодность такого метода для поставленной цели представляется возможным при сравнительном исследовании вирулентности МБТ генотипа Beijing и других генотипов.

Цель работы: обосновать применение ускоренных методов определения лекарственной устойчивости M.tuberculosis и бактериостатической активности крови для лабораторного контроля адекватности терапии, изучить вирулентность (цитотоксичность) M.tuberculosis в зависимости от генотипа и лекарственной устойчивости возбудителя.

Задачи исследования:

1. Исследовать возможность определения лекарственной устойчивости M.tuberculosis посредством биохимической индикации метаболической активности микобактерий.

2. Разработать питательную среду для ускоренного определения лекарственной устойчивости M.tuberculosis. Провести сравнительное исследование лекарственной устойчивости клинических штаммов M.tuberculosis с помощью ускоренного и стандартного методов.

3. Исследовать бактериостатическую активность крови больных туберкулезом органов дыхания с помощью стандартных методов, используя выделенные аутоштаммы М.ШЬегси1оз18, сопоставить полученные результаты с устойчивостью М.ШЬегси1оз1з к противотуберкулезным препаратам и течением туберкулезного процесса. Дать оценку туберкулостатической пробе как методу бактериологического контроля адекватности химиотерапии.

4. Разработать ускоренный метод определения бактериостатической активности крови с помощью полужидкой питательной среды. Исследовать бактериостатическую активность крови больных туберкулезом органов дыхания с помощью ускоренного метода, сопоставить полученные результаты с клиническими и бактериологическими данными.

5. Исследовать вирулентность клинических штаммов М.ШЬегси1оз1з по их способности активировать гибель макрофагов (цитотоксические свойства), сопоставить уровень вирулентности с генотипом и устойчивостью возбудителя.

Научная новизна

Впервые разработана полужидкая питательная среда, позволяющая получить визуально наблюдаемый рост культуры МВТ на 3-5 сутки после инокуляции суспензии. Разработанный ускоренный метод определения лекарственной устойчивости МБТ к изониазиду, стрептомицину, рифампицину дает возможность иметь данные об устойчивости культуры к этим препаратам на 3-5-е сутки, о чувствительности — на 7-е после посева суспензии штамма МБТ. Предложенный метод позволяет на 2 недели раньше в сравнении со стандартным методом изменить терапию, что особенно важно в связи со значительным увеличением множественной лекарственной устойчивости.

Впервые методом вертикальной диффузии показана четкая зависимость величины БАК от устойчивости клинического изолята к изониазиду. С помощью разработанного ускоренного метода сопоставлены результаты определения туберкулостатической пробы как лабораторного метода контроля адекватности терапии и течения процесса у больных туберкулезом органов дыхания, и выявлена корреляция степени БАК и эффективности химиотерапии.

Впервые на модели in vitro при инфицировании дифференцированных клеток линии ТНР-1 микобактериями туберкулеза разных генотипов показано: наибольшая вирулентность (цитотоксичность) характерна для МБТ генотипа Beijing варианта ВО; штаммы сборной группы других генотипов, обладали меньшей способностью активировать некроз макрофагов; МБТ семейства LAM обладали полярными по отношению к Beijing свойствами, вызывая некроз макрофагов в наименьшей степени; высокие цитотоксические свойства обнаружены у МБТ с множественной лекарственной устойчивостью.

Практическая значимость работы

Разработанный на основе использования полужидкой среды ускоренный метод определения устойчивости МБТ к изониазиду, стрептомицину и ри-фампицину, прост, дешев, безопасен и потому доступен любой практической фтизиобактериологической лаборатории. Метод ускоренного определения бактериостатической активности крови также может использоваться любой лабораторией и является надежным способом лабораторной оценки адекватности химиотерапии. Применение ускоренных методов определения лекарственной устойчивости и бактериостатической активности дает возможность сократить сроки получения необходимых данных в 2-3 раза в сравнении со стандартными методами.

Положения, выносимые на защиту

1. Полужидкая питательная среда, разработанная на основе среды Сотона, позволяет получить визуально наблюдаемый рост клинических штаммов и выявить M.tuberculosis с множественной лекарственной устойчивостью в течение 3-7 суток.

2. С помощью метода вертикальной диффузии на среде Левенштейна-Йенсена показана корреляция величины бактериостатической активности крови и чувствительности M.tuberculosis к изониазиду. Применение плотных сред для проведения туберкулостатической пробы некорректно в случае устойчивости M.tuberculosis к препарату, однако метод информативен при исследовании фармакокинетики изониазида при разных путях его введения: показано увеличение концентрации препарата в крови и тканях и пролонгация эффекта при эндолимфатическом введении в сравнении с внутримышечным.

3. Величина бактериостатической активности крови, определяемой с помощью полужидкой среды, коррелирует с устойчивостью клинических штаммов к противотуберкулезным препаратам, тяжестью течения, эффективностью лечения специфического процесса: наиболее тяжелые формы заболевания отмечаются при низких и нулевых значениях бактериостатической активности и множественной лекарственной устойчивости M.tuberculosis. Определение бактериостатической активности с использованием аутоштаммов и полужидкой питательной среды позволяют в течение недели получить объективные сведения об адекватности применяемой химиотерапии.

4. Клинические штаммы M.tuberculosis генотипа Beijing ВО проявляют наибольшую способность активировать гибель макрофагоподобных клеток линии ТНР-1, индуцировать выработку противовоспалительного цитокина TGF-p и уменьшать - провоспалительного цитокина TNF-a. M.tuberculosis генотипа LAM обладают полярными относительно Beijing свойствами. Высокая частота множественной лекарственной устойчивости наблюдается как у штаммов с выраженной цитотоксичностью, так и с низкой.

Реализация результатов работы

Получен патент на изобретение "Питательная среда для ускоренного определения лекарственной устойчивости микобактерий туберкулеза" № 2226398 от 10.04.2004 .

Результаты исследования внедрены в практику работы Курского областного противотуберкулезного диспансера, используются в клинике легочного туберкулеза ФГУ "Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт фтизиопульмонологии Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи", а также в учебном процессе на кафедре фтизиатрии ГОУ ДПО "Санкт-Петербургская медицинская академия последипломного образования Росздрава".

Апробация диссертационной работы

Материалы по теме диссертации доложены и обсуждены на: Всероссийской конференции по внелегочному туберкулезу, С-Петербург, 1997 г.; заседаниях общества микробиологов г.Санкт-Петербурга в 2000 г., 2002 г., VIII Российском съезде фтизиатров, 17-ой Международной конференции "СПИД, рак и общественной здоровье" (СПб. 26.05-29.05.2008 г.), Межрегиональном семинаре для заведующих бактериологическими лабораториями СевероЗападного Федерального Округа РФ (29.09-01.10.2008 г.), Всероссийской научно-практической конференции "Актуальные вопросы лечения туберкулеза различных локализаций" (юбилейная к 85-летию СПб НИИФтизиопульмоно-логии, 29.09-31.09.2008 г.).

Публикации

По материалам работы опубликовано или находится в печати 26 печатных работы, из них 9 статей в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 178 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, главы материалов и методов, четырех глав собственных исследований, заключения, выводов, списка литературы, включающего 72 отечественных и 202 зарубежных источника. Диссертация иллюстрирована 25 таблицами и 14 рисунками.

Заключение диссертации по теме «Микробиология», Маничева, Ольга Алексеевна

144 Выводы

1. 2,3,5-трифенилтетразолий хлорид пригоден для ускоренного (8 дней) предварительного определения лекарственной устойчивости M.tuberculosis к рифампицину.

2. Полужидкая питательная среда, разработанная на основе среды Сотона, позволяет получить визуально наблюдаемый рост клинических штаммов M.tuberculosis в течение 3-7 суток.

3. На основе полужидкой среды разработан ускоренный метод определения лекарственной устойчивости M.tuberculosis к изониазиду, рифампицину, стрептомицину, который выявляет штаммы с множественной лекарственной устойчивостью в короткие сроки (3-5-7 суток).

4. Методом вертикальной диффузии на среде Левенштейна-Иенсена доказана корреляция величины бактериостатической активности крови и чувствительности M.tuberculosis преимущественно к изониазиду. Применение плотных сред для проведения туберкулостатической пробы некорректно в случае устойчивости M.tuberculosis к изониазиду.

5. Метод вертикальной диффузии на среде Левенштейна-Йенсена информативен при исследовании фармакокинетики изониазида при разных путях его введения: в сравнении с внутримышечным эндолимфатическое введение приводит к увеличению концентрации препарата в крови и тканях и пролонгации эффекта.

6. Определение бактериостатической активности крови с использованием аутоштаммов и полужидкой питательной среды позволяет в течение недели получить объективные сведения об адекватности применяемой химиотерапии. Степень бактериостатической активности крови, коррелирует с устойчивостью клинических штаммов к противотуберкулезным препаратам, тяжестью течения, эффективностью лечения специфического процесса.

7. Нулевая бактериостатическая активность крови сочетается с множественной лекарственной устойчивостью M.tuberculosis, наиболее тяжелыми формами заболевания, наибольшей длительностью бактериовыделения, наименьшей частотой благоприятных исходов. 8. Клинические штаммы M.tuberculosis генотипа Beijing ВО проявляют наибольшую способность активировать гибель макрофагоподобных клеток линии ТНР-1, индуцировать выработку противовоспалительного цитокина TGF-P и уменьшать - провоспалительного цитокина TNF-a. M.tuberculosis генотипа LAM обладают полярными относительно Beijing свойствами. Высокая частота множественной лекарственной устойчивости наблюдается у штаммов как с выраженной цитотоксичностью, так и с низкой.

146

Заключение

Актуальность проблемы быстрого выявления ЛУ МБТ и быстрой оценки адекватности химиотерапии туберкулеза с множественной лекарственной устойчивостью, более пристального исследования биологических свойств возбудителя обусловлена продолжающимся ростом лекарственной устойчивости патогена и утяжелением ее структуры, появлением высокотрансмиссивных штаммов генотипа Beijing.

Существующие методы определения ЛУ МБТ либо очень длительны, либо очень дороги, либо требуют высоких трудозатрат и персонала высокой квалификации. В связи с этим были поставлена задача разработки нового метода - быстрого, дешевого, доступного лаборатории любого уровня, не требующего специального оборудования, простого для выполнения и считывания результата, позволяющего в короткие сроки выявить наиболее опасные с эпидемиологической точки зрения МБТ с множественной лекарственной устойчивостью.

Поскольку спектр постоянно нарастающей ЛУ весьма разнообразен, возникает необходимость лабораторного контроля адекватности химиотерапии, так как, во-первых, нет строгой корреляции между ЛЧ МБТ к препаратам и их терапевтической эффективностью, во-вторых, препараты, назначаемые в комплексе, могут проявлять как синергизм, так и антагонизм по отношению друг к другу. Таким методом контроля может быть определение бактериостатической активности крови, так как величина БАК является результирующей действия многих факторов: пути введения препаратов, их фармакокинетики и фармакодинамики в организме конкретного больного, а при использовании аутоштамма - чувствительностью или устойчивостью данного штамма МБТ к данному набору препаратов. Разработка быстрого и корректного метода определения БАК - одна из задач работы.

Широкое распространение на территории РФ штаммов генетического семейства Beijing, для которых характерна высокая частота МЛУ (Нарвская О.В., 2003; Drobniewski F. et al., 2005), приводит к выводу об изменении свойств возбудителя в последние десятилетия. В связи с этим возникает задача оценки соотношения вирулентности МВТ, циркулирующих в регионах РФ, с другими биологическими свойствами патогена — генотипом, ЛУ, жизнеспособностью.

Разработка методов ускоренного определения ЛЧ МВТ была начата с исследования красителей - метиленового синего, малахитового зеленого в качестве индикаторов роста МВТ, которое выявило их непригодность для решения поставленной задачи. Более стабильные результаты получены при использовании ТТХ. Тем не менее, низкая специфичность метода в отношении этамбутола (58,3%) и низкая чувствительность в отношении стрептомицина (57,1%), низкие параметры в отношении изониазида ограничивает применение индикатора только для предварительного определения чувствительности МБТ к рифампицину.

С целью создания ускоренного метода определения ЛУ МБТ была разработана полужидкая питательная среда на основе жидкой модифицированной среды Сотона. Данная среда позволяет получить визуально наблюдаемый рост клинических штаммов МБТ на 3-5 сутки, что в 2,8-3,2 раза быстрее, чем на стандартной плотной среде Левенштейна-Йенсена. Уже на 3 сутки у 42,1% штаммов наблюдаются признаки роста, на 4-5 сутки у 95,2% штаммов, и на 7 сутки - у 98,3%. Из 804 исследованных штаммов лишь 4 дали рост позже 10 суток, причем у 3 из них отмечался замедленный рост и на плотной среде. Быстрый рост МБТ на разработанной среде обусловлен рядом факторов. Во-первых, среда по консистенции близка к жидкой, а на жидких средах мико-бактерии растут быстрее. Во-вторых, рост активизирует внесение сыворотки. В-третьих, содержащийся в среде в небольшом проценте агар-агар способствует повышению локальной концентрации микроорганизмов, не давая взвеси клеток опускаться на дно пробирки. Эта же особенность среды обеспечивает и хорошую аэрацию инокулята. В начальных опытах выявили близкое совпадение результатов определения ЛУ 242 штаммов на стандартной и испытуемой средах: в 90,1% случаев для стрептомицина, 96,1% - для изониазида, 96,3% - для рифампицина. В дальнейшем эти результаты были подтверждены при исследовании еще 407 штаммов. В целом чувствительность и специфичность метода для изониазида составляет 96,3% и 87,4%, для рифампицина -95,8% и 93,1%, для стрептомицина - 96,6% и 94,7%, для этамбутола - 65,8% и 89,2%. Различия в результатах определения чувствительности к этамбуто-лу, возможно, объясняются особенностями препарата (небольшой разницей между критической концентрацией и средней МПК его у устойчивых штаммов МБТ), наличием или отсутствием глюкозы в составе среды, а также влиянием рН среды (Акимова и др., 2003).

Одно из достоинств предлагаемого метода — простота учета результатов, так как он визуальный и не требует дорогостоящего оборудования для индикации роста. Кроме того, все ингредиенты питательной среды отечественного производства (кроме Ь-аспарагина), доступны и недороги. Главное преимущество метода - быстрое, в течение 3-5 дней после посева культуры выявление множественной лекарственной устойчивости у 80,2% штаммов МБТ, и через 7 дней - у 90,2%. Как известно, МБТ с множественной лекарственной устойчивостью особенно опасны в эпидемиологическом отношении.

Таким образом, впервые разработан ускоренный метод определения лекарственной устойчивости МБТ - простой, дешевый и доступный для любой практической фтизиобактериологической лаборатории. На питательную среду для ускоренного определения лекарственной устойчивости микобакте-рий туберкулеза получен патент на изобретение № 2226398 от 10.04.2004.

При исследовании бактериостатической активности крови (БАК) больных туберкулезом органов дыхания методом вертикальной диффузии впервые выявлена четкая зависимость между величиной БАК и чувствительностью культуры, выделяемой больным, к изониазиду. У 96,2% больных с культурами, чувствительными к изониазиду наблюдали среднюю и высокую БАК, у 4% - среднюю и отсутствие нулевых показателей. При устойчивости к данному препарату распределение значений БАК иное: средние и высокие у 2,0% больных, низкие - у 54,0%, нулевые — у 445 (в сумме низкие и нулевые составляли 98,0%). Прослежена зависимость между частотой высоких и средних значений БАК и частотой благоприятного течения туберкулеза. Так, при сохраненной чувствительности к изониазиду при средних и высоких значениях БАК у 100,0-96,5% больных (процент зависит от группы) отмечаются значительные улучшения и улучшения. У больных с низкими и нулевыми значениями БАК в 22% случаев имело место прогрессирование процесса. Однако, у 52,6% больных с изониазидоустойчивыми штаммами отмечается "улучшение" и у 26,0% - "значительное улучшение", хотя величины БАК у них низкие. Данное обстоятельство навело нас на мысль, что затрудненная диффузия в среде препаратов с большой молекулярной массой приводит к занижению значений БАК в случае, когда культура чувствительна к такому препарату. Вследствие этого применение метода вертикальной диффузии (и в целом плотных сред) не корректно в случае устойчивости аутоштамма к изониазиду.

Тем не менее, метод был высоко информативен при использовании с целью изучения фармакокинетики изониазида при различных путях введения препарата - внутримышечном и эндолимфатическом. В случае применения эндолимфатического введения высокие значения БАК регистрировали в 2 раза чаще, чем при внутримышечном, более чем в половине случаев получали высокую концентрацию в крови без увеличения дозы изониазида, причем с четким эффектом пролонгации — до 9 часов против 4 при обычном способе введения.

С целью разработки адекватного метода исследования БАК у больных с устойчивостью к изониазиду использовали полужидкую питательную среду, применявшуюся для определения ЛУ. В ходе сравнительного исследования БАК с применением плотных (яичной и агаризованной), полужидкой и жидких сред доказано, что в случае устойчивости клинического штамма МБТ к изониазиду использовать плотные среды не корректно, так при этом показатели туберкулостатической пробы занижаются. Вероятно, это обусловлено особенностями диффузии ПТП в среду при нанесении разведений сыворотки и из среды - при росте МБТ. Оптимальными для данного исследования являются жидкие и полужидкие среды. Подтверждена зависимость между величиной БАК и чувствительностью аутоштамма к изониазиду: при чувствительности изолята к препарату отмечаются высокие значения, при устойчивости - значения зависят от того, какие среды используются - плотная или жидкая (полужидкая). Полужидкая среда по результатам не отличается от жидкой, но позволяет получать данные о БАК в недельный срок. Достоинством метода является и то, что по величине БАК можно судить о чувствительности аутоштамма в изониазиду: у всех больных с БАК, равной 9, отмечается чувствительность к изониазиду, при 7 или 8 - высокая чувствительность к 1 -2 препаратам при пероральном их приеме, или чувствительность к ПТП, вводимым парэнтерально. Значения БАК, равные 5, 6 или менее, сочетаются с МЛУ. Следовательно, по величине БАК можно в определенной степени судить о чувствительности или устойчивости культуры МБТ больного к назначаемым препаратам еще до получения результатов лабораторного определения ЛУ.

При разработке ускоренного метода определения БАК впервые выявлена обратная корреляция между значениями БАК и длительностью бакте-риовыделения (степень - средняя, г=-0,65, р=0,01). Таким образом, определение БАК с помощью полужидкой среды может служить достоверным и надежным критерием эффективности назначенной терапии, причем результаты определения БАК метод позволяет получить в недельный срок.

При обследовании в клинике терапии туберкулеза легких 101 пациента впервые получены данные о корреляции между значениями БАК и динамикой туберкулезного процесса. При высоких значениях БАК у 93,8% больных с сохраненной чувствительностью к изониазиду и у 80,0% с устойчивостью к нему наблюдали "значительное улучшение" и "улучшение". В целом, снижение показателей БАК от высоких к низким и к нулевым характеризуется ухудшением клинико-лабораторных показателей эффективности лечения. В частности, снижение показателей БАК до нулевых сопровождается уменьшением частоты благоприятного течения процесса до 18,2%. В группе больных с нулевыми значениями БАК, кроме того, наблюдали наиболее высокий процент тяжелых форм процесса, повторного туберкулеза, длительности выделения МБТ, частоты бактериовыделения через 6 месяцев лечения, высокую жизнеспособность МБТ. Следует подчеркнуть, что нулевые значения БАК четко соотносятся с наиболее неблагоприятным течением процесса и, следовательно, требуют незамедлительной и обязательной коррекции химиотерапии.

Таким образом, определение БАК больных с использованием аутош-тамма МБТ и полужидкой среды, является быстрым и надежным лабораторным методом контроля адекватности химиотерапии.

Использование одновременно двух методов - ускоренного определения ЛУ и БАК позволяет в короткие сроки, во-первых, выявить множественную лекарственную устойчивость, и, во-вторых, оценить адекватность химиотерапии и в случае необходимости откорректировать ее.

Преимущества методов — простота, дешевизна, короткий срок получения результатов - очевидны в условиях постоянного роста ЛУ, и, в особенности, множественной лекарственной устойчивости, так как они позволяют клиницистам в более короткие сроки с помощью индивидуализированной химиотерапии прервать распространение эпидемиологически более опасных МБТ.

Изменение свойств Mycobacterium tuberculosis, проявляющееся в широком распространении штаммов с МЛУ, циркуляции на территории РФ штаммов генотипа Beijing, доля которых составляет от 34 до 66% (Нарвская О.В., 2003; Иванов и др., 2004; Маракшин и др., 2004; Медведева и др., 2005 Drobniewski F. et al., 2005; Kovalev et al., 2005) требует решить вопрос о соотношении ЛУ, вирулентности, жизнеспособности и генотипа возбудителя.

При исследовании in vitro на модели инфицирования неактивированных дифференцированных клеток линии ТНР-1 микобактериями различных генотипов наибольшая вирулентность выявлена у МБТ генотипа Beijing варианта ВО. Количественно она проявляется относительно высокой скоростью роста и высокой цитотоксической активностью, стимуляцией индукции противовоспалительного цитокина TGF-р и супрессией провоспалительного TNF-a. Штаммы сборной группы иных генотипов (не Beijing), при схожей выживаемости обладали статистически достоверно меньшей способностью активировать некроз макрофагов. МБТ семейства LAM обладали полярными по отношению к Beijing свойствами, т.е. имели меньшую скорость роста в макрофагах и в меньшей степени вызывали их некроз обратную картину в отношении цитокинов. Полученные данные коррелируют с рядом клинических характеристик пациентов: - возрастным составом, длительностью заболевания и бактериовыделения. Наиболее неблагоприятная картина наблюдается у больных, выделяющих МБТ генотипа Beijing.

МБТ любого генотипа обладают вирулентностью, так как относятся к безусловным патогенным микроорганизмам. Все исследованные штаммы были выделены из патологического материала больных ТОД и, следовательно, были вирулентны. Высокотрансмиссивные штаммы, относящиеся к большим по объему кластерам, в большей степени цитотоксичны, модулируют ответ макрофагов в сторону продукции цитокинов, уменьшающих воспалительную защитную реакцию, что может приводить к диссеминации инфекции, характерной для ТОД, вызванного МБТ генотипа Beijing, и к возможности передачи жизнеспособного возбудителя другому хозяину. Высокая частота множественной лекарственной устойчивости у МБТ генотипа Beijing ВО, сочетающаяся с высокой вирулентностью, свидетельствует о том, что мутации в геноме возбудителя, которые обеспечивают устойчивость к ПТП, не сказываются на патогенных свойствах возбудителя туберкулеза.

Для более точного, количественного сопоставления значимости в туберкулезном процессе генетических и фенотипических особенностей организма-хозяина и организма-паразита необходимы дальнейшие исследования. Использованная в настоящей работе модель in vitro изучения вирулентности (цитотоксичности) с помощью клеточной линии ТНР-1, может позволить провести эти исследования. Кроме того, данная модель перспективна для поиска препаратов влияющих на вирулентность, ингибирующих или снижающих способность МВТ вызывать некроз макрофагов.

Список литературы диссертационного исследования доктор биологических наук Маничева, Ольга Алексеевна, 2009 год

1. Акимова НА., Морозова Т.П., Домотенко JI.B. Влияние рН среды на результаты определения чувствительности M.tuberculosis к этамбутолу // "Туберкулез сегодня": Матер.УН Рос. съезда фтизиатров. М., 2003. — С.81.

2. Алексеева Г.И., Кравченко А.Ф. Мониторинг лекарственной устойчивости микобактерий туберкулеза в республике Саха (Якутия) // Пробл. туб. и болезней легких. 2007. - № 7. - С. 30-33

3. Алексеевская К.П. Лечение больных туберкулезом легких под контролем бактериостатической активности крови. Автореф. дисс. канд.мед.наук. М., 1979.

4. Альховик О.И., Гащенко Н.Н., Лисиченко Г.М. и др. Диагностическая ценность ускоренного метода определения лекарственной устойчивости M.tuberculosis. // «Туберкулез старая проблема в новом тысячелетии»: Матер. Международ, конф. - М., 2002. - С.27.

5. Андреевская С.Н., Черноусова Л.Н., Смирнова Т.Г., и др. Изучение ех vivo роста в макрофагах штаммов Mycobacterium tuberculosis разных геноти-пических кластеров // Пробл. туб. и болезней легких. 2006. - № 12. - С. 4348.

6. Андреевская С.Н., Черноусова Л.Н., Смирнова Т.Г., и др. Влияние генотипа M.tuberculosis на выживаемость мышей при экспериментальном туберкулезе // Пробл. туб. и болезней легких. 2007. - № 7 - С. 45-50.

7. Аникин В.А. Проблемы корректности бактериологического исследования на лекарственную резистентность микобактерий туберкулеза.// Матер. IV (XIV) съезда науч. мед. ассоциации фтизиатров. М. - Йошкар-Ола. -1999.-С.207.

8. Бастиан И., Портале Ф. Туберкулез с множественной лекарственной устойчивостью: прошлое, настоящее и будущее. // Туберкулез с множественной лекарственной устойчивостью. М.: Медицина и жизнь, 2003. С. 17-33.

9. Борисов С.Е. Диагностика туберкулеза: возможности и пределы // «Туберкулез сегодня: проблемы и перспективы»: Науч. тр. и матер, конф., посвящен, памяти М.М.Авербаха. М., 2000. - С. 92-97.

10. Быкадорова K.P., Чубарян В.Т., Будина Н.И., Рыжков С.И. Автоматизированная система ускоренной культуральной диагностики туберкулеза // "Туберкулез сегодня". Матер. VII Рос. съезда фтизиатров. - М., - 2003. -С.82.

11. Бялик И.Б., Журило A.A., Вялых Ж.Э., и др. Исследование бактерио-статической активности крови при полихимиотерапии в различных режимах у больных с деструктивным туберкулезом легких // Укр. химиотерапевт, журн.- 2000.- № 3,- С. 26 29.

12. Васильева И.А., Черноусова JI.H., Заседателев A.C., и др. Клиническое значение микрочиповой технологии определения лекарственной устойчивости микобактерий туберкулеза // Пробл. туб. 2002. - № 6. - С. 21-24.

13. Васильева С.Н., Виноградова Т.И., Кацер ЛИ., и др. Оценка вирулентности микобактерий туберкулеза по объему поражений в легких в эксперименте на мышах // «Туберкулез сегодня». Матер. VII Рос. съезда фтизиатров.-М., 2003.-С. 82.

14. Вилер П.Р., Ретледж К. Метаболизм Mycobacterium tuberculosis. // «Туберкулез. Патогенез, защита, контроль» : пер. с англ. / Под ред. Барри Б.Блума. — М.: Медицина, 2002. С.379-415.

15. Вишневский Б.И. Влияние внутривенной гормоно-химиотерапии на жизнеспособность микобактерий туберкулеза // Пробл.туб. 1971. - № 8. — С. 21-25.

16. Вишневский Б.И., Ткачук В.Н., Милорадович В. Концентрация основных противотуберкулезных препаратов в крови и почечной ткани больных туберкулезом почек // Урол. и нефрол. 1975. - № 4. - С. 12-16.

17. Вишневский Б.И., Истомин Е.А., Мякотина Е.Н. Исследование лекарственной чувствительности микобактерий туберкулеза к левофлоксацину // Антибиотики и химиотерапия. 2002.- Т. 47, № 6.- С. 28-31.

18. Вишневский Б.И., Вишневская Е.Б. Лекарственная устойчивость микобактерий туберкулеза на Северо-Западе России //Пробл. туб. и болезней легких. 2003. - № 5.- С. 42-45.

19. Вишневский Б.И., Вишневская Е.Б., Платонова М.В. Лекарственная устойчивость микобактерий туберкулеза при различных локализациях заболевания.// Матер. VII съезда Всерос. общества эпидемиол., микробиол. и па-разитол. М., 1997. - Т.2. - С. 301-302.

20. Вишневский Б.И., Оттен Т.Ф., Нарвская О.В., Вишневская Е.Б. Клиническая микробиология // «Руководство по легочному и внелегочному туберкулезу» / Под ред. Ю.Н.Левашева, Ю.М.Репина. СПб.: ЭЛБИ-СПб. -2006.-С. 95-114.

21. Гамазков Р.В. Эндолимфатическое введение изониазида в комплексном лечении туберкулезного эпидидимита // Автореф. дис. . канд. мед. наук. СПб. 2000.

22. Голышевская В.И., Корнеев А.А., Черноусова Л.Н., и др. Применение новых микробиологических технологий в диагностике туберкулеза // Пробл. туб. 1996. - № 6. - С. 22- 25.

23. Голышевская В.И., Севастьянова Э.В., Воронина Г.А. Определение лекарственной устойчивости Mycobacterium tuberculosis методами пропорций и абсолютных концентраций // Пробл. туб. 2001а. - № 3. — С. 51-53.

24. Джекобе У .Р., Блум Б.Р. Молекулярно-генетические подходы к идентификации факторов вирулентности Mycobacterium tuberculosis // «Туберкулез. Патогенез, защита, контроль» : Пер. с англ. / Под ред. Барри Б.Блума. -М.: Медицина, 2002. С. 271-290.

25. Домарадский И.В. Вирулентность бактерий как функция адаптации // ЖМЭИ. 1997. - № 4. - С. 16-20.

26. Домотенко Л.В., Морозова Т.П., Булатова Р.Ф., и др. Тест-набор для ускоренного определения лекарственной чувствительности М. Tuberculosis //«Туберкулез сегодня»: Матер. VII Росс. Съезда фтизиатров. М., 2003.- С. 83.

27. Дорожкова И.Р., Попов С.А., Медведева И.Н. Мониторинг лекарственной устойчивости возбудителя туберкулеза в России за 1979-1998 гг. // Пробл.туб. 2000. - № 5. - С. 19-22.

28. Дощак Н.И., Ломаченков В.Д. Устойчивость микобактерий и ее влияние на эффективность лечения впервые выявленных больных туберкулезом легких // Мат. VII съезда Всерос. общества эпидем., микробиол. и паразитол. М., 1997. - Т. 2. - С. 305-306.

29. Журавлев В.Ю., Васильева И.Н., Нарвская О.В. Генодиагностика дис-семинированного туберкулеза // «Генодиагностика инфекционных болезней -2007»/ Под ред. В.И.Покровского. М. - 2007. - Т.З. - С. 17-20.

30. Иванов И.Ю., Степаншина В.Н., Липин М.Ю., Коробова О.В., Шемякин И.Г. Сполиготипы клинических штаммов Mycobacterium tuberculosis, выделенных у больных туберкулезом Центрального региона России // Пробл. туб. и болезней легких. 2004. - № 4. - С. 23-27.

31. Ильина Т.Я., Жангиров А.А., Сидоренко О.А. Резистентность микобактерий туберкулеза у впервые выявленных больных туберкулезом и при рецидивах заболевания // Пробл. туб. и болезней легких. 2003. - № 5. - С. 19-21.

32. Иртуганова О.А., Смирнова Л.С., Слогоцкая Л.В., и др. Автоматизированные методы культурального определения Mycobacterium tuberculosis на жидких средах // Пробл. туб. 2001. - № 3. - С. 53-55.

33. Кибрик Б.С., Челнокова О.Г. Некоторые особенности лекарственной резистентности микобактерий туберкулеза у больных с остропрогрессирующими деструктивными формами туберкулеза легких // Пробл. туб. и болезней легких. 2003. - № 8. - С. 3-5.

34. Кондакова М.Н. Клинико-генетические особенности патогенеза туберкулеза органов дыхания у подростков // Автореф. . .дис. докт.мед.наук. -СПб, 2005.

35. Корнеев А.А. Дифференциальная диагностика и определение лекарственной устойчивости микобактерий туберкулеза // Матер. VII съезда Все-рос. общества эпидемиол., микробиол. и паразитол. М., 1997. - Т. 2. - С.ЗО.

36. Литвинов В.И. Лабораторная диагностика туберкулеза // Науч. тр.(к 75-летию ведущего противотуб. учреждения г.Москвы./ Под ред. В.И.Литвинова.-М., 2001.-С. 216-219.

37. Маракшин А.П., Мезько Е.М., Белякова Н.К., и др. Генотипические характеристики штаммов Mycobacterium tuberculosis из республики Тува // Пробл.туб и болезней легких. 2004. -№ 3. - С. 37-40.

38. Медведева Т.В., Огарков О.В., Некипелов О.М., и др. MIRU-VNTR-типирование штаммов Mycobacterium tuberculosis из Восточной Сибири семейство Beijing, вариант Kilimanjaro // Мол.ген. микробиол. вирусол. - 2004. - № 4. — С. 33-38.

39. Медицинская микробиология // Гл. ред. В.И.Покровский, О.К.Поздеев. М.: ГЭОТАР МЕДИЦИНА, 1999. - 1200 с.

40. Мишин В.Ю., Чуканов В.И., Васильева И.А. Эффективность лечения туберкулеза легких, вызванного микобактериями с множественной лекарственной устойчивостью // Пробл. туб. 2002. - № 12. - С. 18-22.

41. Нарвская О.В. Геномный полиморфизм Mycobacterium tuberculosis и его значение в эпидемическом процессе // Автореф. .дис. докт.мед.наук. -СПб., 2003.

42. Обгольц А.А. Механизмы персистирования бактерий // ЖМЭИ. -1992.-№4.-С. 70-72.53. "О совершенствовании противотуберкулезных мероприятий в Российской Федерации" // Приказ Минздрава РФ от 21.03.2003 г. № 109.

43. Самойлова А.Г., Марьяндышев А.О. Лекарственная устойчивость ми-кобактерий туберкулеза актуальная проблема фтизиатрии (обзор литературы) // Пробл. туб. и болезней легких. - 2005. - № 7. - С. 3-9.

44. Сапожникова Н.В. Особенности течения туберкулеза легких в зависимости от биологических свойств возбудителя // Автореф. дис. .канд.мед.наук. СПб., 2003.

45. Севастьянова Э.В., Голышевская В.И., Сафонова С.Г., Масленникова Ю.В. Определение лекарственной устойчивости M.tuberculosis традиционными и современными методами // Матер. IV съезда науч.-мед. ассоциации фтизиатров. М.-Йошкар-Ола, 1999. С. 218.

46. Севастьянова Э.В., Мартынова Л.П., Масленникова Ю.В. Изучение степени резистентности штаммов M.tuberculosis с множественной лекарственной устойчивостью // Матер. VIII Всерос. съезда эпидемиол., микробиол. и паразитол. -М., 2002. Т.З.- С. 210 -211.

47. Сидоренко С.В. Есть ли будущее у антибактериальной терапии? // Антибиот. химиотер. 1999. - вып.44. - № 1. - С. 3-5.

48. Скотникова О.И., Михайлович В.М., Носова Г.Ю., и др. Новые технологии определения лекарственной чувствительности Mycobacterium tuberculosis // Пробл. туб. и болезней легких.- 2004. № 6. - С. 40-47.

49. Скрягина Е.М., Залуцкая О.М., Рот А. и др. Выявление микобактерий туберкулеза различными методами // Пробл.туб. 2001а.- № 5.-С. 56-58.

50. Скрягина Е.М., Залуцкая О.М., Рот А. и др. Тестирование лекарственной чувствительности микобактерий туберкулеза с использованием различных методов. // Пробл.туб. 20016.- № 5.- С. 43-45.

51. Соколова Г.Б. Индивидуализированная химиотерапия туберкулеза легких// Автореф. дисс. . докт. мед. наук. М., 2000.

52. Степаншин Ю.Г., Степаншина В.Н., Шемякин И.Г. Молекулярные механизмы устойчивости Mycobacterium tuberculosis к лекарственным препаратам // Новости науки и техн. Сер. Мед. Вып. Туберкулез/ ВИНИТИ. -2002. №5.-С. 1-6.

53. Филатова М.С., Валиев Р.Ш. Бактериостатическая активность крови у больных туберкулезом и ее клиническое значение //"Туберкулез сегодня" : Матер. VII Рос. съезда фтизиатров. М., 2003. - С. 93.

54. Хейфец Л. Традиционные методы исследования лекарственной чувствительности Mycobacterium tuberculosis // «Туберкулез с множественнойлекарственной устойчивостью»: М.: «Медицина и жизнь», 2003. - С. 163175.

55. Хоменко А.Г., Голышевская В.И. Распространенность и микробиологическая характеристика штаммов с множественной лекарственной устойчивостью // Реф. сбор. "Туберкулез". 1999. - №1. - С. 1-5.

56. Шемякин И.Г., Степаншина В.Н., Коробова О.А. и др. Биологические свойства клинических изолятов Mycobacterium tuberculosis // ЖМЭИ. — 2002. № 1.-С. 7-11.

57. Щеголева Р.А. Модификация жидкой питательной среды Сотона для выращивания микобактерий туберкулеза // Лаб. дело. 1989. № 5. - С. 78-79.

58. Ягафарова Р.К., Рекель Ю.И., Вишневский Б.И. Влияние террилитина на бактериостатическую активность тканей при химиотерапии туберкулеза почек и женских половых органов в эксперименте // Антибиотики и мед. биотехнология. 1986. - № 4. - С. 294-297.

59. Affolabi D., Odoun М., Martin A. et al. Evaluation of direct detection of Mycobacterium tuberculosis rifampin resistance by a nitrate reductase assay applied to sputum samples in Cotonou, Benin // J.Clin.Microbiol. 2007. - v. 45. -P. 2123-2125.

60. Akhtar P., Srivastava S, Srivastava A. et al. Rv3303c of Mycobacterium tuberculosis protects tubercle bacilli against oxidative stress in vivo and contributes to virulence in mice // Microbes Infect. 2006. - v. 8(14-15). - P. 2855-2862.

61. Al-Akhali A., Ohkado A., Fujiki A. et al. Nationwide survey on the prevalence of anti-tuberculosis drug resistance in the Republic of Yemen, 2004 // Int. J. Tuberc. Lung Dis. 2007. - v.l 1(12).- P. 1328-33.

62. Albert H., Trollip A.P, Seaman T. et al. Evaluation of a rapid screening test for rifampicin resistance in re-treatment tuberculosis patients in the Eastern Cape //S. Afr. Med. J. 2007. - v.91. - № 9. - P. 858-863.

63. Ando M., Yoshimatsu T., Ko C. et al. Deletion of Mycobacterium tuberculosis Sigma Factor E Results in Delayed Time to Death with Bacterial Persistence in the Lungs of Aerosol-Infected Mice // Infec. Immunity. 2003. - Vol. 71.- № 12.- P. 7170-7172.

64. Angeby K.A., Klints L., Hoffner S.A. Rapid and inexpensive drug susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis with nitrate reductase assay // J. Clin. Microbiol. 2002. - v. 40. - P. 553-555.

65. Barreto A.M., Araujo J.B., Medeiros R.F, Caldas P.C. Direct sensitivity test of the MB/BacT system //Mem. Inst. Oswaldo Cruz. 2002. - v. 97. - № 2. -P. 263-264.

66. Bastian I., Rigouts L., Palomino J.C., Portaels F. Kanamycin Susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis Using Mycobacterim Growth Indicator Tube and a Colometric Method.// Antimicrob. Agents Chemotherap. 2001. -v.45. -№ 6. - P. 1934-1936.

67. Bemer P., Bodmer T., Munzinger J. et al. Multicenter evaluation of the MB/BACT system for susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis //J. Clin. Microbiol. 2004. - v. 42. - № 3. - P. 1030-1034.

68. Bergmann J.S., Woods G.L. Evaluation of the ESP Culture System II for Testing Susceptibilities of Mycobacterium tuberculosis Isolates to Four Primary Antituberculosis Drugs // J. Clinic.Microbiol. 1998. - v. 36. - № 10. - P. 29402943.

69. Bergval I.L., Vijzelaar R.N., Dalla Costa E.R., et al. Development of a multiplex assay for the rapid characterisation Mycobacterium tuberculosis // J. Clin. Microbiol. 2007. - v. 46. - № 2. - P. 689-699.

70. Borgdorff M.W., van Deutekom H., De Haas P.E. Mycobacterium tuberculosis, Beijing genotype strains not associated with radiological presentation of pulmonary tuberculosis // Tuberculosis (Edinb). 2004 - v. 84. - № 5. - P. 337340.

71. Brunello F., Fontana R. Reliability of the MB/BacT System for Testing Susceptibility of Mycobacterium tuberculosis Complex Isolates to Antituberculous Drugs // J. Clinic. Microbiology. 2000. - v. 38. - № 2. - P. 872-873.

72. Cardoso R.F., Cardoso M.A., Leite C.Q. et al. Characterization of ndh gene of isoniazid resistant and susceptible Mycobacterium tuberculosis isolates from Brazil // Mem. Inst. Oswaldo Cruz. 2007. - v. 102. - № 1. - P. 59-61.

73. Casart Y., Turcios L., Florez I. IS6110 in oriC affects the morphology and growth of Mycobacterium tuberculosis and attenuates virulence in mice // Tuberculosis (Edinb). 2008. - v. 88. - № 6. - P. 545-552.

74. Castandet J., Prost J.F., Peyron P. et al. Tyrosine phosphatase MptpA of Mycobacterium tuberculosis inhibits phagocytosis and increases actin polymerization in macrophages // Res. Microbiol. 2005. - v. 156. - № 10. - p . 1005-1013.

75. Caviedes L., Delgado J., Gilman R.H. Tetrazolium microplate Assay as a Rapid and Inexpensive Colorimetric Method for Determination of Antibiotic Susceptibility of Mycobacterium tuberculosis // J. Clinic. Microbiol. 2002. - v. 40. -№5.-P. 1873-1874.

76. Caviedes L., Lee T.S., Gilman R.H. et al. Efficient Detection and Drug Susceptibility Testing of Mycobacterium tuberculosis in Sputum by Microscopic observation of Broth Culture // J. Clinic. Microbiol. 2000. - v. 38. - № 3. - P. 1203-1208.

77. Chauca A., Palomino J.C., Guerra H. Evaluation of rifampicin and isoni-azid susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis by a mycobacteriophage D29-based assay // Med. Microbiol. 2007. - V.56 (Pt 3). - P. 360-364.

78. Cheon S.-H., Kampmann B., Hise A.G. et al. Bactericidal Activity in Whole Blood as a Potential Surrogate Marker of Immunity after Vaccination against Tuberculosis // Clin. Diagn. Lab. Immunol. 2002. — v. 9. — № 4. - P. 901907.

79. Coban A.Y., Birinci A., Ekinci B., Durupinar B. Drug susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis by the broth microdilution method with 7H9 broth. //Mem. Inst. Oswaldo Cruz. 2004. v. 99. - № 1. - P. 111-113.

80. Coban A.Y., Bilgin K., Uzun M. et al. Susceptibilities of Mycobacterium tuberculosis to isiniazid and rifampin on blood agar // J. Clin. Microbiol. 2005. -v.43. -№ 4. - P. 1930-1931.

81. Coban A.Y., Cihan C.C., Bilgin K. et al. Blood agar for susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis against first-line drugs // Int. J. Tuberc. Lung Dis. 2006 a. - v. 10. - № 4. - P.450-4503.

82. Coban A.Y., Cekic Cihan C., Bilgin K. et al. Rapid susceptibility test for Mycobacterium tuberculosis to isoniazid and rifampin with resazurin method in screw-cap tubes //J. Chemother. 2006 6. - v. 18. -№ 2. - P. 140-143.

83. Costeira J, Pina J. Multi-drug resistant tuberculosis and the red queen -Diagnosis speed is crucial // Rev Port Pneumol. 2007. - v. 13. - № 6. - P. 869877.

84. Cronjo L., Edmondson N., Eisenach K.D., Bornman L. Iron and iron chelating agents modulate Mycobacterium tuberculosis growth and monocyte-macrophage viability and effector functions //FEMS Immunol. Med. Microbiol. -2005. v. 45. - № 2. - P. 103-112.

85. Diaz-Infantes M.S., Ruiz-Serrano M.J., Martinez-Sanchez L. et al. Evaluation of the MB/BacT mycobacterium detection system for susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis // J. Clin. Microbiol.- 2000. v. 38. - № 5. - P. 1988-1989.

86. Dos Vultos T., Mestre O., Rauzier J. et al. Evolution and diversity of clonal bacteria: the paradigm of Mycobacterium tuberculosis // PLoS ONE. -2008.- v. 3. -№ 3. P. 1538.

87. Drobniewski F., Balabanova Y., Nikolayevsky V. et al. Drug-resistant tuberculosis, clinical virulence, and the dominance of the Beijing strain family in Russia // JAMA. 2005. v. 293. - № 22. - P. 2726-2731.

88. Dye C. Tuberculosis 2000-2010: control, but not elimination // Int. J. Tu-berc. Lung Dis. 2000. - v. 4. - P. 146-152.

89. Ejigu G.S., Woldeamanuel Y., Shah N.S. et al. Microscopic-observation drugsusceptibilityassayprovidesrapidandreliableidentification of MDR-TB // Int. J. Tuberc. Lung Dis. 2008. - v. 12. - № 3. - P. 332-337.

90. Farnia P., Masjedi M.R., Mohammadi F. et al. Colorimetric Detection of Multidrug-Resistant Tuberculosis by Use of Malachite Green Indicator Dye // J. Clinic. Microbiol. 2008. - v. 46. - № 2. - P. 796-799.

91. Ferrer NX., Gomez A.B., Soto C.Y. et al. Intracellular replication of attenuated Mycobacterium tuberculosis phoP mutant in the absence of host cell cytotoxicity // Microbes and infection. 2009. - v. 11. - № l. - p. 115-122.

92. Foongladda S., Roengsanthia D., Arjrattanakool W. et al. Rapid and simple MTT method for rifampicin and isoniazid susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis // Int. J. Tuberc. Lung Dis. 2002. - v.6. - № 12. - P. 11181122.

93. Franzblau S.G., Witzig R.S., McLaughlin J.C. et al. Rapid, Low-technology MIC Determination with Clinical Mycobacterium tuberculosis Isolates by Using the Microplate Alamar Blue Assay // J. Clinic. Microbiol. 1998. - v.36.- № 6. P. 362-366.

94. Freixo I.M., Caldas P.C.S., Martins F. et al. Evaluation of Etest Strips for Rapid Susceptibility Testing of Mycobacterium tuberculosis // J. Clinic. Microbiol.- 2002. v.40. - № 6. - P. 2282-2284.

95. Gagneux S., DeRiemer K., Van T. et al. Variable host-pathogen compatibility in Mycobacterium tuberculosis // Proc. Natl. Acad. Sei. U S A. 2006. - v. 103.-№ 8.-P. 2869-2873.

96. Gali N., Dominguez J., Blanco S. et al. Utility of an in-house mycobacte-riophage-based assay for rapid detection of rifampin resistance in Mycobacterium tuberculosis clinical isolates // J. Clin. Microbiol. 2003. - V. 41. - № 6. - P. 2647-2649.

97. Goldman R.C., Plumley K.V., Laughon B.E. The evolution of exstensively drug resistans tuberculosis (XDR-TB): history, status, and issues for global control // Infect. Disord. Drug Targets 2007. - v. 7.- № 2. - P. 73-91.

98. Gonzalo Asensio J., Mostowy S., Harders-Westerveen J. PhoP: A Missing Piece in the Intricate Puzzle of Mycobacterium tuberculosis Virulence // PLoS. — 2008. — v. 3. №10. - P. 3496.

99. Gordon A.Y., D'Arcy Hart P., Young M.R. Ammonia inhibits phagosome-lysosome fusion in macrophages // Nature. 1980. - v. 286. - P. 79-81.

100. Hanna B.A., Walters S.B., Bonk S.J., Tick L.J. Recovery of mycobacteria from blood in mycobacteria growth indicator tube and Lowenstein-Jensen slant after lysis-centrifugation // J. Clin.Microbiol. 1995. - v. 33. - P. 3315-3316.

101. Hazbon M.H., del Socorro Orozco M., Labrada L.A. et al. Evaluation of Etest for Susceptibility Testing of Multidrug-Resistant Isolates of Mycobacterium tuberculosis // J. Clinic. Microbiol. 2000. - v. 38. - № 12. - P. 4599-4603.

102. Hazbon M. H.,' Guarfn N., Ferro B. E. et al. Photographic and Luminomet-ric Detection of Luciferase Reporter Phages for Drug Susceptibility Testing of

103. Clinical Mycobacterium tuberculosis Isolates I I J. Clinic.l Microbiol. — 2003. v. 41.- № 10.-P. 4865-4869.

104. He H., Hovey R., Kane J. et al. MprAB Is a Stress-Responsive Two-Component System That Directly Regulates Expression of Sigma Factors SigB and SigE in Mycobacterium tuberculosis //J. ofBacteriol. . 2006. - V. 188. - № 6. -P. 2134-2143.

105. Heifets L., Sanchez T. New Agar Medium for Testing Susceptibility of Mycobacterium tuberculosis to Pyrazinamide // J. Clinic. Microbiol. 2000. - v. 38.-№4.-P. 1498-1501.

106. Heifets L.B., Cangelosi G.A. Drug susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis: a neglected problem at the turn of century // Int. J. Tuberc. Lung Dis. 1999. - v. 3. - № 7. - P. 564-581.

107. Hu Y., Movahedzadeh F., Stoker N.G., Coates A.R. Deletion of the Mycobacterium tuberculosis alpha-crystallin-like hspX gene causes increased bacterial growth in vivo // Infect. Immun. 2006. v. 74. -№ 2. - P. 861-868.

108. Huang T.-S., Lee S.S.-J., Tu H.-Z. et al. Use of MGIT 960 for rapid quantitative measurement of the susceptibility of Mycobacterium tuberculosis complex to ciprofloxacin and ethianamide // J. Antimicrib.Chemotherapy. 2004. - v. 53. -P .600-603.

109. Ingham C.J., Ayad A.B., Nolsen K., Mulder B. Rapid drug susceptibility testing of mycobacteria by culture on highly porous ceramic support // Int. J. Tuberc. Lung Dis. 2008. - v. 12. - № 6. - P. 645-650.

110. Jacobs W.R. , Barletta R.G, Udani R. et al. Rapid assessment of drug susceptibilities of Mycobacterium tuberculosis by means of luciferase reporter phages. // Science. 1993. - v. 260(5109). - P.819-822.

111. Janulionis E., Sofer C., Song H.Y., Wallis R.S. Lack of activity of orally administered clofazimine against intracellular Mycobacterium tuberculosis in whole-blood culture // Antimicrob. Agents Chemother. 2004. - v. 48. - № 8. -P. 3133-3135.

112. Jayachandran R., Scherr N., Pieters J. Analyzing the interaction of pathogens with the host immune system //Immunol. Lett. 2009. - v. 122. - № 2. - P. 112-114.J

113. Joh J.-S, Lee C.H., Lee J.E. et al. The Interval Between Initiation of Antituberculosis Treatment in Patients with Culture-positive Pulmonary Tuberculosis and Receipt of Drug-susceptibility Test Results // J. Korean Med. Sei. 2007. -v.22.-P. 26-29.

114. Joloba M.L., Bajaksouzian S., Jacobs M.R. Evaluation of Etest for Susceptibility Testing of Mycobacterium tuberculosis // J. Clinic. Microbial. 2000. - v. 38.-№ 10.-P. 3834-3836.

115. Jrdway D.J., Sonnerberg M.G., Donahue S.F. et al. Drug resistant strains of Mycobacterium tuberculosis exhibit a range of virulence for mice // Infect. Immunity. 1995. - v.63. - P. 741-743.

116. Kamerbeek J., Shouls L., Kolok A. et al. Simultaneous detection and strain differetiatin of Mycobacterium tuberculosis for diagnosis and epidemiology //J. Clin. Microbiol. 1997. - v.35. - P. 907-914.

117. Keane J., Remold H.G., Kornfeld H. Virulent Mycobacterium tuberculosis Strains Evade apoptosis of Infected Alveolar Macrophages // J. Immun. 2000. -v.164. — P. 2016-2020.

118. Kirk S.M., Schell R.F., Moore A.V. et al. Flow Cytometric Testing of Susceptibilities of Mycobacterium tuberculosis Isolates to Ethambutol, Isoniazid, and Rifampin in 24 Hours // J. Clinic. Microbiol. 1998. - v. 36. - № 6. - P. 1568-1573.

119. Kovalev S.Y., Kamaev EY., Kravchenko M.A. et al. Genetic analysis of mycobacterium tuberculosis strains isolated in Ural region, Russian Federation, by

120. MIRU-VNTR genotyping // Int. J. Tuberc. Lung Dis. 2005. - v. 9. - № 7. - P. 746-752.

121. Kurtz S., McKinnon K.P., Runge M.S. et al. The SecA2 secretion factor of Mycobacterium tuberculosis promotes growth in macrophages and inhibits the host immune response // Infect. Immun. 2006. - v. 74. - № 12. - P. 6855-6864.

122. Lam T.H., Yuen K.Y., Ho P.L., et al. Differential fadE28 expression associated with phenotypic virulence of Mycobacterium tuberculosis // Microb. Pathog. 2008.- v.45.-№ l.-P. 112-117.

123. Lamichhane G., Raghunand T.R., Morrison N.E. et al. Deletion of a Mycobacterium tuberculosis proteasomal ATPase homologue gene produces a slow-growing strain that persists in host tissues // J. Infect. Dis. 2006. v. 194. - № 9. -P. 1233-1240.

124. Leite C. Q. F., Beretta A. L. R. Z., Anno I. S., Teiles M. A. S. Standartiza-tion of Broth Microdilution Method for Mycobacterium tuberculosis // Mem. Ins. Oswaldo Cruz. 2000. - v. 95. - № l.-P. 127-129.

125. Lemus D., Martin A., Montoro E., et al. Rapid alternative methods for detection of rifampicin resistance in Mycobacterium tuberculosis // J. Antimicrob. Chemotherap. -2004. v. 54. - P. 130-133.

126. Lemus D., Montoro E., Echemendia M. et al. Nitrate reductase assay for detection of drug resistance in Mycobacterium tuberculosis; simple and inexpensive method for low-resource laboratories // J. Med. Microbiol. 2006. - v. 55. -P.861-863.

127. Levina K., Saluotsa M. Serum bactericidal activity test in patients with tuberculosis performed with BACTEC TB system // Int. J. Tuberc. Lung Dis. 1999. -v. 3.-Suppl.l.-P. 113.

128. Lew W., Pai M., Oxlade O. et al. Initial drug resistance and tuberculosis treatment outcomes: systematic review and meta-analysis // Ann. Intern. Med. -2008.- v. 149.-№2. — P.123-134.

129. Li Q., Whalen C.C., Albert J.M. Differences in Rate and Variability of Intracellular Growth of a Panel of Mycobacterium tuberculosis Clinical Isolates within a Human Monocyte Model // Infec. .Immun. 2002 - v. 70. - № 11. - P. 6489-6493.

130. Lopez B., Aguilar D., Orozco H. et al. A marked difference in pathogenesis and immune response induced by different Mycobacterium tuberculosis genotypes // Clin. Exp. Immunol. -2003. v. 133. -№ 1. - P. 30-37.

131. Ma X.W., Hu Z.Y., Wang J. et al. Comparison between bacteriophage-based assay and BACTEC-960 system in detection of ethambutol resistance in Mycobacterium tuberculosis // Zhonghua Nei Ke Za Zhi. 2005. - V.44. - № 3. -P. 202-205. №t. no: Medline).

132. Macondo E.A., Ba F., Gaye-Diallo A. et al. Rapid susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosi by the Mycobacteria Growth Indicator Tube (MGIT AST SIRE) // Clin. Microbiol. Infect. 2000. - v .6. - P. 361-365.

133. Manca C., Tsenova L., Barry C.E. et al. Mycobacterium tuberculosis CDC 1551 Induces a More Vigorous Host Response In Vivo and In Vitro, But Is Not More Virulent Than Other Clinical Isolates //J. Immunol. 1999. - v. 162. -P. 6740-6746.

134. Manganelli R., Dubnau E., Tyagi S. et al. Differential expression of 10 sigma factor genes in Mycobacterium tuberculosis // Mol. Microbiol. 1999. -v.31. -№ 2. - P. 715-724.

135. Martin A., Camacho M., Portaeis F., Palomini J.C. Resazurin Microtiter Assay plate testing of Mycobacterium tuberculosis to Second-Line Drugs: Rapid,

136. Simple, And Inexpensive Method // Antimicrob. Agenta chemotherapy. 2003. -v.47. — № 11.-P. 3616-3619.

137. Martin A., Morcillo N., Lemus D. et al. Multicenter study of MTT and re-sazurin assays for testing susceptibility to first-line anti-tuberculosis drugs //Int. J. Tuberc. Lung Dis. 2005 a. - v. 9. - № 8. - P. 901-906.

138. Martin A., Palomino J.C., Portaeis F. Rapid detection of ofloxacin resistance in Mycobacterium tuberculosis by two low-cost colorimetric methods: resa-zurin and nitrate reductase assays //J Clin Microbiol. 2005 6. - v. 43. - № 4. - P. 1612-1616.

139. Martin A., Takiff H., Vandamme P. et al. A new rapid and simple method to detect pyrazinamide resistance in Mycobacterium tuberculosis using nicotinamide // J. Antimicrob. Chemotherap. 2006. - v.58. - P. 327-331.

140. Mathema B., Kurepina N.E., Bifania P.J., Kreiswirth B.N. Molecular Epidemiology of Tuberculosis: Current Insights //Clinic. Microbiol. Reviews. 2006. -v. 19.-№4.-P. 658-685.

141. McNerney R., Kiepiela P., Bishop K.S. et al. Rapid screening of Mycobacterium tuberculosis for susceptibility to rifampicin and streptomicin // Int. J. Tuberc. Lung Dis. 2000. - v.4. - P. 69-75.

142. McNerney R., Mallard K., Urassa H.M. et al. Colorimetric phage-based assay for detection of rifampin-resistant Mycobacterium tuberculosis // J. Clin. Microbiol. 2007. - v. 45. - № 4. - P. 1330-1332.

143. Mejia G.I., Castrillon L., Tujillo H., Robledo J.A. Microcolony detection in 7H11 thin layer culture is an alternative for rapid diagnosis of Mycobacterium tuberculosis infection // Int. J. Tuberc. Lung Dis. 1999.- v.3. - P. 138-142.

144. Mengatto L., Chiani Y., Imaz M.S. Evaluation of rapid alternative methods for drug susceptibility testing in clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis // Mem. Inst. Oswaldo Cruz. 2006. - v. 101(5). - P. 535-542.

145. Mirovic V., Lepsanovic Z. Evaluation of the MB/BacT system for recovery of mycobacteria from clinical specimens in comparison to Lowenstein-Jensen medium.//Clin. Microbiol. Infect. -2002.- V.8.-№ 11.-P.709-714.

146. Mitchinson D.A., Wallace J.G., Bhatia A.L. A comparison of the virulence in guinea pig of South India and British tubercle bacilli // Tubercle. 1960. - v.41. -P. 1-22.

147. Moore D.A.J., Evans C.A.W., Gilman R.H. et al. Microscopic Observation Drug-Susceptibility Assay for the diagnosis of TB // N. Engl. J. Med. 2006. - v. 355.- № 15.-P. 1539-1550.

148. Mueller P., Pieters J. Modulation of macrophage antimicrobial mechanisms bypathogenicmycobacteria // Immunobiology. 2006. - v. 211. - № 6-8. -P. 549-556.

149. Musa HR, Ambroggi M, Souto A, Angeby KA. Drug susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis by a nitrate reductase assay applied directly on microscopy-positive sputum samples // J. Clin. Microbiol. -2005. v.43. - No 7. -P. 3159-3161.

150. Nateche F., Martin A., Baraka S., Palomino J.C., Khaled S., Portaeis F. Application of the resazurin microtitre assay for detection of multidrug resistance in Mycobacterium tuberculosis in Algiers // J. Med. Micobiol. 2006. - v.55. — P. 857-560.

151. Nie Fhogartaigh C.J., Vardas-Prada S., Huancare V. et al. Physician-initiated courtesy MODS testing for TB and MDR-TB diagnosis and patient management //Int. J. Tuberc. Lung Dis. 2008. - v. 12. - № 5. - P. 555-560.

152. Nullius M.V., Harth G., Horwitz M.A. Glutamine sythatase GlnAl is essential for growth of Mycobacterium tuberculosis in human THP-1 macrophages and guinea pigs //Infec. Immun.- 2003. v.71. - № 7. - P. 3927-3936.

153. Ordway D.J., Sonnenberg M.G., Donahue S.A. et al. Drug-resistant strains of Mycobacterium tuberculosis exhibit a range of virulence for mice // Infect. Immun. 1995. - v. 63. - № 2. - P. 741-743.

154. Oztur K.S., Ilvan A., Kartaloglu Z. et al. The value of mycobacterial growth indicator tube (MGIT) system for isolation of Mycobacterium tuberculosis from sputum // Int.J.Tuberc. Lung Diseas. 1999. - v. 3. - № 9. - Suppl. 1. - P. 181.

155. Palaci M., Ueki S.Y., Sato D.N. et al. Evaluation of mycobacteria growth indicator tube for recovery and drug susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis isolates from respiratory specimens // J. Clin. Microbiol. 1996. - v. 34. -P. 762-764.

156. Palomino J.C. Nonconventional and new methods in the diagnosis of tuberculosis: feasibility and applicability in the field // Eur. Respir. J. 2005. - v. 26. -P. 339-350.

157. Palomino J. C., Traore H., Fissette K., Portaeis F. Evaluation of Mycobacteria Growth Indicator Tube (MGIT) for drug susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis // Int. J. Tuberc. Lung Dis. 1999. - v. 3. - № 4. - P. 344-348.

158. Park D.J., Drobniewski F.A., Meyer A., Wilson S.M. Use of a phage-based assay for phenotypic detection of mycobacteria directly from sputum // J. Clin. Microbiol. 2003. - v.41. - № 2. - P. 680-688.

159. Park J.S., Tamayo M.H., Gonzalez-Juarrero M. et al. Virulent clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis grow rapidly and induce cellular necrosis but minimal apoptosis in murine macrophages // J. Leukoc. Biol. 2006. — v. 79. — № l.-P. 80-86.

160. Park W.G., Bishai W.R., Chaisson R.E., Dorman S.E. Performance of the Microscopic Observation Drug Susceptibility Assay in Drug Susceptibility Testing for Mycobacterium tuberculosis // J. Clinic. Microbiol. 2002. - v.40. - № 12. -P. 4750-4752.

161. Park Y.K., Shin S., Ryu S. et al. Comparison of drug resistance genotypes between Beijing and non-Beijing family strains of Mycobacterium tuberculosis in Korea // J. Microbiol. Methods. 2005. - v. 65. - № 2. - P. 162-172.

162. Paul S., Laochumroonvorapong P., Kaplan G. Comparable growth of virulent and avirulent Mycobacterium tuberculosis in human macrophages in vitro // J. Infect. Dis. 1996. - v. 174. - № l.-P. 105-112.

163. Perez E., Samper S., Bordas Y. et al. An essential role for phoP in Mycobacterium tuberculosis virulence // Molecul. Microbiol. 2008. - v. 41(1). — P. 179-187.

164. Pfyffer G.E., Welscher H.M., Kissling P. et al. Comparison of the Mycobacteria Growth Indicator Tube (MGIT) with radiometric and solid culture for recovery of acid-fast bacilli // J. Clin. Microbiol. 1997. - V. 35. - № 2. - P. 364368.

165. Piersimoni C., Olivieri A., Benacchio L., Scarparo C. Current Perspectives on Drug Susceptibility Testing of Mycobacterium tuberculosis Complex: the Automated Nonradiometric Systems // J. Clinic. Microbiol. 2000. - v.44. - No 1. -P.20-28.

166. Pillay M, Sturm A.W. Evolution of the extensively drug-resistant F15/LAM4/KZN strain of Mycobacterium tuberculosis in KwaZulu-Natal, South Africa // Clin Infect Dis. 2007. - v.45. - P. 1409-1414.

167. Pina-Vaz C., Costa-de-Oliveira S., Rodrigues A.G. Safe susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis by flow cytometry with the fluorescent nucleic acid strain SYTO 16 //J. Med.Micribiol. 2005. - v. 54. - P. 77-81.

168. Poogary A., Nataraj G., Kanade S. et al.Rapid antibiotic susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis: its utility in resource poor setting // Indian J. Med. Microbiol. 2006. - v. 24. - P. 268-272.

169. Rajavelu P., Das S. D. A Correlation between Phagocytosis and Apoptosis in THP-1 Cells Infected with Prevalent Strains of Mycobacterium tuberculosis // Microbiol. Immunol. 2007. - Vol. 51 . - № 2. - P.201-210.

170. Rama R.A., Satchidanandam V. An approach for studying the mediators of pathogenesis in Mycobacterium tuberculosis //J.Biosci. 1996. - v.21. - № 3. -P. 413-421.

171. Raut U., Narang P., Mendiratta D.K. et al. Evaluation of rapid MTT tube method for detection of drug susceptibility of Mycobacterium tuberculosis to ri-fampicin and isoniazid // Indian. J. Med. Microbiol. 2008. - v. 26. - P. 222-227.

172. Riendeau C. J., Kornfeld H. THP-1 Cell Apoptosis in Response to Mycobacterial Infection // Infect. Immu. 2003. - Vol. 71. - № 1. - P. 254-259.

173. Rivoire N., Ravololonandriana P., Rasolonavalona T. et al. Evaluation of the resazurin assay for the detection of multidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis in Madagascar // Int. J. Tuberc. Lung Dis. 2000. - v. 11. - № 6.- P. 683688.

174. Robledo J.A., Mejia G.I., Morcillo N. et al. Evaluation of a rapid culture method for tuberculosis diagnosis: a Latin American multicenter study // Int. J. Tuberc. Lung Dis. 2006.-v. 10.-№ 6.-P.613-619.

175. Robledo J., Mejia G.I., Paniagua L. et al. Rapid detection of rifampicin and isoniasid resistance in Mycobacterium tuberculosis by the direct thin-layer method //Int. J. Tuberc. Lung Dis.-2008.-v.12.-№ 12.- P.1482-1484.

176. Rohner P., Ninet B., Metrai C. et al. Evaluation of the MB/BacT system and comparison to the BACTEC 460 system and solid media for isolation of mycobacteria from clinical specimens //J. Clin. Microbiol. 1997. - v. 35. — № 12. -P. 3127-3131.

177. Ruis P., Zerolo F.G., Casal M.J. Comparison of Susceptibility Testing of Mycobacterium tuberculosis Using the ESP Culture System II That Using the BACTEC Method // J. Clinic. Microbiol. 2000. - v. 38. - № 12. - P. 4663-4664.

178. Runyon E.H. Identification of mycobacterial pathogens utilizing colony characteristics // Am J.Clin.Pathol. 1970. - v. 54. - P. 578-586.

179. Rusch-Gerdes S., Domehl C., Nardi G., et al. Multicenter Evaluation of the Mycobacteria Growth Indicator Tube for Testing Susceptibility of Mycobacterium tuberculosis to First-Line Drugs // J. Clinic. Microbiol. 1999. - V. 37. - № l.-P. 45-48.

180. Scharberg T., Reichert B., Schulin T. et al. Rapid drug susceptubility testing of Mycobacterium tuberculosis using conventional solid media // Eur. Respir. J.- 1995.-v. 8.-P. 1688-1693.

181. Schmiedel A. Der Vertikaldifffiisiontest als Methode zur Resistenzbestimmung von Tuberkulbakterien und zur JNH-spiegeltestung // Zeitschr.Tuberk. -1959. -B. 112.-№ l.-S. 48-56.

182. Sekiguchi J., Miyoshi-Akiyama T., Augustynowicz-Kopel E. et al. Detection of multidrug resistance in Mycobacterium tuberculosis // J. Clin. Microbiol. -2007.- v. 45.-№ l.-P. 179-192.

183. Shiferaw G., Woldeamanuel Y., Gebeyehu M. et al. Evaluation of Microscopic Observation Drug Susceptibility Assay for Detection of Multidrug-Resistant Mycobacterium tuberculosis // J. Clinic. Microbiol. 2007. - v. 455. - № 4. - P. 1093-1097.

184. Siddiqi S.H., Libonati J.P., Middlbrook G. Evaluation of a rapid radiometric method for drug susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis //J.Clin.Microbiol. 1981. -v. 13. - P. 908-912.

185. Smith I. Mycobacterium tuberculosis Pathogenesis and Molecular Determinants of Virulence // Clinic. Microbiol. Rewiers. 2003. - v. 16. - № 3. - P. 463-496.

186. Sohn H., Lee K.S., Kim S.Y. et al. Induction of cell death in human macrophages by a highly virulent Korean Isolate of Mycobacterium tuberculosis and the virulent strain H37Rv // Scand. J. Immunol. 2009. - v. 69. - № 1. - P. 43-50.

187. Solis L.A., Shin S.S., Han L.L. et al. Validation of a rapid method for detection of M. tuberculosis resistance to isoniazid and rifampin in Lima, Peru // Int. J. Tuberc. Lung Dis. 2005. - v. 9 - P. 760-764.

188. Srisuwanvilai L.O., Monkongdee P., Podewils L.J. et al. Performance of the BACTEC MGIT 960 compared with solid media for detection of Mycobacterium in Bangkok, Thailand // Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 2008. - v. 61.-№4.-P. 402-407.

189. Srivastava V., Rouanet C., Srivastava R. et al. Macrophage-specific Mycobacterium tuberculosis genes: identification by green fluorescent protein andkanamycin resistance selection // Microbiology 2007. - v. 153. - Pt 3. — P. 659666.

190. Su W.J., Feng J.Y., Huang C.C., Perng R.P. Increasing drug resistance of Mycobacterium tuberculosis isolates in a medical center in northern Taiwan // J. Formos Med. Assoc. 2008. - v. 107. - № 3. - P. 259-264.

191. Sun Y.J., Lee A.S., Wong S.Y. et al. Genotype and phenotype relationships and transmission analysis of drug-resistant tuberculosis in Singapore // Int. J. Tuberc. Lung Dis. 2007. - v. 11. - № 4. - P. 436-442.

192. Tan T., Lee W.L., Alexander D.C. et al. The ESAT-6/CFP-10 secretion system of Mycobacterium marinum modulates phagosome maturation // Cell Microbiol. 2006. - v. 8. -№ 9. - P. 1417-1429.

193. Telles M.A.S., Bori A., Amorim A.B.R. et al. Rapid detection of mul-tidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis using the mycobacteria growth indicator tube (MGIT) system // Brazilian J. Med. Biol. Res. 2002. - V. 35. - P. 11271131.

194. Theus S.A., Cave M.D., Eisenach K. D. Activated THP-1 Cells: an Attractive Model for the Assessment of Intracellular Growth Rates of Mycobacterium tuberculosis Isolates I I Infect Immun. 2004. v. 72. - № 2. - P. 1169-1173.

195. Theus S.A., Cave M.D., Eisenach K.D. Intracellular Macrophage Growth Rates and Cytokine Profiles of Mycobacterium tuberculosis Strains with Different Transmission Dynamics // J. Infec. Dis. 2005. - v. 191. - P. 453-460.

196. Theus S.A., Eisenach K., Fomukong N. et al. Beijing family Mycobacterium tuberculosis strains differ in their intracellular growth in THP-1 macrophages // Int. J. Tuberc. Lung Dis. 2007. - v. 11. - № 10. - P. 1087-1093.

197. Timm J., Kurepina N., Kreiswirth B.N. et al. A multidrag-resistant, acrl-deficient clinical isolate of Mycobacterium tuberculosis is unimpaired for replication in macrophages // J. Infect. Dis. 2006. - v. 193. - № 12. - P. 1703-1710.

198. Traore H., Ogwang S., Mallard K., et al. Low-cost rapid detection of ri-fampicin resistant tuberculosis using bacteriophagein Kampala, Uganda // Ann. Clin. Microbiol. Antimicrob. 2007. - v. 9. - P. 6-11.

199. Umubyeyi A.N., Martin A., Zissis G. et al. Evaluation of the resazurin mirotitre assay for rapid detection of ofloxacin resistance in M.tuberculosis // Int. J. Tuberc. Lung Dis. 2006. - v. 10. - № 7. - P. 808-811.

200. Vandal OH, Pierini LM, Schnappinger D A membrane protein preserves intrabacterial pH in intraphagosoma lMycobacterium tuberculosis // Nat. Med.2008.- v.14. № 8. — P.849-8

201. Varma M., Kumar S., Kumar A., Bose M. Comparison of Etest and Agar proportion Method of Testing Drug Susceptibility of M.tuberculosis.// Ind. J. Tub. -2002. v. 490. - P. 217-220.

202. Velmurugan K., Chen B., Miller J. et al. Mycobacterium tuberculosis nuoG is a Virulence Gene That Inhibits Apoptosis of Infected Host Cells // PLoS Pathogens. 2007. - v. 3. - № 7. - P. 0972 - 0980.

203. Vergne I., Chua J., Lee H.-H., Lucas M. et al. Mechanism of phagolysosome biogenesis block by viable Mycobacterium tuberculosis // PNAS. 2005. -v.102. - № 11. - P. 4033-4038.

204. Vestal A.L., Kubica G.P. Differential colonial characteristics of mycobacteria on Middlebrook and Cohn 7H10 agare-base medium // Am.Rev. Repir. Dis. -1965.-v.94.-P.247-252.

205. Wallis R.J., Nash D.R., Steele L.C., Steingrube V. Susceptibility Testing of Slowly Growing Mycobacteria by a Microdilution MIC Method with 7H9 Broth //J. Clinic. Microbiol. 1986. - v. 24. -№ 6. - P. 976-981.

206. Wallis R.S., Palaci M., Vinhas S. et al. A whole blood bactericidal assay for tuberculosis //J. Infec. Dis. 2001. - v. 183. - № 8. - P. 1300-1303 .

207. Walters S.B., Dubnau E., Kolesnikova I. et al. The Mycobacterium tuberculosis PhoPR two-component system regulates genes essential for virulence and complex lipid biosynthesis // Mol. Microbiol. 2006. v. 60. - № 2. - P. 312-330.

208. Wanger A., Mills K. Testing of Mycobacterium tuberculosis Susceptibility to Ethambutol, Isoniazid, Rifampin, and Streptomycin by Using Etest //J. Clinic. Microbiol. 1996. - v. 34. - № 7. - P. 1672-1676.

209. Wayne L.G. Synchronized replication of Mycobacterium tuberculosis // In-fect.Immun. 1977. - v. 17. - P. 528-530.

210. Werngren J., Klintz L., Hoffner S. E. Evaluation of a Novel Kit for Use with the BacT/ALERT 3D System for Drug Susceptibility Testing of Mycobacterium tuberculosis // J. Clin. Microbiol. 2006. - v. 44. - P. 2130-2132.

211. Williams-Bouyer N., Yorke R., Lee H.I., Woods G.L. Comparison of the BACTEC MGIT 960 and ESP culture system II for growth and detection of mycobacteria //J. Clin. Microbiol. 2000. - v. 38. - № 11. - P. 4167-4170.

212. Wilson S.M., al-Suwaidi Z., McNerney R., et al. Evaluation of a new rapid bacteriophage-based method for the drug susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis // Nat. Med. 1997. - v. 3. - P. 465-468.

213. Wolinsky E., Smith M.M.,Steenken W. Isoiniazid susceptibility, catalase activity, and guinea pig virulence of recently isolated cultures of tubercle bacilli // Am. Rev. Tuberc. 1956. - v. 73. - P. 768-772.

214. Yajko D.M., Madej J.J., Lancaster M.V. et al. Colorimetric Method for Determing MICs of Antimicrobial Agents for Mycobacterium tuberculosis // J. Clinic. Microbiol. 1995. - v. 33. - № 9. - P. 2324-2327.

215. Yew W.W., Tong S.C., Lui K.S. et al. Comparison of MB/BacT system and agar proportion method in drug susceptibilitytesting of Mycobacterium tuberculosis / /Diagn Microbiol Infect Dis. 2001 -. v. 39. - № 4. - P. 229-232.

216. Yzquierdo S.L., Lemus D., Echemendia M. et al. Evaluation of phage assay for rapid phenotypic detection of rifampicin resistance in Mycobacterium tuberculosis //Ann. Clinic. Microbiol. Antimicrob. 2006. - v. 5. - P. 11-16.

217. Zhang M., Gong J, Yang Z. Enhanced capacity of a widespread strain of Mycobacterium tuberculosis to grow in human macrophages // J. Infect. Dis. -1999.- v.l79.-№ 5.-P. 1213-1217.

218. Zhang M; Gong J; Lin Y; Barnes P F Growth of virulent and avirulent Mycobacterium tuberculosis strains in human macrophages // Infec. Immun.1998. v. 66. - № 2. - P. 794-799.

219. Zwolska Z., Augustynowicz-Kopec E., Klatt M. New automated, non-radiometric system for the culture of mycobacteria MB/BacT // Int. J. Tuberc. Lung Dis. 1999. - v. 3. - № 9. - Suppl. 1. - P. 112.