Исследование круга хозяев, полиморфизма и клонирование генома Х вируса шалота тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.03, кандидат биологических наук Калошин, Алексей Алексеевич

• Калошин, Алексей Алексеевич
• кандидат биологических наук
• 1999

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Калошин, Алексей Алексеевич

ВВЕДЕНИЕ

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Общая характеристика вирусов, поражающих культурные виды рода Allium

1.1. Потивирусы

1.1.1. Вирус желтой карликовости лука

1.1.2. Вирус желтой штриховатости лука-порея

1.1.3. Предполагаемые члены группы потивирусов

1.1.4. Нуклеотидные последовательности РНК потивирусов, выделенных из растений рода Allium

1.2. Карлавирусы

1.2.1. Латентный вирус шалота

1.2.2. Латентный вирус чеснока

1.3. Вирусы других групп, обнаруженные в растениях рода Allium

2. X вирус шалота и ХВШ-подобные вирусы

2.1. Морфология и физико-химические свойства вирусных частиц

2.2. Симптоматика и круг хозяев

2.3. Серологические свойства

2.4. Цитопатология

2.5. Характеристика геномной РНК

3. Организация генома и сравнительная характеристика генов карла-, потеке- и ХВШ-подобных вирусов

4. Инфекционные кДНК копии геномных РНК фитовирусов

4.1 .Конструкция и экспрессия инфекционных вирусных кДНК

4.2. Определение инфекционности к ДНК копий

4.3. Исследование полноразмерных кДНК копий геномных РНК вирусов

И. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

1. Выделение ХВШ и вирусной РНК

2. Синтез и клонирование кДНК

3. Получение однонаправленных делеций

4. Определение нуклеотидной последовательности

5. Отбор полноразмерных кДНК копий геномной РНК ХВШ

6. Получение протопластов

7. In vitro транскрипция

8. In vitro трансфекция протопластов

9. Электрофорез в сочетании с ИФА (Western blot)

10. Электронная микроскопия

11. Иммуносорбентная электронная микроскопия

12. Компьютерный анализ нуклеотидных и аминокислотных последовательностей и вторичной структуры РНК

III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ.

1. Род Allexviruses: поиск новых видов и предложения по классификации и номенклатуре

2. Моновирусная инфекция растений X вируса шалота: герерогенность нуклеотидной последовательности геномной РНК и морфологическая гетерогенность вирионов

2.1. Морфологическая гетерогенность вирионов

2.2. Сравнительный анализ аминокислотных последовательностей

2.2.1. 42К белок

2.2.2. 28К белок

2.2.3. 15К белок

3. Полноразмерная кДНК-копия геномной РНК X вируса шалота: получение, клонирование, структура, in vitro транскрипция и тестирование инфекционности

3.1. Клонирование полноразмерной кДНК-копии ХВШ

3.2. Определение инфекционности кДНК-копий ХВШ

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

Ас антисыворотка

А-, В-, С-, О- ВЧ А-, В-, С-, О-вирусы чеснока

БВК Б - вирус картофеля

БВХ Б вирус хелениума

ВАТ вирус аспермии томата

ВЖКЛ вирус желтой карликовости лука

ВЖКР вирус желтой крапчатости риса

ВЖМК вирус желтой мозаики клевера

ВЖШЛП вирус желтой штриховатости лука-порея

ВКПЦ вирус кольцевой пятнистости цимбидиума

вмк вирус мозаики костра

ВМЦК вирус мозаики цветной капусты

вмч вирус мозаики чеснока

вмчпк вирус мозаики чеснока переносимый клещом

внмкк вирус некротической мозаики красного клевера

вог вирус опаленности голубики

впт вирус погремковости томата

ВРПГ вирус раннего побурения гороха

ВСМЯ вирус штриховатой мозаики ячменя

втм вирус табачной мозаики

лвг латентный вирус гвоздики

лвч латентный вирус чеснока

лвш латентный вирус шалота

мвк М вирус картофеля

нвпк нитевидный вирус переносимый клещом

онм олигонуклеотид - направленный мутагенез

ОРС открытая рамка считывания

ПЦР полимеразная цепная реакция

ПЭГ полиэтилен гликоль

хвк X вирус картофеля

ХВЧ X вирус чеснока

ХВШ X вирус шалота

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Исследование круга хозяев, полиморфизма и клонирование генома Х вируса шалота»

ВВЕДЕНИЕ.

Практически все растения подвержены вирусной инфекции. В результате нескольких десятилетий исследований было охарактеризовано несколько сот фитовирусов, которые по своей морфологии и серологическим свойствам были объединены в несколько семейств и более 30 групп.

Наиболее интенсивно фитовирусология стала развиваться когда появились первые данные о структуре и организации вирусных геномов. Именно эти результаты легли в основу современного представления о механизмах репликации и экспрессии вирусных геномов, взаимодействии вируса с растениями-хозяевами и переносчиками, транспорте вирусной инфекции и т.д. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей геномных РНК вирусов дал возможность выяснить филогенетические отношения между отдельными группами фитовирусов и некоторые аспекты их эволюционного развития. Работы направленные на изучение структуры и экспрессии геномов фитовирусов имеют не только фундаментальное, но и очевидное прикладное значение, поскольку на их основе ведутся разработки принципиально новых методов защиты растений от вирусной инфекции.

Тем не менее, вирусы, поражающие некоторые семейства растений, остаются недостаточно изученными. В их число входят и вирусы растений рода Allium. Растения этого рода, в особенности размножающиеся вегетативно, как правило, в природных условиях поражаются одновременно несколькими вирусами. Выделение и изучение отдельных компонентов вирусных комплексов из таких растений осложняется тем, что вирусы сложно разделить традиционными методами, поскольку зачастую вирусные частицы практически неразличимы по морфологии и физическим свойствам.

Современные молекулярно-биологические исследования РНК-содержащих вирусов растений все чаще базируются на подходах, связанных с клонированием полноразмерных кДНК-копий вирусных геномов, РНК-транскрипты которых способны инициировать вирусную инфекцию. Такие технологии, в частности, позволяют выявить функциональную значимость не только тех или иных вирусспецифических белков, но и отдельных их доменов.

Настоящая работа посвящена молекулярно-биологическому исследованию сравнительно недавно открытого в лаборатории молекулярной вирусологии ВНИИСБ фитовируса - X вируса шалота (ХВШ), ставшего типовым представителем новой группы ХВШ-подобных фитовирусов, получившей название Аллексивирусы (Allexiviruses). Структура генома ХВШ-подобных вирусов наиболее близка к потеке- и карлавирусам. Характерной особенностью ХВШ-подобных вирусов является наличие уникального 42К белка.

Основными задачами настоящей работы было следующее: выявление спектра хозяев ХВШ-подобных вирусов и проведение для этого серологического скрининга в растениях филогенетически близких роду Allium; исследование влияния аминокислотной последовательности вирусспецифических ХВШ белков на морфологию вирусных частиц; синтез полноразмерной кДНК-копии геномной РНК ХВШ и ее клонирование в составе рекомби-нантных плазмид; исследование инфекционности транскриптов.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. ХАРАКТЕРИСТИКА ВИРУСОВ, ПОРАЖАЮЩИХ КУЛЬТУРНЫЕ

РАСТЕНИЯ РОДА ALLIUM.

Род, Allium относится к семейству Liliaceae, классу Monocoty и включает более 600 видов. Хозяйственное значение имеют выращиваемые как овощные культуры, широко распространенные в сельском хозяйстве: А.сера -репчатый лук, A.sativum - чеснок, А.сера var. ascalonicum - лук-шалот (шалот), A.ampeloporassum var. porrum - лук-порей (порей), а так же ряд декоративных культур.

Культурные растения рода Allium в природных условиях поражены, как правило, не одним, а одновременно несколькими вирусами, различающимися по своей морфологии и принадлежности к той или иной группе фи-товирусов (Bos, 1982а; Van Dijk et al, 1991).

1.1. Потивирусы.

Одними из часто встречающихся в растениях рода Allium фитовирусов являются потивирусы - наиболее обширная из известных в настоящее время групп. Потивирусы получили свое название от типичного представителя этой группы Y вируса картофеля (YBK, potato virus Y) (Гиббс и Харрисон, 1978). Группа содержит более 200 различных вирусов, имеющих форму палочковидных или нитевидных частиц, построенных по принципу спиральной симметрии (Gibbs, 1969). Одни представители этой группы обладают достаточно широким спектром растений-хозяев, другие, особенно передаваемые семенами (например, вирус мозаики фасоли и вирус мозаики салата), ограниченным. Потивирусы поражающие растения рода Allium являются высоко патогенными, вызывая на растениях-хозяев сильные повреждения в виде штриховатой мозаики, некрозов и хлорозов.

Как правило, наиболее ясно выраженные характерные симптомы у луковых возникают при поражении потивирусами. Именно благодаря этому обстоятельству потивирусы репчатого лука и лука-порея были обнаружены

еще в 30-е и 50-е годы (Henderson, 1935, Кирке, 1957). Тем не менее, принадлежность ряда поражающих растения рода Allium вирусов к семейству по-тивирусов остается не доказанной. В настоящее время только вирус желтой карликовости лука (ВЖКЛ, onion yellow dwarf virus) и вирус желтой штри-ховатости лука-порея (ВЖШЛП, leek yellow stripe virus) идентифицированы как потивирусы совершенно четко и корректно.

1.1.1. Вирус желтой карликовости лука.

Первые исследования ВЖКЛ относятся к 30-м годам. Так, было установлено (Henderson, 1935), что заболевание, известное под названием «желтая карликовость» репчатого лука, передается при инъекции сока зараженного растения в точку роста луковицы. Было установлено также, что это заболевание передается тлями. При заражении возникали первичные мозаичные симптомы. В дальнейшем, у пораженных растений репчатого лука выращиваемых на семена, развивалась желтая штриховатость, переходящая в полное пожелтение и искривление цветоносных побегов. Урожайность инфицированных растений значительно снижалась, а выход семян падал на 50-70%. Отмечено, что заражение ВЖКЛ снижало степень сохранности луковиц.

Сходные симптомы наблюдались при инокуляции растений шалота, Narcissus taretta и N .jonqulla. Основным источником инфекции являются перезимовавшие луковицы репчатого лука (Henderson, 1935).

Установлено, что ВЖКЛ может передаваться более чем 50 видами тлей. Поскольку растения рода Allium не являются облигатными хозяевами тлей, распространение вируса происходит во время миграции насекомых (Drake et al., 1933; Tate et ah, 1940). Отмечено появление внутриклеточных включений, характерных для потивирусной инфекции (Tate, 1935; MacWharter, 1937). Как и все потивирусы, вирионы ВЖКЛ представляют собой слегка изогнутые частицы длиной около 700 нм, молекулярная масса бежа оболочки составляет 30 кДа (Bos, 1976; Bos et al., 1978a).

1.1.2. Вирус желтой штриховатости лука-порея.

Первые сообщения о поражении лука-порея ВЖШЛП относятся к 1957 году (Kupke, 1957). Детальные исследования этиологии заболевания лука-порея, проявляющейся в возникновении желтой штриховатости, которая развивалась при круглогодичном выращивании этой культуры, начались в 70-е годы (Bos, 1972).

Симптомы (развитие желтой штриховатости, скрученности и потеря упругости листьев, снижение содержания воды в растениях и значительное увеличение предрасположенности зимующих растений к гниению) были идентичны описанным для инфекции ВЖКЛ как в репчатом луке, так и в луке-порее. Вирус, вызывающий эту симптоматику и был назван вирусом желтой штриховатости лука-порея (Bos, 1976; Bos et al., 1978a). В пораженных растениях легко обнаруживались характерные для потивирусной инфекции фибриллярные внутриклеточные включения, а в соке присутствовали частицы с характерной дня потивирусов морфологией (Bos et al., 1978а). Вирионы ВЖШЛП представляют собой гибкие частицы длиной около 770 нм и диаметром около 16 нм, молекулярная масса белка оболочки составляет 34 кДа (Bos etal, 1978а; Bos, 1981).

Позже было показано, что в отличие от ВЖКЛ, ВЖШЛП не инфицирует растения репчатого лука и шалота. ВЖШЛП образует местные поражения у Ch. amar anticolor и Ch.quinoa, появляющиеся после пожелтения ино-кулированного листа (Bos, 1981).

1.1.3. Предполагаемые члены группы потивирусов.

Довольно часто растения чеснока поражены вирусом, который серологически родственен ВЖКЛ (Ploate et al., 1978; Walkey et al., 1987). Этот вирус называют «вирусом мозаики чеснока» (ВМЧ) и он так же имеет типичную для потивирусов морфологию и может переносится тлями (Meassiaen & Marrou, 1965; Graichen et al., 1985). Другой вирус названный «вирусом мозаики лука» (ВМЛ), имеющий вирионы длинной 675 нм, переносится клещом Acería tulipae и вызывает мозаику у растений лука-порея (Прозенко и др., 1961, 1966; Развязкина и др, 1969, 1971; Черемушкина 1974, 1975; Галуш-

кина и Иващенко, 1981). Так называемый «вирус желтой полосчатости лука» описан в Новой Зеландии как вирус, переносимый тлями (Mohamed & Young, 1981). Этот вирус серологически родственен ВЖШЛП и ВЖКЛ (сыворотка к ВЖПЛ хорошо декорирует вирионы ВЖШЛП и ВЖКЛ, однако обратное декорирование не описано). Молекулярная масса белка оболочки ВМЧ и ВМЛ составляет 33 и 30,5 кДа, соответственно, что близко к молекулярной массе белка оболочки ВЖШЛП и ВЖКЛ.

1.1.4. Анализ нуклеотидных последовательностей потивирусов растений

рода Allium.

До сих пор отсутствуют данные о последовательностях геномных РНК ВЖКЛ и ВЖШЛП. Отсеквенированы фрагменты геномов потивирусов поражающих шалот (Zavriev et al., 1991) и чеснок (Sumi et al., 1993), PHK-полимеразные домены которых обладают значительным сходством. Установленные последовательности нельзя однозначно отнести к какому либо вирусу, ранее идентифицированному серологически или биологически. Возможно, шалотный потивирус у которого определена последовательность генов протеазы и РНК зависимой РНК-полимеразы и N-концевой части белка оболочки, является штаммом ВЖКЛ. Данный потивирус накапливается в побегах вегетативно размножаемых линий шалота в чрезвычайно малом количестве: РНК обнаруживается только Nothern блотом, при этом белок оболочки ВЖКЛ не выявляется серологически.

Нуклеотидные последовательности генов РНК зависимой РНК-полимеразы и белка оболочки чесночного потивируса выделенного в Японии, как полагают авторы (Sumi et al., 1993), также может относиться к ВЖКЛ. Возможно, эти нуклеотидные последовательности относятся к достаточно отдаленным штаммам ВЖКЛ или к разным потивирусам.

1.2. Карлавирусы.

Карлавирусы (carlaviruses) получили свое название от типового представителя данной группы - латентного вируса гвоздики (ЛВГ) - carnation latent virus (Harrison et ah, 1971).

Бессимптомное заражение и отсутствие подходящих растений-индикаторов (Wetter & Milne, 1981) являются причинами, затрудняющими обнаружение карлавирусов. В связи с этим, для тестирования карлавирусов большое значение имеют серологические и электронно-микроскопические методы, а также основанные на полимеразной цепной реакции (ПЦР) моле-кулярно - биологические подходы детекции вирусных РНК (Tsueyoshi & Sumi, 1996).

Вирионы карлавирусов представляют собой слегка изогнутые палочки с модальной длиной около 610 - 700 нм и диаметром около 12 нм (Wetter & Milne, 1981). Коэффициент седиментации одного из наиболее изученных карлавирусов - М вируса картофеля - равен 157S. Плавучая плотность (по данным равновесного центрифугирования в градиенте CsCh) - 1.322 г/см2 (Tavantzis, 1984). Температура инактивации для большинства карлавирусов находится в интервале 55 и 71°С. Вирусные частицы в большинстве случаев стабильны в соке растений при комнатной температуре в течении 2-5 дней (Wetter & Milne, 1981).

Распределение карлавирусных частиц в зараженном растении не является тканеспецифичным. Вирусные частицы выявляются в основном в цитоплазме клеток различных тканей растения. Карлавирусы не вызывают выраженного цитопатологического эффекта. Заражение большинством карлавирусов не приводит к накоплению в тканях растений вирусоспецифических включений (Wetter &Milne, 1981).

Несмотря на это, в цитоплазме молодых клеток растений, пораженных некоторыми вирусами данной группы, образуются трубчатые цитоплазма-тические включения, окруженные мембраной, в зрелых клетках обнаруживаются пучки из параллельно ориентированных друг относительно друга частиц или агрегаты из хаотично переплетенных вирионов (Adams et al., 1980, Biddleetal., 1971, Kassanis, 1955).

1.2.1. Латентный вирус шалота.

Латентный вирус шалота (ЛВШ) был впервые обнаружен в бессимптомных растениях шалота с помощью электронной микроскопии. Форма и размеры вирионов, присутствующих в высокой концентрации в соке, были характерными для карлавирусов (Bos et al, 1978b; Bos, 1982b). Карлавирус-ные частицы обнаруживали в соке и вирусных препаратах выделенных из растений шалота со слабыми или невыраженными симптомами. Часто вирус обнаруживался в комплексе с ВЖКЛ.

Как большинство карлавирусов, ЛВШ в зараженных растениях развивается латентно, иногда появляются слабые симптомы. Вирус индуцирует локальные поражения на С. amar anticolor и C.quinoa и легко переносится механическим путем. Для ЛВШ переносчики пока не идентифицированы (Wetter & Milne, 1981). ЛВШ, как и большинство карлавирусов, не передается семенами зараженных растений.

1.2.2. Латентный вирус чеснока.

Латентный вирус чеснока (ЛВЧ, garlic latent virus) был обнаружен в растениях чеснока с мозаичными симптомами и штриховатостью (Woo Lee et al., 1979). Установлено, что он обладает слабо выраженным серологическим родством только с некоторыми штаммами последнего (Bos, 1982; Deleccolle & Lot, 1981). Вирусные частицы ЛВЧ имеют вид прямых нитей длиной около 650 нм. На инфицированных ЛВЧ растениях чеснока появляются мозаичные симптомы и штриховатость. Спектр растений-хозяев ограничен видами рода Allium. Вирусные частицы ЛВЧ выявляются в цитоплазме клеток различных тканей растения, не вызывая выраженного цитопато-логического эффекта. Заражение ЛВЧ не приводит к накоплению в тканях растений вирусспецифических включений (Wetter & Milne, 1981).

1.3. Вирусы других групп обнаруженные в растениях рода Allium.

Кроме поти- и карлавирусов в растениях Allium обнаружены вирусы других групп, которые первоначально были выделены из других растений и

передаются через почву - это вирус мозаики арабиса, вирус черных колец томата (неповирусы) и вирус погремковости табака (тобравирус). Предполагается наличие переноса инфекции с помощью нематод (Calvert & Harrison, 1963).

Исследования последних лет показали, что некоторые вирусы, поражающие виды Allium, не являются членами групп, обнаруженных ранее. Данные вирусы, имеющие гибкие нитевидные вирионы, которые напоминают поти- или клостеровирусные, не обладают серологическим родством с карла- и потивирусами. В то же время, обнаружена несомненная серологическая близость между предполагаемыми членами новой группы, выделенными из разных источников. Для некоторых членов этой группы показано, что они переносятся клещом Acería tulpae (Yamashita et al., 1996; Barg et al., 1993). Работы по секвенированию геномной РНК ХВШ показали, что 3'-концевя часть геномной РНК ХВШ имеет уникальную организацию. Сходной организацией генома обладают и охарактеризованные впоследствии чесночные вирусы: A-, В-, D- вирусы чеснока (A-, В-, D-ВЧ) и вероятно С-ВЧ (Sumi et al., 1993), вирус мозаики чеснока переносимый клещом -ВМЧПК (Yamashita et al., 1996), нитевидный вирус переносимый клещом -НВПК (Рябов и др., 1986), X вирус чеснока - ХВЧ (Song et al., 1998). Вероятно, членами новой группы являются и некоторые вирусы шалота и чеснока, описанные как штаммы латентного переносимого клещом вируса репчатого лука и латентного переносимого клещом вируса шалота (Van Dijk et al., 1991; Van Dijk, 1994), а также несколько переносимых клещом вирусов репчатого лука и чеснока (Barg et al., 1993).

Представители новой группы вирусов были обнаружены только в пределах рода Allium. Изучению и анализу генома ХВШ - первого представителя новой группы фитовирусов и посвящена данная работа.

2. X ВИРУС ШАЛОТА И ХВШ - ПОДОБНЫЕ ВИРУСЫ.

2.1. Физико-химические свойства вирусных частиц.

Длина вирионов ХВШ-подобные вирусы представляют собой нитевидные частицы длиной от 700 до 800 нм (длина ХВШ равна 780 нм). Диаметр частиц определен у ХВШ и составляет 12 нм (Вишниченко и др., 1993). Частицы ВМЧПК в экстракте сохраняют инфекционность при инкубации в до 3 дней при комнатной температуре, но теряют ее при инкубации в течении 5 дней, также инфекционность сохраняется при разведении до 10 3 и обработке в течении 10 мин температурой 65°С и теряется при разведении до Ю-4 и обработке при 70°С (Yamashita et al, 1996).

2.2. Симптоматика и круг хозяев.

Все ХВШ-подобные вирусы идентифицированы в растениях рода Allium. ХВШ выявлен в растениях лука-шалота (A. ascalonicum) и репчатом луке (А. сера). A-, В-, D-ВЧ, ХВЧ, ВМЧПК и ВНПК обнаружены в чесноке (A. sativum).

Инфекция ХВШ протекает в латентной форме, однако A-, В-, D-ВЧ и ВМЧПК вызывают на растении-хозяине появление мозаичных симптомов (Sumi et al., 1993; Yamashita et al, 1996). В Японии показана возможность заражения растений других семейств при использовании экстракта растений инфицированных ВМЧПК (Yamashita et al., 1996). Этот вирус вызывает редкие локальные повреждения с хлоротичными центрами и образует красные края на инокулированых листьях Gomphrena globosa, локальные хлоро-тичные повреждения возникают на растениях Chenopodium múrate, локальная латентная инфекция встречается у С. amaranticolor и С. quinoa, у Tetragonia expansa обнаруживается системная латентная инфекция.

Не выявляется инфекция у: Allium сера, A. jistulosum, Amaranthus tricolor, Beta vulgaris, Brassica campestris, В. napus, Celosía cristata, Cucumis sativum, Cucurbita pepo, Datura stramonium, Licopercicon esculentum, Nicotiana clevelandii, N. debneyi, N. glutinosa, N. occidentalis, N. rustica, N. tabacum,

Petunia hybrida, Phasecolus vulgaris, Pisum sativum, Vigna sesquipedatis. Тестирование растений проводили через 2 и 4 недели (Yamashita et al, 1996).

Очевидно, что для ХВШ-подобных вирусов характерен перенос инфекции с помощью клещей, это было показано в лабораторных условиях с микроскопическим клещом Acería tulipae, также выяснено, что нет переноса с использованием тлей (Yamashita et al., 1996).

2.3. Серологические свойства.

Для ХВШ используются две вирусспецифичные антисыворотки: против рекомбинантного белка оболочки (БО ХВШ-Ас) и против вирусных частиц (ХВШ-Ас) (Аршава и др., 1996). Антисыворотка против рекомбинантного белка оболочки ХВШ имеет значительное преимущество по сравнению с антисывороткой против вирусных частиц, выделенных из растительного материала, в связи с отсутствием в ней примесей антител к белкам растений-хозяев и, что особенно важно, к другим вирусам, персистирую-щим в растениях одновременно с ХВШ (Аршава и др., 1996). Расчетная масса белка оболочки ХВШ составляет 28 кДа, но в полиакриламидном геле он движется как 37К, что связано с его высокой гидрофильностью (Kanyuka et al., 1992). Было показано, что в препаратах ХВШ, выделяемых из растений в первый год формирования системы вирус-хозяин, в качестве примеси присутствовал ЛВШ. Результаты последующих серологических тестов, осуществленных в ходе выполнения настоящего исследования, показали, что в процессе вегетативного размножения растений в условиях, исключающих возможность инфицирования их из экзогенного источника, концентрация ХВШ в них поддерживалась на высоком уровне, тогда как концентрация ЛВШ постепенно снижалась, и в настоящее время (третий цикл вегетативного размножения) антиген капсидного белка этого карлавируса в растениях уже не обнаруживается. В экстрактах растений и в очищенных вирусных препаратах отсутствуют также антигены капсидных белков ВЖКЛ, ВЖШЛП и ЛВЧ. В то же время показана серологическая идентичность ХВШ и НВПК. 37К белок реагирующий с антисыворотками к этим двум вирусам обнаруживается во всех проанализированных вегетативно размно-

жаемых линиях лука-шалота и в некоторых образцах репчатого лука, не обнаружен 37К в сеянцах лука-шалота (Аршава и др., 1996).

Также была получена антисыворотка к рекомбинантному 42К белку ХВШ и было показано, что в детектируемых количествах этот белок обнаруживается в тех растениях, в которых высокая концентрация белка оболочки, что вполне естественно, так как в зараженной клетке уровень экспрессии неструктурных белков по сравнению со структурными, обычно невысок. (Аршава и др., 1995).

2.4. Цитопатология.

В вирусах чеснока вирионы наблюдаются в цитоплазме клеток мезо-фила, как одиночные так и собранные в пучки. Кроме того в некоторых клетках образуются нецилиндрические включения (Yamashita et al., 1996). В растениях инфицированных ХВШ никаких включений не обнаружено (Вишниченко и др., 1993).

2.5. Характеристика геномной РНК.

Геном ХВШ-подобных вирусов состоит из одноцепочечной «+»полярной РНК. В настоящее время полностью отсеквенированы: ХВШ и ХВЧ длины которых составляют 8890 и 8106 нуклеотидов, соответственно (Kanyuka et al., 1992, Song et al., 1998). Определены З'-концевые последовательности A-,B-,C-,D-B4 (Sumi et al, 1993), ВМЧПК, (Yamashita et al., 1996) и ВНПК (Рябов и др., 1996), содержащие ОРС для 15К, 27К и 40К белков. Показано, что белок оболочки ХВШ экспрессируется с помощью субгеномной РНК (Kanyuka et al., 1992). Кроме того в препаратах ХВШ обнаруживается двухцепочечная РНК с размером около 1500 нуклеотидов (Вишниченко и др., 1993).

3. Организация генома и сравнительная характеристика генов карла-, потеке- и ХВШ - подобных вирусов

Структура генома ХВШ-подобных имеет много характерных черт, присущих геномам карла-, потексвирусов. Очевидно, что эти группы эво-люционно связаны между собой.

195К

25К

42К

27К

ХВШ

МТ HEL POL БО

J

"(А)п

11К

15К

166К__25К 8К 22К

МТ HEL POL БО

12К

223К 25К 7К 34К

МВК МТ PROT HEL POL 1 БО

ü

11К 12К

Рисунок 1. Схема организации геномов потеке-, карла- и ХВШ-подобных вирусов. X вирус шалота - ХВШ, потексвирус - ХВК, карлавирус - МВК. Открытые рамки считывания (ОРС) отмечены прямоугольниками. Указаны молекулярные массы кодируемых ими белков. Участки гена РНК-репликазы, кодирующие метилтрансферазный, протеазный, хеликазный и полимеразный домены соответственно обозначены МТ, PROT, HEL и POL. БО - белок оболочки. (А)п - поли(А).

5'-концевые области геномных РНК кодируют наиболее протяженный белок, являющегося вирусной РНК-репликазой. В последовательностях этих белков у карла-, потеке- и ХВШ-подобных вирусов выявлены три консервативных домена, которые характерны для РНК-репликаз Синдбис-подобных вирусов. А^-концевой домен, судя по аминокислотной последовательности должен обладать потенциальной метилтрансферазной активностью (Коошп & БоЦа, 1993; Могогоу е1 а!., 1990а). В средней части белков,

кодируемых 5'-концевыми ОРС карла- и потексвирусов, прослеживаются последовательности аминокислот, характерные для NTP-азного/хеликазного домена (Koonin & Dolja, 1993). С-конец содержит мотивы, обнаруженные в РНК-полимеразных доменах всех Синдбис-подобных вирусов (Koonin & Dolja, 1993). Следует указать, что продукт ОРС1 карла-вирусов, вероятно, содержит также и протеазный домен, который расположен между метилтрансферазным и хеликазным (Rozanov et al, 1992). В этом участке последовательностей, кодируемых ОРС1 МВК и вируса опаленно-сти голубики (ВОГ), обнаружен мотив, характерный дня папаин-подобных цистеиновых протеаз, который гомологичен протеазному домену расположенному сходным образом в РНК-репликазе тимовирусов, разрезающему полипептид in eis между хеликазным и полимеразным доменами (Morch et al, 1989; Branson et a/., 1991; Kadare et al, 1992). В пользу наличия протеаз-ного домена у карлавирусов свидетельствуют и результаты опытов по in vitro трансляции геномных РНК S вируса хелениума (SBX) и S вируса картофеля (SBK) (Foster & Mills, 1991). Было установлено, что данные РНК направляют синтез полипептидов с молекулярными массами 190 и 160 кДа в случае SBX и 190 кДа и 150 кДа в случае SBK. Причем при увеличении времени инкубации доля легкого продукта возрастала (Foster & Mills, 1991), что согласуется с данными полученными для ЛВГ (Meeham & Mills, 1991). В аминокислотных последовательностях белков, кодируемых ОРС1 потеке- и ХВШ-подобных вирусов, протеазный домен не обнаружен, что является одним из наиболее существенных различий между потеке- и карлавирусами (Koonin & Dolja, 1993). При in vitro трансляции геномные РНК потексвирусов направляет синтез полипептидов с молекулярными массами от 150 до 182 кДа приблизительно равным ожидаемым молекулярным массам продуктов трансляции ОРС1, что говорит об отсутствии специфического про-теолиза (Guilford & Forster, 1986; Bendena & Mackie, 1986; Bendena et al, 1985; Forster et al, 1988; Brown & Wood, 1987, Морозов и др., 1983; Solovyev et al., 1994). Продукты, кодируемые OPC1 ХВШ-подобных вирусов обладает наибольшей гомологией с РНК-репликазами потексвирусов, и также не имеют четко выраженных мотивов, характерных для протеазного домена. Расчетная масса этих белков составляет 195 кДа у ХВШ (Kanyuka et al,

ХВЧ (Song et al, 1998). Расположение доменов в РНК-репликазе (метилтрансферазный, протеазный, хеликазный и полимеразный) характерно для представителей тимо-, карла- и капилловирусов, объединенных на основании гомологии перечисленных доменов в тимоподобную группу (Koonin, 1991а; Koonin & Dolja,1993).

Организация З'-концевых участков геномных РНК карла- потеке- и ХВШ-подобные имеет много общего. Последовательности белков, кодируемых сходно расположенными генами этих вирусов имеют протяженные участки гомологии. В геномах карла-, потеке- и ХВШ-подобных вирусов за репликазным геном лежат ОРС, кодирующие белки тройного блока генов. В состав тройного блока генов входят белки с молекулярными массами 2526 кДа, 11-12 кДа и 7-8 кДа. Есть основания считать, что белки тройного блока генов необходимы для межклеточного транспорта вирусной инфекции (Beck et al., 1991). При том потенциальная ОРС кодирующая 7-8К белок у ХВШ-подобных вирусов, возможно не имеет инициаторного кодона. Такая же ситуация обнаружена в одном из потексвирусов - бессимптомном вирусе лилии (Memelink et al., 1990). Возможно, для 7-8К белков этих вирусов инициаторным является не AUG, а другой кодон. Известно, что в редких случаях возможна трансляция GUG, UUG и AUU кодонов (Ganosa et al., 1985), и в таком случае возможен синтез 7-8К полипептида с помощью кодона UUG. Нельзя исключить, что 7-8К белки у этих вирусов вообще не экспрессируются и это может быть связано с особенностями межклеточного транспорта в растениях семейства Liliaceae.

У всех ХВШ-подобных вирусов между генами тройного блока генов и геном белка оболочки находится ОРС, кодирующая уникальный белок с расчетной молекулярной массой 32-42 кДа. Наличие этой ОРС является наиболе существенной характеристикой, отличающей ХВШ-подобные вирусы от карла - и потексвирусов (Kanyuka et al., 1992; Sumi et al., 1993; Yamashita et al, 1996; Рябов и dp, 1996, Song et al, 1998).

За тройным блоком генов у карла- и потексвирусов, и генами 32-42К белков у ХВШ-подобных вирусов следует ген белка оболочки. С-концевая часть, включающая приблизительно 180 аминокислотных остатков у карла-, потеке- и ХВШ-подобных вирусов имеет высокое сходство (Kanyuka et al,

1992), что характерно для нитевидных фитовирусов, включающих так же поти-, каполло- и бимовирусы (Koonin & Dolja, 1993). Последовательности белков оболочки ХВШ-подобных вирусов обладают высокой гомологией -более 50% аминокислотных остатков являются либо идентичными, либо гомологичными. Молекулярная масса белков оболочки у ХВШ-подобных вирусов составляет 26-28 кДа (Kanyuka et al, 1992; Sumi et al., 1993; Yamashita et al., 1996; Рябов и dp, 1996, Song et al., 1998). Однако N-концевые области протяженностью 60-70 остатков (около 1/4 последовательности) являются вариабельными, что так же характерно для белков оболочки нитевидных фитовирусов (Koonin & Dolja, 1993).

З'-проксимальная ОРС6 ХВШ-подобных вирусов кодирует белок с молекулярным весом 15 кДа (Kanyuka et al., 1992; Sumi et al., 1993; Yamashita et al., 1996; Рябов и dp, 1996, Song et al., 1998). Последовательности 15K белков ХВШ и родственных ему вирусов содержат области сходства с 12К белками карлавирусов, кодируемыми так же З'-концевыми ОРС, включающие участок богатый остатками аргинина и четыре консервативных остатка цис-теина. Предполагается, что основной участок и следующие за ним четыре остатка цистеина 12К белков формируют так называемый цинк-связывающий «палец». Однако, в аминокислотных последовательностях 15К ХВШ подобных вирусов расположение консервативных остатков цистеина и гистидина отличается от такового в 12К белках карлавирусов. Область явного сходства протяженностью около 20 остатков включает только два из четырех остатков цистеина в карлавирусных белках, которые могут участвовать в координации иона цинка.

Роль этих белков в развитии вирусной инфекции остается неясной, хотя показано, что 12К МВК и ВВХ способны in vitro связываться с двухцепо-чечными и одноцепочечными РНК (Gramstat et al., 1990; Левай, 1991). Предположительно они принимают участие в регуляции транскрипции или трансляции аналогично Zn-содержащим клеточным белкам (Coleman, 1992; Schmidenkamp & Klevit, 1994; Petti et al, 1990b; Gimer et al, 1992).

З'-концевые гены карла- и потексвирусов экспрессируются с помощью, по крайней мере, двух субгеномных РНК (Guilford & Forster, 1986; Karasev et al., 1987). В тканях пораженных вирусами растений кроме геном-

ной РНК обнаруживаются тяжелая субгеномная РНК (протяженностью около 2,1 кб в случае потеке- и 2.6 кб в случае карлавирусов), необходимая для экспрессии белков тройного блока генов, а также более легкая субгеномная РНК (длиной около 0.9 кб в случае потеке- и 1.5 кб в случае карлавирусов), требующаяся для экспрессии белка оболочки (и, возможно, белка кодируемого З'-терминальной ОРС в случае карлавирусов). Обе субгеномные РНК карла- и потексвирусов котерминальны и полиаденилированы. «Кэп»-структуру на 5'-конце имеют субгеномные РНК потексвирусов, что показано дня вируса желтой мозаики клевера (ВЖМК) (Mackie & White, 1990). В пользу того, что субгеномные РНК карлавирусов не имеют «кэпа» свидетельствует отсутствие ингибирования трансляции субгеномных РНК SBK с помощью аналогов «кэпа» (Foster & Mills, 1990), однако однозначно интерпретируемых данных, доказывающих отсутствие «кэп»-структуры на 5'-концах субгеномных РНК карлавирусов нет.

Нет пока единого мнения о механизме экспрессии белков тройного блока генов карла и потексвирусов. Так было выдвинуто предположение о существовании дополнительной субгеномной РНК ХВК длиной 1,4 кб, необходимой для синтеза 12К и 7К белков (Morozov et al., 1991). С другой стороны, синтетические транскрипты, содержащие гены белков тройного блока МВК, направляли in vitro трансляцию всех трех белков (Канюка, 1991). Для ХВШ показано наличие одной субгеномной РНК размером приблизительно 1500 нуклеотидов. Вероятно, что с этой субгеномная РНК экспрес-сируется белок оболочки (Kanyuka et al., 1992).

Остается неясным механизм экспрессии цистеин-богатого белка карла-и ХВШ-подобных вирусов, кодируемого ОРС6. Существуют данные свидетельствующие в пользу того, что данный продукт может транслироваться с субгеномной РНК для синтеза белка оболочки путем внутренней инициации. Не исключено, что у некоторых карлавирусов за счет -1 сдвига рамки считывания при трансляции может происходить образование продукта слияния белка оболочки и 12К. Сообщалось что продукт слияния белка оболочки и 12К белка М вируса картофеля синтезировался при in vitro трансляции данных генов (Rohale, 1995). -1 сдвиг рамки считывания происходит, например, при трансляции gog-pol продукта у ретровирусов (Jacks et

а1, 1988), РНК - решжказ диантовирусов (Хюг^ & Ьошшег, 1989; Хюг^ <?/ а1., 1993; Ое е1 ш., 1993; ЫуаЬоу ег а1., 1994). Следует, однако, отметить, что нуклеотидная последовательность участка возможного сдвига рамки считывания в месте перекрывания ОРС, кодирующей белок оболочки и 15К ХВШ-подобных вирусов, отличается от последовательностей, характерных для сайтов -1 сдвига рамок у указанных вирусов. Кроме того, участок РНК ХВШ, лежащий ниже сайта вероятного сдвига рамки, не способен формировать жесткую шпилечную структуру, наличие которой, как правило, необходимо для -1 сдвига (Капуика е/ а1., 1992).

4. ИНФЕКЦИОННЫЕ КДНК - КОПИИ ГЕНОМНЫХ РНК

ФИТОВИРУСОВ.

Исследование молекулярных механизмов репликации вирусных РНК, экспрессии вирусных генов и функций вирусспецифичных белков требует возможности введения соответствующих мутаций и изучения фенотитипи-ческого проявления этих мутаций в растении-хозяине.

На первых этапах направленной манипуляции с геномами фитовиру-сов, вирусные препараты подвергались обработке такими соединениями, как азотистая кислота и гидроксиламин (Мипёгу & 01егег, 1958, Мипёгу, 1960, \У1итапп, 1965). В результате проведенной работы в разных лабораториях были получены, выделены и исследованы условно - летальные и, в частности, 18- мутанты ряда вирусов растений. Но работа осложнялась присутствием в препаратах мутантов вирусов дикого типа и, притом, в большем числе, вследствии чего происходила быстрая эллиминация мутантных геномов. Кроме того, при использовании указанных мутагенов, картирование получаемых мутаций представляло сложную техническую задачу.

Использование искусственной кДНК-стадии в цикле репродукции РНК-содержащих вирусов создало новые возможности исследования как указанных этапов инфекционного процесса, так и сложных проблем взаимодействия вирус-хозяин, участия в этих процессах клеточных факторов. Полноразмерные кДНК клоны геномных РНК содержат ДНК, последова-

тельность которой соответствует геному вируса, как дикого типа, так и его мутантам, которые могут быть выделены, сохранены и в дальнейшем широко использованы для исследований.

4.1. Конструкция и экспрессия инфекционных вирусных кДНК копий.

Полноразмерные кДНК копии РНК-содержащих вирусов получают по следующей принципиальной схеме: синтезируют первую цепь кДНК в результате реакции обратной транскрипции (Watson & Jackeson, 1986), используя в качестве матрицы вирионную РНК, затем с помощью ПЦР синтезируют вторую цепь с амплификацией продукта, используя при этом фланкирующие праймеры, и после чего кДНК клонируется в подходящий вектор.

В случае некоторых РНК содержащих вирусов, кДНК может непосредственно вызывать инфекцию. Инфекционные кДНК клоны геномной РНК были получены у бактериофага QP (Taniguchi et al., 1957), полиовируса (Racaniello & Baltimore, 1978), а также вироида веретеновидности клубней картофеля (Cress et al., 1983), и сателлитов растительных вирусов таких как, вирус некроза табака (vanEmmelo et al., 1987) и кольцевой пятнистости табака (Gerach et ah, 1986).

Молекулярные механизмы экспрессии упомянутых кДНК in vivo не известны, однако показано, что в геномной РНК полиовирусов есть участки схожие с сигналами транскрипции клеток-хозяев и есть основания предполагать, что подобные участки узнаются клеточными РНК-полимеразами (Semler et al., 1984).

Инфекционные полноразмерные кДНК копии геномов РНК содержащих вирусов могут быть получены при клонировании кДНК вставок в составе вектора, содержащего перед 5'-концом вставки 35S промотор вируса мозаики цветной капусты (ВМЦК) и на З'-конце поли(А) сигнал, терминирующий транскрипцию. Таким образом, например, были получены инфекционные кДНК копии вируса раннего побурения гороха (ВРПГ) (MacFarlane et al., 1991), вируса мозаики костра (ВМК) (Mori et al, 1991) и вируса аспермии томата (ВАТ) (Shi et al., 1997).

Как альтернатива конструированию инфекционных кДНК клонов, могут использоваться синтезированные in vitro транскрипты кДНК клонов вирусных геномных РНК. Этот подход широко применяется при исследовании вирусов, имеющих одноцепочечный РНК геном «+»полярности, поскольку обладает рядом преимуществ, по сравнению с использованием к ДНК клонов: удельная инфекционность транскриптов выше, отсутствие необходимости этапа внутриклеточной транскриптции и вероятности возможной рекомбинации ДНК внутри клетки.

При получении транскриптов используют РНК полимеразы бактериофагов Т7, ТЗ и SP6. Таким образом получены in vitro транскрипты вируса погремковости томата (ВПТ) (Hamilton & Baulcombe, 1988), X вируса картофеля (ХВК) (Kavanagh et ah, 1992), вируса погремковости табака (ВПТ) (Angenent et ah, 1989), вируса мозаики табака (ВТМ) (Meshi et ah, 1986), вируса штриховатой мозаики ячменя (ВСМЯ) (Petty & Jackson, 1990), вируса кольцевой пятнистости цимбидиума (ВКПЦ) (Burgyan et ah, 1990), вируса желтой мозаики клевера (ВЖМК) (Holy & AbouHaidar, 1993), вируса желтой крапчатости риса (ВЖКР) (Brugidou et ah, 1995), вируса некротической мозаики красного клевера (ВНМКК) (Xiong et ah, 1993), ВМК (Ahlquist, 1986; Hamilton & Baulcombe, 1988; Angenent et ah, 1989).

В вектор вирусная кДНК встраивается таким образом, чтобы перед 5'-концом вставки находился промотор РНК-полимеразы и со стороны З'-конца распологалься сайт рестрикции, для линеаризации ДНК матрицы перед транскриптцией.

Эффективность инфекционности транскриптов полученных in vitro с полноразмерных копий кДНК, по сравнению с нативной вирионной РНК, обычно составляет 5-10% (Ahlquist et ah, 1984; Holy & AbouHaidar, 1993). Для полиовирусов инфекционность полученных in vitro транскриптов на два порядка выше, чем прямая трансфекция эквимолярным количеством кДНК, которая является инфекционной (Van der Werf et ah, 1986). Существенное влияние на инфекционность транскриптов оказывают нуклеотиды, не входящие в состав геномной РНК. Наличие на 5'-конце 6-60 нуклеотидов и на З'-конце несколько сот нуклеотидов может снижать инфекционность в 10-300 раз (Van der Werf et ah, 1986; Dawson et ah, 1986; Janda et ah, 1987). В

тоже время, добавление к 5'-концу двух G увеличивает эффективность транскрипции на один - два порядка (Van der Werf et al, 1986). У большинства РНК содержащих фитовирусов вирионные РНК на 5'-конце имеет защитную «кэп» структуру. И поэтому кэпирование РНК транскриптов при транскрипции часто необходимо. Так например, не кэпированные in vitro транскрипты ВМК не проявляют инфекционность, в отличие от нативной РНК и кэпированных in vitro транскриптов (Ahlquist et al, 1984). В других случаях, в частности, у полноразмерной кДНК копии вируса желтой мозаики клевера (ВЖМК), если инфекционность у некэппированных транскриптов и проявляется, то она существенно ниже (Holy & AbouHaidar, 1993).

4.2. Определение инфекционности к ДНК - копий.

Инфекционность полноразмерных кДНК-копий геномов РНК-содержащих фитовирусов может быть проверена как на протопластах, так и на интактных растениях-хозяевах. Естественно, работа с целым растением дает более полную картину процесса инфекции, чем с протопластами, так как позволяет изучать процессы транспорта вирусной инфекции (из клетки в клетку и транспорт на дальние расстояния) и взаимоотношения вируса с растением хозяином.

Трансфекцию протопластов проводят с помощью полиэтилен гликоля (ПЭГ) или электропорации, используется обычно 1-10 мкг РНК. Далее клетки инкубируют в течении 40-48 часов и затем анализируют (Angenent et al, 1989, Brugidoueia/., 1994)

Для инокуляции растения РНК транскриптами может быть достаточно окало 5 мкг транскриптов (Holy & AbouHaidar, 1993). Транскрипты разводят в фосфатном буфере (Meshi et al, 1986; Petty & Jackson, 1990; Burgyan et al, 1990; Holy & AbouHaidar, 1993; Brugidou et al, 1995; Zavriev et al, 1995) и в ТЕ-буфере (Cronin et al, 1995), кроме того в состав буфера для инокуляции входят глицин, глицерин, бентонит и другие компоненты. Концентрация транскриптов также варьирует.

При инокулировании инфекционными кДНК-копиями, сконструированными с использованием 35S промотора ВМЦК, на одно растение обыч-

но используют от 10 до 50 мкг ДНК, при разведении в ТЕ-буфере до 0.5-1 мкг/мкл (MacFarlane et ah, 1991; Mori et ah, 1991; Weber et ah, 1992; Shi et ah, 1997). При этом например, в случае ВРПГ, инокулируемый материал в количестве 0.1 мкг и менее не дает инфекции, которая возможна только при инокуляции 0.5 мкг кДНК (MacFarlane et ah, 1991).

Тестирование растений проводят визуально по наличию симптомов, а так же иммуноблотом, ELISA, нозерн блотом и с помощью электронной микроскопии. Время проявления инфекционности составляет от нескольких дней до нескольких недель.

4.3. Исследование полноразмерных кДНК копий.

Направленные манипуляции с геномом позволяют выявить влияние той или иного области генома на фенотип вирусной инфекции. Вводя с помощью направленного мутагенеза отдельные мутации и их сочетания, а также используя рекомбинацию кДНК копии вирусного генома можно судить о функциональной значимости отдельных областей генома.

В настоящее время широко используется олигонуклеотид-направленный мутагенез (OHM), который осуществляется с помощью оли-годезоксирибонуклеотида (праймера) с измененной последовательностью. Суть метода состоит в том, что этот праймер комплиментарен области мишени мутагенеза, за исключением одного или нескольких нуклеотидов, несущих мутации, и после гибридизации его с одноцепочечной матрицей синтезируется комплиментарная содержащая нужные мутации цепь. Синтез мутантной цепи можно осуществить с помощью ПЦР (Perrin & Gilliland 1990) или достройкой комплиментарной цепи на одноцепочечной форме кДНК.

Одноцепочечную форму можно получить клонированием кДНК копии в вектора - производные одноцепочечного бактериофага М13 (Waye et ah, 1985) или, что наиболее распространенно, - выращиванием фагемид (Sambrook et ah, 1989). Фагемиды получают с помощью плазмиды с встроенным фаговым участком инициации репликации бактериофага М13. Это дает возможность, в присутствии фага-помощника (Мр18, К07), которые

основаны на бактериофаге М13, паковать в фаговую оболочку одну из цепей плазмиды, в зависимости от направленности участка инициации сборки. Комплиментарную мутантную цепь на однонитевой форме кДНК строят используя обычно ДНК-полимеразу бактериофага Т7. После этого лидированием замыкают плазмидное кольцо и проводят трансформацию.

Увеличить выход мутантов этим методом до 90% можно путем выращивания фагемиды в штаммах E.coli, несущих мутации ung- (уридин-N-гликозилазы) dut" (dUTPa3a). Матрица, выделенная из таких клеток, содержит до нескольких процентов остатков dU вместо dT. При введении такой ДНК в клетку с геномом ung+ dut+ она разрушается, а комплиментарная ей мутантная цепь остается (Sambrook et al., 1989).

Метод OHM позволяет получать практически любые мутации (единичные или множественные замены, делеции и вставки) в любых местах клонированного фрагмента кДНК.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

1. Выделение ХВШ и вирусной РНК.

В качестве источников вирусных препаратов использовали вегетативно размножаемые инфицированные ХВШ растения шалота (Allium ascalonicum, сортообразец №83). Растения выращивали в фитотроне 600Н (Fisons) при температуре 21-25°С и относительной влажности 80% в течении 2-3 недель.

Вирусные препараты и РНК ХВШ выделяли по методу описанному ранее (Вишниченко и др., 1993). Побеги шалота гомогенизировали пестиком в ступке в 0,1М калий-фосфатном буфере, рН 8,2, содержащем 5 шМ ЭДТА и 0,2% Na2SC>4. Гомогенат фильтровали через Miracloth (Calbiochem) и центрифугировали 25 мин при 12000g и температуре 4°С. К полученному су-пернатанту при перемешивании добавляли Triton XI00 до конечной концентрации 1%. После инкубации в течение 15 часов при +4°С раствор центрифугировали при 17000g 15 мин. Вирус осаждали из полученного супер-натанта улътраценрифугированием в течение 3 часов в роторе SW41 на скорости 40000 оборотов в мин при +12°С через слой раствора сахарозы плотностью 1,2 г/ст3, приготовленного на 0,01 М калий-фосфатном буфере, рН 7,5, содержащем 5 шМ ЭДТА.

Вируссодержащий осадок ресуспендировали в бидистиллированной воде. Для дальнейшей очистки вирусный препарат подвергали ультрацентрифугированию в непреформированном градиенте хлористого цезия. Для этого 1,2 мл суспензии вируса смешивали с 0,6 мл насыщенного раствора CsCL Ультрацентрифугирование проводили в бакетном роторе центрифуги TL-100 «Вескшап» в течение 19 - 20 часов, при +4°С, при 55000 об./мин (150000g в центре бакета). Зона, содержащая вирусные частицы с плавучей плотностью 1,33 г/см3, легко обнаруживалась визуально. Отобранную вирусную зону пятикратно разбавляли бидистиллированной водой и центрифугировали в угловом роторе центрифуги TL-100 «Вескшап» в течение 30

мин при 4°С, при 50000 об./мин (около lOOOOOg). Вирусный осадок ресус-пендировали в 25 мкл бидистиллированной воды.

РНК ХВШ выделяли из препаратов очищенных вирионов методом фе-нольной депротеинизации. Вирусный препарат смешивали с равным объемом экстрагирующего буфера (200 мМ карбоната аммония, рН 9; 2мМ EDTA; 2% SDS). К раствору добавляли протеиназу К, до концентрации 15 мкг/мг и инкубировали 15 минут, при комнатной температуре. Затем проводили экстракцию равными объемами смесями фенол/хлороформ (1:1) и хлороформ/изоамиловый спирт (25:1). РНК осаждали 2,5 объемом этанола и 1/10 объемом ацетата натрия.

2. Синтез и клонирование кДНК.

Синтез первой цепи кДНК проводили обратной транскриптазой вируса лейкоза мышей, лишенной активности РНазы Н (M-MLV RT, RNase Н Minus, Promega). 1 мкг геномной РНК и 0.2 мкг олиго(сГГ) прогревали при 65°С в течение 5 мин, охлаждали до комнатной температуры и затем помещали в ледяную баню. Конечная инкубационная смесь (в объеме 50 мкл) содержала 50 мМ трис-HCl (рН 8,2), 8 мМ MgCb, 10 mM DTT, 50 шМ КС1, по 1шМ каждого dNTP, 50 ед. RNasin и 50 ед. обратной транскриптазы. Синтез кДНК проводили при 37°С в течение 2 часов.

Для получения второй цепи кДНК З'-концевой геномной РНК, выделенной из вирионов второго класса, амплификацию фрагментов ДНК осуществляли методом полимеразной цепной реакции (ПЦР). ПЦР проводили в термоблоке фирмы Perkin Elmer Cetus Apparatus. Реакции ставили в объеме 50 мкл под слоем вазелинового масла в пробирке «Eppendorf». Условия реакции: 10 гаМ Трис-HCl (рН8,4 при 20<>С), 50 mM КС1, 1,5 mM MgCh, 200 mM каждого dNTP, 0,25 mM каждого праймера, 0,05 мкг ДНК-матрицы, 5 ед. Taq-полимеразы. Реакцию проводили по приведенной ниже схеме:

Проводили 30 циклов ПЦР: денатурация - 1 мин при 94°С; отжиг - 1,5 мин при 50°С; синтез - 2 мин при 72°С. В качестве праймеров использовали олигонуклеотиды:

5'-CCGAATTCGTCGCGGGGACAAATGTTGTAGCAG-3\ комплиментарный З'-концу РНК ХВШ, содержащий сайт рестрикции EcoRI. 5'-GCGCATGCATGGTAATTGTCACG-3\ идентичный по последовательности 5'-концу гена 42 кДа белка содержащий на 5'-конце сайт рестрикции Sphl.

Поскольку оказалось, что амплифицированный фрагмент содержал внутренний сайт рестрикции EcoRI, после его обработки рестриктазами Sphl и EcoRI, образовывалось два фрагмента, которые встраивали в плаз-миду pGEM-7Zf линеаризованную в одном случае по сайтам Sphl и EcoRI, а во втором по сайту EcoRI. Лигирование проводили с помощью ДНК-лигазы фага Т4 2 часа при 14°С в объеме 30 мкл при следующих условиях: 50тМ Трис-HCl (рН7,6), ЮтМ MgCh , ImM ATP, 1шМ DTT, 5% ПЭГ 8000, 5 ед. Т4 ДНК-лигазы.

Лигазной смесью трансформировали компетентные клетки тетрациклин-устойчивого штамма E.coli XL-Blue (Stratagene Gene Cloning System) no методу, описанному Ханаханом (Hanahan, 1988). После трансформации клетки высевали на чашки с LB-агаром (Маниатис и др., 1984), содержащей 32 мкг/мл X-Gal, 0,15 mM IPTG, и 100 мкг/мл ампициллина.

В результате были получены два типа клонов, один из которых содержали вставку, соответствующую позициям 6440-7343, а другой - позициям 7344-8890 РНК ХВШ.

Для получения полноразмерных кДНК клонов геномной РНК ХВШ немного изменили условия ПЦР: увеличили концентрацию MgCh и каждого dNTP до 2 mM и 400 тМ соответственно. В реакции использовалась длиннопротягивающая Taq-полимераза DyNAZyme™II.

Проводили 30 циклов ПЦР: денатурация - 1 мин при 94°С; отжиг - 1 мин при 55°С; синтез - 6 мин при 72°С. В качестве праймеров использовали олигонуклеотиды:

5'-CCGAATTCTTTTTTTTTTTTTTTGTCGCGGGGACAAATGTTGTAGC AG-3', комплементарный З'-концу геномной РНК.

5'-GAGCTCGGATCCTAATACGACTCACTATAGGACTCAACCAAAACA

АСАСАСААС-3', содержащий 24 нуклеотида, идентичных 5'-концу геномной РНК и последовательность промотора для Т7 РНК-полимеразы, перед ними.

ПЦР-фрагмент длинной около 9 кв встраивали в плазмиды Bluescript II KS- и pUC 19 по сайту рестрикции Smal. Лигирование проводили в течении 12 часов. Трансформацию проводили в клетки DH5a.

3. Получение однонаправленных делеций.

Для секвенирования протяженных вставок кДНК получали клоны, содержащие однонаправленные делеции вставки кДНК, по методике Erase-a Base System (Promega).

Плазмидную ДНК, выделенную методом щелочного лизиса, и, преимущественно, находящуюся в сверхспирализованной форме, обрабатывали рестриктазами таким образом, чтобы линеаризованная плазмида имела 5'-выступающий липкий конец (или тупой конец) со стороны, предназначенной для укорачивания, и З'-выступающий липкий конец с другой стороны. При этом избегали использовать рестриктазы, обладающие «штриховой» активностью. Обработку приблизительно 5 мкг линеаризованной таким образом плазмидной ДНК экзонуклеазой III (Promega) проводили в 30 мкл раствора, содержащего 66 гаМ Трис-HCl (рН7,5) 0,66 шМ MgCh, Юед./мкл экзонуклеазы III. Реакцию проводили при 30°С, при этой температуре экзонуклеаза III удаляет около 200 З'-концевых нуклеотидов одной из цепей дуплекса в минуту. После добавления фермента с минутными интервалами отбирали по 2,5 мкл реакционной смеси и переносили в стоящие во льду пробирки с 7,5 мкл «S1-раствора» (45 шМ ацетат калия (рН4,6), 345 mM NaCl, 1,3 тМ ZnS04, 6,5% глицерин, 300 ед./мл S1 нуклеа-зы). По завершении отбора временных точек, пробирки инкубировали 30 мин при 20°С для удаления одноцепочечных участков S1 экзонуклеазой. Реакцию останавливали добавлением 1 мкл раствора, содержащего 0,3 М Трис-основания и 50 тМ ЭДТА. S1 нуклеазу инактивировали 10 мин инкубацией при 70°С. По 2 мкл из каждой пробирки анализировали в агарозном геле. Затем в каждую пробирку добавляли по 1 мкл «Смеси Кленова» (20

mM Трис-HCl (рН8,0), 100 гаМ MgCb, 0,1 ед./мкл фрагмента Кленова ДНК -полимеразы I) и по 1 мкл смеси dNTP (125 mM каждый) и инкубировали при 37°С. Через 10 мин в каждую пробирку добавляли по 40 мкл «Лигазной смеси» (50 mM Трис-HCl (рН7,6), 10 гаМ MgCb, 1 mM ATP, 5% ПЭГ, 1 mM DTT, 1 ед. T4 ДНК-лигазы. Лигирование проводилии 12-18 часов при 14 С, трансформацию компетентных клеток и отбор клонов проводили в соответствии с протоколом, приведенным выше.

4. Определение нуклетидной последовательности.

Нуклеотидную последовательность кДНК-вставок определяли методом Сэнгера (Sanger et al., 1977) используя модифицированную ДНК-полимеразу фага Т7 («Sequenase», United States Biochemical Corporation), универсальный прямой и обратный pUC/M13 сиквенсные праймеры (Pharmacia). Определение последовательности нуклеотидов проводили по протоколу для секвенирования двуцепочечных ДНК с помощью Т7 ДНК-полимеразы (Tabor & Richardson, 1987). Ниже приведены основные этапы процесса.

Отжиг: 2-3 мкг денатурированной плазмидной ДНК отжигали с 1 pmol праймера в 10 мкл буфера, содержащего 40 mM Трис-HCl (рН7,5), 20 mM MgCb и 50 mM NaCl. Отжиг проводили 2 мин. при 65°С, а затем, в течение 15-30 мин, смесь охлаждали до комнатной температуры.

Меченье: К отожженной матрице добавляли 1 мкл 100 mM DTT; 2мкл раствора 5mM dGTP, dCTP, dTTP, содержащего около 10 mCi [a p33]dATP и 2 мкл разведенной Т7 ДНК полимеразы (3-4 ед.). Смесь инкубировали 5-7 минут при комнатной температуре.

Терминирование: по окончании меченья реакционную смесь разливали по 3,5 мкл в четыре предварительно прогретые до 37°С пробирки помече-ные «G», «А», «Т» и «С», с 2,5 мкл раствора, содержащего 80 гаМ каждого из dNTP, 8 mM соответствующего ddNTP, 50 mM NaCl. Реакцию проводили в течении 5 минут при 37°С.

Останавливали реакцию добавлением 4 мкл буфера для нанесения (95% формамид, 20 mM ЭДТА, 0,05% бромфенолового синего и 0,05% ксилен-цианола FF).

Полученные образцы прогревали 2-5 мин при 80-90°С и наносили на 57% полиакриламидный денатурирующий гель. В каждый слот геля наносили по 2-3 мкл соответствующего образца. Электрофорез проводили с помощью макрофора фирмы LKB при постоянном напряжении (25-30 V/cm) при температуре 55°С. По окончании электрофореза проводили фиксирование геля в 10% уксусной кислоте, затем гель сушили на стекле при температуре 120°С. Экспонирование с рентгеновской пленкой РМВ проводили в течение 15-48 часов.

5. Отбор полноразмерных кДНК копий геномной РНК ХВШ.

Первичный отбор клонов проводили с помощью рестриктного анализа по сайтам рестрикции Xba I, Pvu II, EcoR I. Были отобраны клоны со вставками длинной около 9 кв. Эти клоны были отсеквенированы по концам. Отобраны клоны, концевые последовательности которых соответствуют концевым последовательностям геномной РНК.

6. Получение протопластов.

Протопласты получали из клеток сахарной свеклы, находящейся в середине логарифмической фазы роста. Клетки промывали раствором, содержащим 2 мМ CaS04 и 20 мМ аскорбата калия, pH 5,5 и осаждали центрифугированием. Супернатант удаляли и осадок суспендировали в среде: 0,4 М сорбит, 1 мМ CaS04, 2,5 шМ K2SO4, 20 mM MES-BTP, pH 6,3 (Среда А), содержащей 10 мМ аскорбата калия и гидролитические ферменты: 0,4% дрейсилаза (Kyowo Hakko Kogyo Со LTP., Япония), 0,1% целлюлизин (Calbiochem, США), 0,2% целлюлаза R-10 (Serva, ФРГ). Ферментацию проводили на качалке при 100 об/мин при 26°С в течении 1,5 часов. Выделившиеся протопласты фильтровали через Miracloth (Calbiochem, США) и дважды промывали средой А центрифугированием 5 мин при 100 g. Протопласты суспендировали в среде А при их концентрации 106/мл.

Протопласты сохраняли жизнеспособность, контролируемую по окрашиванию Флуоресцеина диацетата и исключению Эванса голубого, около 5 часов. По выбранным критериям не менее 90% протопластов в суспензии оставалось интактными во время эксперимента.

7. In vitro транскрипция.

Для синтеза РНК in vitro с полноразмерных кДНК клонов использовалась ДНК-зависимая РНК-полимераза фага Т7. Как было сказано выше, перед 5'-концом полноразмерных кДНК копий вирусного генома имелся промотор для РНК-полимеразы Т7. Перед транскрипцией пробы лианери-зовали после З'-конца ферментом рестрикции Bgl I, сайты которого находятся в молекуле вектора. При этом транскрипты на З'-конце содержат 201 не вирусных нуклеотидов.

Кэппированные in vitro транскрипты получали в обьеме 200 мкл, при следующих условиях: 40 mM Tris-HCl (рН 7,9), 10 шМ NaCl, 6 гаМ MgCh, 10 mM DTT, 2 mM spermidine, 0,05% Tween-20, 0,5 m7G(5')ppp(5')G, по 1,25 мМ ATP, СТР и UTP, 0,125 шМ GTP, 20 мг ДНК матрицы, по 200 ед. Rnasin и Т7 РНК-полимеразы.

Реакцию проводили 1 час при температуре 37°С. При необходимости транскрипты концентрировали осаждением этанола. Выход транскриптов обычно составлял 2 мкг на 1мкг ДНК матрицы.

8. In vitro трансфекция протопластов.

Протопласты осаждали центрифугированием 5 мин при 100 g и суспендировали в среде содержащей 0.45 M маннит, 15 мМ MgCh, 0,1% MES, рН 5,6 (среда В), разводя протопласты до концентрации 2,5-3,0 х 106 в мл. К 0,25 мл этой суспензии добавляют 10 мкл раствора РНК (вирионной РНК в количестве 10 мкг и транскриптов 150 мкг) и 0,25 мл среды В содержащей 40% ПЭГ 6000 и инкубируют 30 минут при комнатной температуре. Затем добавляют 15 мл среды W5, содержащей 154 мМ NaCl, 125 mM СаСЬ, 5 mM КС1, 5 мМ глюкозу, рН 5,6 - 6,0. Инкубируют 48 часов при комнатной температуре и слабом покачивании.

9. Электрофорез в сочетании с ИФА (Western blot).

Образцы для белкового электрофореза готовились следующим образом. Растительный материал гомогенизировали в жидком азоте, экстрагировали тремя объемами 50 мМ калий-фосфатного буфера рН 7.4, содержа-

щего 0.05% Твин 20. Экстракт осветляли 10 минутным центрифугированием. К 50-100 мкл осветленного экстракта добавляли такое же количество Sample буфера.

Белки фракционировали в 10% SDS-полиакриламидном геле по методу Лаеммли и электрофоретически переносили на нитроцеллюлозную мембрану. Фильтры инкубировали в 20 мМ Трис-буфере, рН7,5, содержащем 150 мМ NaCl и 3% бычьего сывороточного альбумина в течении 2 часов при комнатной температуре или 18 часов при +4°С, промывали дистиллированной водой и затем инкубировали с нужной антисывороткой в течении 1-1,5 часов при комнатной температуре. После этого фильтры промывали буфером, содержащим детергент (0,05% Tween 20), 3 раза по 5-10 мин и инкубировали с коньюгатом (антикроличьими антителами, конъюгирован-ными с пероксидазой хрена) 45 минут при комнатной температуре. Затем фильтры вновь промывали указанным выше буфером и обрабатывали раствором субстрата орто-дианизидина (Диа-М, г.Москва).

10. Электронная микроскопи.

Для изучения морфологии выделенных из растений вирионов мы применяли электронно-микроскопический метод негативного контрастирования. Использовался электронный микроскоп фирмы Хитачи (Япония), модель Н-500, инструментальное увеличение - 50000. Вирусные препараты наносились на медную сеточку с пленкой - подложкой и контрастировались 1% раствором уранилацетата, рН 5,0. На фоне плотного слоя вирионы выглядят «неокрашенными» и хорошо различимы.

11. Иммуносорбентная электронная микроскопия.

Метод Деррика заключается в учете сорбированных вирусных частиц на покрытых вирусспецифической сывороткой сетках-подложках: капельку Ас, разведенной 0,05М калий-фосфатным буфером, рН 7,4 (1:10), помещали на сетку для электронного микроскопирования, покрытую углеродно-формваровой пленкой. Инкубировали 5 мин. Избыток Ас удаляли фильтровальной бумагой, сеточку подсушивали на воздухе и помещали на каплю вируссодержащего раствора. После 15-минутной инкубации препарат про-

мывали калий-фосфатным буфером и водой, а затем контрастировали 1% раствором уранилацетата, рН 5,0.

Метод «декорирования» заключается в следующем: сначала сетку-подложку помещали на каплю вируссодержащего раствора и инкубировали 5 мин. После этого промывали калий-фосфатным буфером и просушивали на воздухе. Затем 15 минут инкубировали с Ас, промывали тем же буфером и водой, просушивали и помещали на каплю краски для негативного контрастирования (1% раствор уранилацетата, рН 5,0). Полученный препарат подсушивали и исследовали, используя электронный микроскоп фирмы Хитачи (Япония), модель Н-500, инструментальное увеличение - 50000.

12. Компьютерный анализ нуклеотидных и аминокислотных последовательностей и вторичной структуры РНК.

Выравнивание нуклеотидных и аминокислотных последовательностей, а так же расчет степени их гомологии проводили с помощью компьютерных программ GENEPRO (Riverside Scientific Enterprises) MULTALINE, которые позволяют вычислять процент сходства белков, основываясь на количестве идентичных и аналогичных аминокислотных остатков при оптимальном расположении аминокислотных последовательностей у нескольких белков.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ

1. РОД ALLEXVIRUSESi ПОИСК НОВЫХ ВИДОВ И ПРЕДЛОЖЕНИЯ ПО КЛАССИФИКАЦИИ И НОМЕНКЛАТУРЕ.

В начале 90-х годов в нескольких культурных видах рода Allium были обнаружены гибкие нитевидные вирусы, отличающиеся от обычно инфицирующих эти виды карла- и потивирусов как по серологическим свойствам, так и по морфологии вирусных частиц (Уan Dijk et al., 1991; Vishnichenko et al., 1993). Определение полной нуклеотидной последовательности геномной РНК двух вирусов - X вируса шалота (ХВШ) (Kanyuka et al., 1992) и X вируса чеснока (ХВЧ) (Song et al., 1998), указывает на то, что эти вирусы обладают генетическими элементами, характерными для карла- и потексвиру-сов, однако наличие гена кодирующего уникальный белок с молекулярной массой 32-42 кДа, ряд других структурных особенностей генома, морфологическая гетерогенность вирионов, а также чрезвычайно ограниченный спектр растений-хозяев позволяют рассматривать их как представителей новой группы фитовирусов.

Все обнаруженные представители этой группы фитовирусов инфицируют растения, принадлежащие к роду Allium. Задачей настоящего исследования был поиск вирусов, серологически родственных ХВШ, в растительных сообществах, в которых отсутствуют виды рода Allium, однако включены виды эволюционно близких таксонов. В качестве экспериментальной модели в работе были использованы популяции растений в Оранжереях Главного Ботанического Сада (ГБС) РАН, а также выращиваемые в ГБС в открытом грунте интродукционные образцы ряда цветочных культур.

В результате серологического скрининга популяций растений, выращиваемых в оранжереях и открытом грунте в ГБС РАН (Таблица 1), антиген, серологически родственный белку оболочки ХВШ, был обнаружен в двух видах рода Chlorophytum, в нескольких сортах лилий (Lilium L.),

Таблица 1. Виды растений из коллекции ГБС РАН, проанализированные методом иммуноблоттинга с использованием антиоыворотки к рекомбинантно-му белку оболочки ХВШ.

Сем. Liliaceae

Chlorophytum macrophyllum Aschers.

Chlorophytum elatum R.

Chlorophytum comosum Вас.

Dracaena surculosa L.

Dracaena hookeriana C. Koch.

Dracaena sanderiana

Dracaena fragrans Ker-Gawl.

Veltheimia viridiflora L.

Veltheimia capensis L.

Tupistra sp. L.

Drimiopsis maculata Lindl.

Lilium L., 16 сортов

Rhodeda japónica Roth et Kunth

Cordyline terminalis Kunth.

Agapanthus umbellatus d'Her.

Semele androgyna L.

Asparagus setaceus L.

Nolina longifolia Karw.

Dianella tasmanica Hoor.

Arthropodium cirrhatum R. Br.

Mondo jabuan (Sieb).

Hyacinthus orientalis L.

Tulipa L., 15 сортов.

Сем. Araceae

Calla L.

Сем. Amaryllidaceae

Amaryllis belladonna L. Fulbaghia violaceae L. Galanthus sp.L. Doryanthes excelsa Correa. Hippeastrum aulicum L. Haemanthus coccineus L. Amarillis L., 7 сортов. Clivia miniata Rgl. Zephyranthes candida Herb. Zephyranthes grandiflora Herb. Crinum moorey Hook. Crinum aciaticum L. Polianthes tuberosa Lav. Narcissus L., 16 сортов.

Сем. Orchidaceae

Xilobium pallidiflorum Rchb. Gondora truncata Rchb. Aspasia lunana Lindl. Calanthe masuca Lindl. Cattleya hybr. Veitch., 4 сорта. Maxillaria ochrabuce Rchb. Laelia anceps Lindl. Phalatnopsis aphrodite Rchb.

Сем. Iridaceae

Freesia sp. L.

Сем. Compositae

Chrysanthemum indicum L., 7 сортов.

Сем. Eucommiaceae

Eucommia punctata Oliv.

Сем. Moraceae

Ficus montana Burm.

Сем. Melastomataceae

Medinilla magnifica Lindl.

Сем. Saxifragaceae

Hydrangea hortensis L.

Сем. Rutaceae

Citrus limon L.

Сем. Geraniaceae

Geranium sp., L.

амариллисов {Amarillis L.) и нарциссов {Narcissus L.). В связи с тем, что в максимальной концентрации этот антиген присутствовал в листьях нарциссов на стадии цветения, соответствующий растительный материал был использован для получения очищенных вирусных препаратов. В таких препаратах, присутствовали два класса вирусного белка оболочки с молекулярными массами 28 кДа и 37 кДа (Рис. 2). При этом оказалось, что антисыворотка против рекомбинантного белка оболочки ХВШ (БО ХВШ-Ас) реагировала только с белком молекулярной массой 28 кДа, тогда как антисыворотка, полученная против высокоочищенных препаратов ХВШ (ХВШ-Ас), реагировала с белками обоих классов (Рис. 2).

Какие именно различия в первичной структуре 28К и 37К белков оболочки ХВШ-подобного вируса нарциссов обусловливают столь существенную разницу их кажущихся молекулярных масс, остается неясно. С целью объяснения этого явления может быть использована аналогия с ХВШ (Kanyuka et ah, 1992). Теоретически, открытая рамка считывания 5 (ген белка оболочки) в составе генома ХВШ кодирует белковый продукт с молекулярной массой 28 кДа, тогда как реальная электрофоретическая подвижность белка оболочки ХВШ соответствует молекулярной массе 32-36 кДа.

Сейчас трудно объяснить, почему при серологическом анализе методом иммуноблоттинга 37К белок оболочки ХВШ-подобного вируса нарциссов реагирует с антисывороткой ХВШ-Ас и не реагирует с антисывороткой БО ХВШ-Ас.

А Б В Г Д

Рисунок 2. Электрофоретический и серологический анализ очищенных препаратов ХВШ-подобного вируса нарцисса. А - электрофорез вирусного препарата в 10% полиакриламидном геле; окрашивание Кумасси синим В-250. Б и В - иммуноблоттинг препарата ХВШ-подобного вируса нарциссов, полученного методом дифференциального центрифугирования, с использованием БО ХВШ Ас и ХВШ Ас, соответственно. Г - иммуноблоттинг препарата ХВШ-подобного вируса нарциссов, полученного с использованием неионного детергента Тритон Х100 (БО ХВШ-Ас). Д - иммуноблоттинг очищенного препарата ХВШ, выделенного стандартным методом (БО ХВШ-Ас). Справа указаны молекулярные массы белков в кДа.

Исследование выделенных из листьев нарциссов очищенных вирусных препаратов методами иммуноэлектронной микроскопии выявило наличие в них массы гибких вирусных частиц, длиной около 800 нм и диаметром 12 нм (Рис. 3), Поскольку в этих экспериментах применили процедуру иммуно-сорбции с использованием БО ХВШ-Ас, очевидно, что исследуемые вирио-ны обладают определенным серологическим родством с ХВЩ; однако, при этом ХВШ-Ас декорировала и притом очень слабо, лишь незначительную часть присутствующих в таких препаратах вирусных частиц, что свидетель-

ствует об относительно низкой степени серологического родства исследуемого вируса с ХВШ.

Рисунок 3. Иммуноэлектронная микроскопия очищенных препаратов ХВШ-подобного вируса нарцисса. Иммуносорбцию осуществляли с использованием БО ХВШ Ас, декорирование - с использованием ХВШ Ас. Масштабная линия соответствует 100 нм.

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что в растениях нарциссов присутствует вирус, серологически родственный ХВШ и принадлежащий, как и предполагалось, к группе ХВШ-подобных фито-вирусов. Поскольку вирусная инфекция размножаемых вегетативно нарциссов носит, как правило, смешанный характер, представляется необходимым выделение ХВШ-подобного вируса нарциссов из вирусной смеси путем подбора дифференцирующего хозяина. Результаты предварительных экспериментов показали, что ХВИГ-лодобный вирус нарциссов способен репро-дуцироватся в сеянцах шалота в условиях моновирусной инфекции и накапливаться в значительных концентрациях.

Дальнейшее исследование этого вируса, в частности, установление нуклеотидной последовательности его геномной РНК, позволит получить полезную информацию о молекулярных механизмах эволюции нового семейства ХВШ-подобных фитовирусов, найденных в растениях рода Allium и получивших название Аллексивирусы (Allexiviruses).

2. МОНОВИРУСНАЯ ИНФЕКЦИЯ РАСТЕНИЙ X ВИРУСА ШАЛОТА: ГЕТЕРОГЕННОСТЬ НУКЛЕОТИДНОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ГЕНОМНОЙ РНК И МОРФОЛОГИЧЕСКАЯ ГЕТЕРОГЕННОСТЬ

ВИРИОНОВ.

2Л. Морфологическая гетерогенность вирионов ХВШ.

В большинстве вирусных препаратов, выделяемых из растений лука-шалота наряду с описанными ранее вирусными частицами, которые составляют большую часть популяции частиц ХВШ (гибкие частицы с модальной длиной 800 нм, диаметром 12 нм и с характерной поперечной исчерченно-стью) присутствуют вирионы диаметром 6 нм и, вероятно, большей длинной (Рис. 4, Б).

Рисунок 4. Электронные микрофотографии вирусных частиц, присутствующих в препаратах ХВШ, полученные из индивидуальных растений шалота: А - вирионы первого класса. Б - вирионы первого и второго классов. В - вирионы второго класса. Масштабные линии соответствуют 50 нм.

Частицы диаметром 12 нм были названы вирионами первого класса (ХВШ-1), а частицы с диаметром 6 нм - вирионами второго класса (ХВШ-II). В отдельных растениях 95% популяции вирусных частиц составляли вирионы ХВШ-11. Эти растения использовались для выделения высокоочищенных препаратов ХВЩ-И.

Рисунок 5. Электрофоретический анализ РНК ХВШ в 0.8% - ном агарозном геле. 1 - вирионная РНК частиц первого класса, 2 - вирионная РНК частиц второго класса

Как следует из результатов представленных на рисунке 5, вирионные РНК, выделенные из препаратов частиц первого и второго классов, обладают одинаковой электрофоретической подвижностью в неденатурирующих агарозных гелях. Результаты блот-1 ибридизационного анализа позволяют сделать вывод о высокой степени гомологии геномных РНК двух исследуемых классов частиц: при использовании радиоктивного зонда, комплементарного З'-концевому участку РНК ХВШ, и в условиях равных концентраций препараты РНК, выделенных из частиц первого и второго классов, характеризовались близкими уровнями интенсивности гибридизационншх сигналов.

В препаратах вирионов обоих классов в качестве основного компонента присутствуют белки с молекулярными массами 37кДа которые в экспериментах по иммуноблотингу интенсивно реагируют как с антисывороткой против рекомбинантного белка оболочки ХВШ, так и с антисывороткой против препаратов частиц второго класса (Рис. 6). О близком серологическом родстве белков оболочки вирионов первого и второго классов свидетельствуют также результаты экспериментов по иммунозлектронной микроскопии частично очищенных препаратов ХВШ (Рис. 7). Как следует из этих данных, антисыворотка против рекомбинантного белка оболочки

ХВШ интенсивно декорировала оба класса частиц. Аналогичные результаты были получены также при использовании в экспериментах по декорированию антисывороток, полученных против очищенных частиц первого или второго классов.

С;,: м ■■ Г .-2 5 Т:

I Я1:

иШШ»•••Лкя.; Ж»«® ,, _ .....— ; 111

I ■ Ж&ШМШ---,№

I ^

Рисунок 6. Элекгрофоретический и серологический анализ белков оболочки вирионов первого и второго классов. А - фракционирование в 10%-ном полиакриламидном геле белков оболочки вирионов первого (дорожка 1) и второго (дорожка 2) классов. Окрашивание Кумасси синим К-250. Слева указаны молекулярные массы (кДа) маркерных белков. Б и В - Иммуноблотинг белков оболочки двух различных препаратов вирионов первого (дорожки 1 и 2) и второго (дорожка 3) классов с использованием антисыворотки против рекомбинантного белка оболочки ХВШ (Б) или антисыворотки против препаратов вирионов второго класса (В).

Рисунок 7. Иммуноэлектронная микроскопия ХВШ второго класса с использованием антисыворотки против рекомбинантного белка оболочки ХВШ. Масштабная линия соответствует 50 нм.

2.2. Сравнительный анализ аминокислотных последовательностей.

На рисунке 8 представлена отсеквенированная 3'-концевая последовательность геномной РНК ХВШ-Н, длинной 2452 нуклеотидов, включающая ОРС 4-6.

Степень гомологии нуклеотидных последовательностей З'-концевых областей генома частиц первого и второго классов составляет 87%. При этом у генов 42К белка она равна 81%, белка оболочки - 98% и генов 15К белка - 95%.

АТ ОвТ ААТ ТОТ САСААСС Т Т ССАСАТ Т (2А.С 6С Т ССАС 6С (лАТ С ОТ 4 5

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Калошин, Алексей Алексеевич

выводы

1. На основании результатов серологического скрининга нескольких сотен растений, принадлежащих к 12-ти семействам, сделан вывод о чрезвычайно ограниченном спектре хозяев ХВШ-подобных вирусов и обнаружен новый представитель этой группы, поражающий некоторые виды семейства Amaryllidaceae.

2. В вирусных препаратах, полученных из индивидуальных растений Allium ascalonicum в условиях моноинфекции ХВШ, обнаружены вирионы двух морфологических классов. Показано что частицы с различной морфологией образуются при участии гомологичных геномных РНК и серологически идентичных белков оболочки, что дает основание рассматривать частицы обоих классов как различные формы вирионов ХВШ.

3. Определены частичные нуклеотидные последовательности геномных РНК двух морфологических классов вирионов ХВШ. В белке оболочки и 15К белке локализованы аминокислотные замены.

4. Проклонирована полноразмерная кДНК копия геномной РНК ХВШ под контролем промотора РНК полимеразы фага Т7. Показано, что в результате трансфекции протопластов сахарной свеклы РНК-транскриптами синтезируется белок оболочки и формируются вирусные частицы.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Совокупность полученных результатов позволяет рассматривать ХВШ, как новый вирус, эволюция которого находится, по видимому, в процессе развития. В пользу этого представления свидетельствуют ограниченность спектра хозяев и морфологическая гетерогенность вирусных частиц, обусловленная незначительными изменениями в аминокислотной последовательности его белка оболочки. Получение полноразмерной кДНК-копии геномной РНК ХВШ, синтез инфекционных транскриптов и создание эффективной модельной системы трансфекции протопластов сахарной свеклы позволит в дальнейшем детально исследовать молекулярные механизмы репликации геномной РНК, экспрессии вирусных белков и эволюции ХВШ.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Калошин, Алексей Алексеевич, 1999 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.

Аршава Н.В., Конарева Т.Н., Рябов Е.В. и Завриев С.К. (1995) 42К белок X вируса шалота экспрессируется в инфицированных растениях рода Allium. Молекулярная биология 29, 192-198.

Аршава Н.В., Конарева Т.Н., Черемушкина Н.П. и Завриев (1996) Идентификация компонентов вирусного комплекса, персистирующего в культурных растениях рода Allium. Сельскохозяйственная биология 30, 105111.

Аршава Т.В. (1996) Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук, М.

Гиббс А. Харрисон Б. (1978) Основы вирусологии растений.

Канюка К.В. (1991) Структура З'-концевой области РНК М вируса картофеля и возможные механизмы экспрессии генома вируса. Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук, М.

Левай К.Э. (1991) Структурная организация генома карлавирусов: М вирус картофеля и В вирус хризантемы. Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук, М.

Маниатис Т., Фрич Э. и Сэмбрук Дж. (1984) Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. М.Мир.

Развязкина Г.М. Капкова Е.А., Черемушкина Н.П. и Еременко В.Д. (1969а) Мозаичные болезни чеснока. Защита растений 12, 23.

Развязкина Г.М. Капкова Е.А. и Черемушкина Н.П. (19696) Клещи Acería tulipae (Eriophydae) переносчик вируса мозаики лука. Зоологический журнал 48, 288-289.

Рупасов В.В., Морозов С.Ю., Канюка К.В., Журина В.Ю. Лукашева Л.И. и Завриев С.К. (1990) Нуклеотидная последовательность и структурная организация геномной РНК М-вируса картофеля. Молекулярная биология, 24, 448-459.

Рябов Е.Б., Генерозов Э.В., Феттен Г.Д., Завриев С.К. (1996) Анализ З'-концевой области генома переносимого клещем нитевидного вируса свидетельствует о его принадлежности к группе X - вируса шалота. Молекулярная биология, 30, 104-110.

Рябов Е.В. (1994) Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук, М.

Прозенко А.Е. и Легункова P.M. (1961) Электронная микрофотография вируса мозаики лука. Микробиология 30, 165-167.

Adams A.N. & Barbara D.J. (1980) Host range, purification and some properties of hop mosaic virus. Annals of Applied Biology 96, 201-208.

Ahlquist P., Janda M., Loesch-Fries L.S. (1984) Multicomponent RNA plant virus infection derived from cloned viral cDNA, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A..,81,7066.

Ahlquist P (1986) In Vitro Transcription of infectious Viral RNA from Cloned cDNA. Methods in enzymology, 118, 704-716.

Angenent G. Posthumus E. & Bol J. (1989) Biological activity of transcripts synthesized in vitro from full-length and mutated DNA copies of tobacco rittle virus RNA 2. The Netherlands Received April 26, 68-76.

Barg E., Lesemann D.-E., Green S.K. & Yetten H.J. (1993) Identification, partial characterisastion and distribution of viruses infecting Allium crops in South and South-East Asian countries. Asracts of the Symposium an Allium for the Tropics. Bangkok 15-19.02.1993.

Baulcombe D., Chpman S., Kavanah Т., Santa-cruz S., Goulden M., Davies C., Kanyuka K. & Etessami P. (1991) The triple block and coat protein genes of potato virus X. Abstracts of FEBS Advanced Cource : The Plant Virus Genome: Structure and Expression. Riga, USSR 29.04.-5.05.1991. P. 16.

Beck D.L., Guilford P.J., Voot D.M., Anderson M.T. & Forster R.S.L. (1991) Triple gene block proteins of white clover mosaic potexvirus ara required for transport. Virology 183,695-702.

Biddle P.G. & Tinsley,T.W. (1971) Poplar mosaic virus.CMI/AAB Description of plant viruses No. 75.

Bos L. (1972) Ernstige uitbreidingvan uiegeelstreepvirus in prei. Gewasbescherming 3, 81-87.

Bos L. (1976) Oninon yellow dwarf virus. CMI/AAB Description of plant viruses No. 158.

Bos L., Huijberts N., Huttinga H & Maat D.Z. (1978a) Leek yellow stripe virus and its relationships to onin yellow dwarf virus; characterisation, ecology and possible control. Netherlands Journal of Plant Pathlogy 84, 185-204.

Bos L., Huttinga H & Maat D.Z. (1978b) Shallot latent virus, a new carlavirus. Netherlands Journal of Plant Pathlogy 84, 227-237.

Bos L. (1981) Leek yellow stripe virus. CMI/AAB Description of plant viruses No. 240.

Bos L. (1982a) Viruses and virus diseases of Allium species. Acta horticulturae 127, 11-29.

Bos L. (1982b) Shallot latent virus. CMI/AAB Description of plant viruses No. 250.

Bransom K.L., Weiland J.J. & Dreher T.W.(1991) Proteolytic maturation of the 206-kDa nonstructural protein encoded by turnip yellow mosaic virus. Virology 184, 351-358.

Brugidou C., Holt C., Ngon A Yassi M., Zhang S., Beachy R. & Fauquet C. (1995) Synthesis of an infectious full-length cDNA clone of Rice Yellow Mottle Virus and Mutagenesis of the Coat Protein. Virology 206, 108-115.

Burgyan J., Nagy P. & Russo M. (1990) Synthesis of infectious RNA cloned cDNA to RNA of cymbidium ringspot tombusvirus. Journal of General Viroloogy 71, 1857-1860.

Calvert E.L. & Harrison B.D. (1963) Outbreaks of tomato black ring virus in onion and leek crops in Northern Ireland. Hortic. Res. 2, 115-120.

Chapman S., Hills G., Watts J. & Baulcombe D. (1992) Mutational Analysis of the Coat Protein Gene of Potato Virus X: Effects on Virion Morphology and Viral Pathogenicity. Virology 191, 223-230.

Coleman J.E. (1992) Zink proteins: Enzymes, storage proteins, transcription factors, and replication proteins. Annual Rev. Biochem. 61, 897

Cress D.E., Kiefer M.C. & Owens R.A. (1983) Construction of infectious potato spindle tuber viroid cDNA clones. Nucleic Acids Research 11, 6821.

Cronin S., Verchot J., Haldeman-Cachill R., Schaad M.C. & Carrington J.C. (1995) Long-distance movement factor: A transport function of the potyvirus helper component proteinase. The Plant Cell 7, 549-559.

Dawson W.O., Beck D.L., Knorr D.A. & Grantham G.L. (1986) cDNA cloning of the complete genome of tobacco mosaic virus and production of infectious transcripts, Proc. Nat.,. Acad.Sci. U.S.A.,83, 1832.

Delecolle B. & Lot H. (1981) Yiroses de l'ail: I. Mise en evidence et essais de caracterisations par immuno-electromicroscopie d'un complexe de trois virus chez différentes populations d'ail atteintes de mosaique. Agronomie 1, 763-770.

Drake C.J., Tate H.D. & Harris H.M. (1933) The relationship of aphids to the transmission of ywllow dwarf of onion. Journal of economical Enthomology 26,841-846.

Forster R.L.S., Bavan M.W., Harriso S.-A. & Gardner K.S. (1988) The complete nucleotide sequence of the potexvirus white clover mosaic virus. Nucleic Acids Rasearch 16,291-303.

Foster G.D.& Mills P.R. (1991) Cell-free translation of American hop latent virus. Virus genes 5, 327-334.

Foster G.D.& Mills P.R. (1991) Translation of potato virus S RNA in vitro; evidence of protein processing. Virus Genes 6, 45-52.

Ge Z., Hiruki C. & Roy K.L. (1993) Nucleotide sequence of sweet clover necrotic mosaic virus RNA-1. Virus Research 28, 113-124.

Ganosa M.C.,Marliere P., Kofoid E.C., Lous B.G. (1985) Initiator tRNA may racognize more than the initation codan in mRNA: A model for translational initiation. Proc Nat. Acad. Sci. USA 82, 4587-4591.

Gerlach W.L., Buzayan J.M., Schneider I.R. & Bruening G. (1986) Satellite tobacco ringsport virus RNA: biological activity of DNA clones and their in vitro transcripts. Virology 151, 172.

Gibbs A.J. (1969) Plant virus classification.

Gilmer D., Bouzoubaa S., Gilley H.,Richards K. & Jonard G. (1992) Efficient cell-to-cell movement of beet necrotic yellow vein virus requires 3' proximal genes located on RNA2. Virology 189, 40-47.

Gramstat A., Courtpozans A. & Rohde W. (1990) The 12 kDa protein of potato virus M displays proierties of a nucleic acid - binding regulatory protein. FEBS Letters 276, 34-38.

Gramstat A., Prufer D. & Rohde W. (1993) Ribosomal frame- shifting and initiation: teo mechanisms operate in the expression of the 12K nucleic acid-binding protein of the carlaviruses. Abstracts of the IX International congress of virology, Glasgow, Abstract P61-12.

Guilford P.J. & Forster R.L.S. (1986) Detection of polyadenilated subgenomic RNAs in leaves infected with the potexvirus daphne virus X. Journal of General Virology 67, 83-90.

Hamilton W.D.O. & Baulcombe D.C. (1988) Infectious RNA Produced by in vitro Transcription of a Full-length Tobacco Rattle Virus RNA-1 cDNA. Journal of General Virology 70, 963-968.

Hanahan D. (1986) Teqniques for transformation of E.coli. In: DNA cloning: a practical approach. I.(Ed. by Glover D.M.) IRL Press Limited. Oxford , 1986.

Harrison B.D.,FinchJ.T.,Gibbs A.J., Hollings M., Shepperd R.J., Valenta V. & Wetter C. (1971) Sixteen groups of plant viruses. Virology 45, 356-363.

Henderson W.J., (1935) Yellow dwarf, a virus disease of onins, its control. Res. Bull. Iowa Agr. Exp. Stn. 188, 209-225.

Hillman B.I. & Lawrence D.M. (1993) Carlaviruses.

Holy S. & AbouHaidar M.G. Production of infectious in vitro transcripts from a full-length clover yellow mosaic virus cDNA clone. Journal of General Virology 74, 781-784.

Jacks T., Madhani H.D., Masiarz F.R. & Varmus H.E. (1988) Signals for ribosomal frameshifting in the Rous sarcoma virus gag-pol region. Cell 56, 447-458.

Janda M., French R., & Ahlquist P. (1987) High efficiency T7 polymerase synthesis of infectious RNA from cloned brome mosaic virus cDNA and effects of 5' extension on transcript infectivity, Virology, 158, 259.

Kadare G., Drugeon G., Savithiri H.S. & Haenni A.-L.(1992) Comparison of the strategies of expression of five tymovirus RNAs by in vitro translation studies. Journal of General Virology 73, 493-499.

Kanyuka K.V., Vishnichenko V.K., Levay K.E., Kondrikov D.Yu., Ryabov E.V. & Zavriev S.K. (1992) Nucleotide sequence of shallot virus X RNA reveals a 5'-proximal cistron closely related to those of potexviruses and a unique

arrangement of the 3'-proximal cistrons. Journal of General Virology 73, 2553-2560.

Kassanis B. (1955) Some properties of four viruses isolated from carnation plants. Annals of Applied Biology 43, 103-113.

Klement J.F., Ling M.-L., & McAllister W.T. (1986) Sequencing of DNA using T3 RNA polymerase and chain terminating ribonucleotide analogs. Gene Anal. Tech.,3, 59

Koonin E.V (1991) The phylogeny of RNA-dependent RNA polymerases of positive-strand RNA viruses. Journal of General Virology 72, 2197-2207.

Koonin E.V. & Dolja (1993) Evolution and taxonomy of positive-strand RNA viruses: implications of coomparative analysis of amino acid sequences. CRC Crit. Rev. Biochem Molec. Biol.

Koonin E.V., Mushegian A.R., Ryabov E.V. & Dolja (1991) Diverse groups of plant DNA and RNA viruses share related movevent proteins that may posess chaperone-like activity. Journal of General Virology 72, 2895-2903.

Kupke W. (1957) Die Gelbstreifigkeit, eine gefährliche Krankheit des Porrees. Rhein. Monatschr. Gem. Obst- Gartenbau 45, 173.

MacFarlane S.A. Gilmer D. & Davies J.W. (1992) Efficient inoculation with CaMV 35S promoter-driven DNA clones of the Tobravirus PEBV. Virology 187, 829-831.

McWhorter F.P. (1987) Cell inclusions in onion yellow dwarf. Phytopathology 27, 1627-1628.

Meeham B.M.& Mills P.R. (1991) Cell-free translation of carnation latent virus RNA and analysis of virus specific dsRNA. Virus genes 5, 175-181.

Meeham B.M.& Mills P.R. (1991) Nucleotide sequence of the 3'-terminal region of carnation latent virus. Intervirology 32, 262.

Melton D.A., Krieg, P.A., Rebagliati M.R., Maniatis T., Zinn K. & Green M.R. (1984) Efficient in vitro synthesis of biologically active RNA and RNA hybridization probes from plasmids containing a bacteriophage SP6 promoter, Nucleic Acids Res., 12, 7035.

Memelink J, Van Der Vlugt C.I.M., Linthorst H.J.M. Derks A.F.L.M. Asjes C.J. & Bol J.F. (1990) Homologies between the genomes of a carlavirus (lily

symptomeless virus) and a potexvirus (lily virus X) from lily plants. Journal of General Virology 71, 917-924.

Meshi T., Ishikawa M., Motoyoshi F., Semba K. & Okada Y. In vitro transcription of infectious RNAs from full-length cDNA of tobaco mosaic virus. Proc. Natl. Acad. Sci.USA. 83, 5043-5047.

Messiaen C.M. & Marrou J. (1965) Selection snitaire de 1'ail: deux slutions possible au probleme de la mosaique de Tail: plantes sensibles saines, ou plantes virosees tolerantes. C.R. Le J. Phytiatr. Phytopharm. Tr. Circummedit. Marseille: 204-206.

Mohamed N.A. & Young B.R. (1980) Leek yellow stripe virus (incidence in 19789) in New Zeaiand. New Zeland J. Agric. Res. 23, 129-131.

Morch M.-D., Boyer J.-Ch. & Haenni A.-L.(1988) Overlapping open reading frames revaeled by complete sequebcing of turnip yellow mosaic virus genomic RNA. Nucleic Acid Research 16, 6157-61-73.

Morch M.-D., Drugeon G., Szafrinski P. & Haenni A.-L. (1989) Proteolytic origin of the 150-kilodalton protein encoded by turnip yellow mosaic virus genomic RNA. Journal of Virology 63, 5153-5158.

Mori M., Mise K., Kobayashi K., Okuno T. & Furusawa I. (1991) Infectivity of plasmids containing broome mosaic virus cDNA linked to the cauliflower mosaic virus 35S RNA promoter. Journal of General Virology 72, 243-246.

Morozov S.Yu., Dolja V.V. & Atabekov J.G. (1989) Probable reassortment of genomic elements among elongated RNA-contained plant viruses. Journal of Molecular Evolution 29, 52-62.

Morozov S.Yu., Kanyuka K.V., Levay K.E. & Zavriev S.K. (1990a) The putative RNA replicase of potato virus M: obvous sequence similarity with potex-and tymoviruses. Virology 179, 911-914.

Morozov S.Y., Miroshnichenko N.A., Zelenina D.A., Fedorkin O.N., Solovijev A.G., Lukassheva L.I., Atabecov J.G. (1990b) Expression of RNA transcripts of potato virus X ful-length and subgenomic cDNAs. Biochimie 72, 677-684.

Morozov S.Y., Miroshnichenko N.A., Solovijev A.G., Fedorkin O.N., Zelenina D.A., Lukassheva L.I., Karasev A.V., Dolja V.V. & Atabecov J.G. (1991)

Exspression strategy of the poyato virus X tripe gene block. Journal of General Virology 72, 1-4.

Mundry K.W. & Gierer A. (1958) Die Erzeugung von Mutationen des Tabakmosaikvirus durch chemische Behandliung seiner NucleinsSiure in vitro. Z. ind. Abst. Vererbungslehre 89, 614.

Mundry K.W. (1960) Z. ind. Abst. Vererbungslehre 91, 87.

Nishiguchi M., Kiduchi S., Kiho Y., Ohno T., Meshi T. & Okada Y. (1985) Nucleic Acids Research 13, 5585.

Otsuki Y., Takebe I., Honda Y., Kajita S.& Matsu C. (1974) Infection of tobacco mesophyll protoplast by potato virus X. Journal of General Virology 22,375-385.

Perrin S. & Gilliand. G. (1990) Site-specific mutagenesis using asymmetric polymerase chain reaction and a single mutant primer. Nucleic Acids Research 18, 24, 7433-7437.

Petty I.T.D. & Jackson A.O. (1990) Mutational analisis of Barley Stripe Mosaic Virus RNA p. Virology 179, 712-718.

Racaniello V.R. & Baltimore D. (1981) Science 214, 916.

Rozanov M.N., Koonin E.V. & Gorbalenya A.E. (1992) Conservation of the putative methyltransferase domain: a hallmark of the 'Sindbis-like' supergroup of positive-strand RNA viruses. Journal of General Virology 73, 2129-2134.

Rupasov V.V., Morozov S.Yu., Kanyuka K.V. & Zavriev S.K. (1989) Partial nucleotide sequence of potato virus M shows similarities to potexviruses in gene arrangement and the encoded amino acid sequences. Journal of General Virology 70,1861-1869.

Ryabov E.V., Generozov E.V., Kendall T.L., Lommel S.A. & Zavriev S.K. (1994) Nucleotide sequence of carnation ringspot dinathovirus RNA-1. Journal of General Virology 75, 243-247.

Sambrook J., Fritsch E.F. & Maniatis T. (1989) Molecular cloning.

Semler B. L., Dorner A.J., Wimmer E. (1984) Production of infectious poliovirus from cloned cDNA is dramatically increased by SV40 transcription and replication signals. Nucleic Acids. Res. 12, 5123.

Song S.I., Song J.T., Kim C.H., Lee J.S. & Choi Y.D. (1998) Molecular characterization of the garlic virus X genome. Journal of General Virology 79, 155-159.

Schmeideskamp M. & Klevit R.E. (1984) Zinc finger diversity. Current Option in Structural Biology 4, 28-35.

Shi B.-J., Ding S.-W. & Symons R. (1997) Plasmid vector for cloning infectious cDNAs from plant RNA viruses: high infectivity of cDNA clones of tomato aspermy cucumovirus. Journal of General Virology 78, 1181-1185.

Sijen T., Wellink J., Hendriks J., Verver J. & Kämmen A. (1995) Replication of Coowpea Mosaic Virus RNA1 or RNA2 is Specifically Bloocked in Transgenic Nicotiana benthamiana Plants Expressing the Full-Length Replicase or Movement Protein Genes. MPMI 8, 3, 340-347.

Skryabin K.G., Morozov S.Yu., Kraev A.S., Rozanov M.N., Chernov B.K., Lukasheva L.I. & Atabekov J.G. (1988) Conserved and variable elements in RNA genomes of potexviruses. FEBS Letters 240, 33-40.

Soloviev A.G., Novikov V.K., Merits A., Savenkov E.I. Zelenina D.A. Tyulkina L.G. & Morozov S.Yu. (1994) Genome characterisation and taxonomy of Plantago asiatica mosaic potexvirus. Journal of General Virology 75, 259267

Sumi S, Tsuneyoshi T. & Furutani H. (1993) Novel rod-shaped viruses isolated from garlic, Allium sativum, posessing a unique genome organisation. Journal of General Virology 74, 1879-1885.

Tabor S. & Richardson Ch.C. (1987) DNA sequence analysis with a modified bacteriophage T7 polyverase. Proceedings of the National Academy of Sciences USA 84, 4767-4772.

Takamatsu N., Ishikawa M., Meshi T. & Okada Y. (1987) Expression of bacterial chloramphenicol acetyltransferase gene in tobacco plants mediated by TMV RNA. EMBOO J. 6, 307.

Taniguchi T., Palmieri M. & Weissmann C. (1978) Qß DNA-containing hybrid Plasmids giving rise to Qß phage formation in the bacterial host. Nature (London) 274, 223.

Tanvantzis S.M. (1984) Physicocemical properties of potato virus M. Virology 133, 427-430.

Tate H.D. (1935) Intracellular abnormalities associated with yellow dwarf of onions. Iowa State Coll. J.Sci. 9, 677-683.

Tate H.D. (1940) Insects as a vectors of yellow dwarf, a virus disease of onion. Iowa State Coll. J.Sci. 14, 267-294.

Tceremushkina N.P. (1974) Electron microscopy ultrathin sections study of the relationship between Allium mosaic virus and its vectjr-mite Aceria tulipae L. Comm. Inst. Biol. Pedol. Vladivostok 28, 174-177.

Tceremushkina N.P. (1975) The role of Aceria tulipae in spreading onion mosaic virus. Comm. Inst. Biol. Pedol. Vladivostok 28, 174-177.

Tsueyoshi T. & Simi S. (1996) Differentiation among garlic viruses in mixed infections based on RT-PCR procedures and direct tissue blotting immunoassays. Phytopathology 86, 253-259.

Vishnichenko V.K., Konareva T.N. & Zavriev S.K. (1993) A new filamentous virus in shallot. Plant Pathology 42, 121-126.

Van der Werf S., Bradley J., Wimmer E., Studier F.W. & Dunn J.J. (1986) Synthesis of infectious poliovirus RNA by purified T7 RNA polymerase, Proc. Natl. Acad. Sci.U.S.A., 83, 2330.

Van Dijk P., Verbeek M. & Bos L. (1991) Mite-borne virus isolates from cultivated Allium species, and their classification into two new rhymoviruses in the family Potiviridae. Nederlands Journal of Plant Pathology 97, 381399.

Van Dijk P. (1994) New mite borne virus isolates from rakkyo, shallot and wild leek species. Nederlands Journal of Plant Pathology

Van Emmelo J., Ameloot P. & Fiers W. (1987) Expression in plants of the cloned satellite tobacco necrosis virus genome and of derived insertion mutants.Virology 157, 480.

Van Vloten-doting L (1995) The Plant Viruses 1,117.

Walkey D.G.A., Webb M.J.W., Bolland C.J. & Miller A. (1987) Production of virus-free garlic (Allium sativum L.) and shallot (A. ascalonicum L.) by meristem-tip culture. Journal of Horticultural Science 62, 221-220.

Watson C.J. & Jackeson J.F. (1986) An alternative procedure for the synthesis of double -stranded cDNA for cloning in phage and plasmid vectors. In: DNA

cloning: a practical approach. I.(Ed. by Glover D.M.) IRL Press Limited. Oxford, 1986.

Waye M.M.Y., Yerhoeyen M.E., Jones P.T. & Winter G. (1985) EcoK selection vectors for shootgun cloning into M13 and deletion mutagenesis. Nucleic Acids Research 13, 23, 8560-8571.

Weber H., Haeckel P. & Peitzner A.J.P. (1992) Journal of Virology J., 3909-3912.

Weston J.H. & Mills P.R. (1993) 3'terminal gene expression of potato virus S. Abstracts of the IX International congress of virology, Glasgow, Abstract P61-13.

Wettere C. & Milne R.G. (1981) Tha Carlaviruses. In: Handbook of Plant Virus Infection and Comparative Diagnosis (Ed. by E.Krstak), pp 695-720. Elsevier/North Holland, Amsterdam.

Wittmann H.G. (1965) Die Proteinstruktur der Defektmutante PM2 des Tabakmosaikvirus. Z. ind. Abst. Vererbungslehre 97,297-304.

White K.A., Bancroft J.B. & Mackie G.A. (1992) Mutagenesis of hexanucleotide sequence conserved in potexvirus RNAs. Virology 189, 817-820.

White K.A., & Mackie G.A. (1990) Control and expression of 3' open reading frames in clover yellow mosaic virus. Virology 179, 576-584.

Woo Lee Y., Yamazaki S., Osaki T. & Inouye T. (1979) Two elongated viruses in garlic, garlic latent virus and garlic mosaic virus. Ann. Phytopath. Soc. Japan 45, 727-734.

Xiong Z. & Lommel S.A. (1989) The complete nucleotide sequence and genome organisation of red clover necrotic mosaic virus RNA-1. Virology 171, 543554.

Xiong Z., Kim K.H., Kemdall T.L. & Lommel S.A. (1993) Synthesis of the putative red clover necrotic mosaic virus polymerase by ribosomal frameshifting in vitro. Virology 193, 213-221.

Yamashita K., Sakai J. & Hanada K. (1996) Characterization of a New Virus from Garlic (Allium sativum L.), Garlic Mite-borne Mosaic Virus. Ann. Phytopathool. Sooc. Jpn. 62, 483-489.

Zavriev S.K., Kanyuka K.V. & Levay K.E.(1991) The genome organisation of potato virus M RNA. Journal of General Virology 72,9-14.

Zavriev S.K., Hickey C.M. & Lomrael S.A. (1995) Mapping of the Red Clover Necrotic Mosaic Virus Subgenomic RNA. Virology 216, 407-410.