Новый вирусный вектор на основе генома потексвируса для экспрессии целевых белков в растениях тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.02.02, кандидат наук Путляев, Егор Валерьевич

• Путляев, Егор Валерьевич
• кандидат наук
• 2015

Оглавление диссертации кандидат наук Путляев, Егор Валерьевич

ОГЛАВЛЕНИЕ

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Общая характеристика рода Рс^ехуигиэ

1.1 Структура генома

1.2 Вирусные белки, кодируемые геномом потексвирусов

2. Вирус мозаики альтернантеры

2.1 Структура генома ВМАльт

2.2 Белки, кодируемые геномом ВМАльт

3. Создание векторов на основе геномов представителей рода Ро/еху/гау

3.1 Полноразмерные вирусные векторы, полученные на основе генома ХВК

3.2 Деконструированные вирусные векторы на основе генома ХВК

3.3 Векторы на основе генома вируса мозаики альтернантеры (ВМАльт)

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

1. Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

2. Подбор праймеров для ПЦР

3. Рестрикция ДНК

4. Лигирование фрагментов ДНК

5. Трансформация бактериальных клеток

6. Выделение плазмидной ДНК

7. Электрофоретическое разделение нуклеиновых кислот в агарозном геле

8. Выделение фрагментов ДНК из агарозного геля

9. Выделение тотальной РНК из листьев растений ШсоНапа ЪеЫкатгапа

10. Получение кДНК-копий субгеномных РНК, образуемых векторами

11. Получение кДНК-копии фрагмента кодирующей последо-вательности гемагглютинина вируса гриппа А

12. Получение бинарного вектора р(АкМУ-5ищ1е)

13. Получение бинарного вектора р(АкМУ-с!оиЫе)

14. Получение бинарного вектора р(А1£МУ-1:пр1е)

15. Схема получения бинарного вектора р(АкМУ-с1оиЫе*)

16. Схема получения бинарного вектора р(АкМУ-с!оиЬ1е-МС8)

17. Схема получения бинарного вектора р(АкМУ-<ЗоиЫе-ОРР)

18. Схема получения вектора рСЩ-НАИЕШ

19. Схема получения бинарного вектора р(АНМУ^оиЫе-НАКЕШ)

20. Схема получения бинарного вектора р(АкМУ-с1оиЫе-ЬСС8Р)

21. Схема получения вектора рС^Е-ИССЗР

22. Электрофоретический анализ белков в денатурирующем полиакриламидном геле

23. Вестерн-блот

24. Агроинфильтрация листьев Шсойапа ЬепМат1апа

25. Анализ накопления целевых белков в листьях N. ЬешИат1апа

26. Получение вирусоподобных частиц из БО вируса мозаики альтернантеры, экспрессированного вирусными векторами в листьях N. ЪепМатгапа

27. Выделение целевых белков из листьев растения N. Ъепйгат'шпа

28. Экспрессия и выделение рекомбинантных белков из клеток Е. соН

29. Электронная микроскопия:

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Создание векторов с одним и двумя последовательно расположенными субгеномными промоторами, контролирующими экспрессию гена целевого белка

2. Исследование транскрипционной активности субгеномных промоторов в составе вектора АИМУ-скшЫе

3. Исследование вирусоподобных частиц, образующихся из БО ВМАльт при экспрессии вектора АкМУ-с!оиЫе в листьях N ЬепШат1апа

4. Экспрессия целевых белков различной природы в растениях N ЬемИатгапа с помощью вектора А11МУ-с1оиЬ1е

5. Изучение влияния введения дополнительного третьего СГП на

эффективность вектора АкМУ-с1оиЬ1е

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

БЛАГОДАРНОСТИ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

Названия вирусов:

ВАМК - вирус аукубы мозаики картофеля (PAMV — potato aucuba mosaic virus) ВМАльт - вирус мозаики альтернантеры (AltMV - Alternanthera mosaic virus) ВМАльт-Ми - штамм MU вируса мозаики альтернантеры (AltMV-MU — Alternantera mosaic virus strain MU)

ВМБК - вирус мозаики белого клевера (WC1MV - White clover mosaic virus)

ВМЖК - вируса мозаики жёлтого клевера (CYMV — Clover yellow mosaic virus)

BMJIc - вирус мозаики лисохвоста (FMV, FxMV — Foxtail mosaic virus)

BMH — вирус мозаики нарцисса (NMV — Narcissus mosaic virus)

BMO - вирус мозаики огурца (CMV - Cucumber mosaic virus)

ВМПап - вирус мозаики папайи (PMV - Papaya mosaic virus)

ВМПер — вирус мозаики перца (PepMV - Pepino mosaic virus)

ВМЦК - вирус мозаики цветной капусты (CaMV — Cauliflower mosaic virus)

BTM - вирус табачной мозаики (TMV - Tobacco mosaic virus)

крВТМ - тобамовирус крестоцветных (crTMV - crucifer-infecting tobamovirus)

XBK - X вирус картофеля (PVX - potato virus X)

Другие сокращения:

AT - аппарат Гольджи

АТФ - аденозинтрифосфат

БО - белок оболочки

БСА - бычий сывороточный альбумин

ВПЧ - вирусоподобная частица

вРНП - вирусный рибонуклеопротеид

вРНК- вирусная РНК

ГА - гемагглютинин

ЗФБ - зеленый флуоресцентный белок РСД - рецептор-связывающий домен ГТФ - гуанозинтрифосфат Да - дальтон

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота дНТФ - дезоксирибонуклеозидтрифосфат ДСН - додецилсульфат натрия к ДНК - комплементарная ДНК нт - нуклеотид

ЛСКМ - лазерная сканирующая конфокальная микроскопия

МАЖХ - металл-афинная жидкостная хроматография

ОРС - открытая рамка считывания

ПААГ — полиакриламидный гель

поли(А) — полиаденилатный тракт

НТО - нетранслируемая область РНК

НТФ - нуклеозид трифосфат

ПТУГ - посттранскрипционное умолкание генов

ПЦР - полимеразная цепная реакция

ПЭГ - полиэтиленгликоль

ПЭМ - просвечивающая электронная микроскопия

РНК - рибонуклеиновая кислота

РНП - рибонуклеопротеидный комплекс

РСА - рентгено-структурный анализ

СГП - субгеномный промотор

сгРНК - субгеномная РНК

ТБГ - тройной блок генов

ТЕМЕД - Ы^Ы'^'-тетраметилэтилендиамин

УТФ - уридинтрифосфат

УФ - ультрафиолет

ФБ - флуоресцентный белок

ЦБ - целевой белок ЦТ —ген целевого белка

чГ-КСФ - человеческий гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (hG-CSF - human granulocyte colony-stimulating factor) ЭДТА - этилендиаминтетраацетат натрия ЭПР - эндоплазматический ретикулюм

ICTV - international committee on taxonomy of viruses, международный комитет по

таксономии вирусов

CP - capsid protein, белок оболочки

MCS - multi-clonong site, множественный сайт клонирования

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Новый вирусный вектор на основе генома потексвируса для экспрессии целевых белков в растениях»

ВВЕДЕНИЕ

Создание вирусных векторов, позволяющих эффективно экспрессировать чужеродные белки в растенях, является важной задачей молекулярной вирусологии и растительной биотехнологии.

На сегодняшний день растения все чаще используются для накопления различных целевых белков (ЦБ). Растения обладают уникальным сочетанием свойств, делающих целесообразным производство в них ЦБ (Hefferton et al., 2012; Gleba et al., 2014). Во-первых, растения не требуют сложных условий культивирования, дорогостоящих питательных сред. Во-вторых, растения не имеют общих с человеком патогенов, что снижает опасность биологической контаминации конечного продукта. В-третьих, растения являются эукариотами, что также оказывается важным в ряде случаев (Twyman et al., 2003), когда требуется гликозилирование ЦБ или когда этот белок эффективно накапливается лишь в определенном компартменте клетки (например в эндоплазматическом ретикулуме). Таким образом, достижение высокой эффективности накопления ЦБ в растениях является безусловно актуальной задачей.

Одним из наиболее часто используемых подходов для экспрессии целевого белка в растении является заражение растения вектором, несущим последовательность гена ЦБ, созданным на основе генома вируса растения (Hefferton et al., 2012; Gleba et al., 2014; Lico, 2008). Вектор сохраняет способность вируса к репликации и, иногда, также к распространению по растению. Продукция ЦБ в растении также может быть получена путем создания трансгенного растения, содержащего ген соответствующего целевого белка. При этом скорость накопления ЦБ при использовании вирусного вектора как правило превышает скорость его накопления в трансгенном растении, и является технически менее сложным. В качестве основы для создания вирусного вектора часто используют геномы РНК-содержащих вирусов растений, в том числе вирусов, относящихся к группе Potexvirus, сем. Alphaflexiviridae, пор. Tymovirales

(по данным ICTV1). Такие вирусы характеризуются высоким уровнем накопления в зараженном растении, а также тем, что геномы этих вирусов реплицируются в цитоплазме - это исключает необходимость учитывать механизмы контроля транскрипции в ядре при создании нового вектора. В то же время, в силу компактности геномов РНК-содержащих вирусов добавление длинных чужеродных последовательностей связано с определенными трудностями, такими как, например, повышение вероятности выщепления чужеродной последовательности в ходе репликации вируса. Для успешной экспрессии ЦБ с помощью вектора, полученного на основе фитовируса, необходимо изучение процесса репликации вируса, а также исследования участков генома, регулирующих этот процесс. На сегодняшний день, несмотря на интенсивное развитие этого направления исследований, остаются невыясненными определенные аспекты репликации потексвирусов, в том числе неизвестна структура и точное расположение промоторов синтеза субгеномных РНК ряда потексвирусов, а также промторов синтеза их геномной и антигеномной РНК. Таким образом, создание вирусных векторов на основе генома РНК-содержащих вирусов является актуальной задачей молекулярной вирусологии, имеющей как прикладное, так и фундаментальное значение.

Объектом данного исследования и основой для создания новых векторных систем является штамм MU вируса мозаики альтернантеры (ВМАльт-МЦ), относящийся к роду Potexvirus (Ivanov et al., 2011). Геном ВМАльт представлен единственной позитивной молекулой РНК длиной 6606 нт. Вирионы имеют нитевидную форму и образованы молекулами белка оболочки вируса, уложенными в спиральную структуру вокруг геномной РНК. Геном вируса кодирует 5 вирусных белков: РНК-зависимую РНК-полимеразу (репликазу), три транспортных белка (также называемые белками тройного блока генов) и белок оболочки. В ходе репликации вирус способен образовывать субгеномные РНК, на матрице которых транслируются все вирусные белки, за исключением репликазы, которая транслируется непосредственно с геномной РНК.

'International Committee on Taxonomy of Viruses, URL: http://ictvonline.org/

Настоящая работа посвящена созданию новых вирусных векторов на основе генома вируса мозаики альтернантеры позволяющих достигать высокого уровня накопления в растениях ЦБ различной природы, и изучению участков генома ВМАльт, регулирующих процесс репликации.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1. Общая характеристика рода Potexvirus 1.1 Структура генома

Род Potexvirus - один из восьми родов, относящихся к порядку Tymovirales, семейству Alphaßexiviridae, согласно данным International Committee of Taxonnomy of Viruses на 2014 год (ICTV). Представители этого рода обладают гибкими, нитевидными вирионами, от 470 до 580 им в длину, построенными из мономеров единственного структурного белка оболочки (БО или CP — coat protein). Геном потексвирусов представлен одной молекулой РНК, позитивной полярности, 5' - конец которой кэпирован, в то время как на 3' конце расположена поли(А)-последовательность (Huang et ah, 2004; Huisman et ah, 1988). В составе генома имеется пять открытых рамок считывания (ОРС) (Рис.1). Первая ОРС кодирует вирусную РНК-зависимую-РНК-полимеразу (далее -репликазу). Центральный участок генома кодирует три перекрывающиеся ОРС, известных как тройной блок генов (ТБГ). Эти белки необходимы для транспорта вируса между клетками (Verchot-Lubicz, 2005). Последней с 3' конца является ОРС, кодирующая БО вируса, который нужен для сборки вирионов и транспорта между клетками (Huisman et al., 1988; Santa Cruz et ah, 1998).

В базе данных ICTV содержится 37 видов, относящихся к роду потексвирусов. Типичный представитель данного рода — Х-вирус картофеля (ХВК). Многие представители рода потексвирусов такие как: ХВК, вирус мозаики белого клевера (ВМБК), вирус мозаики лисохвоста (ВМЛс), X вирус зигокактуса, вирус желтой мозаики клевера и вирус мозаики бамбука (ВМБ) являются моделями для изучения молекулярных механизмов, управляющих вирусной репликацией и системного транспорта. Помимо прочего, на модели ХВК были открыты и изучены такие явления, как умолкание генов в растении (Hamilton and

Baulcombe, 1999) и R-ген опосредованный сайленсинг (Bendahmane et al., 1999; Santa Cruz and Baulcombe, 1993).

СГП1 СГП2 СГПЗ

m7G

Г»-

¿¿¿Репликаза;;:/ 2 «БО^1

:?1 3

5'HTP

crPHKl -2.1 тыс.нт crPHK2 — 1.4 тыс.нт сгРНКЗ - 0.9 тыслгг

(A)n

З'НТР

>-

сгРНК

Рис. 1. На рисунке изображена схема генома типичного представителя рода Potexvirus, X вируса картофеля (ХВК), длиной 6,4 тыс. нт. Серыми прямоугольниками обозначены ОРС генома вируса: репликаза, 1 — ТБ1, 2 — ТБ2, 3 — ТБЗ, БО — белок оболочки. Фигурными скобками отмечены области 5'- и 3 'НТО. Субгеномные промоторы (СГП): СГП1 — СГП синтеза субгеномной РНК1; СГП2 — СГП синтеза субгеномной РНК2; СГПЗ — СГП синтеза субгеномной РНКЗ; (А)п — поли(А)-тракт; кэп-структура.

В составе генома потексвирусов, как, впрочем, и других РНК-содержащих вирусов, присутствуют последовательности, регулирующие процессы репликации, транскрипции, трансляции, а также инкапсидации вирусного генома белком оболочки. (Liu et al., 2009; Verchot-Lubicz, 2007). Данные участки обычно располагаются в нетранслируемых областях генома, хотя могут и перекрываться с ОРС. Регуляторные последовательности у вирусов рода Potexvirus, насколько это известно на сегодняшний день, работают в положении in eis, то есть оказывают воздействие на ту молекулу РНК, в составе которой они находятся (Batten et al., 2003; Liu et al., 2009; Verchot-Lubicz et al., 2007). В первой части данного литературного обзора суммированы имеющиеся на сегодняшний день данные о цис-регуляторных элементах (цис-элементах) генома потексвирусов.

1.1.1 5'- концевые цис-регуляторные элементы генома потексвирусов.

5'НТО РНК ХВК имеет длину 83 нт без учета кэп-структуры. 5'-НТО ХВК также принято называть «оф-лидер» (Smirnyagina et al., 1991). При этом первые 41 нуклеотид с 5'-конца геномной РНК обозначаются как «а», а следующие 42 нуклеотида обозначаются как <ф». Участок а не содержит гуаниновых остатков и частично комплементарен 3'-проксимальному участку растительной 18S-pPHK. Было показано, что ар-лидер является энхансером трансляции, подобно П-лидеру вируса табачной мозаики (Smirnyagina et al., 1991; Gallie, 2002). Последовательность 5'-НТО входит в состав 5'-концевого участка геномной РНК с выраженной вторичной структурой, представленной двумя шпильками с терминальными выпетливаниями (Рис.2). Эти структуры были названы 5'SL1 (32106 нт) и 5'SL2 (143-182 нт) (считая от 5'-конца РНК соответственно) (Kim and Hemenway, 1996; Miller et al, 1998, 1999).

5'SL1 элемент является многофункциональным. Анализ эффективности транскрипции и репликации мутантов вируса, имеющих нарушения или вариации во вторичной структуре SL1, показал, что данная шпилька участвует в синтезе геномной и субгеномных РНК ХВК (Miller et al, 1998, 1999).

Шпилька 5'SL1, как это было показано методом SELEX (Систематическая эволюция лигандов путем накопления по экспоненциальному закону, Systemic Evolution of Ligands by Exponential enrichment), является необходимой для синтеза геномных и субгеномных (+) цепей РНК вируса. В особенности важен для функциональности этого элемента тетрануклеотид GAAA, входящий в состав концевой петли этой шпильки, и некомплементарная пара нуклеотидов С-С в ее стволе. Также было установлено, что 5'SL1 специфически связывается с белками из SlOO-фракции, полученной из лизата протопластов табака. Авторы предполагают, что данное взаимодействие играет важную роль в репликации вируса. (Kwon and Kim, 2006). Исходя из полученных данных, авторы предложили механизм переключения между репликацией и межклеточным транспортом вирусной РНК. При раздевании вириона в инфицированной клетке

первым освобождается от БО 5'-конец РНК, в том числе и 5'SL1, с которым связываются клеточные факторы запускающие трансляцию и репликацию вирусного генома. После накопления достаточного количества субгеномной РНК БО, и, как следствие, самого БО, данный белок связывается с 5'SL1, вытесняя связанные с ней клеточные факторы, и, таким образом, блокирует репликацию вируса. Далее запускается процесс одевания вирусной РНК и ее транспорта в соседнюю клетку. (Kwon and Kim, 2006). Данные, свидетельствующие в пользу этой модели, получены в работе Lough et al., 2006. Авторами была создана серия

m7G

4

ТБГ

Репликаза

5'SLl 5'SL2

ТБ2

TBI

ТЕЗ

БО

-(А)„

Условные обозначения

■—1 1-46 нт

38-47 нт

6428-6436 нт

ЕЗ 3'NUE

/

3'SL1 3'SL2 3'SL3

Рис. 2 Схема расположения 5'- и 3 '-концевых регуляторных участков геномной РНК ХВК. Схематически изображена геномная РНК ХВК Прямоугольниками обозначены ОРС генов вируса. Фигурными скобками обозначены границы 5'- и 3'-концевых регуляторных эелементов генома. Схематически изображены элементы вторичной структуры этих регуляторных участков — шпильки 5'SLl, 5'SL2, 3'SL1, 3'SL2, 3'SL3. Прямоугольниками с различной штриховкой обозначены последовательности регуляторных цис-элементов с известными функциями. 1-46 нт — АС-богатый элемент, связывающий клеточный белок р54. 38-47 нт — минимальный элемент, необходимый для сборки вириона. 6428-6436 нт — уридил-богатая последовательность. Прямоугольники с диагональной штриховкой — 3'-концевые ЫиЕ-элементы(Иеаг Upstream Elements). В составе 5'SLl обозначен GAAA тетрануклеотид, необходимый для инициации синтеза геномной цепи, (по Verchot-Lubicz et al., 2007).

векторных конструкций на базе генома ХВК, из которого были удалены тройной блок генов, ген белка оболочки. Чтобы картировать участок, отвечающий за межклеточный транспорт вирусной РНК, векторные конструкции имели делеции в 5'-концевой области вирусного генома. Для детекции межклеточного транспорта, в векторные конструкции был введен ген зеленого флуоресцентного белка (green fluorescent protein-ЗФБ). Далее растения трансформировали полученными векторами совместно с ХВК дикого типа. После этого проводился анализ межклеточного транспорта векторных РНК по наличию флюоресценции ЗФБ. Было показано, что делеция 107 и более н.т. с 5'-конца вирусной РНК (что как раз перекрывает район расположения структуры 5'SL1) блокирует межклеточный транспорт (Lough et al, 2006). Функции второй структуры 5'-НТО - 5'SL2 - в настоящее время подробно не изучены (Park et aL, 2014).

Кроме регуляторных участков с выраженной вторичной структурой в 5'НТО ХВК присутствуют неструктурированные регуляторные элементы. В области 1-46 нт, располагается участок, для которого наличие вторичной структуры не было показано, содержащий пять тетрануклеотидов АССА (Miller et al., 1998; Kim and Hemenway, 1996). Было продемонстрировано, что данные повторяющиеся последовательности, а особенно первая из них (10-13 нт), связывают р54 — хозяйский белок, важный для репликации вируса. Мутации данной области, приводившие к понижению афинности к р54, снижали эффективность накопления (+) РНК вируса в протопластах (Kim et al., 2002). Позицию 4-11 нт от 5'-конца занимает консервативный октануклеотид GUUAAGUU, встречающийся в том же положении у ряда других потексвирусов (Рис. 3), способный комплементарно взаимодействовать с четырьмя консервативными октануклеотидами во внутренней последовательности генома: на 3' конце ОРС репликазы и в составе субгеномных промоторов 1,2,3 (Kim and Hemenway, 1999). Путем внесения мутаций, приводящих к изменению степени комплементарности дынных последовательностей удалось показать, что комплементарное взаимодействие между концевым октануклеотидом и октануклеотидом в составе СГП 1 или 3 необходимо для синтеза

соответствующих субгеномных РНК (сгРНК). При этом, нарушение всех возможных вариантов комплементарных взаимодействий между октануклеотидом в составе 5'НТО и внутренними октануклеотидами, за счет внесения мутаций в краевой октануклеотид, приводило к радикальному снижению накопления геномной и всех субгеномных РНК, не оказывая заметного влияния на количество синтезируемой (-) РНК. Следовательно, дальние комплементарные взаимодействия являются необходимыми для репликации и транскрипции ХВК и, вероятно, других потексвирусов. (Kim and Hemenway, 1999; Ни et al„ 2007).

PVX 3' -CUU UUGAUUUG GUAUG

BaMV 3' -CUU UUGGUGAG GUUUG

CCMV 3" •GUU UUGUUUUG UCUUG

CYMV 3' -CUU UUGUUUUG CUUUU

FMV 3" -CUU UUGAGAAG GCUUU

NMV 3' -CUU UUGUUUGG UUGUG

PMV 3' • CUU UUCUUUGU GUUUC

PIAMV 31 -CUU UUGUUUGG AUGUG

PAMV 3" -CUU UUGUUUUG UUGUU

SMYEAV 3* -CUU AUAGGUUG UGUGA

WCIMV 3* -CUU UUGUUCUG CUCUG

Рис.3. Выравнивание 3 '-концевых последовательностей антигеномных матриц различных потексвирусов: ХВК (PVX); ВМБ (BaMV); Вирус обычной мозаики кассавы (CCMV); вирус мозаики желтого клевера (CYMV); вирус мозаики лисохвоста (FMV, ВМЛс); вирус мозаики нарцисса (NMV);eupyc мозаики папайи (PMV);eupyc мозаики подорожника азиатского (PlAMV);eupyc аукубы мозаики картофеля (.ВАМК\ РАМУ); вирус умеренного желтого края клубники (SMYEA V); вирус мозаики белого клевера (WCIMV, ВМБК). Консенсусная последовательность обозначена жирным шрифтом. (Kim and Hemenway, 1999).

1.1.2 3'- концевые цнс-регуляторные элементы генома потексвирусов

Основные данные о структуре и функциях З'-НТО потексвирусов получены при исследовании геномов ХВК и ВМБ.

З'НТО ХВК имеет длину 74 нт. Анализ нуклеотидной последовательности при помощи компьютерной программы 2икег МРОЬЭ показал, что данный участок предположительно образует три шпильки с концевым выпетливаниями (Рис. 4) (РШаьШг а а1, 2003).

Эти шпильки получили названия 8Ь1, 8Ь2 и БЬЗ соответственно их последовательному расположению от 3' к 5' концу геномной РНК (РШаьЫа^ еЬ а!., 2003). Наиболее термодинамически стабильными являются БЫ и БЬЗ. Показано, что 8ЬЗ необходима для синтеза (-) цепи РНК, при этом важны как целостность вторичной структуры шпильки, так и наличие консервативной после-

SL2 Рис. 4. Структура З'-НТО ХВК. На

SL3 v * ° — рисунке обозначены шпильки SL1, SL2, SL3. *

А и А с и

. с * w и обозначает старт последовательности

ft а с о и ^

и с и и

с-о о.с консервативного гексануклеотида ACAUAA;

\U»A А» II

о»с С.О „

^.с uac.o ссуассс.о стрелкой обозначен старт

последовательности U-богатого участка

А А

u-A UAUUUCU; < обозначает старт участка, в

et 1 о-и

U-A

a-u< котором располагаются предполагаемые

а д S NUE. (Ни et al., 2007)

довательности из 6 нт (консервативный гексануклеотид) в концевом выпетливании. В то же время последовательность нуклеотидов в двуцепочечном участке структуры БЬЗ не оказывает существенного влияния на эффективность синтеза (-) цепи РНК (РШаьШг а1, 2003).

Консервативный гексануклеотид ACNUAA - элемент, присутствующий в геноме большинства исследованных потексвирусов (Bancroft et al, 1991). Его расположение в терминальной петле SL3 или аналогичной структуры встречается в геноме 8 из 11 проанализированных потексвирусов (Pillai-Nair et al., 2003, Рис.5).

С помощью мутационного анализа были получены данные свидетельствующие о возможности комплементарного взаимодействия гексануклеотида с консервативными элементами во внутренних районах генома ХВК: октануклеотидами располагающиеся внутри ОРС полимеразы, в СГП 1, СГП 2 и СГП 3. (Ни et al, 2007). Нарушение этого комплементарного вза имодействия приводило к снижению уровня синтеза антигеномной матрицы на 98%. Авторы работы Ни et al, 2007 предполагают, что такие взаимодействия могут приближать 3'-конец (+) РНК к месту образования репликазы, что может значительно повысить вероятность инициации синтеза (-) цепи. В то же время сближение кэпированного 5'-конца и полиаденилированного 3'-конца в результате комплеметарного взаимодействия НТО с консервативными элементами внутри генома (Kim and Hemenway 1996, 1997, 1999; Miller et al 1998; Hu et al, 2007) может способствовать усилению эффективности трансляции геномной РНК, согласно модели «замкнутого кольца» (Kahvejian et al, 2001; Merrick et al., 2004).

Так же, как и в 5'- концевой области, в 3' НТО важная функциональная роль принадлежит участкам без выраженной вторичной структуры. К таким областям относится уридил - богатая последовательность (U-богатая последовательность), присутствующая в 3' НТО многих потексвирусов (Рис. 5), а также элементы, близкие по последовательности к NUE ("near upstream element") -сигналам полиаднилирования растительных мРНК. (Рис. 5). Следует, впрочем, отметить, что NUE могут входить в состав вторичной структуры, как, например, в случае ВМБ (Chen et al, 2003).

РУХ -----------------------------------------------------------------

ВаКУ----------иЛЛАССииОСАиСАиССиААААСАиСССССССииАСССиСАССССССиииСАААС

СушМУ—---------------------—-—---------------------------—--------

СУМУ иЛАССААССЛССААССАииСАиЛ1ЯШЛАиСААиЛААСДАССССССССАЛСС<К:ОиСССАСиС<Х?

гхму исаисаоцаоцацоацассаацааацааацссоосоаа--------исссссссиссиалсилис

ПНУ ---------------------------------------------------------------ТС

РАМУ----------------------------------------------------------------

Р1АМУ-----------------------------------------------------иАСиСииСААС

РМУ --------------иАААСАСАСииОАСССАСССССииСиииАССАСиАи1ШСии(КХКК:иАииО

8МУЕАУ----------иЛАСАиСАСиССААиАООСииААААиС<К?АСиииСиисиСАСиисииСиАСССА

у(с1му----------------------------------------------------------------

PVX-------------------------ЦААСиАСОиСЦАСАЦААСССАССССЦАСССС----АСиииСА

ВаМУ АААТС1ШиАСЛС0САСиси0ии0С0ШтС0САССЦАССиААССССиСССА(К:А0' — " - вАСС СутМУ------------------------ —иААС0ССАААСЦиААиАА0СС0и0и-----------——

СЮТ ЦииАСЦиОССССииАЦАЦАЦСОСОЦАиСССЦААААСЦЦААиСАОСАСиОСОАОАСССОЦАОАСЦи

РХШГ СССАССЦЦЦАСОСАССААОСЦСЦАиСОЛСАиАСОАССиААССиААСССАОСЦААССССЦСААиСС

ММУ ААОСАССЦССАОААЦЦОиААЦАОАААСАСЦАССАААСЦЦАААЦиАОиСЦСиССЦЦЦ—АиЛААСЦи

РАМУ-----------------------ЦААЦСОЦССЮАААСииААииАСОАСОООАСЦи------иСААС

Р1АМУСОиССАААОАСисиАААСАСиССАССЦАиССССАААСииААССАССССЦСААСССССисисиА1ШЦ

РМУ ОШШиСААААЦСЦССШПШОСиАЦАСЦАСАСОАААС1ШАСиАССЦАОШГиССЦ1Ш---------и

БМУЕАУССиССААиСАСиОССАиСААСиСААиАиАСиАСиАСииААСССиАСииАСАиАО----------в

ис1му----------------иааииоссииаисасиисасииааиаиаиси-

РУХ иАСиАиШШСиООиииСАиивиАиОААиАА4А'1'" > ' (А), ваму ииииооииисиАСАаиииииисс (А)„

СугаМУ---ССииииСиАААС1ШисиииССАСиАСиСССАи>.и ШТОАСССАОЛиАЧЛи (А),

СУМУ иис«;ио ^(А).

рхму асасаиссси л!1 (а)„

ЫМУ ииАСииССАСилиСл \ Л л' • л л / силиивлилии ( А ) в

раму асшгасштсисссилаиссссисацилааситсициа •'1! ( а ) »

р1аму иассоиииисшлшсшлшс v.!'а.' ' ссиасаассасиоалаоисискикюсссс (а)„

РМУ ССАААиииССиииСС(А)в

БМУЕАУиииоиШЛШС1ШиииССии( а) „

нс1му---сссишсисиии ••/• " л аццисаб(а)в

Рис. 5. Выравнивание последовательностей З'НТО различных потексвирусов. Консервативный для потексвирусов гексануклеотид отмечен красным шрифтом. Дополнительный потенциальный гексануклеотид обнаружен в геномах ВМЖК, ВМЛс, вирус мозаики подорожника азиатского, ВМПа. Вирусы, на основе последовательностей которых построено выравнивание: РУХ (ХВК); ВаМУ (ВМБ); СутМУ (ВМ цимбидиума); СУМУ (ВМЖК); РХМУ (ВМЛс); ЫМУ (Вирус мозаики нарцисса); РАМУ (Вирус мозаики-акуба картофеля); РЫМУ (Вирус

мозаики подорожника азиатского); SMYEA V (Вирус умеренного желтого края клубники); WCIMV (ВМБК). С обеих сторон от гексануклеотида отмечены палиндромные последовательности (подчеркивание). На рисунке также отмечены U-богатые последовательности (голубой шрифт) и NUE-подобные элементы (желтый шрифт). (Pillai-Nair et al., 2003)

U-богатая последовательность UAUUUUCU, занимает положение к 3'-концу от SL2 и частично с ней перекрывается. Данный элемент встречается в геномах 9 из 11 проанализироованных потексвирусов (Рис. 5, Pillai-Nair et al., 2003). Показана необходимость этой последовательности для связывания клеточных факторов р28 и р32 (Sriskanda et al, 1996). Функции данных белков неизвестны, однако, удаление U-богатой последовательности специфично нарушает синтез (-) цепи и приводит к резкому уменьшению эффективности размножения вируса. Замена двух последних нуклеотидов достаточна для подавления процесса синтеза (-) цепи (Pillai-Nair et al, 2003). Полученные данные позволили авторам предположить, что факторы р28 и р32 играют важную роль в репликации вируса (Sriskanda et al, 1996; Pillai-Nair et al, 2003).

Удаление участка между U-богатой последовательностью и предполагаемыми NUE (6412- 6424 нт) не влияет на уровень синтеза антигеномной цепи (Pillai-Nair et al, 2003).

На 3'-конце З'НТО ХВК присутствуют две перекрывающиеся AU-богатые последовательности UAUAAA, последовательность которых совпадает с NUE-элементами - сигналами полиаденилирования растительных мРНК (Rothnie et al, 1996), мРНК в ооцитах Xenopus (Fox et al, 1989) и мРНК некоторых параретровирусов (Sanfacon et al, 1994). Было показано, что удаление предполагаемых NUE из генома ХВК приводит к значительному уменьшению накопления (+) цепи. При этом уровень синтеза (-) цепей снижался меньше. Также, существуют данные о том, что замена единственного нуклеотида в аналогичной последовательности генома ВМБК приводит к критическому нарушению процесса репликации вируса (Guilford et al, 1991). Удаление 12 нт,

отделяющих U-богатый участок от начала первого из предполагаемых NUE, не оказывает заметного влияния на репликацию ХВК (Pillai-Nair et al, 2003).

Имеющиеся на сегодняшний день данные, позволяют заключить, что структурно- функциональная организация З'НТО ВМБ отличается от соответствующей области ХВК. (Рис. 6). Его длина составляет 142 нт. 3' НТО

D

С"» А , С А

А С

О С*

5." с е- о

А - II jf С -О в с-с - с* о с-с"- с (у О в - А

0-0

А^А

* * <Г - С _ -

О о о - А-А 0 I?

О - A f А

* С- С^-А „ Л

с

<Г°вАвЛоС-вООО"АСАС \ /Л*А\

В Сс л Ь H â I I С* В» f ? , î t î î Î А А А * А х

О - А С А - О А

.C-.iT А A A i

АО А С A tf»C

■^j о «*u в

О О 0*С О А СХЧ

Рис.6. Вторичная структура З'НТО ВМБ. Буквами A,B,C,D,E (Cheng and Tsai., 1999) обозначены шпильки с концевыми выпетливаниями. Шпилька Е образует псевдоузел с частью поли (А) тракта. (Chen etal., 2003)

ВМБ образует следующие элементы вторичной структуры (перечислены от 5' к 3' концу): структура подобная клеверному листу, шпилька с концевым выпетливанием и псевдоузел. (Huang et al, 2001) «Клеверный лист» принято подразделять на три домена — А, В, С, - являющиеся, по сути, отдельными шпильками с концевыми выпетливаниями (Huang et al, 2001). Делеция АБС-структуры приводит к неспособности данного мутанта накапливать БО в протопластах. (Cheng and Tsai, 1999). Делеционный анализ АВС-структуры показал, что домены В и С играют важную роль в репликации ВМБ. Домен А, судя по всему, не нужен для этого процесса. Делеция домена А приводила к нарушению распространения данного мутанта по растению, что позволяет предположить участие этого элемента в транспорте вирусной РНК. (Chen et al,

2003). ABC-структура способна, кроме того, связывать хеликазоподобный домен реплнказы ВМБ, причем связывание осуществляют концевое выпетливание шпильки В, часть ее ствола и неструктурированный участок с 3'конца данной области (Chen et al, 2003). Следующая за клеверным листом шпилька обозначается как домен D. В ее терминальном выпетливании присутствует консервативный для всех потексвирусов гексануклеотид ACNUAA. Анализ мутантов по З'НТО ВМБ показал, что сохранение шпильки D необходима для репликации вируса в протопластах (Tsai et al., 1999; Cheng and Tsai, 1999). Было показано, что С-концевой домен репликазы ВМБ, экспрессированный в Е. coli, способен связываться со шпилькой D. При этом специфичность связывания зависит от присутствия интактного консервативного гексануклеотида и части двучепочечного участка шпильки (Huang et al., 2001).

Следом за доменом D расположен псевдоузел, образованный шпилькой Е и частью поли(А)-тракта. С помощью метода мутационного анализа авторы работы Tsai et al., 1999 показали, что более 15 адениловых остатков входят в состав псевдоузла и необходимы для поддержания его структуры. Целостность данного структурного элемента критически важна для репликации ВМБ. Присутствия псевдоузла на 3' конце вирусной РНК достаточно для поддержания репликации ВМБ на низком уровне (29% от базового) (Cheng et al, 2001; Tsai et al, 1999). Кроме того, псевдоузел ВМБ связывает клеточные факторы: р43 и р51, причем, вероятно, белки связываются именно с поли(А)-трактом (Lin et al, 2007). Дополнительно, р51 может связываться с 11 нт из ствола шпильки D. Судя по всему, эти два фактора конкурируют за сайт связывания и оказывают противоположенное влияние на синтез (-) цепи РНК: р51 его подавляет, а р43 не влияет. Однако, р43 вытесняет р51 из комплекса с РНК. р43 идентифицирован как фосфоглицераткиназа хлоропластов растения N.tabacum (Lin et al., 2007). В работе Cheng et al., 2002 показано, что репликаза может связываться примерно с 20 5'-концевыми аденилатными остатками в составе поли(А) тракта ВМБ. Для локализации сайта инициации синтеза (-) РНК, авторы работы Cheng et al, 2002 определили последовательность кДНК соответствующей 5' концу -РНК. Данное

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Путляев, Егор Валерьевич, 2015 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Мухамеджанова А.А., Карпова О.В., Родионова Н.П., Атабеков И.Г. Неспецифическая активация трансляции инкапсидированной РНК потесквирусов с участием транспортного белка ТБГ1 X вируса картофеля // ДАН. 2009. Т. 428. № 2. С. 266-268.

2. Серазев Т.В., Надеждина Е С., Шанина Н.А., Лещинер А Д., Калинина Н.О, Морозов С.Ю. Вирионы и белок оболочки Х-вируса картофеля взаимодействуют с микротрубочками и способствуют полимеризации тубулина in vitro // Молекулярная биология. 2003. Т. 37 № 6. С. 1080-1088.

3. Aguilar-Yáñez J.M., Portillo-Lara R., Mendoza-Ochoa G.I., García-Echauri S.A., López-Pacheco F., Bulnes-Abundis D., Salgado-Gallegos J., Lara-Mayorga I.M., Webb-Vargas Y., León-Angel F.O., Rivero-Aranda R.E., Oropeza-Almazán Y., Ruiz-Palacios G.M., Zertuche-Guerra M.I., DuBois R.M., White S.W., Schultz-Cherry S., Russell C.J., Alvarez M.M. An influenza A/H1N1/2009 hemagglutinin vaccine produced in Escherichia coli.ll PLoS One. 2010. V. 5(7). P. el 1694.

4. Allison A.V., Shalla T.A. The ultrastructure of local lesions induced by potato virus X: a sequence of cytological events in the course of infection. Phytopathology. 1974. V. 64. P. 784-793.

5. Angelí S.M., Davies C., Baulcombe D.C. Cell-to-cell movement of potato virus X is associated with a change in the size-exclusion limit of plasmodesmata in trichome cells of Nicotiana clevelandii.// Virology. 1996. V. 216. P. 197-201.

6. Atabekov J.G., Rodionova N.P., Karpova O.V., Kozlovsky S.V., Poljakov V.Y. The movement protein-triggered in situ conversion of potato virus X virion RNA from a nontranslatable into a translatable form.// Virology. 2000. V. 271 P. 259263.

7. Atabekov J.G., Rodionova N.P., Karpova O.V., Kozlovsky S.V., Novikov V.K., Arkhipenko M.V. Translational activation of encapsidated potato virus X RNA by coat protein phosphorylation.// Virology. 2001. V. 286(2). P. 466-474.

8. Atabekov J., Dobrov E., Karpova O., Rodionova N. Potato virus X: structure, disassembly and reconstitution.// Mol.PlantPathol. 2007. V. 8 P. 667-675.

9. Balmori E., Gilmer D., Richards K., Guilley H., Jonard G. Mapping the promoter for subgenomic RNA synthesis on beet necrotic yellow vein virus RNA 3.// Biochimie 1993. V.75. P.517-521.

10. Bancroft J.B., Rouleau M., Johnston R., Prins L., Mackie G.A. The entire nucleotide sequence of foxtail mosaic virus RNA.// J Gen Virol. 1991. V. 72 № 9. P. 2173-2181.

11. Batten J.S., Yoshinari S., Hemenway C. Potato virus X: a model system for virus replication, movement and gene expression.// Mol Plant Pathol. 2003. V. 14 № 2. P. 125-131.

12. Baulcombe D.C., Lloyd J., Manoussopoulos I.N., Roberts I.M., Harrison B.D. Signal for potyvirus-dependent aphid transmission of potato aucuba mosaic virus and the effect of its transfer to potato virus X. // J. Gen. Virol. 1993. Vol. 74 (Pt 7). P. 1245-1253.

13. Baulcombe D.C., Chapman S., Santa-Cruz S. Jellyfish green fluorescent protein as a reporter for virus infections.// Plant J. 1995. V. 7 № 6. P. 1045-1053.

14. Barton K.A., Binns A.N., Matzke A.J., Chilton M.D. Regeneration of intact tobacco plants containing full length copies of genetically engineered T-DNA, and transmission of T-DNA to R1 progeny.// Cell. 1983. V. 32. P. 1033-1043.

15. Bayne E.H., Rakitina D.V., Morozov S.Y., Baulcombe D.C Cell-to-cell movement of potato Potexvirus X is dependent on suppression of RNA silencing.// Plant J. 2005. V. 44. P. 471-482.

16. Beck D.L., Guilford P.J., Voot D.M., Andersen M.T., Forster R.L.S. Triple gene block proteinsof white clover mosaic Potexvirus are required for transport.// Virology. 1991. V. 183 № 2. P. 695-702.

17. Bendahmane A., Kanyuka K., Baulcombe D.C. The Rx gene from potato controls separate virus resistance and cell death responses.// Plant Cell. 1999. V. 11 № 5. P. 781-92.

18. Boehm R. Bioproduction of therapeutic proteins in the 21st century and the role of plants and plant cells as production platforms.// Ann. N. Y. Acad. Sci. 2007. V. 1102. P. 121-134.

19. Callaway A., Giesman-Cookmeyer D., Gillock E.T., Sit T.L., Lommel S.A. The multifunctional capsid proteins of plant RNA viruses.// Annu. Rev. Phytopathol. 2001. Vol. 39. P. 419-460.

20. Chapman S., Kavanagh T.A., Baulcombe D.C. Potato virus X as a vector for gene expression in plants.// Plant J. 1992a. V. 2 № 4 P. 549-557.

21. Chapman S., Hills G., Watts J., Baulcombe D. Mutational analysis of the coat protein gene of potato virus X, effects on virion morphology and viral pathogenicity.//Virology. 1992b. V. 191 № 1 P. 223-230.

22. Chen I.H., Meng M., Hsu Y.H., Tsai C.H. Functional analysis of the cloverleaf-like structure in the 30-untranslated region of bamboo mosaic Potexvirus RNA revealed dual roles in viral RNA replication and long distance movement.// Virology. 2003. V. 315 № 2. P. 415-424.

23. Chen I.H., Chou W.J., Lee P.Y., Hsu Y.H., Tsai C.H. The AAUAAA motif of bamboo mosaic virus RNA is involved in minusstrand RNA synthesis and plusstrand RNA polyadenylation.// J Virol. 2005. V. 79 № 23. P. 14555-14561.

24. Chen I.H., Chu C.H., Lin J.W., Hsu Y.H., Tsai C.H. Maintaining the structural integrity of the Bamboo mosaic virus 3' untranslated region is necessary for retaining the catalytic constant for minus-strand RNA synthesis.// Virol. J. 2013. V. 10. P. 208.

25. Cheng C.P., Tsai C.H. Structural and functional analysis of the 3' untranslated region of bamboo mosaic Potexvirus genomic RNA.// J. Mol. Biol. 1999. V. 14 № 288(4). P. 555-565.

26. Cheng J.H., Ding M.P., Hsu Y.H., Tsai C.H. The partial purified RNA-dependent RNA polymerases from bamboo mosaic Potexvirus and potato virus X infected

plants containing the template-dependent activities.// Virus. Res. 2001. V. 28 № 80(1-2). P. 41-52.

27. Cheng J.H., Peng C.W., Hsu Y.H., Tsai C.H. The synthesis of minus-strand RNA of bamboo mosaic Potexvirus initiates from multiple sites within the poly(A) tail.// J. Virol. 2002. V. 76 № 12. P. 6114-6120.

28. Cho S.Y., Cho W.K., Choi H.S., Kim K.H. Cis-acting element (SL1) of Potato virus X controls viral movement by interacting with the NbMPB2Cb and viral proteins.// Virology. 2012a. V. 427. P. 166-176.

29. Cho S.Y., Cho W.K., Choi H.S., Kim K.H. Identification of tobacco proteins associated with the stem-loop 1 RNAs of Potato virus X.// Molecules and Cells. 2012b. V. 33. P. 379-384.

30. Cho S.Y., Cho W.K., Sohn S.H., Kim K.H. Interaction of the host protein NbDnaJ with Potato virus X minus-strand stem-loop 1 RNA and capsid protein affects viral replication and movement.// Biochemical and Biophysical Research Communications. 2012c. V. 417. P. 451-456.

31. Denis J., Majeau N., Acosta-Ramirez E., Savard C., Bedard M.C., Simard S., Lecours K., Bolduc M., Pare C., Willems B., Shoukiy N., Tessier P., Laçasse P., Lamarre A., Lapointe R., Lopez Macias C., Leclerc D. Immunogenicity of papaya mosaic virus-like particles fused to a hepatitis C virus epitope: evidence for the critical function of multimerization.// Virology. 2007. V. 20 № 363(1). P. 59-68.

32. Dickmeis C., Fischer R., Commandeur U. Potato virus X-based expression vectors are stabilized for long-term production of proteins and larger inserts.// Biotechnol. J. 2014. V. 9(11). P. 1369-79.

33. Dolja V.V., Grama D.P., Morozov S.Y., Atabekov J.G. Potato virus X-related single- and double-stranded RNAs.// FEB S Lett. 1987. V. 214. P. 308-312.

34. Doronin S.V., Hemenway C. Synthesis of potato virus X RNAs by membrane-containing extracts.// J. Virol. 1996. V. 70. P. 4795^1799.

35. Fedorkin O. N., Solovyev A. G., Yelina N. E., Zamyatnin A. A., Zinovkin R. A., Makinen K., Schiemann J. and Morozov S. Yu. Cell-to-cell movement of potato

virus X involves distinct functions of the coat protein.// J. Gen. Virol. 2001. V. 82 № 2. P. 449-458.

36. Fox C.A., Sheets M.D., Wickens M.P. Poly(A) addition during maturation of frog oocytes: distinct nuclear and cytoplasmic activities and regulation by the sequence UUUUUAU.//Genes Dev. 1989. V. 3 № 12B. P. 2151-2162.

37. Fraley R.T., Rogers S.G., Horsch R.B., Sanders P.R., Flick J.S., Adams S.P., Bittner M.L., Brand L.A., Fink C.L., Fry J.S., Galluppi G.R., Goldberg S.B., Hoffmann N.L., Woo S.C. Expression of bacterial genes in plant cells.// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1983. V. 80 P. 4803^1807.

38. Fu H., Pang S., Xue P., Yang J., Liu X., Wang Y., Li T., Li H., Li X. High levels of expression of fibroblast growth factor 21 in transgenic tobacco {Nicotiana benthamiana)./! Appl. Biochem. Biotechnol. 2011. V. 165(2) P. 465-75.

39. Gallie D.R. The 5'-leader of tobacco mosaic virus promotes translation through enhanced recruitment of eIF4F.// Nucleic. Acids. Res. 2002. V. 30(15). P. 34013411.

40. Garcia O., Koenig R., Lesemann D-E. Properties and classification of a Potexvirus isolated from three plant species in Argentina.// Phytopathology. 1983. V. 73. P. 1488-1492.

41. Geering A.D., Thomas J.E. Characterisation of a virus from Australia that is closely related to papaya mosaic Potexvirus.11 Arch. Virol. 1999. V. 144(3) P. 577952.

42. Gleba Y., Klimyuk V., Marillonnet S. Viral vectors for the expression of proteins in plants.// Curr Opin Biotechnol. 2007. V. 18(2). P. 134-141.

43. Gleba Y.Y., Tusé D., Giritch A. Plant viral vectors for delivery by Agrobacterium.ll Curr. Top. Microbiol. Immunol. 2014. V. 375 P. 155-92.

44. Guan H., Simon A.E. Polymerization of nontemplate bases before transcription initiation at the 3' ends of templates by an RNA-dependent RNA polymerase: an activity involved in 3' end repair of viral RNAs.//Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000. V. 7 №. 97(23). P. 12451-12456.

45. Guilford P.J., Beck D.L., Forster R.L. Influence of the poly(A) tail and putative polyadenylation signal on the infectivity of white clover mosaic Potexvirus.ll Virology. 1991. V. 182 № 1. P. 61-67.

46. Hamilton A.J. and Baulcombe D.C. A species of small antisense RNA in posttranscriptional gene silencing in plants.// Science 1999. V. 286 P. 950-952.

47. Hammond J., Reinsel M.D., Maroon-Lango C.J. Identification and full sequence of an isolate of Alternanthera mosaic Potexvirus infecting Phlox stolonifera. Arch. Virol. 2006. V. 151(3). P. 477-493.

48. Han Y.T., Hsu Y.H., Lo C.W., Meng M. Identification and functional characterization of regions that can be crosslinked to RNA in the helicase-like domain of BaMV replicase.// Virology. 2009. V. 389(1-2). P. 34-44.

49. Hendy S., Chen Z. C., Barker H., Santa Cruz, S., Chapman S., Torrance L., Cockburn W., Whitelam G. C. Rapid production of single-chain Fv fragments in plants using a potato virus X episomal vector.// Journal of Immunol. Methods. 1999. V. 231 P. 137-146.

50. Hefferton K.L. Plant virus expression vectors set the stage as production platforms for biopharmaceutical proteins.// Virology. 2012. V. 433(1). P. 1-6.

51. Howard A.R., Heppler M.L., Ju H.J., Krishnamurthy K., Payton M.E., Verchot-Lubicz J. Potato virus X TGBpl induces plasmodesmata gating and moves between cells in several host species whereas CP moves only in N. henthamiana leaves.// Virology. 2004. V. 328. P. 185-197.

52. Hsu H.T., Chou Y.L., Tseng Y.H., Lin Y.H., Lin T.M., Lin N.S., et al. Topological properties of the triple gene block protein 2 of Bamboo mosaic virus.// Virology. 2008. V. 379. P. 1-9.

53. Huang C.Y., Huang Y.L., Meng M., Hsu Y.H. and Tsai C.H. Sequences at the 3'-untranslated region of bamboo mosaic Potexvirus RNA interact with the viral RNA-dependent RNA polymerase.// J. Virol. 2001. V. 75. P. 2818-2824.

54. Huang Y.L., Han Y.T., Chang Y.T., Hsu Y.H. and Meng M. Critical residues for GTP methylation and formation of the covalent m7GMP-enzyme intermediate in

the capping enzyme domain of bamboo mosaic virus.// J. Virol. 2004. V. 78. P. 1271-1280.

55. Huang Y.L., Hsu Y.H., Han Y.T., Meng MmRNA guanylation catalyzed by the S-adenosylmethionine-dependent guanylyltransferase of bamboo mosaic virus.// J Biol Chem. 2005. V. 280(13). P. 13153-13162.

56. Huang Y.W., Hu C.C., Lin C.A., Liu Y.P., Tsai C.H., Lin N.S., Hsu Y.H. Structural and functional analyses of the 3' untranslated region of Bamboo mosaic virus satellite RNA.// Virology. 2009. V. 386. P. 139-153.

57. Huisman M.J., Linthorst H.J.M., Bol J.F. and Cornelissen B.J.C. The complete nucleotide sequence of potato virus X and its homologies at the amino acid level with various plus-stranded RNA viruses.// J. Gen. Virol. 1988. V. 69. P. 17891798.

58. Hu B., Pillai-Nair N., Hemenway C. Long-distance RNA-RNA interactions between terminal elements and the same subset of internal elements on the potato virus X genome mediate minus- and plus-strand RNA synthesis.// RNA. 2007. V. 13 №. 2. P. 267-280.

59. Ivanov P.A., Mukhamedzhanova A.A., Smirnov A.A., Rodionova N.P., Karpova O.V., Atabekov J.G. The complete nucleotide sequence of Alternanthera mosaic virus infecting Portulaca grandijlora represents a new strain distinct from phlox isolates.// Virus Genes. 2011. V. 42 №. 2. P. 268-271.

60. Jang C., Seo E.Y., Nam J., Bae H., Gim Y.G., Kim H.G., Cho I.S., Lee Z.W., Bauchan GR, Hammond J., Lim H.S. Insights into Alternanthera mosaic virus TGB3 Functions: Interactions with Nicotiana benthamiana PsbO Correlate with Chloroplast Vesiculation and Veinal Necrosis Caused by TGB3 Over-Expression.// Front. Plant. Sci. 2013. V. 4. P. 5.

61. Johnston J.C., Rochon D.M. Deletion analysis of the promoter for the cucumber mosaic necrosis virus 0.9-kb subgenomic RNA.// Virology. 1995. V. 214. P. 100109.

62. Ju H-J., Samuels T.D., Wang Y-S., Blancaflor E., Payton M., Mitra R., Krishnamurthy K., Nelson R.S., Verchot-Lubicz J. The potato virus X TGBp2

movement protein associates with endoplasmic reticulum-derived vesicles during virus infection.//Plant Physiol. 2005. V. 138. P. 1877-1895.

63. Kalinina N.O., Rakitina D.V., Solovyev A.G., Schiemann J., Morozov S.Y. RNA helicase activity of the plant virus movement proteins encoded by the first gene of the triple gene block.// Virology. 2002. V. 296. P. 321-329.

64. Kalthoff D., Giritch A., Geisler K., Bettmann U., Klimyuk V., Hehnen H-R., Gleba Y., Beer M. Immunization with plant-expressed hemagglutinin protects chickens from lethal highly pathogenic avian influenza virus H5N1 challenge infection.// Journal of virology. 2010. V. 84(22). P. 12002^-12010.

65. Kahvejian A., Roy G., Sonenberg N. The mRNA closed-loop model: the function of PABP and PABP-interacting proteins in mRNA translation.// Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 2001. V. 66. P. 293-300.

66. Karpova O.V., Zayakina O.V., Arkhipenko M.V., Sheval E.V., Kiselyova O.I., Poljakov V.Y., Yaminsky I.V., Rodionova N.P., Atabekov J.G. Potato virus X RNA-mediated assembly of single-tailed ternary 'coat protein- RNA-movement protein' complexes.//J. Gen. Virol. 2006. V. 87. P. 2731-2740.

67. Kendall A., Bian W., Maris A., Azzo C., Groom J., Williams D., Shi J., Stewart P.L., Wall J.S., Stubbs G. A common structure for the PotexvirusQS.il Virology. 2013. V. 436. P. 173-178.

68. Komarova T.V., Skulachev M.V., Zvereva A.S., Schwartz A.M., Dorokhov Y.L., Atabekov J.G. New viral vector for efficient production of target proteins in plants.// Biochemistry (Mosc). 2006. V. 71 №. 8. P. 846-850.

69. Kim K.H., Hemenway C. The 59 nontranslated region of potato virus X RNA affects both genomic and subgenomic RNA synthesis.// J. Virol. 1996. V. 70 P. 5533-5540.

70. Kim K.-H., Hemenway C. Mutations that alter a conserved element upstream of the potato virus X triple block and coat protein genes affect subgenomic RNA accumulation.//Virology. 1997. V. 232 P. 187-197.

71. Kim K.H., Hemenway C.L. Long-distance RNA-RNA interactions and conserved sequence elements affect potato virus X plus-strand RNA accumulation.// RNA. 1999. V. 5. P. 636-645.

72. Krishnamurthy K., Heppler M., Mitra R., Blancaflor E., Payton M., Nelson R.S., Verchot-Lubicz J. The potato virus X TGBp3 protein associates with the ER network for virus cell-to-cell movement.// Virology. 2003. V. 309. P. 135-151.

73. Kwon S.J., Kim K.H. The SL1 stem-loop structure at the 59-end of potato virus X RNA is required for efficient binding to host proteins and for viral infectivity.// Mol. Cells. 2006. V. 21. P. 63-75.

74. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. //Nature. 1970. V. 227. P. 680-685.

75. Lacasse P., Denis J., Lapointe R., Leclerc D., Lamarre A. Novel plant virus-based vaccine induces protective cytotoxic T-lymphocyte-mediated antiviral immunity through dendritic cell maturation. //Journal of Virology. 2008. V. 82. P. 785-794.

76. Laliberte Gagne M.E., Lecours K., Gagne S., Leclerc D. The F13 residue is critical for interaction among the coat protein subunits of Papaya mosaic virus.// The FEBS Journal. 2008. V. 275. P. 1474-1484.

77. Lecours K., Tremblay M.H., Gagne M.E., Gagne S.M., Leclerc D. Purification and biochemical characterization of a monomeric form of papaya mosaic Potexvirus coat protein.// Protein Expression and Purification. 2006. V. 47. P. 273-280.

78. Leclerc D., Beauseigle D., Denis J., Morin H., Pare C., Lamarre A., Lapointe R. Proteasome-independent major histocompatibility complex class I cross-presentation mediated by papaya mosaic virus-like particles leads to expansion of specific human T cells.//J. Virol. 2007. V. 81 №. 3. P. 1319-1326.

79. Lee Y.S., Lin B.Y., Hsu Y.H., Chang B.Y., Lin N.S. Subgenomic RNAs of bamboo mosaic Potexvirus-V isolate are packaged into virions.// J Gen Virol. 1998. V. 79(7). P. 1825-1832.

80. Lee Y.S., Hsu Y.H., Lin N.S. Generation of subgenomic RNA directed by a satellite RNA associated with bamboo mosaic Potexvirus: analyses of Potexvirus subgenomic RNA promoter.// J Virol. 2000. V. 74 №. 22 P. 10341-10348.

81. Lee S.C., Wu C.H., Wang C.W. Traffic of a viral movement protein complex to the highly curved tubules of the cortical endoplasmic reticulum.// Traffic. 2010. V. 11(7). P. 912-930.

82. Lee C.C., Ho Y.N., Hu R.H., Yen Y.T., Wang Z.C., Lee Y.C., Hsu Y.H., Meng M. The interaction between bamboo mosaic virus replication protein and coat protein is critical for virus movement in plant hosts.// J. Virol. 2011. V. 85(22). P. 1202212031.

83. Leshchiner A.D., Solovyev A.G., Morozov S.Y., Kalinina N.O. A minimal region in the NTPase/helicase domain of the TGBpl plant virus movement protein is responsible for ATPase activity and cooperative RNA binding.// J. Gen. Virol. 2006. V. 87. P. 3087-3095.

84. Leshchiner A.D., Minina E.A., Rakitina D.V., Vishnichenko V.K., Solovyev A.G., Morozov S.Y., Kalinina N.O. 2008. Oligomerization of the Potato virus X 25-kD movement protein.// Biochemistry (Moscow). 2008. V. 73. P. 50-55.

85. Li Y.-I., Cheng Y.-E., Huang Y.-L., Tsai C.-H., Hsu Y.-H., Meng M. Identification and characterization of the Escherichia coli-expressed RNA-dependent RNA polymerase of bamboo mosaic virus.// J. Virol. 1998. V. 72. P. 10093-10099.

86. Li Y.-I., Chen Y.-J., Hsu Y.-H., Meng M. Characterization of the AdoMet-dependent guanylyltransferase activity that is associated with the N terminus of bamboo mosaic virus replicase.// J. Virol. 2001a. V. 75. P. 782-788.

87. Li Y.I., Shih T.W., Hsu Y.H., Han Y.T., Huang Y.L., Meng M. The helicase-like domain of plant Potexvirus replicase participates in formation of RNA 5' cap structure by exhibiting RNA 5'-triphosphatase activity.// J. Virol. 2001b. V. 75(24). P. 12114-12120.

88. Lico C., Chen Q., Santi L. Viral vectors for production of recombinant proteins in plants. // Journal of Cellular Physiology. 2008. V. 216. P. 366-377.

89. Lico C., Capuano F., Renzone G., Donini M., Marusic C., Scaloni A., Benvenuto E., Baschieri S. Peptide display on Potato virus X, molecular features of the coat

protein-fused peptide affecting cell-to-cell and phloem movement of chimeric virus particles.// Journal of General Virology. 2006. V. 87 P. 3103-3112.

90. Lim H.S., Vaira A.M., Reinsei M.D., Bae H., Bailey B.A., Domier L.L., Hammond J. Pathogenicity of Alternanthera mosaic virus is affected by determinants in RNA-dependent RNA polymerase and by reduced efficacy of silencing suppression in a movement-competent TGB1.// J. Gen. Virol. 2010a. V. 91(1) P. 277-287.

91. Lim H.S., Vaira A.M., Domier L.L., Lee S.C., Kim H.G., Hammond J. Efficiency of VIGS and gene expression in a novel bipartite Potexvirus vector delivery system as a function of strength of TGB1 silencing suppression.// Virology. 2010b. V. 20 №402(1) P. 149-163.

92. Lim H.S., Vaira A.M., Bae H., Bragg J.N., Ruzin S.E., Bauchan G.R., Dienelt M.M., Owens R.A., Hammond J. Mutation of a chloroplast-targeting signal in Alternanthera mosaic virus TGB3 impairs cell-to-cell movement and eliminates long-distance virus movement.//J. Gen. Virol. 2010c. V. 91(Pt 8) P. 2102-2115.

93. Lin J.W., Ding M.P., Hsu Y.H., Tsai C.H. Chloroplast phosphoglycerate kinase, a gluconeogenetic enzyme, is required for efficient accumulation of Bamboo mosaic virus.//Nucleic Acids Res. 2007. V. 35 №. 2. P. 424-432.

94. Liu Y., Wimmer E., Paul A.V. Cis-acting RNA elements in human and animal plus-strand RNA viruses.// Biochim. Biophys. Acta. 2009. V. 1789 №. 9-10. P. 495-517.

95. Liu Z., Kearney C.M. An efficient Foxtail mosaic virus vector system with reduced environmental risk.//BMC Biotechnol. 2010. V. 10. P. 88.

96. Lough T.J., Shash K., Xoconostle-Cazares B., Hofstra K.R., Beck D.L., Balmori E., Forster R.L.S., Lucas W.J. Molecular dissection of the mechanism by which Potexvirus triple gene block proteins mediate cell-to-cell transport of infectious RNA.//Mol. Plant Microbe Interact. 1998. V. 11. P. 801-814.

97. Lough T.J., Netzler N.E., Emerson S.J., Sutherland P., Carr F., Beck D.L., Lucas W.J., Forster R.L.S. Cell-to-cell movement of Potexviruses: evidence for a

ribonucleoprotein complex involving the coat protein and first triple gene block protein.// Mol. Plant Microbe Interact. 2000. V. 13. P. 962-974.

98. Lough T.J., Lee R.H., Emerson S.J., Forster R.L., Lucas W.J. Functional analysis of the 59 untranslated region of Potexvirus RNA reveals a role in viral replication and cell-to-cell movement.// Virology. 2006. V. 351. P. 455-465.

99. Lukashina E., Badun G., Fedorova N., Ksenofontov A., Nemykh M., Serebryakova M., Mukhamedzhanova A., Karpova O., Rodionova N., Baratova L., Dobrov E. Tritium planigraphy study of structural alterations in the coat protein of Potato virus X induced by binding of its triple gene block 1 protein to virions.// The FEBS Journal. 2009. V. 276. P. 7006-7015.

100. Lukashina E., Ksenofontov A., Fedorova N., Badun G., Mukhamedzhanova A., Karpova O., Rodionova N., Baratova L., Dobrov E. Analysis of the role of the coat protein N-terminal segment in Potato virus X virion stability and functional activity.// Molecular Plant Pathology. 2012. V. 13. P. 38-45.

101. Maia I.G., Seron K., Haenni A.L., Bernardi F. Gene expression from viral RNA genomes.// Plant Mol. Biol. 1996. V. 32 №. 1-2. P. 367-391.

102. Mardanova E.S., Kotliarov R.Iu., Ravin N.V. The Optimization of Viral Vector Translation Improves the Production of Recombinant Proteins in Plants.// Mol Biol (Mosk). 2009. V. 43(3). P. 524-27.

103. Marconi G., Albertini E., Barone P., De Marchis F., Lico C., Marusic C., Rutili D., Veronesi F., Porceddu A. In planta production of two peptides of the Classical Swine Fever Virus (CSFV) E2 glycoprotein fused to the coat protein of potato virus X.// BMC Biotechnol. 2006. V. 6. P. 29.

104. Marillonnet S., Giritch A., Gils M., Kandzia R., Klimyuk V., Gleba Y. In planta engineering of viral RNA replicons: efficient assembly by recombination of DNA modules delivered by Agrobacterium. //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2004. V. 101(18). P. 6852-6857.

105. Mathieu C., Rioux G., Dumas M.C., Leclerc D.Induction of innate immunity in lungs with virus-like nanoparticles leads to protection against influenza and Streptococcus pneumoniae challenge.//Nanomedicine. 2013. V. 9(7). P. 839-848.

106. Mathioudakis M.M., Veiga R., Ghita M., Tsikou D., Medina V., Canto T., Makris A.M., Livieratos I.C.Pepino mosaic virus capsid protein interacts with a tomato heat shock protein cognate 70.// Virus Res. 2012. V. 163(1). P. 28-39.

107. Mechtcheriakova I.A., Eldarov M.A., Nicholson L., Shanks M., Skryabin K.G., Lomonossoff G.P. The use of viral vectors to produce hepatitis B virus core particles in plants.//J. Virol. Methods. 2006. V. 131(1). P. 10-15.

108. Merrick W.C. Cap-dependent and cap-independent translation in eukaryotic systems.// Gene. 2004. V. 12 №. 332 P. 1-11.

109. Miller E.D., Plante C.A., Kim K.H., Brown J.W. and Hemenway C. Stem-loop structure in the 59 region of potato virus X genome required for plus-strand RNA accumulation.//J Mol Biol 1998. V. 284 P. 591-608.

110. Miller E.D., Kim K.H. and Hemenway C. Restoration of a stem-loop structure required for potato virus X RNA accumulation indicates selection for a mismatch and a GNRA tetraloop.// Virology. 1999. V. 260 P. 342-353.

111. Minato N., Komatsu K., Okano Y., Maejima K., Ozeki J., Senshu H., Takahashi S., Yamaji Y., Namba S. Efficient foreign gene expression in planta using a plantago asiatica mosaic virus-based vector achieved by the strong RNA-silencing suppressor activity of TGBpl.// Arch Virol. 2014. V. 159(5). P. 885-896.

112. Mitra R, Krishnamurthy K., Blancaflor E., Payton M., Nelson R.S., Verchot-Lubicz J. The potato virus X TGBp2 protein association with the endoplasmic reticulum plays a role in but is not sufficient for viral cell-to-cell movement.// Virology. 2003. V. 312(1). P. 35-48.

113.Morozov S.Yu., Fedorkin O.N., Juttner G., Schiemann J., Baulcombe D.C., Atabekov J.G. Complementation of a potato virus X mutant mediated by bombardment of plant tissues with cloned viral movement protein genes.// J. Gen. Virol. 1997. V. 78(8). P. 2077-2083.

114. Morozov S.Y., Solovyev A.G., Kalinina N.O., Fedorkin O.N., Samuilova O.V., Schiemann J., Atabekov J.G. Evidence for two nonoverlapping functional domains in the potato virus X 25K movement protein.// Virology. 1999. V. 260(1). P. 5563.

115. Morozov S.Y., Solovyev A.G. Triple gene block: modular design of a multifunctional machine for plant virus movement.// J. Gen. Virol. 2003. V. 84. P. 1351-1366.

116. Nam J., Nam M., Bae H., Lee C., Lee B.C., Hammond J., Lim H.S. AltMV TGB1 Nucleolar Localization Requires Homologous Interaction and Correlates with Cell Wall Localization Associated with Cell-to-Cell Movement.// Plant Pathol. J. 2013. V. 29(4). P. 454-459.

117. Natilla A., Hammond R.W., and Nemchinov L. G. Epitope presentation system based on cucumber mosaic virus coat protein expressed from a potato virus X-based vector.//Arch. Virol. 2006. V. 151 №. 7. P. 1373-1386.

118.Nemykh M.A., Efimov A.V., Novikov V.K., Orlov V.N., Arutyunyan A.M., Drachev V.A., Lukashina E.V., Baratova L.A., Dobrov E.N. One more probable structural transition in Potato virus X virions and a revised model of the virus coat protein structure.// Virology. 2008. V. 373. P. 61-71.

119. O'Brien G.J., Bryant C.J., Voogd C., Greenberg H.B., Gardner R.C., Bellamy A.R. Rotavirus VP6 expressed by PVX vectors in Nicotiana benthamiana coats PVX rods and also assembles into viruslike particles.// Virology. 2000. V. 270(2). P. 444-453.

120. Ozeki J., Hashimoto M., Komatsu K., Maejima K., Himeno M., Senshu H., Kawanishi T., Kagiwada S., Yamaji Y., Namba S. The N-terminal region of the Plantago asiatica mosaic virus coat protein is required for cell-to-cell movement but is dispensable for virion assembly.// Mol. Plant. Microbe Interact. 2009. V. 22(6). P. 677-685.

121. Park M.R., Jeong R.D., Kim K.H. Understanding the intracellular trafficking and intercellular transport of Potexviruses in their host plants.// Front Plant Sci. 2014. V. 5. P. 60.

122. Park M.R., Park S.H., Cho S.Y., Kim K.H. Nicotiana benthamiana protein, NbPCIPl, interacting with Potato virus X coat protein plays a role as susceptible factor for viral infection. // Virology. 2009. V. 386. P. 257-269.

123. Pillai-Nair N., Kim K. H., Hemenway C. cis-Acting regulatory elements in the potato virus X 39 non-translated region differentially affect minus-strand and plusstrand RNA accumulation.// J. Mol. Biol. 2003. V. 326 P. 701-720.

124. Plante C.A., Kim K.H., Pillai-Nair N., Osman T.A.M., Buck K.W., Hemenway C.L. Soluble,template-dependent extracts from Nicotiana benthamiana plants infected withpotato virus X transcribe both plus- and minus- strand RNA templates.// Virology. 2000. V. 275. P. 444-451.

125. Pogue G.P., Lindbo J.A., Garger S.J., Fitzmaurice W.P. Making an ally from an enemy, plant virology and the new agriculture.// Annu. Rev. Phytopathol. 2002. V. 40. P. 45-74.

126. Rakitina D.V., Kantidze O.L., Leshchiner A.D., Solovyev A.G., Novikov V.K., Morozov S.Y., Kalinina N.O. Coat proteins of two filamentous plant viruses display NTPase activity in vitro // FEBS Lett. 2005. V. 579(22). P. 4955-4960.

127. Ravin N.V., Mardanova E.S., Kotlyarov R.Yu., Novikov V.K., Atabekov J.G. and Skryabin K.G. Complete Sequencing of Potato Virus X New Strain Genome and Construction of Viral Vector for Production of Target Proteins in Plants.// Biochemistry (Mosc). 2008a. V. 73 №. 1. P. 44-49.

128. Ravin N.V., Kuprianov V.V., Zamchuk L.A., Kochetov A.V., Dorokhov Y.L., Atabekov J.G., Skryabin K.G. Highly efficient expression of Escherichia coli heat-labile enterotoxin B subunit in plants using potato virus X-based vector.// Biochemistry (Mosc). 2008b. V. 73(10). P. 1108-1113.

129. Rodionova N.P., Karpova O.V., Kozlovsky S.V., Zayakina O.V., Arkhipenko M.V., Atabekov J.GLinear remodeling of helical virus by movement protein binding.//J. Mol. Biol. 2003. V. 333. P. 565-572.

130. Roggero P., Ciuffo M., Benvenuto E., Franconi R. The expression of a single-chain Fv antibody fragment in different plant hosts and tissues by using Potato virus X as a vector.// Protein Expr. Purif. 2001. V. 22(1). P. 70-74.

131. Rothnie H.M. Plant mRNA 3'-end formation./ZPlant Mol Biol. 1996. V. 32 №. 1-2. P. 43-61.

132. Sablowski R.W.M., Baulcombe D.C., and Bevan M. Expression of a flower-specific Myb protein in leaf cells using a viral vector causes ectopic activation of a target promoter.// Plant Bioligy. 1995. V. 92. P. 6901-6905.

133. Samuels T.D., Ju H-J., Ye C-M., Motes C.M., Blancaflor E.B., Verchot-Lubicz J. Subcellular targeting and interactions among the Potato virus X TGB proteins.// Virology. 2007. V. 367. P. 375-389.

134. Sanfacon H. Analysis of figwort mosaic virus (plant pararetrovirus) polyadenylation signal.// Virology. 1994. V. 198 №. 1. P. 39-49.

135. Saitoh H., Kiba A., Nishihara M., Yamamura S., Suzuki K., Terauchi R. Production of Antimicrobial Defensin in Nicotiana benthamiana with a Potato Virus X Vector.// Mol. Plant Microbe Interact. 2001. V. 14 №. 2 P. 111-115.

136. Santa-Cruz S., Baulcombe D.C. Molecular analysis of potato virus X isolates in relation to the potato hypersensitivity gene Nx.// Mol. Plant Microbe Interact. 1993. V. 6. P. 707-714.

137. Santa-Cruz S., Chapman S., Roberts A. G., Roberts I. M., Prior D. A. M., and Oparka K. J. Assembly and movement of a plant virus carrying a green fluorescent protein overcoat.// Plant Biology. 1996. V. 93 P. 6286-6290.

138. Santa Cruz S., Roberts A. G., Prior D. A., Chapman S., Oparka K. J. Cell-to-cell and phloem-mediated transport of potato virus X. The role of virions.// Plant Cell. 1998. V. 10. P. 495-510.

139. Sempere R.N., Gomez P., Truniger V., Aranda M.A. Development of expression vectors based onpepino mosaic virus.//Plant Methods. 2011. V. 11 №. 7. P. 6.

140. Seo E.Y., Nam J., Kim H.S., Park Y.H., Hong S.M., Lakshman D., Bae H., Hammond J., Lim H.S.. Selective Interaction Between Chloroplast betta-ATPase and TGB1L88 Retards Severe Symptoms Caused by Alternanthera mosaic virus Infection.// Plant Pathol. J. 2014. V. 30(1). P. 58-67.

141. Schepetilnikov M.V., Manske U., Solovyev A.G., Zamyatnin A.A. Jr, Schiemann J., Morozov S.Y. The hydrophobic segment of Potato virus X TGBp3 is a major determinant of the protein intracellular trafficking.// J. Gen. Virol. 2005. V. 86. P. 2379-2391.

142. Scholthof H.B., Scholthof K.-B.G., Jackson A.O. Plant gene virus vectors for transient expression of foreign proteins in plants.// Annu. Rev. Phytopathol. 1996. V. 34 P. 299-323.

143. Shivprasad S., Pogue G.P., Lewandowski D.J., Hidalgo J., Donson J., Grill L.K. and Dawson W.O. Heterologous sequences greatly affect foreign gene expression in tobacco mosaic virus-based vectors.// Virology. 1999. V. 255. P. 312—323.

144. Smirnyagina E.V., Morozov S.Y., Rodionova N.P., Miroshnichenko N.A., Solovev A.G., Fedorkin O.N., Atabekov J.G. Translational efficiency and competitive ability of mRNAs with 5'-untranslated alpha beta-leader of potato virus X RNA.//Biochimie. 1991. V. 73 №. 5. P. 587-598.

145. Smolenska L., Roberts I.M., Learmonth D., Porter A.J., Harris W.J., Wilson T.M., Santa Cruz S. Production of a functional single chain antibody attached to the surface of a plant virus.// FEBS Lett. 1998. V. 441(3). P. 379-382.

146. Spillane C., Verchot J., Kavanagh T.A., Baulcombe D.C. Concurrent suppression of virus replication and rescue of movement-defective virus in transgenic plants expressing the coat protein of potato virus X.// Virology. 1997. V. 236. P. 76-84.

147. Sriskanda V.S., Pruss G., Ge X., Vance V.B. An eight-nucleotide sequence in the potato virus X 3' untranslated region is required for both host protein binding and viral multiplication.//J. Virol. 1996. V. 70 №. 8. P. 5266-5271.

148. Takken F.L.W., Luderer R., Gabriels S.H.E.J., Westerlink N., Lu R., de Wit P.J.G.M., Joosten M.H.A.J. A functional clonoing strategy, based on a binary PVX-expression vector, to isolate HR-inducing cDNAs of plant pathogens.// Plant J. 2000. V. 24 №. 2 P. 275-283.

149. Tilsner J., Linnik O., Christensen N.M., Bell K., Roberts I.M., Lacomme C., Oparka K.J. Live-cell imaging of viral RNA genomes using a pumilio-based reporter.// Plant J. 2009. V. 57. P. 758-770.

150. Tilsner J., Linnik O., Wright K.M., Bell K., Roberts A.G., Lacomme C., Santa Cruz S., Oparka K.J. The TGB1 movement protein of potato virus X reorganises actin and endomembranes into the 'X-body' a viral replication factory.// PlantPhysiol. 2012a. V. 158. P. 1359-1370.

151.Tilsner J., Oparka K.J. Missing links?-The connection between replication and movement of plant RNA viruses.// Curr.Opin. Virol. 2012b. V. 2. P. 699-705.

152. Tilsner J., Linnik O., Louveaux M., Roberts I.M., Chapman S.N., Oparka K.J. Replication and trafficking of a plant virus are coupled at the entrances of plasmodesmata.// J Cell Biol. 2013. V. 201(7). P. 981-995.

153. Toth R.L., Chapman S., Carr F., Santa Cruz S. A novel strategy for the expression of foreign genes from plant virus vectors.// FEBS Lett. 2001. V. 489(2-3). P. 215219.

154. Tsai C.H., Cheng C.P., Peng C.W., Lin B.Y., Lin N.S., Hsu Y.H. Sufficient length of a poly(A) tail for the formation of a potential pseudoknot is required for efficient replication of bamboo mosaic Potexvirus RNA.//J Virol. 1999. V. 73 №. 4 P. 2703-2709.

155. Tseng Y.H., Hsu H.T., Chou Y.L., Hu C.C., Lin N.S., Hsu Y.H., Chang B.Y. The two conserved cysteine residues of the triple gene block protein 2 are critical for both cell-to-cell and systemic movement of Bamboo mosaic virus.// Mol.Plant Microbelnteract. 2009. V. 22. P. 1379-1388.

156. Twyman R.M., Stoger E., Schillberg S., Christou P., Fischer R.Molecular farming in plants: host systems and expression technology.// Trends Biotechnol. 2003. V. 21(12). P. 570-578.

157. Uhde-Holzem K., Schlosser V., Viazov S., Fischer R., Commandeur U. Immunogenic properties of chimeric potato virus X particles displaying the hepatitis C virus hypervariable region I peptide R9.// J. Virol. Methods. 2010. V. 166(1-2). P. 12-20.

158. Van-Esse H.P. Identification of HR-inducing cDNAs from plant pathogens via a Gateway(®)-compatible binary Potato virus X-expression vector.// Methods Mol Biol. 2012. V. 835. P. 97-105.

159. Voinnet O., Rivas S., Mestre P., Baulcombe D. An enhanced transient expression system in plants based on suppression of gene silencing by the pl9 protein of tomato bushy stunt virus.// Plant J. 2003. V. 33. P. 949-956.

160. Verchot J., Angell S. M., Baulcombe D. C. In vivo translation of the triple gene block of potato virus X requires two subgenomic mRNAs.// J. Virol. 1998. V. 72 P. 8316-8320.

161. Verchot-Lubicz J. A new model for cell-to-cell movement of PotexvirusQs.il Mol. Plant Microbe Interact. 2005. V. 18. P. 283-290.

162. Verchot-Lubicz J., Ye C.M., Bamunusinghe D. Molecular biology of Potexviruses: recent advances.//! Gen. Virol. 2007. V. 88(6). P. 1643-1655.

163. Wang Y., Cong Q.Q., Lan Y.F., Geng C., Li X.D., Liang Y.C., Yang Z.Y., Zhu X.P., Li X.D. Development of new potato virus X-based vectors for gene overexpression and gene silencing assay.// Virus Res. 2014. V. 191. P. 62-69.

164. White K.A., Bancroft J.B., Mackie G.A. Mutagenesis of a hexanucleotide sequence conserved in Potexvirus RNAs.// Virology. 1992. V. 189 P. 817-820.

165. Wu C.H., Lee S.C., Wang C.W. Viral protein targeting to the cortical endoplasmic reticulum is required for cell-cell spreading in plants.// J. Cell Biol. 2011. V. 193. P. 521-535.

166. Yang S., Wang T., Bohon J., Gagne M. E., Bolduc M., Leclerc D., Li H. Crystal structure of the coat protein of the flexible filamentous Papaya mosaic virus.// Journal of Molecular Biology. 2012. V. 422. P. 263-273.

167. Zamyatnin A.A., Solovyev A.G., Sablina A.A., Agranovsky A.A., Katul L.,Vetten H.J., Schiemann J., Hinkkanen A.E., Lehto K., Morozov S.Y. Dual-colour imaging of membrane protein targeting directed by poa semilatent virus movement proteinTGBp3 in plant and mammalian cells.// J. Gen.Virol. 2002. V. 83. P. 651662.

168. Zayakina O., Arkhipenko M., Kozlovsky S., Nikitin N., Smirnov A., Susi P., Rodionova N., Karpova O., Atabekov J. Mutagenic analysis of potato virus X movement protein (TGBpl) and the coat protein (CP): in vitro TGBpl-CP binding and viral RNA translation activation.// Mol. Plant Pathol. 2008. V. 9. P. 37-44.

169. Zhao Y., Owens R.A., Hammond R.W. Use of a vector based on Potato virus X in a whole plant assay to demonstrate nuclear targeting of Potato spindle tuber viroid.//J. Gen. Virol. 2001. V. 82(6). P. 1491-1497.

170. Zhou F., Wang M.L., Albert H.H., Moore P.H., Zhu Y.J. Efficient transient expression of human GM-CSF protein in Nicotiana benthamiana using potato virus X vector.// Appl. Microbiol. Biotechnol. 2006. V. 72(4). P. 756-762.

171.Zvereva A.S., Petrovskaya L.E., Rodina A.V., Frolova O.Y., Ivanov P.A., Shingarova L.N., Komarova T.V., Dorokhov Y.L., Dolgikh D.A., Kirpichnikov M.P., Atabekov J.G. Production of biologically active human myelocytokines in plants.//Biochemistry (Moscow). 2009. V. 74. P. 1187-1194.

БЛАГОДАРНОСТИ

Автор выражает глубочайшую признательность:

своему научному руководителю д.б.н. профессору Ольге Вячеславовне Карповой за научные консультации, помощь в планировании экспериментов и подготовке публикаций;

A.A. Смирнову и Е.А. Лазаревой за неоценимую помощь в планировании и проведении некоторых экспериментов;

всем своим многоуважаемым коллегам — Е.А. Трифоновой, Е.К. Петровой, H.A. Никитину, М.В. Архипенко — за дружественную атмосферу в лаборатории и помощь в работе;

П.А. Иванову и Е.В. Скурату за предоставление генетических конструкций;

всем сотрудникам кафедры вирусологии биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова во главе с академиком РАН Иосифом Григорьевичем Атабековым за возможность выполнения данной работы и за внимание к ней.