Новый способ направленной доставки онкотоксического белка апоптина с помощью цитотоксических Т-лимфоцитов человека для терапии злокачественных форм рака молочной железы тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.03, кандидат наук Лежнин Юрий Николаевич

• Лежнин Юрий Николаевич
• кандидат наук
• 2017

Оглавление диссертации кандидат наук Лежнин Юрий Николаевич

Введение

Глава 1. Обзор литературы

1.1. Онкотоксические белки

1.1.1. Онкотоксические белки невирусного происхождения

1.1.1.1. TRAIL

1.1.1.2. MDA7

1.1.1.3. HAMLET

1.1.2. Онкотоксические белки вирусной природы

1.1.2.1. Белок аденовируса E4orf4

1.1.2.2. Белок парвовируса NS1

1.1.2.3. Белок вируса анемии кур - Апоптин (VP3)

1.1.2.3.1. Структура и характеристика апоптина

1.1.2.3.2. Механизмы апоптин-опосредованной клеточной гибели

1.1.2.3.3. Фосфорилирование апоптина, как ключевое событие обеспечивающее его противоопухолевый потенциал

1.1.2.3.4. Практическое применение апоптина

1.2. Клеточная иммунотерапия

1.2.1. Терапия с использованием клеток адаптивного иммунитета

1.2.1.1. Дендритно-клеточные вакцины

1.2.1.2. Т-клеточная терапия

1.3. Современные проблемы иммунотерапии

1.4. Заключение

Глава 2. Материалы и методы

2.1. Оборудование

2.2. Реактивы

2.3. Реагенты, антитела и наборы

2.4. Растворы и среды

2.5. Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

2.6. Рестрикция

2.7. Лигирование

2.8. Приготовление химически компетентных клеток E.coli

2.9. Трансформация клеток E.coli

2.10 Выделение плазмидной ДНК

2.11. Выделение тотальной РНК

2.12. Упаковка и очистка лентивирусных частиц

2.13. Определение титра лентивирусных частиц

2.14. Иммуноцитохимическое окрашивание клеток

2.15. ПААГ-электрофорез и иммуноблоттинг белков

2.16. Работа с эукариотическими клетками

2.17. Выделение отдельных популяций клеток

из периферической венозной крови человека

2.18. Активация презентации опухоль-ассоциированного

антигена HER2/neu дендритными клетками человека

2.19. Определение фенотипического профиля

и морфологии зрелых дендритных клеток человека

2.20. Проточная цитометрия и подготовка образцов

2.21. Праймирование цитотоксических Т-лимфоцитов in vitro

и анализ цитотоксического потенциала

2.22. Лентивирусная трансдукция активированных ЦТЛ

2.23. Исследование эффективности модифицированных Т-лимфоцитов на ксенографтной модели рака молочной железы с использованием иммунодефицитных мышей линии nude

2.24. Статистический анализ

Глава 3. Результаты и обсуждение

3.1. Создание рекомбинантной системы межклеточного транспорта онкотоксического белка апоптина на основе лентивирусных векторов

3.2. Выбор чувствительной культуры для определения цитотоксического потенциала системы межклеточного транспорта апоптина

3.3. Предварительный анализ цитотоксического потенциала межклеточной системы доставки рекомбинантного онкотоксического белка апоптина в культуре клеток in vitro

3.4. Поиск способов оптимальной доставки и экспрессии рекомбинантной генетической конструкции, содержащей последовательности сигнальных пептидов и апоптина, в первичной культуре цитотоксических CD8+ Т-лимфоцитов человека

3.5. Разработка способа активации модифицированных Т-лимфоцитов in vitro против клеток аденокарциномы молочной железы - MCF7, без снижения уровня экспрессии рекомбинантного апоптина

3.6. Исследование цитотоксического потенциала модифицированных Т-лимфоцитов человека на модели подкожных ксенографтов на иммунодефицитных мышах

3.6. Выводы

Список литературы

Список сокращений и условных обозначений

AIF - apoptosis inducing factor (апоптоз-индуцирующий фактор);

APC/C - anaphase promoting complex (комплекс стимуляции анафазы);

CAR - chimeric antigen receptor (химерный антигенный рецептор);

CMV - промотор цитомегаловируса;

DD - death domain (домен смерти);

DED - death-effector domain (домен эффектора смерти);

E. coli - Escherichia coli;

EF1alpha - фактор элонгации трансляции 1 alpha (в данном случае EF1alpha - промоторный регион);

FADD - Fas-associated DD-protein (белок, взаимодействующий с доменом смерти Fas-рецептора);

FBS - fetal bovine serum (эмбриональная телячья сыворотка); FITC - флуоресцеин изотиоцианат;

GLuc - cекреторный пептид люциферазы Gaussia princeps

HAMLET - Human Alpha-lactalbumin Made LEthal to Tumor cells (онкотоксический белок - представляет собой комплекс альфа-лактальбумина с олеиновой кислотой);

HEPES - 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid (4-(2-оксиэтил) 1 -пиперазинэтансульфоновая кислота);

HER2 - epidermal growth factor receptor 2 (рецептор

человеческогоэпидермального фактора роста 2);

LRS - leucin rich sequence (последовательность обогащенная остатками лейцина);

MHCI/II - молекулы главного комплекса гистосовместимости I/II типа; Nf-кВ - nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells; (ядерный фактор активации В-клеток);

NLS - nuclear localization signal (сигнал ядерной локализации);

NES - nuclear export signal (сигнал ядерного экспорта);

O.D. - optical density (оптическая плотность);

PBS - phosphate buffered saline (натрий-фосфатный буфер);

PBST - Phosphate Buffered Saline (PBS) solution with the detergent Tween 20; (натрий-фосфатный буфер с детергентом Твин 20);

PI - пропидий йодида;

PVDF - Polyvinylidene fluoride (Поливинилиденфторид);

RFP - красный флуоресцентный белок;

TNF - tumor necrosis factor (фактор некроза опухоли);

WPRE - woodchuck hepatitis virus regulatory element (энхансерная область вируса гепатита лесного сурка)

а.о. - аминокислотные остатки;

АДФ - аденозиндифосфат;

АМФ - аденозинмонофосфат;

АТФ - аденозинтрифосфат;

Да, кДа - дальтон, килодальтон;

ДК - дендритные клетки;

нДК - незрелые дендритные клетки

ДДС-Ыа - додецилсульфат натрия;

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота;

кДНК - комплиментарная ДНК;

мРНК - матричная РНК;

ОТ-ПЦР - полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией;

о. е. - оптические единицы;

П - приложение;

п.н. - пары нуклеотидов;

ПААГ - полиакриламидный гель;

ПЦР - полимеразная цепная реакция;

РНК - рибонуклеиновая кислота;

РНКаза - рибонуклеаза;

Трис - 2-Амино-2-(гидроксиметил)-1,3-пропандиол гидрохлорид; ЦТЛ - цитотоксические Т-лимфоциты;

Введение

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Новый способ направленной доставки онкотоксического белка апоптина с помощью цитотоксических Т-лимфоцитов человека для терапии злокачественных форм рака молочной железы»

Актуальность темы исследования.

В современной онкологии все большее значение приобретают высокотехнологичные и безопасные методы лечения, направленные на достижение максимального терапевтического эффекта с минимальным снижением качества жизни пациента. Одним из таких методов является клеточная иммунотерапия, также известная как терапия противораковыми вакцинами.

Данный метод заключается во введении пациенту популяций иммунных клеток, обладающих прямым противоопухолевым действием, либо модифицированных антиген-презентирующих клеток, способных «обучить» собственные иммунные клетки пациента распознавать маркеры опухоли. Впервые такой вид иммунотерапии был применен в клинической практике сравнительно недавно: в 2010-м году компания Dendrion Corporation разработала и успешно испытала вакцину на основе дендритных клеток для лечения рака простаты. Сейчас практические возможности клеточной иммунотерапии не ограничиваются использованием дендритных клеток: разрабатываются методики использования макрофагов, Т-хелперных и цитотоксических Т-лимфоцитов (ЦТЛ), натуральных киллеров и других типов клеток иммунной системы. Однако зачастую использование простых клеток иммунной системы и даже их модифицированных вариантов малоэффективно благодаря наличию сложных механизмов иммуносупрессии и маскировки, которыми обладают некоторые типы трансформированных клеток. Поэтому актуальной задачей является создание новых подходов клеточной терапии, способных избирательно и эффективно поражать опухолевые клетки, несмотря на низкий статус системного иммунного ответа.

Многие современные подходы клеточной иммунотерапии имеют своей целью создание модифицированных клеток той или иной популяции иммунитета, которые могли бы распознавать опухолевые клетки. Так, вершиной современной биотехнологии стала разработка химерных Т-клеточных рецепторов (chimeric antigen receptor - CAR), способных распознавать практически любой специфический антиген. Однако даже такая технология имеет ряд значительных ограничений, главным из которых является наличие специфических маркеров не только на поверхности опухолевых клеток, но и на поверхности нормальных клеток, в результате чего могут возникнуть тяжелые побочные эффекты. Модификации сигнальных областей химерных рецепторов, позволяющие снизить частоту возникновения нежелательных реакций, приводят также и к снижению цитотоксического потенциала модифицированных иммунных клеток. Преодолеть эту проблему предлагается путем создания генетически модифицированных клеток, экспрессирующих онкотоксические молекулы и обеспечивающих их адресную доставку к опухолевым клеткам.

Одним из наиболее активно исследуемых на сегодняшний день вариантов онколитических белков является белок вирусного происхождения - апоптин (VP3). Апоптин способен вызывать p53-независимый апоптоз опухолевых клеток, при этом не воздействуя на нормальные, здоровые клетки. Использование апоптина в клинических испытаниях ограничено исключительно местным применением вследствие возникновения иммунного ответа на прямое введение белка в организм пациента, поэтому апоптин применяют для лечения поверхностных опухолей на коже и слизистых оболочках. Расширение области применения апоптина является актуальной проблемой, поиски решения которой лежат на пересечении различных иммунотерапевтических подходов.

Разработка нового подхода клеточной терапии на основе цитотоксических Т-лимфоцитов, экспрессирующих онкотоксический белок апоптин, и поиск оптимальных способов его доставки к клеткам опухоли является важной задачей, решение которой позволит создать новый протокол иммунотерапии, перспективный для лечения социально значимых онкопатологий, таких как агрессивные формы рака молочной железы, а также позволит создать общую методическую базу для дальнейшего использования других онкотоксических белков и онколитических вирусов.

Степень разработанности темы исследования.

На сегодняшний день исследование механизмов действия

онкотоксических белков и возможность их применения в терапии

онкопатологий находится в ряду наиболее перспективных направлений

исследования в биологии и медицине. В настоящее время известно около

семи различных онкотоксических белков, как клеточного, так и вирусного

происхождения, обладающих селективным противоопухолевым

потенциалом. При анализе литературы обнаруживается множество

доклинических испытаний связанных с использованием белков данной

группы, однако пока нет ни одного свидетельства о проведении

клинических исследований [1, 2]. Отсутствие подобных исследований

может объясняться не до конца исследованными молекулярными

механизмами действия онкотоксических белков, а также их высокой

иммуногенностью, в особенности белков вирусного происхождения. Как

правило, онкотоксические белки доставляются к клеткам опухоли в виде

генетических ДНК-конструкций, защищенных с помощью различных

соединений [3, 4]. Однако подобная методика не обеспечивает точность

доставки препарата. Подобную проблему можно решить экспрессией

онкотоксического белка в клетках иммунной системы, специально

10

нацеленных на опухолевые клетки. Аналогичный способ используется, как правило, для доставки иммуностимулирующих молекул в очаг опухолеобразования, с целью привлечь и активировать наивные клетки иммунитета для борьбы с клетками опухоли [5, 6]. Таким образом, объединение двух терапевтических подходов может решить проблемы связанные с доставкой препарата онкотоксического белка к опухоли. Анализ доступной литературы показал отсутствие каких-либо работ в данном направлении.

Цели и задачи

Целью настоящей работы являлось создание оптимальной системы межклеточного переноса онкотоксического вирусного белка апоптина и изучение возможности его направленной доставки к опухолевым клеткам аденокарциномы молочной железы, обладающих повышенным уровнем экспрессии RIL (PDLIM4), с помощью цитотоксических Т-лимфоцитов человека.

В задачи работы входило:

1) Создание рекомбинантной системы секреции-интернализации онколитического белка апоптина на основе лентивирусных векторов:

а) Выбор оптимальной пары сигнальных пептидов клеточной секреции и транспорта;

б) Изучение свойств пар-кандидатов на иммортализованных линиях in vitro

2) Поиск способов оптимальной доставки и экспрессии рекомбинантной генетической конструкции, содержащей последовательности сигнальных пептидов и апоптина, в первичной культуре цитотоксических CD8+ Т-лимфоцитов человека;

3) Разработка способа активации модифицированных Т-лимфоцитов in vitro против клеток аденокарциномы молочной железы без снижения их экспрессионного потенциала.

4) Первичный анализ противоопухолевого потенциала модифицированных ЦТЛ, экспрессирующих онкотокический белок апоптин, in vivo, на модели подкожных ксенографтов на иммунодефицитных мышах линии nude.

Научная новизна и практическая значимость

Впервые показана возможность доставки онкотоксического белка апоптина с помощью клеток иммунной системы, в частности с помощью цитотоксических CD8+ Т-лимфоцитов человека (ЦТЛ). Показана возможность создания комбинированной терапии с использованием клеточных вакцин и онкотоксических белков для лечения солидных типов рака, недоступных для одиночной терапии онкотоксическими белками вирусного происхождения.

Впервые показана возможность использования клеток иммунной системы, как механизма адресной доставки противоопухолевых белковых препаратов к очагам опухолеообразования.

Положения, выносимые на защиту

1. Подобран наиболее эффективный сигнал для секреции рекомбинантного апоптина. Анализ локализации апоптина на модели аденокарциномы молочной железы (MCF7) показал, что апоптин способен транспортироваться и накапливаться в клетках-мишенях, вызывая впоследствии их апоптоз.

2. Подобраны оптимальные условия трансдукции и экспрессии

генетической конструкции GLuc-TAT-Apoptin в цитотоксических Т-

лимфоцитах человека. Проведено сравнение различных промоторных

12

регионов на экспрессию целевого белка. Показано, что замена конститутивного вирусного промотора СМУ на клеточный промотор ЕБШрИа увеличивает экспрессию белка в несколько раз.

3. Разработана универсальная хэлперная конструкция рК8У-Яеу-Т2Л-Урх, обеспечивающая наработку лентивирусных частиц, содержащих в структуре капсида белок Урх, что позволяет поднять уровень заражения дендритных клеток человека с 8 до 21%.

4. Показано, что праймирование трансгенных цитотоксических Т-лимфоцитов с помощью антиген-презентирующих дендритных клеток не оказывает негативного влияния на экспрессию рекомбинантного белка и позволяет увеличить их селективность по отношению к опухолевым клеткам.

5. Создана методическая база для дальнейшего использования Т-клеток в доставке онколитических белков, а также ряда онкотоксических вирусов.

6. Проведены предварительные опыты по тестированию модифицированных цитотоксических Т-лимфоцитов на модели подкожных ксенографтов опухолевой линии МСБ7, которые продемонстрировали терапевтический эффект оказываемый модифицированными Т-клетками.

Глава 1. Обзор литературы 1.1 Онкотоксические белки

Онкотоксические белки представляют собой довольно небольшую группу специфических молекул, куда входят некоторые виды цитокинов, искусственно модифицированные секретируемы белки, а также ряд белков вирусного происхождения. Последние обладают естественной способностью, воздействуя на измененные в раковых клетках компоненты сигнальных и метаболических путей, избирательно подавлять их пролиферацию или вызывать апоптоз, не влияя при этом на клетки в норме. Спектр действия большинства онкотоксических белков весьма широк - чувствительны к ним опухоли, находящиеся в разных тканях и на различных стадиях опухолевой прогрессии. Если учесть еще и высокую эффективность действия, становится понятным, почему онкотоксические белки считают перспективным направлением в современной противораковой терапии. Еще один важный момент противоопухолевого действия некоторых онкотоксических белков - их способность вызывать р53-независимый апоптоз раковых клеток, что важно в связи с высокой частотой (до 50%) инактивирующих мутаций гена р53 в опухолях человека. В то же, время на сегодняшний момент знаний о механизмах действия онкотоксических белков недостаточно для того, чтобы говорить об их внедрении в клинику. В настоящее время исследование онкотоксических белков очень актуально и интерес к ним растет. В обзоре будут кратко описаны известные онкотоксические белки, а также уже существующие и возможные варианты их применения в терапии онкопатологий. Кроме того, будет рассмотрена концепция иммунотерапии рака с помощью клеточных технологий, связанных с модификацией клеток иммунной системы, направленной на экспрессию рекомбинантных белков, усиливающих противоопухолевый ответ.

1.1.1 Онкотоксические белки невирусного происхождения

1.1.1.1 TRAIL

TRAIL (TNF related apoptosis inducing ligand) - цитокин семейства факторов некроза опухоли, вызывающий апоптоз опухолевых клеток. TRAIL связывается с рецепторами смерти TRAILR1 (DR4) и TRAILR2 (DR5) и вызывает их олигомеризацию, что приводит к образованию эффекторного комплекса DISC. Этот комплекс ответствен за активацию прокаспазы 8 и инициацию собственно апоптоза [7]. Помимо образования DISC после связывания с TRAIL рецепторы DR4 и DR5 способны вызывать сборку другого комплекса, включающего в себя FADD (Fas associated protein with Death Domain), TRADD (Tumor necrosis factor receptor type 1 associated DEATH domain protein), RIP (Receptor (TNFRSF) interacting serine threonine kinase 1 protein) и каспазу 10. Кроме индукции апоптоза этот комплекс активирует сигнальные пути NFkB, PKB/AKT и MAPK [8]. TRAIL также может связываться с двумя "фальшрецепторами" DcR1 и DcR2, которые не имеют функциональных цитоплазматических доменов и не инициируют передачу сигналов внутрь клетки. Наличие на поверхности клетки большого количества DcR1 и DcR2 может снижать ее чувствительность к TRAIL за счет конкуренции между функциональными и нефункциональными рецепторами [9]. Также имеются данные, что DcR1 и DcR2 могут вызывать устойчивость к TRAIL индуцированному апоптозу, вызывая стимуляцию клеточных путей, направленных на выживание посредством активации NFkB, ERK и p38 [10]. Парадоксально, но злокачественная трансформация, вызванная некоторыми онкогенами, в частности RAS, MYC и HER2, также сопровождается повышением активности каспаз и стимуляцией апоптоза. Причиной этого может быть участие клеточных факторов, контролирующих одновременно передачу пропролиферативных и проапоптозных сигналов. В возникающем в таком случае "ансамбле" стимулирующих и ингибирующих сигналов могут

15

преобладать стимулирующие. Такие клетки обладают повышенной чувствительностью к TRAIL индуцированному апоптозу. С другой стороны, подавление проапоптозных сигналов снижает чувствительность клеток к TRAIL. К снижающим чувствительность перестройкам относятся конститутивная активация NFkB, PI3K, гиперэкспрессия cFLIP, XIAP, а также противо-апоптозных белков семейства Bcl2 [11].

Избирательная чувствительность именно опухолевых клеток к TRAIL, видимо, связана с высоким содержанием на их поверхности рецепторов DR4 и DR5 [12], что обусловлено усилением их транскрипции под действием некоторых онкогенов, в частности RAS, и мутациями BRAF. Роль самих DR4 и DR5 в функционировании раковых клеток достаточно противоречива и не до конца изучена - стимуляция этих рецепторов смерти может вызывать апоптоз в некоторых видах раковых клеток и в то же время в других видах, в частности в опухолях толстого кишечника, стимулировать инвазивность и метастатическую активность клеток под влиянием KRAS. Опухоли второго типа хорошо реагируют на терапию при помощи TRAIL [13].

Важная особенность TRAIL - отсутствие зависимости его функции от

статуса опухолевого супрессора p53. Хотя активация p53 потенциирует

действие TRAIL за счет активации экспрессии рецептора DR4,

чувствительность к TRAIL сохраняется и у клеток, в которых p53 не

активен по причине мутаций или делеций [14]. Рекомбинантный TRAIL, а

также несколько его функциональных аналогов - моноклональных

антител, агонистов рецепторов DR4 и DR5 - в настоящее время проходят

клинические испытания в качестве противораковых препаратов. Хотя

предварительные результаты испытаний свидетельствуют о низкой

эффективности монотерапии TRAIL и его аналогами, вполне вероятно, что

препараты этого типа могут быть успешно применены в качестве

компонентов комплексной терапии - вместе с традиционными

16

химиотерапевтическими средствами [15]. В пользу этого говорят данные о повышении чувствительности устойчивых к TRAIL линий клеток после обработки субтерапевтическими дозами химиотерапевтических препаратов, которые подавляют антиапоптозные сигнальные пути или усиливают активность каспаз. Так, в линиях клеток неходжкинских лимфом устойчивость к TRAIL обусловлена повышенной экспрессией противоапоптозных белков: Mcll, Bcl2 и Survivin. Обработка таких клеток субтоксичными концентрациями кверцетина - препарата, снижающего экспрессию белка Survivin, - восстанавливала их способность входить в апоптоз под действием TRAIL [16]. Восстановление чувствительности к TRAIL и его аналогам наблюдалось также после подавления сигнального пути PI3K Akt при помощи рапамицина, который селективно ингибирует белок mTOR [17]. Ингибитор сигнального пути RafMEKERK гелданамицин и его аналог, 17 AAG, также способны потенциировать действие TRAIL, в частности, в устойчивых к нему линиях глиом [18].

1.1.1.2 MDA7

Белок MDA7/IL24 (melanoma differentiation associated7/interleukin24) входит в семейство интерлейкина 10, так как имеет характерный для этого семейства структурный мотив [19]. Экспрессия MDA7/IL24 характерна для меланоцитов. Иммунохимическим анализом выявлен высокий уровень экспрессии MDA7/IL24 в меланоцитах и клетках меланомы на ранних стадиях развития заболевания. Напротив, в клетках инвазивной и метастазирующей меланомы экспрессия MDA7/IL24 полностью отсутствует. Искусственная экспрессия рекомбинантного MDA7/IL24 в клетках метастазирующей меланомы приводит к остановке роста опухоли и ее регрессии - это подтверждает гипотезу, что MDA7/IL24 участвует в формировании злокачественного фенотипа клеток меланомы.

Результаты исследования механизма опухолеспецифического апоптоза указывают на то, что при связывании MDA7 с BiP/GRP78, белком семейства шаперонов Hsp70, происходит фосфорилирование фактора инициации трансляции eIF2 с последующим подавлением экспрессии противоапоптозных белков, таких как BclXL, Meli и cFLIP (Рисунок 1) [20].

Рисунок 1. Механизм действия MDA7. 1 - Взаимодействие BiP (binding immunoglobulin protein) и MDA7 приводит к фосфорилированию эукариотического фактора инициации 2 (eIF2) и, как следствие,

прекращению процессов трансляции; 2 - MDA7 ингибирует киназу Akt, что приводит к активации проапоптозных белков Bim и Bad, которые, воздействуя на митохондрию, включают каспазный каскад и апоптоз клетки; 3 - индуцированная MDA7 активация транскрипционного фактора регуляции интерферона (IRF) приводит к экспрессии ß-интерферона, активации PBK-киназы, проапоптозных белков Bad и Bid и, в конечном счете, к апоптозу.

1.1.1.3 HAMLET

HAMLET (human alpha lactalbumin made lethal to tumor cells) относится

к белковым комплексам, которые способны вызывать апоптоз

преимущественно в раковых клетках. Белковый компонент HAMLET -

производное а-лактальбумина, одного из главных компонентов женского

молока. Обнаружено, что мультимер а-лактальбумина вызывает апоптоз в

культуре клеток карциномы легкого, не приводя к гибели нормальных

клеток [21]. В ходе дальнейших исследований был выявлен активный

компонент HAMLET, ответственный за противоопухолевую активность -

им оказался не сам а-лактальбумин, а его комплекс с олеиновой кислотой.

Олеиновая кислота выступает в качестве кофактора, необходимого для

стабилизации неструктурированного а-лактальбумина [22]. Белковый

компонент комплекса HAMLET способствует доставке цитотоксичной

олеиновой кислоты внутрь опухолевых клеток через плазматическую

мембрану [23]. Противоопухолевая активность HAMLET подтверждена в

исследованиях in vivo - на животных и человеке. При лечении больных

глиобластомой и раком мочевого пузыря наблюдалась значительная

регрессия опухолей без каких-либо побочных эффектов [24, 25]. Что

касается структуры комплекса, то замена жирной кислоты в его составе

вызывает значительные изменения его активности. Установлено, что

наиболее эффективными кофакторами а-лактальбумина служат олеиновая

19

(C18:1:9 eis) и вакцениевая (C18:1: 11 eis) кислоты. Замена олеиновой кислоты на С16 и С20 cis-ненасыщенные жирные кислоты также приводит к формированию комплексов с а-лактальбумином, хотя их активность сильно снижена. Транс-жирные кислоты с аналогичной длиной цепи и насыщенные жирные кислоты вообще не способны образовывать комплексы с а-лактальбумином [26]. Образование специфического комплекса с жирной кислотой определенной структуры, по всей видимости, обусловлено структурой соответствующего участка а-лактальбумина, где реализуется это связывание.

На сегодняшний день выявлено более 40 линий опухолевых клеток, чувствительных к комплексу HAMLET. Механизм действия HAMLET сильно отличается от других онколитических белков. Не до конца понятна его способность отличать раковые клетки от нормальных дифференцированных клеток. Недавно установлено, что олеиновая кислота, входящая в состав комплекса, способна взаимодействовать с фосфатидилсерином и О-гликозилированным муцином на мембране клеток - эти молекулы обильно представлены именно на раковых клетках [27] (Рисунок 2). Механизм транспорта HAMLET в клетку также пока не выяснен. После попадания в клетку HAMLET постепенно транслоцируется в ядро. До этого, находясь в цитоплазме, комплекс способен вызвать протеотоксический стресс (или стресс эндоплазматического ретикулума) -из-за неупорядоченной структуры.

Большой интерес представляет и устойчивость комплекса к

протеасомной деградации. Взаимодействуя с 20S протеасомой белок

HAMLET подавляет ее активность за счет модификаций каталитической и

структурной субъединиц. Это приводит не только к неспособности клетки

разрушать белок HAMLET, но прекращает также удаление многих

остальных субстратов протеасом, что приводит к их накоплению и к еще

большему протеотоксическому стрессу [28] (Рисунок 2). Последующая

20

транслокация и накопление комплекса в ядре характерна преимущественно для раковых клеток, в нормальных же клетках количество ядерного HAMLET крайне мало.

Накапливаясь в ядре, HAMLET взаимодействует с гистонами H2A, H2B, H3 и H4 и подавляет транскрипцию, что приводит к активации р53 [29]. Наряду с таким специфическим механизмом HAMLET активирует митохондриальный путь апоптоза, который сопровождается выходом цитохрома С в цитозоль и активацией каспазного каскада. Стоит отметить, что повышенная экспрессия противоапоптозных белков семейства Bcl-2 или мутантных р53 не приводят к подавлению апоптоза, вызванного комплексом HAMLET [30]. Помимо апоптоза, комплекс HAMLET способен запускать макроаутофагию - катаболический процесс, при котором участки цитоплазмы и органеллы окружаются двойной мембраной и доставляются в лизосомы, где подвергаются перевариванию. Этот процесс обычно запускается под действием ряда внешних и внутренних стимулов, включающих голодание, повреждения органелл, образование комплексов денатурированных белков и др. [31].

Таким образом, HAMLET обладает широким спектром действия и запускает разнообразные процессы, которые могут приводить к гибели опухолевых клеток. В связи с этим комплекс HAMLET представляет интерес в качестве потенциального инструмента противоопухолевой биотерапии (Рисунок 2).

Апоптоз

Рисунок 2. Механизм действия HAMLET. 1 - Накапливаясь в ядре,

HAMLET связывается с гистонами H2A, H2B, H3, H4, тем самым

ингибируя процессы репликации и транскрипции; 2 - за счет своей

неупорядоченной пространственной структуры HAMLET приводит к

протеотоксическому стрессу и запуску компенсаторных механизмов,

которые вызывают образование активных форм кислорода (АФК), которые

в дальнейшем приводят к окислительному стрессу; 3 - HAMLET

ингибирует 20S протеасому, усиливая протеотоксический стресс; 4 -

22

воздействуя на митохондрию, HAMLET способствует высвобождению цитохрома С и запуску апоптоза с участием каспаз.

1.1.2 Онкотоксические белки вирусного происхождения 1.1.2.1 Белок аденовируса - E4orf4

Помимо апоптина идентифицировано еще несколько вирусных белков, обладающих онкотоксическим действием. E4orf4 - белок аденовируса, который регулирует множество процессов в ходе вирусного цикла. E4orf4 регулирует экспрессию ранних генов вируса, индуцирует снижение уровня фосфорилирования различных вирусных и клеточных белков, участвует в альтернативном сплайсинге аденовирусных мРНК, а также влияет на общий статус трансляции через сигнальный путь mTOR [32, 33]. При экспрессии в клетках белок E4orf4 вызывает гибель трансформированных клеток по неклассическому, независимому от каспаз, варианту апоптоза. К белкам-партнерам E4orf4 относятся фосфатаза PP2A, киназы семейства Src, APC/C и УДФаза телец Гольджи NTPDASE4 [34, 35].

Основным компонентом комплексов E4orf4, который влияет на его способность вызывать гибель клеток, считается фосфатаза PP2A. Связывание с PP2A необходимо для выполнения большинства функций E4orf4. PP2A состоит из структурной (А), каталитической (С) и регуляторной (В) субъединиц. Каждая из субъединиц представлена несколькими изоформами, а их сочетание определяет характер активности ферментного комплекса. Например, взаимодействие E4orf4 с PP2A, содержащей регуляторную субъединицу B55, сопровождается остановкой клеточного цикла и апоптозом, хотя комплекс, содержащий регуляторную субъединицу B56, таких событий не вызывает [36, 37].

Механизм индукции клеточной смерти под действием белка E4orf4

включает подавление функции АТФ-зависимых комплексов участвующих

23

в перестройке (ремоделировании) хроматина. Такие комплексы обеспечивают доступ к плотно упакованным областям генома для осуществления репарации, репликации ДНК и регуляции транскрипции. Один из них, ACF (ATP-utilizing chromatin assembly and modifying factor), состоит из белка SNF2h (АТФазы семейства ISWI) и регуляторной субъединицы Acfl/BazlA. Установлено, что функции ACF1 требуются для репликации [38] и репарации двухцепочечных разрывов ДНК [39]. Образование комплекса между PP2A и E4orf4 способствует взаимодействию между PP2A и Acfl/BazlA, предотвращая тем самым связывание PP2A с SNF2h и ACF. Высвободившийся белок SNF2h образует альтернативный комплекс с регуляторным фактором WSTF. Белок WSTF, в свою очередь, входит в состав регуляторного комплекса WITCH, который в ответ на повреждения ДНК фосфорилирует гистон H2A.X по Tyr142. Такая модификация гистона H2A.X способствует переключению реакции клетки - с репарации повреждений ДНК на индукцию клеточной смерти. Вызванное связыванием белка E4orf4 изменение функциональной активности комплекса Acfl/BazlA и фосфатазы PP2A приводит к увеличению уровня комплекса SNF2h-WSTF и снижению содержания комплекса SNF2h-Acf1, что также приводит к переключению клетки на индукцию апоптоза, а не активацию процессов репарации [39]. Заметим, что, несмотря на понимание многих деталей механизма запуска клеточной смерти, пока нет ответа на вопрос об избирательности действия белка E4orf4 на опухолевые клетки.

1.1.2.2 Белок парвовируса - NS1

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Лежнин Юрий Николаевич, 2017 год

Список литературы

1. Louis, C.U., et al., Antitumor activity and long-term fate of chimeric antigen receptor-positive Tcells in patients with neuroblastoma. Blood, 2011. 118(23): p. 6050-6.

2. Backendorf, C. and M.H. Noteborn, Apoptin towards safe and efficient anticancer therapies. Adv Exp Med Biol, 2014. 818: p. 39-59.

3. Shoae-Hassani, A., et al., lambda Phage nanobioparticle expressing apoptin efficiently suppress human breast carcinoma tumor growth in vivo. PLoS One, 2013. 8(11): p. e79907.

4. Xu, D., et al., pH-sensitive degradable nanoparticles for highly efficient intracellular delivery of exogenous protein. Int J Nanomedicine, 2013. 8: p. 3405-14.

5. Sharpe, M. and N. Mount, Genetically modified T cells in cancer therapy: opportunities and challenges. Dis Model Mech, 2015. 8(4): p. 337-50.

6. Ribas, A., Genetically modified dendritic cells for cancer immunotherapy. Curr Gene Ther, 2005. 5(6): p. 619-28.

7. Oberst, A., et al., Inducible dimerization and inducible cleavage reveal a requirement for both processes in caspase-8 activation. J Biol Chem, 2010. 285(22): p. 16632-42.

8. Falschlehner, C., et al., TRAIL signalling: decisions between life and death. Int J Biochem Cell Biol, 2007. 39(7-8): p. 1462-75.

9. Sheridan, J.P., et al., Control of TRAIL-induced apoptosis by a family of signaling and decoy receptors. Science, 1997. 277(5327): p. 818-21.

10. Shirley, S., A. Morizot, and O. Micheau, Regulating TRAIL receptor-induced cell death at the membrane : a deadly discussion. Recent Pat Anticancer Drug Discov, 2011. 6(3): p. 311-23.

11. Oikonomou, E. and A. Pintzas, The TRAIL of oncogenes to apoptosis. Biofactors, 2013. 39(4): p. 343-54.

12. Sayers, T.J. and W.J. Murphy, Combining proteasome inhibition with TNF-related apoptosis-inducing ligand (Apo2L/TRAIL) for cancer therapy. Cancer Immunol Immunother, 2006. 55(1): p. 76-84.

13. Smyth, M.J., et al., Tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL) contributes to interferon gamma-dependent natural killer cell protection from tumor metastasis. J Exp Med, 2001. 193(6): p. 661-70.

14. Ashkenazi, A., et al., Safety and antitumor activity of recombinant soluble Apo2 ligand. J Clin Invest, 1999. 104(2): p. 155-62.

15. Fox, N.L., et al., Tumor Necrosis Factor-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL) Receptor-1 and Receptor-2 agonists for cancer therapy. Expert Opin Biol Ther, 2010. 10(1): p. 1-18.

16. Jacquemin, G., et al., Quercetin-mediated Mcl-1 and survivin downregulation restores TRAIL-induced apoptosis in non-Hodgkin's lymphoma B cells. Haematologica, 2012. 97(1): p. 38-46.

17. Panner, A., et al., mTOR controls FLIPS translation and TRAIL sensitivity in glioblastoma multiforme cells. Mol Cell Biol, 2005. 25(20): p. 8809-23.

18. Siegelin, M.D., A. Habel, and T. Gaiser, 17-AAG sensitized malignant glioma cells to death-receptor mediated apoptosis. Neurobiol Dis, 2009. 33(2): p. 243-9.

19. Pestka, S., C.D. Krause, and M.R. Walter, Interferons, interferon-like cytokines, and their receptors. Immunol Rev, 2004. 202: p. 8-32.

20. Yacoub, A., et al., MDA-7 regulates cell growth and radiosensitivity in vitro of primary (non-established) human glioma cells. Cancer Biol Ther, 2004. 3(8): p. 739-51.

21. Hakansson, A., et al., Apoptosis induced by a human milk protein. Proc Natl Acad Sci U S A, 1995. 92(17): p. 8064-8.

22. Svensson, M., et al., Conversion of alpha-lactalbumin to a protein inducing apoptosis. Proc Natl Acad Sci U S A, 2000. 97(8): p. 4221-6.

23. Nakamura, T., et al., Molecular mechanisms of the cytotoxicity of human alpha-lactalbumin made lethal to tumor cells (HAMLET) and other protein-oleic acid complexes. J Biol Chem, 2013. 288(20): p. 14408-16.

24. Fischer, W., et al., Human alpha-lactalbumin made lethal to tumor cells (HAMLET) kills human glioblastoma cells in brain xenografts by an apoptosis-like mechanism and prolongs survival. Cancer Res, 2004. 64(6): p. 2105-12.

25. Mossberg, A.K., et al., Bladder cancers respond to intravesical instillation of HAMLET (human alpha-lactalbumin made lethal to tumor cells). Int J Cancer, 2007. 121(6): p. 1352-9.

26. Svensson, M., et al., Lipids as cofactors in protein folding: stereo-specific lipid-protein interactions are required to form HAMLET (human alpha-lactalbumin made lethal to tumor cells). Protein Sci, 2003. 12(12): p. 2805-14.

27. Hamada, S. and K. Takeda, Conformational changes of alpha-lactalbumin and its fragment, Phe31-Ile59, induced by sodium dodecyl sulfate. J Protein Chem, 1993. 12(4): p. 477-82.

28. Gustafsson, L., et al., Changes in proteasome structure and function caused by HAMLET in tumor cells. PLoS One, 2009. 4(4): p. e5229.

29. Brest, P., et al., Histone deacetylase inhibitors promote the tumoricidal effect of HAMLET. Cancer Res, 2007. 67(23): p. 11327-34.

30. Svanborg, C., et al., HAMLET kills tumor cells by an apoptosis-like mechanism-cellular, molecular, and therapeutic aspects. Adv Cancer Res, 2003. 88: p. 1-29.

31. Aits, S., et al., HAMLET (human alpha-lactalbumin made lethal to tumor cells) triggers autophagic tumor cell death. Int J Cancer, 2009. 124(5): p. 1008-19.

32. Kleinberger, T. and T. Shenk, Adenovirus E4orf4 protein binds to protein phosphatase 2A, and the complex down regulates E1A-enhancedjunB transcription. J Virol, 1993. 67(12): p. 7556-60.

33. O'Shea, C., et al., Adenoviral proteins mimic nutrient/growth signals to activate the mTOR pathway for viral replication. EMBO J, 2005. 24(6): p. 1211-21.

34. Champagne, C., et al., Activation of adenovirus type 2 early region 4 ORF4 cytoplasmic death function by direct binding to Src kinase domain. J Biol Chem, 2004. 279(24): p. 25905-15.

35. Avital-Shacham, M., R. Sharf, and T. Kleinberger, NTPDASE4 gene products cooperate with the adenovirus E4orf4 protein through PP2A-dependent and -independent mechanisms and contribute to induction of cell death. J Virol, 2014. 88(11): p. 6318-28.

36. Kornitzer, D., R. Sharf, and T. Kleinberger, Adenovirus E4orf4 protein induces PP2A-dependent growth arrest in Saccharomyces cerevisiae and interacts with the anaphase-promoting complex/cyclosome. J Cell Biol, 2001. 154(2): p. 331-44.

37. Shtrichman, R., R. Sharf, and T. Kleinberger, Adenovirus E4orf4 protein interacts with both Balpha and B' subunits of protein phosphatase 2A, but E4orf4-induced apoptosis is mediated only by the interaction with Balpha. Oncogene, 2000. 19(33): p. 3757-65.

38. Collins, N., et al., An ACF1-ISWI chromatin-remodeling complex is required for DNA replication through heterochromatin. Nat Genet, 2002. 32(4): p. 627-32.

39. Brestovitsky, A., et al., The adenovirus E4orf4 protein targets PP2A to the ACF chromatin-remodeling factor and induces cell death through regulation of SNF2h-containing complexes. Nucleic Acids Res, 2011. 39(15): p. 6414-27.

40. Cotmore, S.F. and P. Tattersall, The autonomously replicating parvoviruses of vertebrates. Adv Virus Res, 1987. 33: p. 91-174.

41. Loktev, V.B., et al., [Oncolytic parvoviruses. A new approaches for cancer therapy]. Vestn Ross Akad Med Nauk, 2012(2): p. 42-7.

42. Hristov, G., et al., Through its nonstructural protein NS1, parvovirus H-1 induces apoptosis via accumulation of reactive oxygen species. J Virol, 2010. 84(12): p. 5909-22.

43. Rommelaere, J., et al., Oncolytic parvoviruses as cancer therapeutics. Cytokine Growth Factor Rev, 2010. 21(2-3): p. 185-95.

44. Cotmore, S.F. and P. Tattersall, Parvoviral host range and cell entry mechanisms. Adv Virus Res, 2007. 70: p. 183-232.

45. Op De Beeck, A. and P. Caillet-Fauquet, The NS1 protein of the autonomous parvovirus minute virus of mice blocks cellular DNA replication: a consequence of lesions to the chromatin? J Virol, 1997. 71(7): p. 5323-9.

46. Allaume, X., et al., Retargeting of rat parvovirus H-1PV to cancer cells through genetic engineering of the viral capsid. J Virol, 2012. 86(7): p. 3452-65.

47. Noteborn, M.H., et al., A single chicken anemia virus protein induces apoptosis. J Virol, 1994. 68(1): p. 346-51.

48. Backendorf, C., et al., Apoptin: therapeutic potential of an early sensor of carcinogenic transformation. Annu Rev Pharmacol Toxicol, 2008. 48: p. 143-69.

49. Noteborn, M.H., et al., Characterization of cloned chicken anemia virus DNA that contains all elements for the infectious replication cycle. J Virol, 1991. 65(6): p. 3131-9.

50. Danen-Van Oorschot, A.A., et al., Importance of nuclear localization of apoptin for tumor-specific induction of apoptosis. J Biol Chem, 2003. 278(30): p. 27729-36.

51. Zhang, Y.H., et al., Recombinant Apoptin multimers kill tumor cells but are nontoxic and epitope-shielded in a normal-cell-specific fashion. Exp Cell Res, 2003. 289(1): p. 36-46.

52. Leliveld, S.R., et al., Apoptin protein multimers form distinct higherorder nucleoprotein complexes with DNA. Nucleic Acids Res, 2003. 31(16): p. 4805-13.

53. Rohn, J.L., et al., A tumor-specific kinase activity regulates the viral death protein Apoptin. J Biol Chem, 2002. 277(52): p. 50820-7.

54. Zhuang, S.M., et al., Differential sensitivity to Ad5 E1B-21kD and Bcl-2 proteins of apoptin-induced versus p53-induced apoptosis. Carcinogenesis, 1995. 16(12): p. 2939-44.

55. Burek, M., et al., Apoptin-induced cell death is modulated by Bcl-2 family members and is Apaf-1 dependent. Oncogene, 2006. 25(15): p. 2213-22.

56. Lin, B., et al., Conversion of Bcl-2 from protector to killer by interaction with nuclear orphan receptor Nur77/TR3. Cell, 2004. 116(4): p. 52740.

57. Maddika, S., et al., Cancer-specific toxicity of apoptin is independent of death receptors but involves the loss of mitochondrial membrane

potential and the release of mitochondrial cell-death mediators by a Nur77-dependentpathway. J Cell Sci, 2005. 118(Pt 19): p. 4485-93.

58. Huo, D.H., L.N. Yi, and J. Yang, Interaction with Ppil3 leads to the cytoplasmic localization of Apoptin in tumor cells. Biochem Biophys Res Commun, 2008. 372(1): p. 14-8.

59. Cheng, C.M., et al., The viral death protein Apoptin interacts with Hippi, the protein interactor of Huntingtin-interacting protein 1. Biochem Biophys Res Commun, 2003. 305(2): p. 359-64.

60. Chen, K., et al., A critical role of heat shock cognate protein 70 in Apoptin-induced phosphorylation of Akt. Biochem Biophys Res Commun, 2011. 409(2): p. 200-4.

61. Teodoro, J.G., et al., The viral protein Apoptin associates with the anaphase-promoting complex to induce G2/M arrest and apoptosis in the absence of p53. Genes Dev, 2004. 18(16): p. 1952-7.

62. Guelen, L., et al., TAT-apoptin is efficiently delivered and induces apoptosis in cancer cells. Oncogene, 2004. 23(5): p. 1153-65.

63. Maddika, S., et al., Interaction with PI3-kinase contributes to the cytotoxic activity of apoptin. Oncogene, 2008. 27(21): p. 3060-5.

64. Maddika, S., et al., Unscheduled Akt-triggered activation of cyclin-dependent kinase 2 as a key effector mechanism of apoptin's anticancer toxicity. Mol Cell Biol, 2009. 29(5): p. 1235-48.

65. Jiang, J., et al., Crucial roles for protein kinase C isoforms in tumor-specific killing by apoptin. Cancer Res, 2010. 70(18): p. 7242-52.

66. Pietersen, A.M., et al., Specific tumor-cell killing with adenovirus vectors containing the apoptin gene. Gene Ther, 1999. 6(5): p. 882-92.

67. van der Eb, M.M., et al., Gene therapy with apoptin induces regression of xenografted human hepatomas. Cancer Gene Ther, 2002. 9(1): p. 53-61.

68. Pan, Y., et al., Antitumor effects of a recombinant pseudotype baculovirus expressing Apoptin in vitro and in vivo. Int J Cancer, 2010. 126(11): p. 2741-51.

69. Li, X., et al., Potent anti-tumor effects of a dual specific oncolytic adenovirus expressing apoptin in vitro and in vivo. Mol Cancer, 2010. 9: p. 10.

70. Liu, L., et al., Therapeutic efficacy of an hTERT promoter-driven oncolytic adenovirus that expresses apoptin in gastric carcinoma. Int J Mol Med, 2012. 30(4): p. 747-54.

71. Jin, J.L., et al., PTD4-apoptin protein and dacarbazine show a synergistic antitumor effect on B16-F1 melanoma in vitro and in vivo. Eur J Pharmacol, 2011. 654(1): p. 17-25.

72. Vanbervliet, B., et al., The inducible CXCR3 ligands control plasmacytoid dendritic cell responsiveness to the constitutive chemokine stromal cell-derived factor 1 (SDF-1 )/CXCL12. J Exp Med, 2003. 198(5): p. 823-30.

73. Hsu, F.J., et al., Vaccination of patients with B-cell lymphoma using autologous antigen-pulsed dendritic cells. Nat Med, 1996. 2(1): p. 52-8.

74. Zitvogel, L., et al., Therapy of murine tumors with tumor peptide-pulsed dendritic cells: dependence on T cells, B7 costimulation, and T helper cell 1-associatedcytokines. J Exp Med, 1996. 183(1): p. 87-97.

75. Nestle, F.O., et al., Vaccination of melanoma patients with peptide- or tumor lysate-pulsed dendritic cells. Nat Med, 1998. 4(3): p. 328-32.

76. Breckpot, K., et al., Lentivirally transduced dendritic cells as a tool for cancer immunotherapy. J Gene Med, 2003. 5(8): p. 654-67.

77. Kaplan, J.M., et al., Induction of antitumor immunity with dendritic cells transduced with adenovirus vector-encoding endogenous tumor-associated antigens. J Immunol, 1999. 163(2): p. 699-707.

78. Murphy, G., et al., Phase I clinical trial: T-cell therapy for prostate cancer using autologous dendritic cells pulsed with HLA-A0201-specific peptides from prostate-specific membrane antigen. Prostate, 1996. 29(6): p. 371-80.

79. Holtl, L., et al., Cellular and humoral immune responses in patients with metastatic renal cell carcinoma after vaccination with antigen pulsed dendritic cells. J Urol, 1999. 161(3): p. 777-82.

80. Yu, J.S., et al., Vaccination of malignant glioma patients with peptide-pulsed dendritic cells elicits systemic cytotoxicity and intracranial T-cell infiltration. Cancer Res, 2001. 61(3): p. 842-7.

81. Reichardt, V.L., et al., Idiotype vaccination using dendritic cells after autologous peripheral blood stem cell transplantation for multiple myeloma--a feasibility study. Blood, 1999. 93(7): p. 2411-9.

82. Geiger, J.D., et al., Vaccination of pediatric solid tumor patients with tumor lysate-pulsed dendritic cells can expand specific T cells and mediate tumor regression. Cancer Res, 2001. 61(23): p. 8513-9.

83. Nair, S.K., et al., Induction of tumor-specific cytotoxic T lymphocytes in cancer patients by autologous tumor RNA-transfected dendritic cells. Ann Surg, 2002. 235(4): p. 540-9.

84. Palucka, A.K., et al., Dendritic cells loaded with killed allogeneic melanoma cells can induce objective clinical responses and MART-1 specific CD8+ T-cell immunity. J Immunother, 2006. 29(5): p. 545-57.

85. Chang, D.H., et al., Sustained expansion of NKT cells and antigen-specific T cells after injection of alpha-galactosyl-ceramide loaded mature dendritic cells in cancer patients. J Exp Med, 2005. 201(9): p. 1503-17.

86. Kennedy, R. and E. Celis, Multiple roles for CD4+ T cells in anti-tumor immune responses. Immunol Rev, 2008. 222: p. 129-44.

87. Michie, C.A., et al., Lifespan of human lymphocyte subsets defined by CD45 isoforms. Nature, 1992. 360(6401): p. 264-5.

88. Marcus, A., T. Waks, and Z. Eshhar, Redirected tumor-specific allogeneic T cells for universal treatment of cancer. Blood, 2011. 118(4): p. 975-83.

89. Marks, M.H. and P.S. Rosen, Adult orthodontics: periodontic and cosmetic enhancements. Compendium, 1991. 12(8): p. 584, 586, 588 passim.

90. Yee, C., et al., Adoptive Tcell therapy using antigen-specific CD8+ Tcell clones for the treatment of patients with metastatic melanoma: in vivo persistence, migration, and antitumor effect of transferred T cells. Proc Natl Acad Sci U S A, 2002. 99(25): p. 16168-73.

91. Takayama, T., et al., Adoptive immunotherapy to lower postsurgical recurrence rates of hepatocellular carcinoma: a randomised trial. Lancet, 2000. 356(9232): p. 802-7.

92. Kryczek, I., et al., Phenotype, distribution, generation, and functional and clinical relevance of Th17 cells in the human tumor environments. Blood, 2009. 114(6): p. 1141-9.

93. Woo, E.Y., et al., Regulatory CD4(+)CD25(+) T cells in tumors from patients with early-stage non-small cell lung cancer and late-stage ovarian cancer. Cancer Res, 2001. 61(12): p. 4766-72.

94. Clark, C.E., et al., Dynamics of the immune reaction to pancreatic cancer from inception to invasion. Cancer Res, 2007. 67(19): p. 9518-27.

95. McHugh, R.S. and E.M. Shevach, The role of suppressor T cells in regulation of immune responses. J Allergy Clin Immunol, 2002. 110(5): p. 693-702.

96. Grivennikov, S.I., F.R. Greten, and M. Karin, Immunity, inflammation, and cancer. Cell, 2010. 140(6): p. 883-99.

97. Loo, J.C., et al., Dose-dependent pharmacokinetics of prednisone and prednisolone in man. J Pharm Pharmacol, 1978. 30(11): p. 736.

98. Langrish, C.L., et al., IL-23 drives a pathogenic T cell population that induces autoimmune inflammation. J Exp Med, 2005. 201(2): p. 23340.

99. Harrington, L.E., et al., Interleukin 17-producing CD4+ effector T cells develop via a lineage distinct from the T helper type 1 and 2 lineages. Nat Immunol, 2005. 6(11): p. 1123-32.

100. Aggarwal, S. and A.L. Gurney, IL-17: prototype member of an emerging cytokine family. J Leukoc Biol, 2002. 71(1): p. 1-8.

101. Martin-Orozco, N., et al., T helper 17 cells promote cytotoxic T cell activation in tumor immunity. Immunity, 2009. 31(5): p. 787-98.

102. Muranski, P., et al., Tumor-specific Th17-polarized cells eradicate large established melanoma. Blood, 2008. 112(2): p. 362-73.

103. Sun, J.B., et al., Vaccination with dendritic cells pulsed in vitro with tumor antigen conjugated to cholera toxin efficiently induces specific tumoricidal CD8+ cytotoxic lymphocytes dependent on cyclic AMP activation of dendritic cells. Clin Immunol, 2004. 112(1): p. 35-44.

104. Rosenblatt, J., et al., Generation of tumor-specific T lymphocytes using dendritic cell/tumor fusions and anti-CD3/CD28. J Immunother, 2010. 33(2): p. 155-66.

105. Qu, H.Q., et al., Effect of DC-CIK cell on the proliferation, apoptosis and differentiation of leukemia cells. Asian Pac J Trop Med, 2014. 7(8): p. 659-62.

106. Bohnenkamp, H.R., et al., Breast carcinoma cell lysate-pulsed dendritic cells cross-prime MUC1-specific CD8+ T cells identified by peptide-MHC-class-I tetramers. Cell Immunol, 2004. 231(1-2): p. 112-25.

107. Wang, Y., et al., The combination of dendritic cells-cytotoxic T lymphocytes/cytokine-induced killer (DC-CTL/CIK) therapy exerts immune and clinical responses in patients with malignant tumors. Exp Hematol Oncol, 2015. 4: p. 32.

108. Dembic, Z., et al., Transfer of specificity by murine alpha and beta T-cell receptor genes. Nature, 1986. 320(6059): p. 232-8.

109. Clay, T.M., et al., Efficient transfer of a tumor antigen-reactive TCR to human peripheral blood lymphocytes confers anti-tumor reactivity. J Immunol, 1999. 163(1): p. 507-13.

110. Calogero, A., et al., Retargeting of a T cell line by anti MAGE-3/HLA-A2 alpha beta TCR gene transfer. Anticancer Res, 2000. 20(3A): p. 17939.

111. Aggen, D.H., et al., Single-chain ValphaVbeta T-cell receptors function without mispairing with endogenous TCR chains. Gene Ther, 2012. 19(4): p. 365-74.

112. Cohen, C.J., et al., Enhanced antitumor activity of murine-human hybrid T-cell receptor (TCR) in human lymphocytes is associated with improved pairing and TCR/CD3 stability. Cancer Res, 2006. 66(17): p. 8878-86.

113. Sebestyen, Z., et al., Human TCR that incorporate CD3zeta induce highly preferred pairing between TCRalpha and beta chains following gene transfer. J Immunol, 2008. 180(11): p. 7736-46.

114. Boulter, J.M., et al., Stable, soluble T-cell receptor molecules for crystallization and therapeutics. Protein Eng, 2003. 16(9): p. 707-11.

115. Zhou, G. and H. Levitsky, Towards curative cancer immunotherapy: overcoming posttherapy tumor escape. Clin Dev Immunol, 2012. 2012: p. 124187.

116. Vago, L., et al., Loss of mismatched HLA in leukemia after stem-cell transplantation. N Engl J Med, 2009. 361(5): p. 478-88.

117. Rossig, C., et al., Targeting of G(D2)-positive tumor cells by human T lymphocytes engineered to express chimeric T-cell receptor genes. Int J Cancer, 2001. 94(2): p. 228-36.

118. Abken, H., et al., A novel strategy in the elimination of disseminated melanoma cells: chimeric receptors endow T cells with tumor specificity. Recent Results Cancer Res, 2001. 158: p. 249-64.

119. Hombach, A., A.A. Hombach, and H. Abken, Adoptive immunotherapy with genetically engineered T cells: modification of the IgG1 Fc 'spacer' domain in the extracellular moiety of chimeric antigen receptors avoids 'off-target' activation and unintended initiation of an innate immune response. Gene Ther, 2010. 17(10): p. 1206-13.

120. Wilkie, S., et al., Retargeting of human T cells to tumor-associated MUC1: the evolution of a chimeric antigen receptor. J Immunol, 2008. 180(7): p. 4901-9.

121. Pule, M.A., et al., A chimeric T cell antigen receptor that augments cytokine release and supports clonal expansion of primary human T cells. Mol Ther, 2005. 12(5): p. 933-41.

122. Kahlon, K.S., et al., Specific recognition and killing of glioblastoma multiforme by interleukin 13-zetakine redirected cytolytic T cells. Cancer Res, 2004. 64(24): p. 9160-6.

123. Milone, M.C., et al., Chimeric receptors containing CD137 signal transduction domains mediate enhanced survival of T cells and increased antileukemic efficacy in vivo. Mol Ther, 2009. 17(8): p. 145364.

124. Hombach, A.A., et al., 0X40 costimulation by a chimeric antigen receptor abrogates CD28 and IL-2 induced IL-10 secretion by redirected CD4(+) Tcells. Oncoimmunology, 2012. 1(4): p. 458-466.

125. Song, D.G., et al., In vivo persistence, tumor localization, and antitumor activity of CAR-engineered T cells is enhanced by costimulatory signaling through CD137 (4-1BB). Cancer Res, 2011. 71(13): p. 461727.

126. Tammana, S., et al., 4-1BB and CD28 signaling plays a synergistic role in redirecting umbilical cord blood T cells against B-cell malignancies. Hum Gene Ther, 2010. 21(1): p. 75-86.

127. Sadelain, M., R. Brentjens, and I. Riviere, The basic principles of chimeric antigen receptor design. Cancer Discov, 2013. 3(4): p. 38898.

128. Imai, C., et al., Chimeric receptors with 4-1BB signaling capacity provoke potent cytotoxicity against acute lymphoblastic leukemia. Leukemia, 2004. 18(4): p. 676-84.

129. Eshhar, Z., et al., Specific activation and targeting of cytotoxic lymphocytes through chimeric single chains consisting of antibody-binding domains and the gamma or zeta subunits of the immunoglobulin and T-cell receptors. Proc Natl Acad Sci U S A, 1993. 90(2): p. 720-4.

130. Altenschmidt, U., E. Klundt, and B. Groner, Adoptive transfer of in vitro-targeted, activated T lymphocytes results in total tumor regression. J Immunol, 1997. 159(11): p. 5509-15.

131. Maher, J., et al., Human T-lymphocyte cytotoxicity and proliferation directed by a single chimeric TCRzeta /CD28 receptor. Nat Biotechnol, 2002. 20(1): p. 70-5.

132. Pule, M., H. Finney, and A. Lawson, Artificial T-cell receptors. Cytotherapy, 2003. 5(3): p. 211-26.

133. Bridgeman, J.S., et al., The optimal antigen response of chimeric antigen receptors harboring the CD3zeta transmembrane domain is dependent upon incorporation of the receptor into the endogenous TCR/CD3 complex. J Immunol, 2010. 184(12): p. 6938-49.

134. Chmielewski, M., et al., IL-12 release by engineered T cells expressing chimeric antigen receptors can effectively Muster an antigen-independent macrophage response on tumor cells that have shut down tumor antigen expression. Cancer Res, 2011. 71(17): p. 5697-706.

135. Pegram, H.J., et al., Tumor-targeted T cells modified to secrete IL-12 eradicate systemic tumors without need for prior conditioning. Blood, 2012. 119(18): p. 4133-41.

136. Wu, Y., et al., Apoptin enhances the oncolytic properties of Newcastle disease virus. Intervirology, 2012. 55(4): p. 276-86.

137. Cornelis, J.J., et al., Cancer gene therapy through autonomous parvovirus--mediated gene transfer. Curr Gene Ther, 2004. 4(3): p. 249-61.

138. Nuesch, J.P., et al., Molecular pathways: rodent parvoviruses--mechanisms of oncolysis and prospects for clinical cancer treatment. Clin Cancer Res, 2012. 18(13): p. 3516-23.

139. Costello, R.T., et al., Defective expression and function of natural killer cell-triggering receptors in patients with acute myeloid leukemia. Blood, 2002. 99(10): p. 3661-7.

140. Guler-Gane, G., et al., Overcoming the Refractory Expression of Secreted Recombinant Proteins in Mammalian Cells through Modification of the Signal Peptide and Adjacent Amino Acids. PLoS One, 2016. 11(5): p. e0155340.

141. Knappskog, S., et al., The level of synthesis and secretion of Gaussia princeps luciferase in transfected CHO cells is heavily dependent on the choice of signal peptide. J Biotechnol, 2007. 128(4): p. 705-15.

142. Luft, C., et al., Application of Gaussia luciferase in bicistronic and non-conventional secretion reporter constructs. BMC Biochem, 2014. 15: p. 14.

143. Barash, S., W. Wang, and Y. Shi, Human secretory signal peptide description by hidden Markov model and generation of a strong artificial signal peptide for secreted protein expression. Biochem Biophys Res Commun, 2002. 294(4): p. 835-42.

144. Kim, J.H., et al., High cleavage efficiency of a 2A peptide derived from porcine teschovirus-1 in human cell lines, zebrafish and mice. PLoS One, 2011. 6(4): p. e18556.