Исследование белок-белковых взаимодействий в комплексе DISC внешнего сигнального пути программируемой клеточной гибели методами компьютерного моделирования тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, кандидат наук Иванисенко Никита Владимирович

• Иванисенко Никита Владимирович
• кандидат наук
• 2021

Оглавление диссертации кандидат наук Иванисенко Никита Владимирович

Введение

Глава 1. Обзор литературы

1.1 Программируемая клеточная гибель: внутренний и внешний сигнальные пути

1.2 Сигнальный путь программируемой клеточной гибели опосредуемый CD95L/FasL и TRAIL

1.2.1 Механизм активации прокаспазы-8 во внешнем сигнальном пути апоптоза

1.2.2 Структурная организация DED филаментов прокаспазы-8

1.2.3 Структура и функция FADD

1.3 Про- и антиапоптотическая функция белка c-FLIP в регуляции программируемой клеточной гибели

1.4 Молекулярные механизмы активации прокаспазы-8 белком c-FLIPl

1.5 Роль белка c-FLIP в инициация сигнального пути NF-kB

1.6 Модели связывания DED белков в комплексе DISC

1.7 Математические модели инициации программируемой клеточной гибели

1.8 Методы молекулярного докинга и виртуального скрининга

1.8.1 Алгоритмы молекулярного докинга

1.8.1.1 Алгоритмы систематического поиска

1.8.1.2 Случайные или стохастические алгоритмы

1.8.1.3 Методы отжига

1.8.2 Оценочные функции молекулярного докинга

1.8.2.1 Оценочные функции основанные на силовых полях

1.8.2.2 Эмпирические оценочные функции

1.8.2.3 Оценочные функции, основанные на знаниях

1.8.2.4 Консенсусные оценочные функции

1.8.2.5 Алгоритм молекулярного докинга Glide

1.8.3 Виртуальный скрининг и базы данных химических соединений

1.8.4 Оценка точности пакетов молекулярного докинга

1.8.5 Выбор и анализ структуры мишени

1.9 Методы молекулярного моделирования структур белков

1.9.1 Метод моделирования по гомологии

1.9.2 Методы моделирования структур белков, основанные на силовых полях

1.9.3 Пакет программ FoldX и его силовое поле

1.9.4 Пакет программ Rosetta

1.9.5 Энергетический функционал пакета программ Rosetta

1.9.6 Стратегии перебора конформаций, осуществляемые с помощью пакета Rosetta

1.9.6.1 Релаксация структуры с использованием Rosetta

1.9.6.2 Белок-белок докинг с использованием протоколов пакета Rosetta

Заключение по главе

Глава 2. Материалы и методы, применяемые для структурного и математического моделирования

2.1 Предсказание структуры комплекса е^ЫРь/каспаза-8

2.2 Протокол виртуального скрининга

2.3 Структурное моделирование комплекса DISC

2.4 Дизайн пептида, направленного на DED1 домен белка с-FLIP

2.5 Протокол математического моделирования активации сигнального пути CD95 с использованием системы обыкновенных дифференциальных уравнений

Глава 3 Виртуальный скрининг соединений, направленных на гетеродимер с-FLIPl/ каспаза-8

3.1 Проведение виртуального скрининга базы данных химических соединений ZINC и селекция соединений-кандидатов, способных связываться с гетородимерным комплексом c-FLIPL/каспаза-8

3.2 Оптимизация соединения FLIPinB с целью улучшения его физико-химических свойств

Заключение по главе

Глава 4 Структурное моделирование комплекса DISC

4.1 Структурная модель FADD платформы комплекса DISC

4.2 Моделирование по гомологии DED доменов белка c-FLIP

4.3 Оценка энергий белок-белкового взаимодействия для интерфейсов DED доменов комплексов c-FLIP/FADD и прокаспаза-8/FADD

4.4 Построение структурной модели DED филаментов в составе комплекса DISC

Заключение по главе

Глава 5. Предсказание структуры пептида на основе последовательности белка NEMO, способного связываться с DED1 доменом белка c-FLIP

5.1 Построение структурной модели комплекса c-FLIP/NEMO

5.2 Предсказание структуры пептида на основе последовательности белка NEMO, способного связываться с DED1 c-FLIP

Заключение по главе

Глава 6. Математическое моделирование кинетики инициации программируемой клеточной гибели в комплексе DISC

6.1 Структура и идентификация параметров кинетической математической модели

6.2 Анализ механизма действия FLIPin с использованием математической модели

Заключение по главе

Заключение

Выводы

Список литературы

Приложение

Список сокращений

C8 - каспаза-8

CD95 - кластер дифференцировки CD95 CD95L - лиганд CD95

c-FLIP - Cellular FLICE inhibitory proteins; клеточные белки, ингибирующие FLICE (каспаза-8)

c-FLIPL - длинная изоформа белка c-FLIP

c-FLIPr - Raji (R) изоформа белка c-FLIP

c-FLIPS - короткая изоформа белка c-FLIP

DcRs - decoy receptors, рецепторы-ловушки

DD - Death domain, домены смерти

DED - Death effector domain, эффекторный домен смерти

DISC - Death Inducing Signaling Complex, Сигнальный комплекс индуцирующий смерть

FADD - Fas-associated protein with death domain, Fas-ассоциированный белок с доменом смерти

FLIPin - c-FLIP interactor, c-FLIP взаимодействующее соединение

FNIIP - c-FLIP-NEMO-Interaction imitating Peptide, пептид имитирующий взаимодействие c-FLIP-NEMO

IKK - IkB kinase complex, IkB киназный комплекс

IKK - IkB kinase complex, IkB киназный комплекс

ks-v-FLIP - вирусный гомолог c-FLIP, экспрессируемый герпесвирусом, ассоциированным с саркомой Капоши

MC159-v-FLIP - MC159, вирусный гомолог c-FLIP, экспрессируемый вирусом Molluscum contagiosum (Контагиозный моллюск)

MOMP - mitochondrial major outer membrane polarization protein, основной белок поляризаци внешней мембраны митохондрии

NF-kB -nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cell; ядерный фактор «каппа-би»

NEMO - nuclear factor (NF)-kB essential modulator, основной модулятор ядерного фактора (NF)-kB

RMSD - root-mean-square deviation, среднеквадратичное отклонение SP - Standard precision, стандартная точность XP - Extra-precision, повышенная точность

TRAIL - TNF-Related Apoptosis-Inducing Ligand, Апоптоз-индуцирующий лиганд, относящийся к семейству связанный с ФНО

TRAIL-R1/2 - TRAIL рецепторы 1/2

WLC - Worm-like chain model, модель червеподобной цепи

а.о. - аминокислотные остатки

ВС - виртуальный скрининг

ГА - генетические алгоритмы

ДЭ - дифференциальная эволюция

МД - молекулярная динамика

МК - Монте-Карло

ОДУ - обыкновенные дифференциальные уравнения

РС - рецепторы смерти

ФНО - фактор некроза опухоли-альфа

ЯМР - ядерный магнитный резонанс

Введение

Апоптоз является основной формой программируемой клеточной гибели, свойственной всем многоклеточным организмам. Этот процесс имеет фундаментальное значение в развитии организма. Нарушение регуляции программируемой клеточной гибели является причиной многих патологий, включая аутоиммунные, онко- и нейродегенеративные заболевания [1], [2]. Существует два пути активации программируемой клеточной гибели: внутренний (митохондриальный) и внешний (рецептор-зависимый). Внутренний путь индуцируется внутриклеточными факторами, такими как недостаток факторов роста, оксидативный стресс, повреждения ДНК и др. Внешний путь запускается в результате связывания лигандов смерти, в роли которых выступает ряд цитокинов, с рецепторами смерти (РС) (англ. death receptor сокр. (DR)), расположенными на внешней стороне клеточной мембраны [3], [4]. Как в случае индукции внутреннего, так и внешнего сигнального пути апоптоза, белки семейства цистеиновых аспартат-специфических протеаз, каспаз (англ. cysteinyl aspartate specific proteases; цистеинил-аспартат-специфические протеазы; сокр. caspases) являются основными ферментами, вовлеченными в процесс инициации и осуществления апоптоза. Белки данного семейства способны осуществлять протеолитическое расщепление белков-субстратов и ответственны за большинство морфологических особенностей, ассоциированных с клеточной гибелью [5], [6]. Каспазы экспрессируются в клетках в виде неактивных предшественников (прокаспаз), состоящих из трёх основных доменов: N-терминального (продомена), большого (p20) и малого (p10) каталитических доменов. Домены p20 и p10 обладают каталитической активностью и образуют активный гетеротетрамер р102-р202. Образование гетеротетрамера происходит в результате протеолитического расщепления пептидных связей после аминокислотного остатка аспарагиновой кислоты (D), расположенного между продоменом, малым и большим каталитическими доменами [5], [7].

Предполагается, что в результате протеолиза происходит стабилизация активной конформации протеолитического сайта фермента.

Основными членами семейства РС, которые индуцируют апоптоз, являются рецепторы CD95/Fas и TRAIL-R1/R2 (DR4/DR5). Активация CD95/Fas происходит при связывании цитокинов CD95L/FasL, а рецептор TRAIL-R1/R2 активируется цитокином TRAIL (англ. TNF-Related Apoptosis-Inducing Ligand; Апоптоз-индуцирующий лиганд, относящийся к семейству ФНО). Взаимодействие лигандов смерти с PC приводит к активации каскада белок-белковых взаимодействий и последующей сборки сигнального комплекса, индуцирующего клеточную гибель (англ. Death Inducing Signaling Complex, сокр. DISC). В состав DISC входят белки РС, а также FADD (англ. Fas-associated protein with death domain, Fas-ассоциированный белок с доменом смерти, сокр. FADD), прокаспаза-8/10 и c-FLIP (англ. Cellular FLICE inhibitory proteins; клеточные белки, ингибирующие FLICE, сокр. c-FLIP). Данный макромолекулярный комплекс является центральной платформой для активации прокаспазы-8, которая, в свою очередь, является ключевым индуктором апоптотического ответа [8], [9]. Сборка комплекса DISC, индуцированная активацией РС, происходит с участием специфических взаимодействий между структурными элементами суперсемейства доменов смерти, представленными в структуре белков комплекса: доменами смерти (англ. Death Domain, сокр. DD) и эффекторными доменами смерти (англ. Death Effector Domain, сокр. DED). В частности, белок FADD содержит DED домен в N- концевой части и DD домен на C- конце аминокислотной последовательности. Связывание белка FADD с РС происходит с участием взаимодействий между DD доменами. В свою очередь, DED домен белка FADD необходим для взаимодействия с DED доменами прокаспазы-8 и c-FLIP, которые содержат два DED домена (DED1 и DED2) в N-концевой части аминокислотной последовательности. Прокаспаза-8 состоит из продомена, содержащего DED1 и DED2 домены, обеспечивающие связывание с белками

комплекса DISC, а также С-концевого домена, выполняющего каталитическую функцию.

Протеолитическая активность С-концевого домена прокаспазы-8 необходима для аутопротеолиза белка в результате расщепления по аминокислотным остаткам D374/D384 и его превращения в каспазу-8 [10]. Каспаза-8 обладает способностью осуществлять протеолиз, как прокаспазы-8, так и прокаспазы-3. Процессинг прокаспазы-3, в свою очередь, приводит к образованию каталитически активной формы этого белка (каспазы-3), которая впоследствии расщепляет целый ряд клеточных субстратов, запуская апоптоз. Предполагается, что для каталитической активации С-концевого домена прокаспазы-8 необходима димеризация данного белка, за которой следует конформационный переход, приводящий к образованию активного центра прокаспазы-8 [10]. Димер прокаспазы-8 обладает каталитической активностью, что и инициирует его аутопротеолиз, приводящий к образованию активного гетеротетрамера каспазы-8. Также известно, что активный сайт, образованный димером прокаспазы-8, не является достаточно стабильным за счет возможных конформационных переходов в структуре данного белка. Известны два основных пути стабилизации активной конформации активного центра каспазы-8. Один из них обеспечивает активность каспазы-8 в составе гетеротетрамера. В данном случае, в результате протеолитического расщепления димера прокаспазы-8 происходит димеризация процессированных субъединиц р10 и р18, ведущая к стабилизации активной конформации каталитического центра каспазы-8. Другой путь стабилизации не требует расщепления белка и обеспечивает каталитическую активность С-концевого домена в составе прокаспазы-8 за счет контактов с белком c-FLIP [11].

Белок c-FLIP играет одну из ключевых ролей в передаче сигнала внешнего пути апоптоза, обеспечивая инициацию каскадных реакций в результате аутопротеолиза прокаспазы-8 и контролируя активацию данного

фермента [11]. Он также обладает способностью образовывать комплекс с прокаспазой-8. Однако, молекулярные механизмы функционирования сигнального пути программируемой клеточной гибели при участии этого белка остаются плохо изученными. Известно, что белок c-FLIP имеет высокую гомологию с белком прокаспаза-8, но не обладает протеолитической активностью. Известны три изоформы белка c-FLIP: длинная изоформа c-FLIPl, и две коротких изоформы c-FLIPr и c-FLIPs [12], [13]. Все три изоформы содержат N-концевой домен, в состав которого входят DED1 и DED2 домены. Длинная изоформа белка c-FLIPL также содержит C-концевой домен, обладающий высокой гомологией и структурным сходством с C-концевым доменом прокаспазы-8, но не имеет каталитически активного центра.

Количественные соотношения или стехиометрия между белками прокаспаза-8, каспаза-8 и c-FLIP в комплексе DISC во многом определяет баланс между апоптотической гибелью и выживанием клеток [14], [15]. Предполагается, что про-апоптотической активностью обладает только c-FLIPl изоформа, в то время как короткая изоформа c-FLIPs, а также в ряде случаев длинная изоформа c-FLIPL, могут выполнять антиапоптотическую функцию [12], [13]. Одним из механизмов антиапоптотической функции c-FLIPL/S является активация сигнального пути выживания клеток NF-kB, регуляция которого происходит с участием белка NEMO (англ. nuclear factor (NF)-kB essential modulator; основной модулятор ядерного фактора (NF)-kB) [16]. Остается неясным, какую роль играет прямое взаимодействия изоформ c-FLIP с белком NEMO в активации сигнального пути выживания клеток NF-kB, а также роль комплекса DISC в этом процессе.

Кроме того, было показано, что прокаспаза-8 способна образовывать так называемые DED филаменты в результате взаимодействия DED доменов. Филаменты являются центральной платформой для димеризации и последующей активации прокаспазы-8 [15], [17], [18]. Однако, структура DED

филаментов комплекса DISC, содержащих белки c-FLIP, FADD, прокаспазу-8 и каспазу-8 до сих пор не расшифрована, что делает задачу компьютерного моделирования таких комплексов чрезвычайно актуальной. Существующие представления о структуре данных комплексов требуют дальнейшего подтверждения и изучения молекулярных механизмов, лежащих в основе их функционирования.

В настоящее время для изучения структурно-функциональной организации белковых макромолекулярных структур широкое применение нашли компьютерные методы структурного и математического моделирования. В данной работе для изучения функциональной активности гетеродимера c-FLIPL/каспаза-8 выполнен дизайн низкомолекулярных химических соединений, способных связываться в области белок-белкового контакта данных белков и стабилизировать структуру каталитического сайта. В частности, были сконструированы соединения, которые могут непосредственно влиять на аллостерическую регуляцию активного центра фермента каспазы-8. Предсказания были подтверждены в независимом экспериментальном исследовании. Оказалось, что рационально-сконструированное низкомолекулярное соединение, названное FLIPin (англ. c-FLIP interactor; c-FLIP взаимодействующее соединение), увеличивает скорость активации каспазы-8 в составе макромолекулярного комплекса DISC, а также обладает способностью усиливать активацию программируемой клеточной гибели при индукции апоптоза лигандами смерти.

Компьютерная реконструкция структуры DED филаментов в составе макромолекулярного комплекса DISC, содержащих белки c-FLIP, FADD и прокаспазу-8, позволили предсказать наличие сайтов в DED доменах, обеспечивающих специфическое связывание белка FADD с белками c-FLIP и прокаспазой-8, а также специфические взаимодействия белков c-FLIP и NEMO.

С использованием полученных данных осуществлен компьютерный дизайн пептидов, способных связываться с белком c-FLIP в составе комплекса DISC и приводить к подавлению активации сигнального пути NF-kB. Предсказанная активность пептидов также получила экспериментальное подтверждение.

С использованием данных, полученных из структурной модели комплекса DISC и информации об активности созданных соединений FLIPin была разработана математическая модель на основе системы обыкновенных дифференциальных уравнений (ОДУ), объясняющая кинетику активации комплекса DISC в присутствии малых химических соединений -аллостерических регуляторов каталитической активности каспазы-8 для различного состава комплекса DISC.

Целью работы являлось исследование структурно-функциональной организации макромолекулярного комплекса DISC, ключевой платформы активации внешнего CD95/TRAIL рецептор-опосредованного сигнального пути программируемой клеточной гибели, с использованием методов молекулярного и математического моделирования, а также рационального дизайна низкомолекулярных и пептидных соединений.

Задачи:

1. Провести компьютерный дизайн низкомолекулярных химических соединений, способных специфически взаимодействовать с гетеродимером c-FLIPL/каспаза-8 в области интерфейса белок-белковых взаимодействий, с целью стабилизации комплекса и аллостерической регуляции активного центра фермента каспазы-8.

2. Провести компьютерную реконструкцию пространственной структуры макромолекулярного комплекса DISC, содержащего в своем составе белки c-FLIP, FADD, прокаспазу-8, каспазу-8 и образуемые ими DED филаменты.

3. Предсказать белок-белковые взаимодействия между белками c-FLIP и NEMO в составе макромолекулярного комплекса DISC.

4. Провести компьютерный дизайн пептидных ингибиторов на основе последовательности белка NEMO, способных связываться с белком c-FLIP и подавлять активацию сигнального пути NF-kB.

5. Построить математическую модель индукции CD95-опосредованного пути программируемой клеточной гибели, описывающую с помощью системы ОДУ динамику состава комплекса DISC и активацию каталитической функции каспазы-8 в присутствии низкомолекулярных химических соединений, аллостерических регуляторов каталитической активности гетеродимера c-FLIPL/каспаза-8.

Научная новизна:

1. Впервые предсказана структура низкомолекулярного химического соединения, способного связываться с белком c-FLIP в составе гетеродимера c-FLIPL/каспаза-8, и приводить к активации протеолитической функции каспазы-8 и индукции программируемой клеточной гибели.

2. Впервые построена компьютерная модель пространственной структуры DED филамента, входящего в макромолекулярный комплекс DISC, образованного в результате белок-белковых взаимодействий белков c-FLIP, FADD и прокаспазы-8. Показано, что белок c-FLIP может способствовать кооперативному связыванию комплексов DISC в супрамакромолекулярную структуру за счет взаимодействия между DED филаментами этих комплексов.

4. Впервые предсказана способность DED1 домена белка c-FLIP в составе комплекса DISC взаимодействовать с белком NEMO.

5. Впервые предсказаны структуры пептидов, способных ингибировать взаимодействия белков c-FLIP и NEMO и осуществлять регуляцию сигнального пути NF-kB.

6. Впервые создана математическая модель индукции СВ95-опосредованного пути программируемой клеточной гибели, описывающая с помощью системы ОДУ кинетику активации каспазы-8 в присутствии низкомолекулярного химического соединения FLIPin, аллостерического регулятора каталитической активности гетеродимера c-FLIPL/каспаза-8, в зависимости от состава комплекса. С использованием математической модели сделано предсказание, что низкомолекулярные химические соединения, которые способны связываться с белком c-FLIP в составе гетеродимера c-FLIPL/каспаза-8 и приводить к активации протеолитической функции каспазы-8, могут обладать эффективностью для терапии раковых клеток с повышенной экспрессией белка c-FLIP.

Практическая значимость:

Полученные низкомолекулярные химические соединения FLIPin являются основой для создания нового класса лекарств, механизм действия которых базируется на активации внешнего сигнального пути программируемой клеточной гибели, через усиление протеолитической активности каспазы-8 в составе комплекса c-FLIPL/каспаза-8.

Полученные пептидные соединения являются основой для создания нового класса лекарств, механизм действия которых базируется на подавлении активации сигнального пути выживания клеток NF-kB, путем ингибирования взаимодействия белков c-FLIP и NEMO.

Данные лекарства могут быть использованы для терапии онкологических и аутоиммунных заболеваний, а также других заболеваний, лечение которых требует активации программируемой клеточной гибели.

Полученные малые химические соединения и пептиды могут быть использованы, как молекулярные зонды для проведения исследований инициации внешних сигнальных путей программируемой клеточной гибели.

Методы исследования:

Для решения поставленных задач в работе использовались методы молекулярного докинга, виртуального скрининга, методы структурного моделирования, включая белок-белковый докинг, реализованные в пакетах программ FoldX и Rosetta, а также методы кинетического математического моделирования с использованием систем обыкновенных дифференциальных уравнений.

Положения, выносимые на защиту:

1. Белок c-FLIP (Cellular FLICE inhibitory protein) определяет структуру и стехиометрию макромолекулярного комплекса DISC (Death Inducing Signaling Complex), участвуя в образовании DED (Death Effector Domain) филаментов и их кооперативном связывании.

2. Пептид LAQLQVAYHQLFQEYYNHIKSSRRRRRRRRR, являясь структурным миметиком альфа-спирального участка (K123-Y156) белка NEMO (NF-kB essential modulator), способен связываться с N- терминальным доменом белка c-FLIP и препятствовать его взаимодействию с белком NEMO, что приводит к ингибированию CD95-индуцированной активации сигнального пути NF-kB.

3. Низкомолекулярное химическое соединение 2-[[4-(4-пиридил)бензоил]амино]этил-3-(3-пиридил-метилсульфамоил)бензоат, получившее название FLIPin (c-FLIP interactor), усиливает протеолитическую функцию каспазы-8 и CD95-индуцированную активацию сигнального пути апоптоза, что, согласно компьютерной модели, обусловлено взаимодействием FLIPin с гетеродимерным комплексом c-FLIP/каспаза-8 в области контакта С-терминальных доменов субъединиц.

Апробация работы:

Результаты работы докладывались и обсуждались на следующих конференциях:

1. 26th Conference of the European Cell Death Organization, Rational design of molecular probes targeting caspase-8/c-FLIPL heterodimer in the Death-Inducing Signaling Complex, Санкт-Петербург, 10 октября - 12 октября, 2018, с. 1-48, DOI: 10.1038/s41420-018-0128-4.

2. Международный конгресс Биотехнология: состояние и перспективы развития. Компьютерное моделирование низкомолекулярных ингибиторов эффекторного домена смерти белка FADD, Москва, 20-22 февраля 2017 года, с

3. BIOINFORMATICS OF GENOME REGULATION AND STRUCTURE\SYSTEMS BIOLOGY, Novel approach for computational design of small molecule inhibitors of protein/protein interactions in CD95/FAS pathway Novosibirsk, 29 августа - 02 сентября 2016 года. С

4. Симпозиум «Системная биология репарации ДНК и программируемой клеточной гибели» в рамках 11 Международной мультиконференции по биоинформатике регуляции и структуры геномов и системной биологии (Bioinformatics of Genome Regulation and Structure and Systems Biology —BGRSnSB-2018), Rational design of small molecule compounds targeting CD95 programmed cell death pathway, Новосибирск, 20 августа - 22 августа 2018 г., c

5. BGRS/SB-2020: 11th International Multiconference «Bioinformatics of Genome Regulation and Structure/Systems Biology», Computational insights into molecular mechanisms of CD95 programmed cell death activation, Новосибирск, 29 августа - 02 сентября 2016 года, с

6. Мультиконференция «Биотехнология — медицине будущего», Структурный анализ механизмов активации внешнего сигнального пути программируемой клеточной гибели CD95, Новосибирск, 29 июня - 2 июля 2019, с

7. Беляевские чтения, Сателлитный симпозиум «Молекулярно-генетические механизмы патогенеза глаукомы», Виртуальный скрининг ингибиторов активации программируемой клеточной гибели, Новосибирск, 7 - 10 августа 2017 года

8. Первая студенческая научно-образовательная школа-конференция по генетике и биотехнологиям, Компьютерная протеомика и фармакология, Сочи, Сириус, 18 - 22 августа 2017 года

Личный вклад: Результаты, полученные с использованием различных методов компьютерного моделирования получены автором самостоятельно. Автором разработаны и реализованы компьютерные подходы, лежащие в основе исследования, проведено компьютерное моделирование и обработка, расчеты, а также анализ литературных данных и обсуждение полученных результатов. Экспериментальные данные были получены коллективом лаборатории д. б. н. Лаврик И.Н.

Публикации. Основные результаты по теме диссертации изложены в 10 печатных изданиях, входящих в международные базы цитирования (WoS, Scopus).

1. Hillert L.K. #, Ivanisenko N. V. #, Espe J., König C., Ivanisenko V.A., Kähne T., Lavrik I.N. Long and short isoforms of c-FLIP act as control checkpoints of DED filament assembly // Oncogene. 2020. № 8(39). С. 1756-1772. DOI: 10.1038/s41388-019-1100-3. # - Равный вклад

2. Seyrek K. #, Ivanisenko N. V. #, Richter M., Hillert L.K., König C., Lavrik I.N. Controlling Cell Death through Post-translational Modifications of DED

Proteins. // Trends in Cell Biology. 2020. № 5(30). С. 354-369. D01:10.1016/j.tcb.2020.02.006. # - Равный вклад

3. Hillert L.K. #, Ivanisenko N. V. #, Busse D., Espe J., König C., Peltek S.E., Kolchanov N.A., Ivanisenko V.A., Lavrik I.N. Dissecting DISC regulation via pharmacological targeting of caspase-8/c-FLIPL heterodimer // Cell Death and Differentiation. 2020. № 7(27). С. 2117-2130. D0I:10.1038/s41418-020-0489-0. # - Равный вклад

4. Ivanisenko N. V., Buchbinder J.H., Espe J., Richter M., Bollmann M., Hillert L.K., Ivanisenko V.A., Lavrik I.N. Delineating the role of c-FLIP/NEMO interaction in the CD95 network via rational design of molecular probes // BMC Genomics. 2019. № S3(20). С. 293. D0I:10.1186/s12864-019-5539-y.

5. Ivanisenko N. V., Seyrek K., Kolchanov N.A., Ivanisenko V.A., Lavrik I.N. The role of death domain proteins in host response upon SARS-CoV-2 infection: modulation of programmed cell death and translational applications. // Cell Death Discovery. 2020. № 1(6). 1234567890с. D0I:10.1038/s41420-020-00331-w.

6. Ivanisenko N. V., Lavrik I.N. Mathematical Modeling Reveals the Importance of the DED Filament Composition in the Effects of Small Molecules Targeting Caspase-8/c-FLIPL Heterodimer // Biochemistry (Moscow). 2020. № 10(85). С. 1134-1144. DOI: 10.1134/S0006297920100028.

7. Ivanisenko N. V., Lavrik I.N. Mechanisms of Procaspase-8 Activation in the Extrinsic Programmed Cell Death Pathway // Molecular Biology. 2019. № 5(53). С. 732-738. DOI: 10.1134/S0026893319050091.

8. Ivanisenko N. V., Lavrik I.N., Ivanisenko V.A. Computer simulation of the spatial structures of MUC1 peptides capable of inhibiting apoptosis // Russian Journal of Genetics: Applied Research. 2016. № 7(6). С. 771-777. DOI: 10.1134/S2079059716070042.

9. König C., Hillert-Richter L.K., Ivanisenko N. V., Ivanisenko V.A., Lavrik I.N. Pharmacological targeting of c-FLIPL and Bcl-2 family members promotes apoptosis in CD95L-resistant cells // Scientific Reports. 2020. № 1(10). С. 1-10. DOI:10.1038/s41598-020-76079-1.

10. Ivanisenko N. V., Hillert L., Ivanisenko V.A., Lavrik I.N. Design and experimental validation of small-molecule inhibitors of the FADD protein // Russian Journal of Genetics: Applied Research. 2016. № 7(6). С. 778-784. DOI: 10.1134/S2079059716070030.

Объем и структура работы

Диссертация состоит из введения, 6 глав, заключения, выводов и одного приложения. Полный объём диссертации составляет 187 страницы, включая 38 рисунков и 10 таблиц. Список литературы содержит 144 наименования.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Исследование белок-белковых взаимодействий в комплексе DISC внешнего сигнального пути программируемой клеточной гибели методами компьютерного моделирования»

Актуальность исследования

Развитие множества нейродегенеративных и онкозаболеваний ассоциировано с нарушением баланса между регуляцией апоптотических и антиапоптотических сигнальных путей в процессе активации РС. Ключевую роль в данной регуляции играет структура и состав комплекса DISC, в который входят белки c-FLIP, FADD и прокаспаза-8. В связи с этим построение структурной модели комплекса DISC является важной задачей для исследования роли взаимодействий белков c-FLIP, FADD и каспазы-8 в активации программируемой клеточной гибели. Белок c-FLIP в составе комплекса DISC вовлечен в активацию антиапоптотического сигнального пути NF-kB в результате индукции рецептора CD95. Особую роль в данном процессе может играть белок-белковое взаимодействие c-FLIP с ключевым активатором сигнального пути NF-kB - белком NEMO. Однако, детальные молекулярные механизмы данного процесса остаются плохо изученными. Разработка новых рационально сконструированных пептидов, способных ингибировать взаимодействие белков c-FLIP c NEMO, является важным

подходом для изучения механизмов устойчивости клеток к программируемой клеточной гибели.

Образование гетеродимера белков c-FLIP и прокаспазы-8 является важным этапом активации каспазы-8 и клеточной гибели, однако, функциональная роль гетеродимера c-FLIPL/каспазы-8 до сих пор до конца не изучена. Разработка низкомолекулярных химических соединений, направленных на усиление каталитической активности данного гетеродимера, является перспективной задачей для разработки новых препаратов и стратегий лечения онкозаболеваний на основе стимуляции РС. Более того, полученные химические соединения могут быть использованы как инструмент для исследования молекулярных механизмов активации каспазы-8 в комплексе DISC. В связи с этим, данное исследование имеет как фундаментальное, так и прикладное значение.

Глава 1. Обзор литературы

1.1 Программируемая клеточная гибель: внутренний и внешний

сигнальные пути

На сегодняшний день описано два основных сигнальных пути, по которым происходит инициация апоптоза: внутренний или митохондриальный и внешний. Внутренний путь индуцируется при недостатке факторов роста, оксидативном стрессе или в результате повреждения ДНК. Внешний путь, в свою очередь, запускается в результате активации так называемых РС [3], [4].

В обоих случаях белки семейства каспаз, являются основными ферментами, вовлеченными в инициацию апоптоза и ответственными за большинство морфологических особенностей, ассоциированных с апоптотической клеточной гибелью [5], [6]. Активация каспаз происходит при появлении сигнала инициации апоптоза, который передается через внешние или внутренние сигнальные пути [5]. В свою очередь апоптотический сигнал приводит к формированию макромолекулярных комплексов, внутри которых происходит активация инициаторных каспаз, инициирующих программу клеточной гибели [19], [20]. Известно, что для активации инициаторных каспаз необходима их димеризация в составе соответствующих комплексов, что приводит к конформационным изменениям и образованию активного центра фермента в составе димера прокаспазы. За образованием активного центра прокаспазы, как правило, следует ее дальнейший протеолиз. Каспазы экспрессируются в клетках как неактивные предшественники (или прокаспазы), состоящие из трёх основных доменов: К-терминального домена (называемого продоменом), а также большого (р20) и малого (р10) протеазных доменов. Протеазные домены являются предшественниками для каталитических субъединиц, которые формируют активную каспазу. Образование каталитических субъединиц происходит в результате протеолитического разрезания пептидных связей после аспарата (Э),

локализованного между продоменом, малым и большим каталитическими доменами [5]. Каталитические субъединицы образуют гетеротетрамер р102-р202, состоящий из двух больших (~20 kDa) и двух малых субъединиц (~10 kDa). Множество белков, которые вовлечены в сигнальный путь апоптоза, а также воспалительные сигнальные пути, являются субстратами для каспаз.

Ряд макромолекулярных белковых комплексов, в которых происходит активация инициаторных (или апикальных) прокаспаз (-2, -8, -9, и -10), собирается при индукции сигнального пути апоптоза. В свою очередь, инициаторные каспазы расщепляют и активируют эффекторные цистеиновые протеазы (каспазы-3, -6, -7), что приводит к выполнению программы гибели клеток. Важным отличием между инициаторными и эффекторными каспазами является то, что инициаторные каспазы активируются при димеризации в составе макромолекулярных белковых комплексов, в то время как эффекторные каспазы активируются только при их расщеплении инициаторными каспазами и, таким образом, димеризация не может привести к активации эффекторных каспаз.

Важное структурное отличие между инициаторными и эффекторными каспазами заключается в наличии удлиненного продомена у инициаторных каспаз, который, в свою очередь, включает такие белковые модули, как эффекторный домен смерти (англ. Death Effector Domain, сокр. DED) или домен активации и рекрутирования каспаз (англ. caspase activation and recruitment domain, сокр. CARD). Вместе с доменом смерти (англ. Death Domain, сокр. DD) эти два структурных модуля относятся к суперсемейству DD доменов согласно их структурным особенностям укладки [3], [21]. Каждый из этих мотивов содержит 6 антипараллельных альфа-спиральных участка, которые формируют так называемый греческий узел (Рис. 1.1). Продомены каспаз, как правило, вовлечены в так называемые гомотипические белок-белковые взаимодействия, которые характеризуются взаимодействием между доменами одного и того же типа [19]. Именно гомотипические

взаимодеиствия позволяют связывание инициаторных каспаз в соответствующий комплекс и их последующую димеризацию и активацию.

Рисунок 1.1 Доменная организация основных членов суперсемейства DD, контролирующих (А) программируемую клеточную гибель, (Б) врожденный иммунный ответ, (В) воспаление. DD, DED, CARD и PYD показаны зеленым, синим, оранжевым и желтым цветами, соответственно. (Г) Показаны наложенные друг на друга структуры DD RIPK1 DD (идентификатор PDB 6AC5), FADD DED (идентификатор PDB 1A1W), ASC CARD (идентификатор PDB 5GPQ) и NLRP3 PYD (идентификатор PDB 3QF2). N- и C-концевые области были удалены для наглядности (Рисунок модифицирован из [22]).

В результате гомотипического связывания, DD домены взаимодействуют с другими DD доменами (соответственно, CARD с CARD; DED с DED). Известно, что апоптотические макромолекулярные комплексы образуются в результате данных гомотипических взаимодействий [19]. При этом, CARD- и DED- мотивы позволяют вовлечь инициаторные прокаспазы-2, -8, -9, и -10 в состав данных комплексов, что в результате приводит к их димеризации и активации. Следует отметить, что для каждой инициаторной каспазы известен свой специфический макромолекулярный комплекс [5].

Индукция внутренних и внешних апоптотических путей, которые контролируются формированием инициаторных белковых комплексов, фундаментально отличается друг от друга и приводят к активации различных инициаторных каспаз. В частности, активация каспазы-8 происходит в результате индукции внешнего апоптотического сигнального пути. В свою очередь, активация каспазы-9 и в некоторых случаях каспазы-2, происходят при инициации внутреннего пути [21].

1.2 Сигнальный путь программируемой клеточной гибели опосредуемый CD95L/FasL и TRAIL

Внешний сигнальный путь апоптоза инициируется в результате активации семейства РС [4], [8]. Семейство РС является частью суперсемейства рецепторов фактора некроза опухоли (ФНО) [23]. CD95/Fas является одним из наиболее изученных РС, активация которого может приводить к запуску апоптотического сигнального пути. Стимуляция рецептора CD95 лигандом CD95L приводит к формированию DISC. (Рис. 1.2.1). Данный комплекс состоит из белков CD95 и CD95L, а также белков, содержащих DED, таких как FADD, прокаспаза-8/10, а также c-FLIP [8], [9], [15], [17], [18].

Прокаспаза-8 Выживание

Димер каспазы-8

4

Anoптоз

Рисунок 1.2.1 Схема активации внешнего сигнального пути программируемой клеточной гибели CD95. Обозначения: эффекторные домены смерти (DED), домены смерти (DD), транс-мембранный домен (TM), цистеин-богатые домены (cystein rich domains, CRD), сигнальный комплекс индуцирующий смерть (DISC).

Внешний сигнальный путь апоптоза инициируется через активацию семейства РС [4], [8]. Семейство РС входит в суперсемейство рецепторов фактора некроза опухоли (ФНО) [4], [23]. Всего на сегодняшний день, охарактеризовано 8 РС: TNF-Rl^, CD95 (Fas/APO-1), TRAIL-R1, TRAIL-R2, DR3, DR6, EDAR, и NGFR/p75 [3]. Считается, что РС образуют олигомерные структуры (предположительно, тримеры), которые необходимы для образования рецепторных комплексов и для передачи сигнала. Каждый РС ((TNF-R1/ р55), CD95 (Fas/APO-1), TRAIL-R1/DR4, и TRAIL-R2/DR5) связывается со специфическим лигандом смерти (TNFa (ФНО), CD95L (FasL/APO-1L), и TRAIL), который принадлежит суперсемейству ФНО, исключением являются лиганды рецепторов DR6 и NGFR/p75. Цитоплазматическая часть РС содержит структурный мотив, который является отличительной чертой всех членов семейства РС, называемый DD доменом.

Как указывалось выше, DD домены являются структурным мотивом (или доменом) длиной от 80 до 100 аминокислотных остатков, который формирует 6 антипараллельных a-спиральных участка [3], [24]. DD домены играют ключевую роль в передаче апоптотических сигналов, а именно в формировании макромолекулярных комплексов, которые образуются в результате гомотипических взаимодействий между DD рецепторов и соответствующих DD адапторных белков. Например, адапторный белок FADD, содержит не только DD, но и DED домен, который, в свою очередь, способен связываться с прокаспазой-8 для формирования инициаторного комплекса. Последующая активация прокаспазы-8 в комплексе образованном РС и белком-адаптором FADD приводит к апоптотической гибели клеток. Помимо РС, лиганды смерти так же специфично узнают и связываются с так называемыми рецепторами-ловушками (англ. decoy receptors, сокр. DcRs). DcRs не имеют DD, и таким образом, они не могут участвовать в сборке апоптотического комплекса, и соответственно, быть вовлечены в передачу сигнала клеточной смерти. Уровень экспрессии DcRs часто повышен в раковых клетках, таким образом, позволяя им защищать себя от индукции внешнего сигнального пути клеточной гибели. CD95 (также называемый APO-1, Fas, Fas antigen, TNFRSF6, и APT1) является одним из наиболее изученных членов семейства РС [9]. Первая стадия инициации апоптоза через рецептор CD95 происходит в результате формирования комплекса, индуцирующего клеточную гибель (DISC) [9]. Связывание CD95L с внеклеточным доменом CD95 инициирует конформационные переходы во внутриклеточном домене, который, в свою очередь, делает DD доступным для связывания белков комплекса DISC. CD95 DISC является ключевым макромолекулярным комплексом инициации внешнего пути апоптоза, который, как упоминалось выше, состоит из олигомеризованного белка CD95, a также адапторного белка FADD, прокаспазы-8/10, и c-FLIP [9]. Гомотипические взаимодействия играют центральную роль в формировании комплекса CD95 DISC. DD домен рецептора CD95 взаимодействуют с DD доменом адапторного белка FADD. В

свою очередь, белки FADD, прокаспаза-8, прокаспаза-10, и c-FLIP связаны в комплекс DISC в результате взаимодействия их DED доменов, что приводит к активации каспазы-8 и запуску внешнего сигнального пути апоптоза. Следует отметить, что DISC также может образовываться при активации TRAIL-R1/2 [25], [26]. Более того, состав рецепторного комплекса TRAIL-R1/2 сравним с составом комплекса DISC, образуемого рецептором CD95 и включает олигомеризованный рецептор, FADD, прокаспазы-8/10, и белок c-FLIP [27].

Таким образом, комплекс DISC является молекулярной машиной (или макромолекулярной платформой), которая включает целый ряд DD и DED-содержащих белков. Тонкая регуляция эффективной сборки комплекса DISC играет важную роль в инициации внешнего сигнального пути апоптоза.

1.2.1 Механизм активации прокаспазы-8 во внешнем сигнальном пути

апоптоза

Прокаспаза-8 (также называемая CAP4, FLICE, MACH, MCH5) является одной из двух DED-содержащих каспаз [28]. Прокаспаза-8 состоит из следующих структурных элементов: N-концевого продомена, который включает DED1 (аминокислотные остатки 2-80) и DED2 (аминокислотные остатки 100-177), за которым следуют большой и малый каталитические домены (Рис. 1.2.1.1). Прокаспаза-8 рекрутируется в комплекс DISC в результате гомотипических взаимодействий DED доменов [9]. Прокаспаза-10 является структурно близким аналогом прокаспазы-8, и также связывается с комплексом DISC в результате взаимодействия DED доменов [25], [29]. Прокаспаза-10 также содержит два DED домена в составе N-концевого продомена, за которым следуют малый и большой каталитические домены. Несмотря на высокое структурное сходство, согласно ряду исследований, прокаспаза-10 не может инициировать апопотоз в отсутствии прокаспазы-8, судя по всему, ввиду более низкого уровня экспрессии в большинстве тканей [25], [29]. Таким образом, инициация внешнего пути апоптоза определяется в значительной степени активацией прокаспазы-8 в комплексе DISC, но не

активацией прокаспазы-10. Всего описано девять изоформ прокаспазы-8, которые образуются в результате альтернативного сплайсинга [28]. Считается, что только две изоформы прокаспазы-8 (8a и 8b) с молекулярным весом 55 kDa (p55) и 53 kDa (p53) соответственно, связываются с комплексом DISC [28], [30] (Рис. 1.2.1.1).

Рисунок 1.2.1.1 Доменная организация двух ключевых изоформ прокаспазы-8. Указаны сайты протеолиза (остатки Э) и цистеин (С) активного сайта.

Прокаспаза-8а считается основной изоформой и нумерация первичной структуры всех изоформ прокаспазы-8 основывается на аминокислотной последовательности прокаспазы-8а. Структурные отличия изоформ-8а и -8Ь являются незначительными, прокаспаза-8а содержит небольшой участок (аминокислотные остатки 184-198) после ОБВ2 домена, отсутствующий в прокаспазе-8Ь (Рис. 1.2.1.1). Таким образом, прокаспаза-8Ь, состоит из 464 аминокислотных остатков, и обладает меньшей молекулярной массой, чем прокаспаза-8а (479 остатков) [28], [30]. Участок 184-198 расположен перед сайтом разрезания между продоменом и большим каталитическим доменом; таким образом большая (р18) и малая (р10) каталитические субъединицы, которые образуются после расщепления прокаспаз-8а и 8Ь имеют идентичную структуру. Интересно, что функциональная разница в индукции апоптоза между этими двумя белками до сих пор неизвестна, что может быть объяснено схожестью их структур.

Аутокаталитическое протеолитическое расщепление прокаспазы-8а/Ь (р55/р53) происходит в две стадии [10], [31]. На первой стадии, происходит расщепление большого и малого каталитических доменов по аминокислотным остаткам аспарагиновых кислот 374 и 384 (Э374 и Э384), что приводит к образованию фрагментов р43/р41 и р10. Далее, за этим процессом следует разрезание после остатка аспарагиновой кислоты между продоменом р26/р24 и большим каталитическим доменом с формированием активного гетеротетрамера р102-р182 (Рис. 1.2.1.2) [10], [30], [31]. Следует отметить, что далее в тексте под термином «прокаспаза-8» будет подразумеваться полноразмерная форма (р55/р53), а для обозначения продуктов расщепления прокаспазы-8: р43/р41, р18 и р10 будет использоваться термин "каспаза-8".

Рисунок 1.2.1.2 Схема расщепления прокаспазы-8а/Ь (р55/р53) и образования активного гетеротетрамера р182-р102. Указаны сайты протеолиза (остатки Э) и его основные этапы. Также, показаны продукты продуктов расщепления прокаспазы-8: р43/р41, р18 и р10, для обозначения которых далее будет использоваться термин "каспаза-8", в то время как для обозначения полноразмерной формы р55/р53 будет использоваться термин "прокаспаза-8".

Как указывалось выше, структура большой (р18) и малой (р10) каталитических субъединиц, образуемых в результате разрезания прокаспаз-

8а и -8Ь является идентичной. Единственной разницей, наблюдаемой между ними является различный молекулярный вес продомена прокаспазы-8а, р26, и р43 продукта первой стадии расщепления прокаспазы-8а, которые на 2 Ша больше, чем молекулярный вес соответствующих фрагментов прокаспазы-8Ь (р24 и р41 соответственно) [31]. Важно отметить, что два ключевых остатка активного центра фермента (С360 и Н317) необходимых для осуществления каталитической функции, расположены на большой каталитической субъединице р18 (Рис. 1.2.1.2). При этом, для непроцесированного мономера прокаспазы-8 наблюдается неупорядоченная конформация активного сайта, которая переходит в упорядоченную конформацию при димеризации прокаспазы-8 (Рис. 1.2.1.3) [10].

Рисунок 1.2.1.3 ЯМР структура неактивной формы С-концевого домена мономера прокаспазы-8 [РЭБ ГО 2К77]. Аминокислотные остатки, по которым происходит протеолиз Ь2 петли в процессе расщепления прокаспазы-8 показаны красным цветом (Б374 и Б384). Фрагменты р10 и р18 показаны тёмно- и светло-синими цветами соответственно. Показано позиционное выравнивание всех конформаций прокаспазы-8, согласно ЯМР структуре.

0374

0384

12' (закрытая конформация)

Гомодимер, образуемый двумя молекулами прокаспазы-8, также обладает ферментативной активностью, однако, последующее расщепление гомодимера прокаспазы-8 с образованием p102-p182 гетеротетрамера каспазы-8 необходимо для стабилизации активного центра фермента (Рис. 1.2.1.4) [32]. Каталитическая активность гомодимера прокаспазы-8 может объясняться пространственным сближением каталитических доменов p18 и p10 в структуре гомодимера двух молекул прокаспазы-8 (р55ф55) и последующим конформационным переходом в структуре активного центра, который приводит к его активации, что в свою очередь приводит к аутопротеолизу прокаспазы-8. Данный процесс обеспечивается за счёт специфической конформации L2 петли в структуре прокаспазы-8, которая находится в так называемом «закрытом состоянии» в составе прокаспазы-8 и стабилизируется за счет взаимодействий в составе гомодимера [10] (Рис. 1.2.1.3; Рис. 1.2.1.4). Другой интересной особенностью гомодимера, образуемого двумя молекулами прокаспазы-8 (р55ф55), является субстратная специфичность фермента, образуемого гомодимером прокаспазы-8, которая отличается от субстратной специфичности фермента, образуемого гетеротетрамером каспазы-8 [32]-[34]. Было показано, что белки с-FLIP и RIPK1 являются субстратами прокаспазы-8, в то время как прокаспаза-3 и Bid являются субстратами каспазы-8 [32]. Было установлено, что субстратная специфичность прокаспазы-8 меняется уже при ее протеолизе до фрагмента p43 [33]. Молекулярные механизмы различной субстратной специфичности прокаспазы-8 и каспазы-8 до сих пор плохо изучены.

Рисунок 1.2.1.4 Структура активной формы димера каспазы-8 после разрезания Ь2 петли [РББ ГО 3ЮЩ Фрагменты р10 и р18 показаны тёмно- и светло-синими цветами, соответственно. Атомы С360 активного сайта показаны сферами. Стрелками показана Ь2' петля в открытой конформации.

1.2.2 Структурная организация БЕБ филаментов прокаспазы-8

С помощью метода крио-электронной микроскопии было показано,что взаимодействие между ЭБЭ доменами прокаспазы-8 приводит к формированию так называемых ЭБЭ филаментов (Рис 1.2.2.1).

Рисунок 1.2.2.1 Структура DED филамента прокаспазы-8. (А) Структура доменов DED прокаспазы-8 в ленточном представлении, домен DED1 выделен оранжевым цветом, DED2 - синим. (Б) Интерфейсы взаимодействия домена DED прокаспазы-8 в филаменте DED. Указаны типы интерфейсов и образующие их аминокислотные остатки. (В) Структура DED филамента прокаспазы-8 в ленточном представлении. (Г) Трехмерная диаграмма DED филамента. N-концевые области доменов прокаспазы-8 DED1 (оранжевый) и DED2 (синий) обозначены сферами. Направления взаимодействий I, II и III типов для одной из субъединиц филаментов показаны черным пунктиром. Три цепи (а, б и в), образованные взаимодействием типа I, показаны пунктирными красными, зелеными и синими линиями соответственно. (Д) Двумерная диаграмма структуры DED филамента и схема взаимодействий DED-доменов прокаспазы-8. Схема доменов прокаспазы-8 DED1 и DED2 показана вверху, указаны интерфейсы взаимодействия. Цветными пунктирными линиями показаны цепи DED, образованные взаимодействием типа I. Направление взаимодействий типов II и III указано черными пунктирными линиями. (Рисунок адаптирован из [35]).

Такая олигомерная структура служит платформой для димеризации и последующей активации прокаспазы-8. Изначально, на основании данных количественной масс-спектрометрии, предполагалось, что прокаспаза-8 формирует так называемые DED цепи в комплексе DISC [14], [15], [17]. Однако, с помощью метода крио-электронной микроскопии [18] было показано, что линейные DED цепи являются лишь частью структур, формируемых прокаспазой-8 в комплексе DISC. При этом, полная структура этого комплекса получила название DED филамента, и может быть охарактеризована как олигомер прокаспазы-8, который состоит из трёх линейных цепей прокаспазы-8. Оказалось, что организация DED филаментов, может быть описана тремя типами взаимодействий, которые приводят к формированию структуры со спиральной симметрией. Такой тип сборки является общим для членов суперсемейства DD домена [24]. В составе DED

филамента, каждый DED домен, может быть окружен шестью соседними доменами за счет ассиметричных взаимодействий их интерфейсов. Всего возможно три типа взаимодействий между соседними DED доменами: I, II и III тип взаимодействий. DED филаменты могут быть охарактеризованы наличием трёх DED цепей. Каждая из этих цепей образована за счет взаимодействий I типа между DED доменами соседних молекул прокаспазы-8. Линейные цепи, при этом, взаимодействуют друг с другом, образуя структуру филамента за счёт взаимодействия интерфейсов II и III типа (Рис. 1.2.2.1).

Образование линейных цепей за счет взаимодействий типа I основано на связывании домена DED2 одной молекулы прокаспазы-8 (интерфейс Ib, Рис. 1.2.2.1) с доменом DED1 соседней молекулы прокаспазы-8 (интерфейс Ia, Рис. 1.2.2.1). Это взаимодействие в основном происходит в результате связывания а-спиральных участков DED2 и DED1 доменов. В случае I типа взаимодействий спираль 2b (англ. helix 2b, сокр. H2b) и H5b домена DED2 взаимодействуют со спиралями H1a и H4a домена DED1. В частности, высококонсервативные остатки FL мотива (F122, L123), которые входят в состав H2b DED2 домена прокаспазы-8, вовлечены в гидрофобные взаимодействия с остатками Y8, L42, и L44 DED1 домена прокаспазы-8, тем самым участвуя во взаимодействии I типа (Рис. 1.2.2.1). Полярные остатки, такие как S4, R5, D40, и Q46, входящие в состав интерфейса Ia и R118, S119, E126, Q166, входящие в состав интерфейса Ib, также вовлечены в I тип взаимодействий. Согласно данным сайт-специфичного мутагенеза, двойная замена гидрофобных остатков (включая F122A/L123A) приводит к наиболее сильному эффекту подавления сборки DED филамента, в то время как замены полярных остатков приводят к значительно более слабому эффекту [15], [35]. Интерфейсы IIa и IIb вовлечены в формирование взаимодействий II типа. Интерфейс IIa формируется H4a и H4b а-спиральными участками DED1 и DED2 доменов прокаспазы-8 соответственно. Интерфейс IIb формируется H5a, H6a, и петлей между H5a и H6a в случае DED1 домена и H5b, H6b, и петлей между H5b и

H6b в случае DED2 домена. Остатки, которые образуют консервативный элемент в семействе DED доменов (так называемая «заряженная триада», англ. «charged triad»), вовлечены во взаимодействия данного типа [29], [36]. В состав «заряженной триады» (также известной как RxDL мотив) входят остатки R71, D73, и L74 DED1 домена прокаспазы-8. В случае взаимодействий III типа, интерфейс IIIa преимущественно формируется остатками H3a и петлей между а-спиральными участками H2b и H4b DED2 домена. Интерфейс IIIb формируется остатками H1a и петлей между а-спиральными участками H1a и H2a DED1 домена, а также H1b и петлей между а-спиральными участками H1b и H2b DED2 домена. Большое количество полярных остатков на интерфейсах II и III типа взаимодействий позволяет предположить, что комплементарность электростатических взаимодействий может определить селективность связывания различных DED доменов и является важным фактором, регулирующим сборку DED филаментов и комплекса DISC [18]. Интересно, что все комбинации II и III типа взаимодействия, включая гомотипические (DED1:DED1, DED2:DED2) и гетеротипические (DED1:DED2, DED2:DED1) взаимодействия вовлечены в формирование структуры DED филамента прокаспазы-8.

Таким образом, три DED цепи (а, б и в) формируют структуру филамента (Рис. 1.2.2.1), цепь а и б, а также цепи бис, связаны гомотипическими взаимодействиями интерфейсов II и III типа (Рис. 1.2.2.1). II тип гетеротипических и III тип гомотипических взаимодействий возникает между соседними цепями а и в (Рис. 1.2.2.1). Можно предположить, что наличие всех комбинаций взаимодействующих интерфейсов между DED доменами является важным фактором для корректной сборки комплекса DISC.

1.2.3 Структура и функция FADD

Белок FADD играет основную роль в инициации сборки DED филаментов комплекса DISC [36]. В состав белка FADD входят два ключевых домена: DD и DED. DD домены FADD способны образовывать олигомеры с

ББ доменами рецептора СБ95 [36]. Согласно ряду исследований, состав комплекса, образуемого ББ доменом белка СБ95 и ББ доменом белка БЛОВ, может отличаться. В частности, согласно структуре олигомерного комплекса ББ CD95/DD FЛDD, полученного с использованием метода рентгеноструктурного анализа, оказалось, что 5 субъединиц БАББ ББ способны одновременно связываться с 5-7 субъединицами СБ95 ББ (РБВ Ш 3Ор9) [36]. Согласно другой кристаллической структуре (РБЬ ГО 3Е7Р) 4 субъединицы БЛББ ББ способны одновременно связываться с 4 субъединицами СБ95 ББ [37].

Структура олигомерного комплекса, состоящего из БЕБ доменов белка БЛББ, до сих пор не расшифрована. Однако, согласно структуре мономера БЕБ домена белка БАББ [38], [39], БЕБ домены белков БЛББ и прокаспазы-8 имеют высокое структурное сходство, что позволяет предположить, что FADD БЕБ способен образовывать схожие олигомерные структуры, что и БЕБ домены прокаспазы-8, образуемые за счет I, II и III типов взаимодействий [18]. Также, с использованием иммунного мечения с частицами золота было показано, что БЕБ домены белка FADD формируют комплекс, локализованный на одном конце БЕБ филамента FADD/прокаспаза-8 [18], что указывает на наличие одного направления роста БЕБ филамента прокаспазы-8 относительно FADD и потенциальном наличии специфических взаимодействий БЕБ домена белка FADD с БЕБ доменом прокаспазы-8. На основании исследований с использованием метода сайт-направленного мутагенеза FADD БЕБ и прокаспазы-8 БЕБ, можно предположить, что № интерфейс БЕБ домена белка FADD вовлечен в связывание с прокаспазой-8 в составе БЕБ филамента [40]. Согласно ряду исследований, белок FADD так же способен связываться с белком с-РЫР. Подробнее это будет обсуждаться ниже. Согласно данным количественной масс спектрометрии, отношение между прокаспазой-8 и FADD в составе БЕБ филамента составляет 10 : 1 [15],

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Иванисенко Никита Владимирович, 2021 год

Список литературы

1. Friedlander R.M. Apoptosis and Caspases in Neurodegenerative Diseases // New England Journal of Medicine. 2003. № 14(348). С. 1365-1375. DOI: 10.1056/NEJMra022366.

2. Kerr J.F.R., Winterford C.M., Harmon B. V. Apoptosis. Its significance in cancer and cancer Therapy // Cancer. 1994. № 8(73). С. 2013-2026. DOI:10.1002/1097-0142( 19940415)73:8<2013: :AID-CNCR2820730802>3.0.C0;2-J.

3. Lavrik I., Golks A., Krammer P.H. Death receptor signaling // Journal of Cell Science. 2005. № 2(118). С. 265-267. D0I:10.1242/jcs.01610.

4. Guicciardi M.E., Gores G.J. Life and death by death receptors // Wiley Online Library. 2009. № 6(23). С. 1625-1637. D0I:10.1096/fj.08-111005.

5. Lavrik I.N., Golks A., Krammer P.H. Caspase: Pharmacological manipulation of cell death. // The Journal of clinical investigation. 2005. № 10(115). С. 2665-2672. DOI: 10.1172/JCI26252.

6. Salvesen G.S., Dixit V.M. Caspases: Intracellular signaling by proteolysis. // Cell. 1997. № 4(91). С. 443-446. DOI:10.1016/s0092-8674(00)80430-4.

7. Pop C., Salvesen G.S. Human caspases: Activation, specificity, and regulation. // Journal of Biological Chemistry. 2009. № 33(284). С. 21777-21781. DOI: 10.1074/jbc.R800084200.

8. Krammer P.H., Arnold R., Lavrik I.N. Life and death in peripheral T cells // Nature Reviews Immunology. 2007. № 7(7). С. 532-542. DOI: 10.1038/nri2115.

9. Lavrik I.N., Krammer P.H. Regulation of CD95/Fas signaling at the DISC // Cell Death and Differentiation. 2012. № 1(19). С. 36-41.

DOI: 10.1038/cdd.2011.155.

10. Keller N., Mares J., Zerbe O., Grütter M.G. Structural and Biochemical Studies on Procaspase-8: New Insights on Initiator Caspase Activation // Structure. 2009. № 3(17). C. 438-448. D0I:10.1016/j.str.2008.12.019.

11. Yu J.W., Jeffrey P.D., Shi Y. Mechanism of procaspase-8 activation by c-FLIPL // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2009. № 20(106). C. 8169-8174. DOI: 10.1073/pnas.0812453106.

12. Öztürk S., Schleich K., Lavrik I.N. Cellular FLICE-like inhibitory proteins (c-FLIPs): Fine-tuners of life and death decisions. // Experimental Cell Research.

2012. № 11(318). C. 1324-1331. D0I:10.1016/j.yexcr.2012.01.019.

13. Kataoka T. The caspase-8 modulator c-FLIP. // Critical Reviews in Immunology. 2005. № 1(25). C. 31-58. D0I:10.1615/critrevimmunol.v25 .i1.30.

14. Schleich K., Krammer P.H., Lavrik I.N. The chains of death // Cell Cycle.

2013. № 2(12). C. 193-194. D0I:10.4161/cc.23464.

15. Dickens L.S., Boyd R.S., Jukes-Jones R., Hughes M.A., Robinson G.L., Fairall L., Schwabe J.W.R., Cain K., MacFarlane M. A Death Effector Domain Chain DISC Model Reveals a Crucial Role for Caspase-8 Chain Assembly in Mediating Apoptotic Cell Death // Molecular Cell. 2012. № 2(47). C. 291305. D0I:10.1016/j.molcel.2012.05.004.

16. Bagnoli M., Canevari S., Mezzanzanica D. Cellular FLICE-inhibitory protein (c-FLIP) signalling: A key regulator of receptor-mediated apoptosis in physiologic context and in cancer. // International Journal of Biochemistry and Cell Biolology. № 2(42). C. 210-213. D0I:10.1016/j.biocel.2009.11.015.

17. Schleich K., Warnken U., Fricker N., Öztürk S., Richter P., Kammerer K.,

Schnölzer M., Krammer P.H., Lavrik I.N. Stoichiometry of the CD95 Death-Inducing Signaling Complex: Experimental and Modeling Evidence for a Death Effector Domain Chain Model // Molecular Cell. 2012. № 2(47). C. 306-319. D01:10.1016/j.molcel.2012.05.006.

18. Fu T.M., Li Y., Lu A., Li Z., Vajjhala P.R., Cruz A.C., Srivastava D.B., DiMaio F., Penczek P.A., Siegel R.M., Stacey K.J., Egelman E.H., Wu H. Cryo-EM Structure of Caspase-8 Tandem DED Filament Reveals Assembly and Regulation Mechanisms of the Death-Inducing Signaling Complex // Molecular Cell. 2016. № 2(64). C. 236-250. D0I:10.1016/j.molcel.2016.09.009.

19. Zamaraev A. V., Kopeina G.S., Zhivotovsky B., Lavrik I.N. Cell death controlling complexes and their potential therapeutic role // Cellular and Molecular Life Sciences. 2015. № 3(72). C. 505-517. D0I:10.1007/s00018-014-1757-2.

20. Zamaraev A. V., Kopeina G.S., Prokhorova E.A., Zhivotovsky B., Lavrik I.N. Post-translational Modification of Caspases: The 0ther Side of Apoptosis Regulation. // Trends in Cell Biology. 2017. № 5(27). C. 322-339. D0I:10.1016/j.tcb.2017.01.003.

21. Aksenova V.I., Bylino O. V., Zhivotovsky B.D., Lavrik I.N. Caspase-2: What do we know today? // Molecular Biology (Moskva). 2013. № 2(47). C. 184204. D0I:10.7868/s0026898413010023.

22. Seyrek K., Ivanisenko N. V., Richter M., Hillert L.K., König C., Lavrik I.N. Controlling Cell Death through Post-translational Modifications of DED Proteins. // Trends in Cell Biology. 2020. № 5(30). C. 354-369. D01:10.1016/j.tcb.2020.02.006.

23. Lavrik I.N. Systems biology of death receptor networks: Live and let die // Cell Death and Disease. 2014. № 5(5). C. 1-9. D0I:10.1038/cddis.2014.160.

24. Ferrao R., Wu H. Helical assembly in the death domain (DD) superfamily. // Current 0pinion in Structural Biology. 2012. № 22(2). C. 241-247. D0I:10.1016/j.sbi.2012.02.006.

25. Horn S., Hughes M.A., Schilling R., Sticht C., Tenev T., Ploesser M., Meier P., Sprick M.R., MacFarlane M., Leverkus M. Caspase-10 Negatively Regulates Caspase-8-Mediated Cell Death, Switching the Response to CD95L in Favor of NF-kB Activation and Cell Survival // Cell Reports. 2017. № 4(19). C. 785-797. D0I:10.1016/j.celrep.2017.04.010.

26. Lafont E., Kantari-Mimoun C., Draber P., De Miguel D., Hartwig T., Reichert M., Kupka S., Shimizu Y., Taraborrelli L., Spit M., Sprick M.R., Walczak H. The linear ubiquitin chain assembly complex regulates TRAIL -induced gene activation and cell death // The EMBO Journal. 2017. № 9(36). C. 1147-1166. D01:10.15252/embj.201695699.

27. Cullen S.P., Martin S.J. Fas and TRAIL "death receptors" as initiators of inflammation: Implications for cancer. // Seminar in Cell and Developmental Biology. 2015. № 39. C. 26-34. D0I:10.1016/j.semcdb.2015.01.012.

28. Hoffmann J.C., Pappa A., Krammer P.H., Lavrik I.N. A New C-Terminal Cleavage Product of Procaspase-8, p30, Defines an Alternative Pathway of Procaspase-8 Activation // Molecular and Cellular Biology. 2009. № 16(29). C. 4431-4440. D01:10.1128/mcb.02261-07.

29. Schleich K., Buchbinder J.H., Pietkiewicz S., Kähne T., Warnken U., Öztürk S., Schnölzer M., Naumann M., Krammer P.H., Lavrik I.N. Molecular architecture of the DED chains at the DISC: Regulation of procaspase-8 activation by short DED proteins c-FLIP and procaspase-8 prodomain // Cell Death and Differentiation. 2016. № 4(23). C. 681-694. D0I:10.1038/cdd.2015.137.

30. Golks A., Brenner D., Schmitz I., Watzl C., Krueger A., Krammer P.H., Lavrik

I.N. The role of CAP3 in CD95 signaling: New insights into the mechanism of procaspase-8 activation // Cell Death and Differentiation. 2006. № 3(13). C. 489-498. D0I:10.1038/sj.cdd.4401766.

31. Lavrik I., Krueger A., Schmitz I., Baumann S., Weyd H., Krammer P.H., Kirchhoff S. The active caspase-8 heterotetramer is formed at the CD95 DISC [2] // Cell Death and Differentiation. 2003. № 1(10). C. 144-145. D01:10.1038/sj.cdd.4401156.

32. Hughes M.A., Powley I.R., Jukes-Jones R., Horn S., Feoktistova M., Fairall L., Schwabe J.W.R., Leverkus M., Cain K., MacFarlane M. Co-operative and Hierarchical Binding of c-FLIP and Caspase-8: A Unified Model Defines How c-FLIP Isoforms Differentially Control Cell Fate // Molecular Cell. 2016. № 6(61). C. 834-849. D0I:10.1016/j.molcel.2016.02.023.

33. Hughes M.A., Harper N., Butterworth M., Cain K., Cohen G.M., MacFarlane M. Reconstitution of the Death-Inducing Signaling Complex Reveals a Substrate Switch that Determines CD95-Mediated Death or Survival // Molecular Cell. 2009. № 3(35). C. 265-279. D01:10.1016/j.molcel.2009.06.012.

34. Powley I.R., Hughes M.A., Cain K., MaCfarlane M. Caspase-8 tyrosine-380 phosphorylation inhibits CD95 DISC function by preventing procaspase-8 maturation and cycling within the complex // Oncogene. 2016. № 43(35). C. 5629-5640. D0I:10.1038/onc.2016.99.

35. Singh N., Hassan A., Bose K. Molecular basis of death effector domain chain assembly and its role in caspase-8 activation // The FASEB Journal. 2016. № 1(30). C. 186-200. D01:10.1096/fj.15-272997.

36. Wang L., Yang J.K., Kabaleeswaran V., Rice A.J., Cruz A.C., Park A.Y., Yin Q., Damko E., Jang S.B., Raunser S., Robinson C. V., Siegel R.M., Walz T., Wu H. The Fas-FADD death domain complex structure reveals the basis of

DISC assembly and disease mutations // Nature Structural and Molecular Biology. 2010. № 11(17). C. 1324-1329. D01:10.1038/nsmb.1920.

37. Scott F.L., Stec B., Pop C., Dobaczewska M.K., Lee J.J., Monosov E., Robinson H., Salvesen G.S., Schwarzenbacher R., Riedl S.J. The Fas-FADD death domain complex structure unravels signalling by receptor clustering // Nature. 2009. № 7232(457). C. 1019-1022. D0I:10.1038/nature07606.

38. Carrington P.E., Sandu C., Wei Y., Hill J.M., Morisawa G., Huang T., Gavathiotis E., Wei Y., Werner M.H. The Structure of FADD and Its Mode of Interaction with Procaspase-8 // Molecular Cell. 2006. № 5(22). C. 599-610. DOI: 10.1016/j.molcel.2006.04.018.

39. Eberstadt M., Huang B., Chen Z., Meadows R.P., Ng S.-C., Zheng L., Lenardo M.J., Fesik S.W. NMR structure and mutagenesis of the FADD (Mort1) death-effector domain // Nature. 1998. № 6679(392). C. 941-945. DOI: 10.1038/31972.

40. Majkut J., Sgobba M., Holohan C., Crawford N., Logan A.E., Kerr E., Higgins C.A., Redmond K.L., Riley J.S., Stasik I., Fennell D.A., Van Schaeybroeck S., Haider S., Johnston P.G., Haigh D., Longley D.B. Differential affinity of FLIP and procaspase 8 for FADD's DED binding surfaces regulates DISC assembly // Nature Communications. 2014. № 1(5). C. 1-12. DOI: 10.1038/ncomms4350.

41. Golks A., Brenner D., Krammer P.H., Lavrik I.N. The c-FLIP-NH2 terminus (p22-FLIP) induces NF-kB activation // Journal of Experimental Medicine. 2006. № 5(203). C. 1295-1305. D0I:10.1084/jem.20051556.

42. Chang D.W., Xing Z., Pan Y., Algeciras-Schimnich A., Barnhart B.C., Yaish-Ohad S., Peter M.E., Yang X. C-FLIPL is a dual function regulator for caspase-8 activation and CD95-mediated apoptosis // EMBO Journal. 2002. № 14(21). C. 3704-3714. DOI: 10.1093/emboj/cdf356.

43. Micheau 0., Thome M., Schneider P., Holler N., Tschopp J., Nicholson D.W., Briand C., Grütter M.G. The long form of FLIP is an activator of caspase-8 at the Fas death-inducing signaling complex // Journal of Biological Chemistry. 2002. № 47(277). C. 45162-45171. D0I:10.1074/jbc.M206882200.

44. Peter M.E. The flip side of FLIP. // Biochemical Journal. 2004. № 2(382). C. e1. D0I:10.1042/BJ20041143

45. Fricker N., Beaudouin J., Richter P., Eils R., Krammer P.H., Lavrik I.N. Model-based dissection of CD95 signaling dynamics reveals both a pro- and antiapoptotic role of c-FLIPL // Journal of Cell Biology. 2010. № 3(190). C. 377-389. D0I:10.1083/jcb.201002060.

46. Boatright K.M., Deis C., Denault J.B., Sutherlin D.P., Salvesen G.S. Activation of caspases-8 and -10 by FLIPL // Biochemical Journal. 2004. № 2(382). C. 651-657. D0I:10.1042/BJ20040809.

47. Pop C., 0berst A., Drag M., Van Raam B.J., Riedl S.J., Green D.R., Salvesen G.S. FLIPL induces caspase 8 activity in the absence of interdomain caspase 8 cleavage and alters substrate specificity // Biochemical Journal. 2011. № 3(433). C. 447-457. D0I:10.1042/BJ20101738.

48. Barnhart B.C., Legembre P., Pietras E., Bubici C., Franzoso G., Peter M.E. CD95 ligand induces motility and invasiveness of apoptosis-resistant tumor cells // EMBO Journal. 2004. № 15(23). C. 3175-3185. D01:10.1038/sj.emboj.7600325.

49. Neumann L., Pforr C., Beaudouin J., Pappa A., Fricker N., Krammer P.H., Lavrik I.N., Eils R. Dynamics within the CD95 death-inducing signaling complex decide life and death of cells // Molecular Systems Biology. 2010. № 352(6). C. 1-17. D0I:10.1038/msb.2010.6.

50. Maubach G., Schmädicke A.C., Naumann M. NEMO Links Nuclear Factor-kB to Human Diseases // Trends in Molecular Medicine. 2017. № 12(23). C.

1138-1155. D0I:10.1016/j.molmed.2017.10.004.

51. Bagneris C., Ageichik A. V., Cronin N., Wallace B., Collins M., Boshoff C., Waksman G., Barrett T. Crystal Structure of a vFlip-IKKy Complex: Insights into Viral Activation of the IKK Signalosome // Molecular Cell. 2008. № 5(30). C. 620-631. D0I:10.1016/j.molcel.2008.04.029.

52. Bagneris C., Rogala K.B., Baratchian M., Zamfir V., Kunze M.B.A., Dagless S., Pirker K.F., Collins M.K., Hall B.A., Barrett T.E., Kay C.W.M. Probing the solution structure of IkB kinase (IKK) subunit y and its interaction with Kaposi sarcoma-associated herpes virus Flice-interacting protein and IKK subunit ß by EPR spectroscopy // The Journal of biological chemistry. 2015. № 38(290). C. 23024. D0I:10.1074/jbc.A114.622928.

53. Baratchian M., Davis C.A., Shimizu A., Escors D., Bagneris C., Barrett T., Collins M.K. Distinct Activation Mechanisms of NF-kB Regulator Inhibitor of NF-kB Kinase (IKK) by Isoforms of the Cell Death Regulator Cellular FLICE-like Inhibitory Protein (cFLIP) // The Journal of biological chemistry. 2016. № 14(291). C. 7608-7620. D0I:10.1074/jbc.M116.718122.

54. Ivanisenko N. V., Buchbinder J.H., Espe J., Richter M., Bollmann M., Hillert L.K., Ivanisenko V.A., Lavrik I.N. Delineating the role of c-FLIP/NEM0 interaction in the CD95 network via rational design of molecular probes // BMC Genomics. 2019. № S3(20). C. 293. D0I:10.1186/s12864-019-5539-y.

55. Scaffidi C., Schmitz I., Krammer P.H., Peter M.E. The role of c-FLIP in modulation of CD95-induced apoptosis // Journal of Biological Chemistry. 1999. № 3(274). C. 1541-1548. D0I:10.1074/jbc.274.3.1541.

56. Hwang E.Y., Jeong M.S., Park S.Y., Jang B. Evidence of complex formation between FADD and c-FLIP death effector domains for the death inducing signaling complex // BMB Reports. 2014. № 9(47). C. 488-493. D0I:10.5483/BMBRep.2014.47.9.239.

57. Ueffing N., Keil E., Freund C., Kühne R., Schulze-0sthoff K., Schmitz I. Mutational analyses of c-FLIPR, the only murine short FLIP isoform, reveal requirements for DISC recruitment // Cell Death and Differentiation. 2008. № 4(15). C. 773-782. D0I:10.1038/sj.cdd.4402314.

58. Kitano H. Computational systems biology // Nature. 2002. № 6912(420). C. 206-210. D01: 10.1038/nature01254.

59. Chen W.W., Niepel M., Sorger P.K. Classic and contemporary approaches to modeling biochemical reactions. // Genes Dev. 2010. № 17(24). C. 1861-1875. D0I:10.1101/gad.1945410.

60. Spencer S.L., Sorger P.K. Measuring and modeling apoptosis in single cells. //Cell. № 6(144). C. 926-939. D0I:10.1016/j.cell.2011.03.002.

61. Ashyraliyev M., Fomekong-Nanfack Y., Kaandorp J.A., Blom J.G. Systems biology: parameter estimation for biochemical models // FEBS Journal. 2009. № 4(276). C. 886-902. D0I:10.1111/j.1742-4658.2008.06844.x.

62. Eydgahi H., Chen W.W., Muhlich J.L., Vitkup D., Tsitsiklis J.N., Sorger P.K. Properties of cell death models calibrated and compared using Bayesian approaches // Molecular Systems Biology. 2013. № 1(9). C. 644. D0I:10.1038/msb.2012.69.

63. Bonabeau E. Agent-based modeling: Methods and techniques for simulating human systems // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2002. № SUPPL. 3(99). C. 7280-7287. D01:10.1073/pnas.082080899.

64. Bentele M., Lavrik I., Ulrich M., Stößer S., Heermann D.W., Kalthoff H., Krammer P.H., Eils R. Mathematical modeling reveals threshold mechanism in CD95-induced apoptosis // Journal of Cell Biology. 2004. № 6(166). C. 839-851. D0I:10.1083/jcb.200404158.

65. Lavrik I.N., Golks A., Riess D., Bentele M., Eils R., Krammer P.H. Analysis of CD95 threshold signaling: Triggering of CD95 (FAS/AP0-1) at low concentrations primarily results in survival signaling // Journal of Biological Chemistry. 2007. № 18(282). C. 13664-13671. D01:10.1074/jbc.M700434200.

66. Legewie S., Blüthgen N., Herzel H. Mathematical Modeling Identifies Inhibitors of Apoptosis as Mediators of Positive Feedback and Bistability // PLoS Computational Biology. 2006. № 9(2). C. e120. D01:10.1371/journal.pcbi.0020120.

67. Rehm M., Huber H.J., Dussmann H., Prehn J.H.M. Systems analysis of effector caspase activation and its control by X-linked inhibitor of apoptosis protein // EMBO Journal. 2006. № 18(25). C. 4338-4349. D01:10.1038/sj.emboj.7601295.

68. Albeck J.G., Burke J.M., Aldridge B.B., Zhang M., Lauffenburger D.A., Sorger P.K. Quantitative Analysis of Pathways Controlling Extrinsic Apoptosis in Single Cells // Molecular Cell. 2008. № 1(30). C. 11-25. D0I:10.1016/j.molcel.2008.02.012.

69. Spencer S.L., Gaudet S., Albeck J.G., Burke J.M., Sorger P.K. Non-genetic origins of cell-to-cell variability in TRAIL-induced apoptosis // Nature. 2009. № 7245(459). C. 428-432. D0I:10.1038/nature08012.

70. Muegge I. Effect of ligand volume correction on PMF scoring // Journal of Computational Chemistry. 2001. № 4(22). C. 418-425. D0I:10.1002/1096-987X(200103)22:4<418:: AID-JCC1012>3.0.C0;2-3.

71. Sousa S.F., Fernandes P.A., Ramos M.J. Protein-ligand docking: Current status and future challenges // Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics. 2006. № 1(65). C. 15-26. D0I:10.1002/prot.21082.

72. Kramer B., Rarey M., Lengauer T. Evaluation of the FLEXX incremental

construction algorithm for protein-ligand docking // Proteins: Structure, Function, and Genetics. 1999. № 2(37). C. 228-241. DOI: 10.1002/(SICI) 1097-0134(19991101)37:2<228: :AID-PROT8>3.0.CO;2-8.

73. Ewing T.J.A., Kuntz I.D. Critical evaluation of search algorithms for automated molecular docking and database screening // Journal of Computational Chemistry. 1997. № 9(18). C. 1175-1189. DOI: 10.1002/(SICI) 1096-987X( 19970715)18:9<1175::AID-JCC6>3.0.C0;2-0.

74. Miller M.D., Kearsley S.K., Underwood D.J., Sheridan R.P. FLOG: A system to select "quasi-flexible" ligands complementary to a receptor of known three-dimensional structure // Journal of Computer-Aided Molecular Design. 1994. № 2(8). C. 153-174. DOI:10.1007/BF00119865.

75. Taylor R.D., Jewsbury P.J., Essex J.W. A review of protein-small molecule docking methods // Journal of Computer-Aided Molecular Design. 2002. № 3(16). C. 151-166. DOI: 10.1023/A: 1020155510718.

76. Trosset J.-Y., Scheraga H.A. Prodock: Software package for protein modeling and docking // Journal of Computational Chemistry. 1999. № 4(20). C. 412427. DOI:10.1002/(SICI)1096-987X(199903)20:4<412::AID-JCC3>3.0.CO;2-N.

77. Abagyan R., Totrov M., Kuznetsov D. ICM?A new method for protein modeling and design: Applications to docking and structure prediction from the distorted native conformation // Journal of Computational Chemistry. 1994. № 5(15). C. 488-506. DOI:10.1002/jcc.540150503.

78. Liu M., Wang S. MCDOCK: A Monte Carlo simulation approach to the molecular docking problem // Journal of Computer-Aided Molecular Design. 1999. № 5(13). C. 435-451. DOI:10.1023/A:1008005918983.

79. Friesner R.A., Banks J.L., Murphy R.B., Halgren T.A., Klicic J.J., Mainz D.T., Repasky M.P., Knoll E.H., Shelley M., Perry J.K., Shaw D.E., Francis P., Shenkin P.S. Glide: A New Approach for Rapid, Accurate Docking and Scoring. 1. Method and Assessment of Docking Accuracy // Journal of Medicinal Chemistry. 2004. № 7(47). C. 1739-1749. D0I:10.1021/jm0306430.

80. Verdonk M.L., Cole J.C., Hartshorn M.J., Murray C.W., Taylor R.D. Improved protein-ligand docking using G0LD // Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics. 2003. № 4(52). C. 609-623. D0I:10.1002/prot. 10465.

81. Morris G.M., Huey R., Lindstrom W., Sanner M.F., Belew R.K., Goodsell D.S., 0lson A.J. AutoDock4 and AutoDockTools4: Automated docking with selective receptor flexibility // Journal of Computational Chemistry. 2009. № 16(30). C. 2785-2791. D0I:10.1002/jcc.21256.

82. Baxter C.A., Murray C.W., Clark D.E., Westhead D.R., Eldridge M.D. Flexible docking using tabu search and an empirical estimate of binding affinity // Proteins: Structure, Function, and Genetics. 1998. № 3(33). C. 367382. D0I:10.1002/(SICI)1097-0134(19981115)33:3<367::AID-PR0T6>3.0.C0;2-W.

83. Karplus M., McCammon J.A. Molecular dynamics simulations of biomolecules. // Nature Structural Biology. 2002. № 9(9). C. 646-652. D01:10.1038/nsb0902-646.

84. Kitchen D.B., Decornez H., Furr J.R., Bajorath J. Docking and scoring in virtual screening for drug discovery: Methods and applications. // Methods Mol Biol. 2017. № 11(3). C. 255-266. D0I:10.1007/978-1-4939-7201-2_18.

85. Taylor J.S., Burnett R.M. DARWIN: A program for docking flexible molecules // Proteins: Structure, Function, and Genetics. 2000. № 2(41). C. 173-191. D01:10.1002/1097-0134(20001101)41:2<173:: AID-

PR0T30>3.0.C0;2-3.

86. Ewing T.J.A., Makino S., Skillman A.G., Kuntz I.D. D0CK 4.0: Search strategies for automated molecular docking of flexible molecule databases // Journal of Computer-Aided Molecular Design. 2001. № 5(15). C. 411-428. D01:10.1023/A: 1011115820450.

87. Halgren T.A., Murphy R.B., Friesner R.A., Beard H.S., Frye L.L., Pollard W.T., Banks J.L. Glide: A New Approach for Rapid, Accurate Docking and Scoring. 2. Enrichment Factors in Database Screening // Journal of Medicinal Chemistry. 2004. № 7(47). C. 1750-1759. D0I:10.1021/jm030644s.

88. Bissantz C., Folkers G., Rognan D. Protein-based virtual screening of chemical databases. 1. Evaluation of different docking/scoring combinations // Journal of Medicinal Chemistry. 2000. № 25(43). C. 4759-4767. D0I:10.1021/jm001044l.

89. Morris G.M., Goodsell D.S., Halliday R.S., Huey R., Hart W.E., Belew R.K., 0lson A.J. Automated docking using a Lamarckian genetic algorithm and an empirical binding free energy function // Journal of Computational Chemistry. 1998. № 14(19). C. 1639-1662. D0I:10.1002/(SICI)1096-987X(19981115)19:14<1639::AID-JCC10>3.0.C0;2-B.

90. Nobeli I., Mitchell J.B.0., Alex A., Thornton J.M. Evaluation of a knowledge-based potential of mean force for scoring docked protein-ligand complexes // Journal of Computational Chemistry. 2001. № 7(22). C. 673-688. D0I:10.1002/jcc.1036.

91. Gohlke H., Klebe G. Drugscore meets CoMFA: Adaptation of fields for molecular comparison (AFMoC) or how to tailor knowledge-based pair-potentials to a particular protein // Journal of Medicinal Chemistry. 2002. № 19(45). C. 4153-4170. D0I:10.1021/jm020808p.

92. DeWitte R.S., Shakhnovich E.I. SMoG: De novo design method based on

simple, fast, and accurate free energy estimates. 1. Methodology and supporting evidence // Journal of the American Chemical Society. 1996. № 47(118). C. 11733-11744. D01:10.1021/ja960751u.

93. Jorgensen W.L., Maxwell D.S., Tirado-Rives J. Development and testing of the OPLS all-atom force field on conformational energetics and properties of organic liquids // Journal of the American Chemical Society. 1996. №2 45(118). C. 11225-11236. D0I:10.1021/ja9621760.

94. Eldridge M.D., Murray C.W., Auton T.R., Paolini G. V., Mee R.P. Empirical scoring functions: I. The development of a fast empirical scoring function to estimate the binding affinity of ligands in receptor complexes // Journal of Computer-Aided Molecular Design. 1997. № 5(11). C. 425-445. DOI: 10.1023/A: 1007996124545.

95. Irwin J.J., Shoichet B.K. ZINC - A free database of commercially available compounds for virtual screening // Journal of Chemical Information and Modeling. 2005. № 1(45). C. 177-182. D0I:10.1021/ci049714+.

96. Mysinger M.M., Carchia M., Irwin J.J., Shoichet B.K. Directory of useful decoys, enhanced (DUD-E): Better ligands and decoys for better benchmarking // Journal of Medicinal Chemistry. 2012. № 14(55). C. 65826594. DOI: 10.1021/jm300687e.

97. Yan Y., Wang W., Sun Z., Zhang J.Z.H., Ji C. Protein-Ligand Empirical Interaction Components for Virtual Screening // Journal of Chemical Information and Modeling. 2017. № 8(57). C. 1793-1806. DOI: 10.1021/acs.jcim.7b00017.

98. Salmaso V., Sturlese M., Cuzzolin A., Moro S. Combining self- and cross-docking as benchmark tools: the performance of DockBench in the D3R Grand Challenge 2 // Journal of Computer-Aided Molecular Design. 2018. № 1(32). C. 251-264. DOI: 10.1007/s 10822-017-0051 -4.

99. Gaieb Z., Parks C.D., Chiu M., Yang H., Shao C., Walters W.P., Lambert M.H., Nevins N., Bembenek S.D., Ameriks M.K., Mirzadegan T., Burley S.K., Amaro R.E., Gilson M.K. D3R Grand Challenge 3: blind prediction of protein-ligand poses and affinity rankings // Journal of Computer-Aided Molecular Design. 2019. № 1(33). C. 1-18. D0I:10.1007/s10822-018-0180-4.

100. Gathiaka S., Liu S., Chiu M., Yang H., Stuckey J.A., Kang Y.N., Delproposto J., Kubish G., Dunbar J.B., Carlson H.A., Burley S.K., Walters W.P., Amaro R.E., Feher V.A., Gilson M.K. D3R grand challenge 2015: Evaluation of protein-ligand pose and affinity predictions // Journal of Computer-Aided Molecular Design. 2016. № 9(30). C. 651-668. D0I:10.1007/s10822-016-9946-8.

101. Brady G.P., Stouten P.F.W. Fast prediction and visualization of protein binding pockets with PASS // Journal of Computer-Aided Molecular Design. 2000. № 4(14). C. 383-401. D0I:10.1023/A:1008124202956.

102. Halgren T.A. Identifying and characterizing binding sites and assessing druggability // Journal of Chemical Information and Modeling. 2009. № 2(49). C. 377-389. D0I:10.1021/ci800324m.

103. Muegge I. A knowledge-based scoring function for protein-ligand interactions: Probing the reference state // Perspectives in Drug Discovery and Design. 2000. № 1(20). C. 99-114. D0I:10.1023/A:1008729005958.

104. Xiang Z. Advances in Homology Protein Structure Modeling // Current Protein & Peptide Science. 2006. № 3(7). C. 217-227. D0I:10.2174/138920306777452312.

105. Eswar N., Webb B., Marti-Renom M.A., Madhusudhan M.S., Eramian D., Shen M., Pieper U., Sali A. Comparative Protein Structure Modeling Using Modeller // Current Protocols in Bioinformatics. 2006. № 1(15). C. 5.6.1-

5.6.30. D01:10.1002/0471250953.bi0506s15.

106. MacKerell A.D., Bashford D., Bellott M., Dunbrack R.L., Evanseck J.D., Field M.J., Fischer S., Gao J., Guo H., Ha S., Joseph-McCarthy D., Kuchnir L., Kuczera K., Lau F.T.K., Mattos C., Michnick S., Ngo T., Nguyen D.T., Prodhom B., Reiher W.E., Roux B., Schlenkrich M., Smith J.C., Stote R., Straub J., Watanabe M., Wiorkiewicz-Kuczera J., Yin D., Karplus M. All-atom empirical potential for molecular modeling and dynamics studies of proteins // Journal of Physical Chemistry B. 1998. № 18(102). C. 3586-3616. D0I:10.1021/jp973084f.

107. Schwede T., Kopp J., Guex N., Peitsch M.C. SWISS-M0DEL: An automated protein homology-modeling server // Nucleic Acids Research. 2003. № 13(31). C. 3381-3385. D0I:10.1093/nar/gkg520.

108. Yang J., Yan R., Roy A., Xu D., Poisson J., Zhang Y. The I-TASSER suite: Protein structure and function prediction. //Nature Methods. 2014. № 1(12). C. 7-8. D0I:10.1038/nmeth.3213.

109. Klepeis J.L., Lindorff-Larsen K., Dror R.0., Shaw D.E. Long-timescale molecular dynamics simulations of protein structure and function. //Current 0pinion In Structural Biology. 2009. № 2(19). C. 120-127. D0I:10.1016/j.sbi.2009.03.004.

110. Leman J.K., Weitzner B.D., Lewis S.M., Adolf-Bryfogle J., Alam N., Alford R.F., Aprahamian M., Baker D., Barlow K.A., Barth P., Basanta B., Bender B.J., Blacklock K., Bonet J., Boyken S.E., Bradley P., Bystroff C., Conway P., Cooper S., Correia B.E., Coventry B., Das R., De Jong R.M., DiMaio F., Dsilva L., Dunbrack R., Ford A.S., Frenz B., Fu D.Y., Geniesse C., Goldschmidt L., Gowthaman R., Gray J.J., Gront D., Guffy S., Horowitz S., Huang P.S., Huber T., Jacobs T.M., Jeliazkov J.R., Johnson D.K., Kappel K., Karanicolas J., Khakzad H., Khar K.R., Khare S.D., Khatib F., Khramushin A., King I.C., Kleffner R., Koepnick B., Kortemme T., Kuenze G., Kuhlman

B., Kuroda D., Labonte J.W., Lai J.K., Lapidoth G., Leaver-Fay A., Lindert S., Linsky T., London N., Lubin J.H., Lyskov S., Maguire J., Malmström L., Marcos E., Marcu 0., Marze N.A., Meiler J., Moretti R., Mulligan V.K., Nerli S., Norn C., O'Conchuir S., Ollikainen N., Ovchinnikov S., Pacella M.S., Pan X., Park H., Pavlovicz R.E., Pethe M., Pierce B.G., Pilla K.B., Raveh B., Renfrew P.D., Burman S.S.R., Rubenstein A., Sauer M.F., Scheck A., Schief W., Schueler-Furman 0., Sedan Y., Sevy A.M., Sgourakis N.G., Shi L., Siegel J.B., Silva D.A., Smith S., Song Y., Stein A., Szegedy M., Teets F.D., Thyme S.B., Wang R.Y.R., Watkins A., Zimmerman L., Bonneau R. Macromolecular modeling and design in Rosetta: recent methods and frameworks // Nature Methods. 2020. № 7(17). C. 665-680. D0I:10.1038/s41592-020-0848-2.

111. Schymkowitz J., Borg J., Stricher F., Nys R., Rousseau F., Serrano L. The FoldX web server: An online force field // Nucleic Acids Research. 2005. № SUPPL. 2(33). C. W382-W388. D0I:10.1093/nar/gki387.

112. Alford R.F., Leaver-Fay A., Jeliazkov J.R., O'Meara M.J., DiMaio F.P., Park H., Shapovalov M. V., Renfrew P.D., Mulligan V.K., Kappel K., Labonte J.W., Pacella M.S., Bonneau R., Bradley P., Dunbrack R.L., Das R., Baker D., Kuhlman B., Kortemme T., Gray J.J. The Rosetta All-Atom Energy Function for Macromolecular Modeling and Design // Journal of Chemical Theory and Computation. 2017. № 6(13). C. 3031-3048. D0I:10.1021/acs.jctc.7b00125.

113. Boyken S.E., Chen Z., Groves B., Langan R.A., 0berdorfer G., Ford A., Gilmore J.M., Xu C., DiMaio F., Pereira J.H., Sankaran B., Seelig G., Zwart P.H., Baker D. De novo design of protein homo-oligomers with modular hydrogen-bond network-mediated specificity // Science. 2016. № 6286(352).

C. 680-687. D01:10.1126/science.aad8865.

114. Lu P., Min D., DiMaio F., Wei K.Y., Vahey M.D., Boyken S.E., Chen Z., Fallas J.A., Ueda G., Sheffler W., Mulligan V.K., Xu W., Bowie J.U., Baker

D. Accurate computational design of multipass transmembrane proteins //

Science. 2018. № 6379(359). C. 1042-1046. D0I:10.1126/science.aaq1739.

115. Chen Z., Boyken S.E., Jia M., Busch F., Flores-Solis D., Bick M.J., Lu P., VanAernum Z.L., Sahasrabuddhe A., Langan R.A., Bermeo S., Brunette T.J., Mulligan V.K., Carter L.P., DiMaio F., Sgourakis N.G., Wysocki V.H., Baker D. Programmable design of orthogonal protein heterodimers // Nature. 2019. № 7737(565). C. 106-111. D0I:10.1038/s41586-018-0802-y.

116. Kahraman A., Herzog F., Leitner A., Rosenberger G., Aebersold R., Malmström L. Cross-Link Guided Molecular Modeling with R0SETTA // PLoS ONE. 2013. № 9(8). C. e73411. D0I:10.1371/journal.pone.0073411.

117. Chaudhury S., Berrondo M., Weitzner B.D., Muthu P., Bergman H., Gray J.J. Benchmarking and Analysis of Protein Docking Performance in Rosetta v3.2 // PLoS ONE. 2011. № 8(6). C. e22477. D0I:10.1371/journal.pone.0022477.

118. Sivasubramanian A., Maynard J.A., Gray J.J. Modeling the structure of mAb 14B7 bound to the anthrax protective antigen // Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics. 2007. № 1(70). C. 218-230. D0I:10.1002/prot.21595.

119. Sivasubramanian A., Chao G., Pressler H.M., Wittrup K.D., Gray J.J. Structural model of the mAb 806-EGFR complex using computational docking followed by computational and experimental mutagenesis // Structure. 2006. № 3(14). C. 401-414. D0I:10.1016/j.str.2005.11.022.

120. Kaufmann K.W., Lemmon G.H., Deluca S.L., Sheehan J.H., Meiler J. Practically useful: What the Rosetta protein modeling suite can do for you. //Biochemistry. 2010. № 14(49). C. 2987-2998. D0I:10.1021/bi902153g.

121. Vickers C.J., Gonzalez-Paez G.E., Litwin K.M., Umotoy J.C., Coutsias E.A., Wolan D.W. Selective inhibition of initiator versus executioner caspases using small peptides containing unnatural amino acids // ACS Chemical Biology. 2014. № 10(9). C. 2194-2198. D0I:10.1021/cb5004256.

122. Madhavi Sastry G., Adzhigirey M., Day T., Annabhimoju R., Sherman W. Protein and ligand preparation: Parameters, protocols, and influence on virtual screening enrichments // Journal of Computer-Aided Molecular Design. 2013. № 3(27). C. 221-234. D0I:10.1007/s10822-013-9644-8.

123. Irwin J.J., Sterling T., Mysinger M.M., Bolstad E.S., Coleman R.G. ZINC: A free tool to discover chemistry for biology // Journal of Chemical Information and Modeling. 2012. № 7(52). C. 1757-1768. D0I:10.1021/ci3001277.

124. Webb B., Sali A. Comparative protein structure modeling using M0DELLER // Current Protocols in Bioinformatics. 2016. (2016). C. 5.6.1-5.6.37. D0I:10.1002/cpbi.3.

125. Chang J.M., Di Tommaso P., Taly J.F., Notredame C. Accurate multiple sequence alignment of transmembrane proteins with PSI-Coffee // BMC Bioinformatics. 2012. № SUPPL.4(13). C. 1-7. D0I:10.1186/1471-2105-13-S4-S1.

126. Eastman P., Swails J., Chodera J.D., McGibbon R.T., Zhao Y., Beauchamp K.A., Wang L.-P., Simmonett A.C., Harrigan M.P., Stern C.D., Wiewiora R.P., Brooks B.R., Pande V.S. 0penMM 7: Rapid development of high performance algorithms for molecular dynamics // PL0S Computational Biology. 2017. № 7(13). C. e1005659. D0I:10.1371/journal.pcbi.1005659.

127. Leman J.K., Weitzner B.D., Lewis S.M., Adolf-Bryfogle J., Alam N., Alford R.F., Aprahamian M., Baker D., Barlow K.A., Barth P., Basanta B., Bender B.J., Blacklock K., Bonet J., Boyken S.E., Bradley P., Bystroff C., Conway P., Cooper S., Correia B.E., Coventry B., Das R., De Jong R.M., DiMaio F., Dsilva L., Dunbrack R., Ford A.S., Frenz B., Fu D.Y., Geniesse C., Goldschmidt L., Gowthaman R., Gray J.J., Gront D., Guffy S., Horowitz S., Huang P.S., Huber T., Jacobs T.M., Jeliazkov J.R., Johnson D.K., Kappel K., Karanicolas J., Khakzad H., Khar K.R., Khare S.D., Khatib F., Khramushin A., King I.C., Kleffner R., Koepnick B., Kortemme T., Kuenze G., Kuhlman

B., Kuroda D., Labonte J.W., Lai J.K., Lapidoth G., Leaver-Fay A., Lindert S., Linsky T., London N., Lubin J.H., Lyskov S., Maguire J., Malmström L., Marcos E., Marcu 0., Marze N.A., Meiler J., Moretti R., Mulligan V.K., Nerli S., Norn C., O'Conchuir S., Ollikainen N., Ovchinnikov S., Pacella M.S., Pan X., Park H., Pavlovicz R.E., Pethe M., Pierce B.G., Pilla K.B., Raveh B., Renfrew P.D., Burman S.S.R., Rubenstein A., Sauer M.F., Scheck A., Schief W., Schueler-Furman 0., Sedan Y., Sevy A.M., Sgourakis N.G., Shi L., Siegel J.B., Silva D.A., Smith S., Song Y., Stein A., Szegedy M., Teets F.D., Thyme S.B., Wang R.Y.R., Watkins A., Zimmerman L., Bonneau R. Macromolecular modeling and design in Rosetta: recent methods and frameworks. //Nature Methods. 2020. № 7(17). C. 665-680. D0I: 10.1038/s41592-020-0848-2.

128. Maguire J.B., Boyken S.E., Baker D., Kuhlman B. Rapid Sampling of Hydrogen Bond Networks for Computational Protein Design // Journal of Chemical Theory and Computation. 2018. № 5(14). D01:10.1021/acs.jctc.8b00033.

129. Barlow K.A., O Conchuir S., Thompson S., Suresh P., Lucas J.E., Heinonen M., Kortemme T. Flex ddG: Rosetta Ensemble-Based Estimation of Changes in Protein-Protein Binding Affinity upon Mutation // Journal of Physical Chemistry B. 2018. № 21(122). C. 5389-5399. D01:10.1021/acs.jpcb.7b11367.

130. Storn R., Price K. Differential Evolution - A Simple and Efficient Heuristic for Global 0ptimization over Continuous Spaces // Journal of Global Optimization. 1997. № 4(11). C. 341-359. D0I:10.1023/A:1008202821328.

131. Raue A., Kreutz C., Maiwald T., Bachmann J., Schilling M., Klingmüller U., Timmer J. Structural and practical identifiability analysis of partially observed dynamical models by exploiting the profile likelihood // Bioinformatics. 2009. № 15(25). C. 1923-1929. D0I:10.1093/bioinformatics/btp358.

132. Hillert L.K., Ivanisenko N. V., Busse D., Espe J., König C., Peltek S.E.,

Kolchanov N.A., Ivanisenko V.A., Lavrik I.N. Dissecting DISC regulation via pharmacological targeting of caspase-8/c-FLIPL heterodimer // Cell Death and Differentiation. 2020. № 7(27). C. 2117-2130. DOI:10.1038/s41418-020-0489-0.

133. Hardy J.A., Lam J., Nguyen J.T., O'Brien T., Wells J.A. Discovery of an allosteric site in the caspases // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2004. № 34(101). C. 12461-12466. DOI: 10.1073/pnas.0404781101.

134. Scheer J.M., Romanowski M.J., Wells J.A. A common allosteric site and mechanism in caspases // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2006. № 20(103). C. 7595-7600. DOI: 10.1073/pnas.0602571103.

135. Zhou H.X. Loops in proteins can be modeled as worm-like chains // Journal of Physical Chemistry B. 2001. № 29(105). C. 6763-6766. DOI: 10.1021/jp011355n.

136. Ding Y., Apostolidou D., Marszalek P. Mechanical Stability of a Small, Highly-Luminescent Engineered Protein NanoLuc // International Journal of Molecular Sciences. 2020. № 1(22). C. 55. D0I:10.3390/ijms22010055.

137. Kabsch W. A solution for the best rotation to relate two sets of vectors // Acta Crystallographica Section A. 1976. № 5(32). C. 922-923. DOI: 10.1107/S0567739476001873.

138. Yang J.K., Wang L., Zheng L., Wan F., Ahmed M., Lenardo M.J., Wu H. Crystal structure of MC159 reveals molecular mechanism of DISC assembly and FLIP inhibition // Molecular Cell. 2005. № 6(20). C. 939-949. DOI: 10.1016/j.molcel.2005.10.023.

139. Eddy S.R. Where did the BLOSUM62 alignment score matrix come from? //Nature Biotechnology. 2004. № 8(22). C. 1035-1036. DOI: 10.1038/nbt0804-

140. Stranges P.B., Kuhlman B. A comparison of successful and failed protein interface designs highlights the challenges of designing buried hydrogen bonds // Protein Science. 2013. № 1(22). C. 74-82. D0I:10.1002/pro.2187.

141. Hillert L.K., Ivanisenko N. V., Espe J., König C., Ivanisenko V.A., Kähne T., Lavrik I.N. Long and short isoforms of c-FLIP act as control checkpoints of DED filament assembly // Oncogene. 2020. № 8(39). C. 1756-1772. D01:10.1038/s41388-019-1100-3.

142. Fuchs S.M., Raines R.T. Pathway for Polyarginine Entry into Mammalian Cells // Biochemistry. 2004. № 9(43). C. 2438-2444. D0I:10.1021/bi035933x.

143. Kallenberger S.M., Beaudouin J., Claus J., Fischer C., Sorger P.K., Legewie S., Eils R. Intra- and Interdimeric Caspase-8 Self-Cleavage Controls Strength and Timing of CD95-Induced Apoptosis // Science Signaling. 2014. № 316(7). C. ra23 LP-ra23. D0I:10.1126/scisignal.2004738.

144. Roux J., Hafner M., Bandara S., Sims J.J., Hudson H., Chai D., Sorger P.K. Fractional killing arises from cell-to-cell variability in overcoming a caspase activity threshold // Molecular Systems Biology. 2015. № 5(11). C. 803. D0I:10.15252/msb.20145584.

Приложение

Протокол 1. Протокол RosettaScripts оптимизации структуры белков и генерации конформационного ансамбля

<ROSETTASCRIPTS> <SCOREFXNS> <ScoreFunction name="ref15s" weights="ref2015.wts" > </ScoreFunction> </SCOREFXNS> <RESIDUE_SELECTORS> </RESIDUE_SELECTORS> <TASKOPERATIONS> <RestrictToRepacking name="repackonly" /> </TASKOPERATIONS> <FILTERS> </FILTERS> <MOVERS>

<FastRelax name="RELAX" scorefxn="ref15s" repeats="8" task_operations="repackonly" />

<MinMover name="min" scorefXn="ref15s" chi="1" bb="1" jump="0" tolerance="0.01" /> </MOVERS> <APPLY_TO_POSE> </APPLY_TO_POSE> <PROTOCOLS> <Add mover_name="min" /> <Add mover_name="RELAX" /> </PROTOCOLS> <OUTPUT /> </ROSETTASCRIPTS>

Команда запуска:

rosetta/rosetta_source/bin/rosetta_scripts.static.linuxgccrelease -in:file:fullatom -out:file:fullatom -packing:ex1 -no_optH false -flip_HNQ -packing:ex2 -score:weights ref2015.wts -s input.pdb -packing:use_input_sc -parser:protocol prepare.xml -nstruct N -use_input_sc

Протокол 2. Протокол RosettaScripts Оптимизации конформации гетеродимеров

<ROSETTASCRIPTS>

<SCOREFXNS> <ScoreFunction name="ref15s" weights="ref2015.wts" /> </SCOREFXNS> <RESIDUE_SELECTORS> </RESIDUE_SELECTORS> <TASKOPERATIONS> <InitializeFromCommandline name="ifcl" /> <RestrictToInterfaceVector name="rtiv" chain1_num="1" chain2_num="2" CB_dist_cutoff="15.0" />

<RestrictToRepacking name="repackonly" /> <IncludeCurrent name="ic" /> </TASKOPERATIONS> <FILTERS>

<Rmsd name="rmsd" superimpose="0" threshold="2.0" > <span begin_res_num="CHAIN_2_START" end_res_num="CHAIN_2_END" /> </Rmsd> </FILTERS> <MOVERS>

<FastRelax name="relax" scorefxn="ref15s" repeats="1" task_operations="repackonly,ic,rtiv" >

<MoveMap chi="true" bb="false" jump = "1" > </MoveMap> </FastRelax> </MOVERS> <APPLY_TO_POSE> </APPLY_TO_POSE> <PROTOCOLS>

<Add mover="relax" /> <Add filter_name = "rmsd" /> </PROTOCOLS> <OUTPUT /> </ROSETTASCRIPTS>

Команда запуска:

rosetta/rosetta_source/bin/rosetta_scripts.static.linuxgccrelease -in:file:fullatom -out:file:fullatom -packing:ex1 -no_optH false -flip_HNQ -packing:ex2 -score:weights ref2015.wts -s input.pdb -packing:use_input_sc -parser:protocol het.xml -nstruct 50 -use_input_sc

Протокол 3. Протокол RosettaScripts предсказания К- терминального метионина и оптимизации конформации ^терминальных остатков DED белков

Восстановление N- терминальных метионинов FADD, procaspase-8 и c-FLIP проводилось с использованием модуля remodel пакета Rosetta, с использованием команды

$ROSETTA3/bin/remodel.static.linuxgccrelease -s heterodimer.pdb -remodel:blueprint input.bp -extrachi_cutoff 1 -ex1 -ex2 -num_trajectory 10 -save_top 1 -overwrite -remodel:no_jumps

Первые строки blueprint файла (input.bp) для белка FADD: 1 x D PIKAA M 1 x H PIKAA D

Первые строки blueprint файла (input.bp) для белка c-FLIP: 1 x D PIKAA M 1 x H PIKAA S

Первые строки blueprint файла (input.bp) для белка прокаспаза-8: 1 x D PIKAA M 1 x H PIKAA D

Оптимизация конформации N- терминальных участков проводилось с использованием следующего протокола RosettaScripts:

<ROSETTASCRIPTS> <SCOREFXNS> <ScoreFunction name="ref15s" weights="ref2015.wts" > </ScoreFunction> </SCOREFXNS> <RESIDUE_SELECTORS> </RESIDUE_SELECTORS> <TASKOPERATIONS> <RestrictToRepacking name="repackonly" /> <IncludeCurrent name="ic" /> </TASKOPERATIONS> <FILTERS> </FILTERS> <MOVERS>

<FastRelax name="relax" scorefxn="ref15s" repeats="8" task_operations="repackonly,ic">

<MoveMap chi="true" bb="false" jump = "1" > <Span begin=" 1" end="3" chi="1" bb="1" /> <Jump number="1" setting="0" /> </MoveMap>

</FastRelax> </MOVERS> <APPLY_TO_POSE> </APPLY_TO_POSE> <PROTOCOLS>

<Add mover="relax" /> </PROTOCOLS> <OUTPUT /> </ROSETTASCRIPTS>

Команда запуска:

rosetta/rosetta_source/bin/rosetta_scripts.static.linuxgccrelease -in:file:fullatom -out:file:fullatom -packing:ex1 -no_optH false -flip_HNQ -packing:ex2 -score:weights ref2015.wts -s input.pdb -packing:use_input_sc -parser:protocol met.xml -nstruct N -use_input_sc

Протокол 4. Протокол Ко8еМа8спр18 белок-белок докинга и оценки энергии взаимодействия субъединиц

<ROSETTASCRIPTS> <SCOREFXNS> <ScoreFunction name="ref15sfxn" weights="ref2015.wts" > <Reweight scoretype="hbnet" weight="1.0" /> <Reweight scoretype="buried_unsatisfied_penalty" weight="1.0" /> </ScoreFunction>

<ScoreFunction name="ref15s" weights="ref2015.wts" > </ScoreFunction> </SCOREFXNS> <RESIDUE_SELECTORS> </RESIDUE_SELECTORS> <TASKOPERATIONS> <RestrictToInterfaceVector name="rtiv" chain1_num="1" chain2_num="2" CB_dist_cutoff="15.0" />

<RestrictToRepacking name="repackonly" /> </TASKOPERATIONS> <FILTERS> </FILTERS> <MOVERS>

<FastRelax name="relax_interface" scorefxn="ref15sfxn" repeats = "1" task_operations="repackonly">

<MoveMap chi="true" bb="false" jump = "0" > </MoveMap>

</FastRelax>

<Docking name="dock_high" score_low="score_docking_low" score_high="ref15sfxn" fullatom="1" local_refine="1" optimize_fold_tree=" 1" conserve_foldtree="0" design="0" task_operations="rtiv" jumps="1"/> <MinMover name="min" scorefxn="ref15s" chi="1" bb="1" jump="1" tolerance="0.01" />

<InterfaceAnalyzerMover name="fullanalyze" scorefxn="ref15sfxn" packstat="0" pack_input="1" jump="1" tracer="0" use_jobname="1" resfile="0" /> </MOVERS> <APPLY_TO_POSE> </APPLY_TO_POSE> <PROTOCOLS> <Add mover_name="relax_interface" /> <Add mover="dock_high" /> <Add mover="min" /> <Add mover="fullanalyze" /> </PROTOCOLS> <OUTPUT /> </ROSETTASCRIPTS>

Команда запуска:

rosetta/rosetta_source /bin/rosetta_scripts.static.linuxgccrelease -in:file:fullatom -out:file:fullatom -packing:ex1 -packing:ex2 -score:weights ref2015.wts -s input.pdb -packing:use_input_sc -extrachi_cutoff 0 -parser:protocol docking.xml -partners A_B -nstruct N -docking -partners A_B -dock_pert 0 0 -dock_mcm_trans_magnitude 0.5 -dock_mcm_rot_magnitude 0.1 -docking_local_refine -run:max_retry_job 10 -use_input_sc