Изучение структуры транспортного вирусного рибонуклеопротеида X вируса картофеля и способов трансляционной активации РНК в его составе тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.06, кандидат биологических наук Никитин, Николай Александрович

• Никитин, Николай Александрович
• кандидат биологических наук
• 2008

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Никитин, Николай Александрович

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. СБОКА ПОТЕКСВИРУСОВ in vitro.

2. ДИССОЦИАЦИЯ ВИРИОНОВ ХВК

2.1. Влияние концентрации солей на диссоциацию вирионов.

2.2. Влияние температуры и детергентов на стабильность и диссоциацию вирионов ХВК.

2.3. Линейная дестабилизация и разборка вирионов ХВК при взаимодействии с ТБ1 ХВК.

2.4. Дестабилизация и разборка ХВК при фосфорилировании БО в составе вириона.

3. ТРАНСПОРТНЫЕ ФОРМЫ ВИРУСОВ РАСТЕНИЙ.

3.1 Транспортные формы потексвирусов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

РЕЗУЛЬТАТЫ.

1. Изучение структуры вРНП, собранного in vitro из РНК ХВК, БО и ТБ1.

1.1 В отсутствие РНК ХВК БО и ТБ1 образуют нерастворимый комплекс

1.2 Исследование методом АСМ частиц вРНП, образованных при различных молярных соотношениях «РНК : БО».

1.3 ТБ1 связывается с одним из концов вРНП.

1.4 Анализ вРНП методом торможения в геле.

1.5 Сборка вРНП начинается с 5-конца РНК ХВК.

2. Изучение трансляционной активации РНК в составе вРНП.

2.1 Фосфорилирование БО в составе ХВК.

2.2 Трансляционная активация РНК ХВК в составе вРНП.

2.3 Трансляционная активация РНК ХВК в составе вРНП,собранного из РНК и БО-Ptd.

2.4 БО мутантного ХВК, содержащего нефосфорилируемый N-конец утрачивает способность подавлять трансляцию

РНК в составе вРНП.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

ВЫВОДЫ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Изучение структуры транспортного вирусного рибонуклеопротеида X вируса картофеля и способов трансляционной активации РНК в его составе»

Транспорт вирусной инфекции в зараженном растении является одной из наиболее интенсивно изучаемых проблем современной фитовирусологии.

В момент заражения растения вирусом только небольшое количество клеток оказывается инфицированными. Для развития инфекции необходимо перемещение вируса от зараженных клеток в здоровые. Межклеточный транспорт фитовирусов является активным процессом, происходит через плазмодесмы и для него необходимы кодируемые вирусом транспортные белки (ТБ) (Atabekov & Dorokhov, 1984; Atabekov & Taliansky, 1990).

Объект нашего исследования - X вирус картофеля (ХВК) - типичный представитель рода Potexvirus семейства Flexiviridae, содержащий геномную одноцепочечную «плюс» РНК.

В литературе были предложены две модели транспортной формы при межклеточной транслокации генома потексвирусов: нативные вирионы (Oparka et al., 1996; Santa Cruz et al., 1998) или комплексы невирионного типа, состоящие из вирусной РНК, белка оболочки (БО) и транспортного белка (ТБ1) (Lough et al., 1998; 2000). При изучении транспортной формы вируса Lough et al. (1998) инкубировали вирусную РНК с БО и ТБ1 и использовали смесь для микроинъекций. Однако структура таких комплексов изучена не была.

Независимо от структуры транспортной формы, вирусная РНК в ее составе должна исключается из процессов репликации и трансляции и вновь становится доступной для рибосом в процессе развития инфекции.

Ранее в нашей лаборатории было показано, что в отличие от ряда вирусов, РНК ХВК в составе вириона недоступна для рибосом. Но она становится доступной в результате: 1) фосфорилирования N- концевого полипептида БО вируса in situ протеинкиназами серинового типа или 2) при взаимодействи ХВК с ТБ1 (Atabekov et al., 2000; 2001; Rodionova et al., 2003;).

В связи с этим, целью настоящей работы было изучение структуры рибонуклеопротеидов, собранных in vitro из РНК, БО и ТБ1 ХВК (возможной транспортной формы потексвирусов), а также выяснение возможности трансляционной активации РНК ХВК в составе тройных комплексов РНК-БО-ТБ1.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Вирусы рода Potexvirus семейства Flexviridae представляют собой нитевидные вирионы длиной 470-580 нм и шириной около 13 нм с однонитевой позитивной геномной РНК размером от 5,8 до 7,0 х 106 (Atabekov, 1995). Геномная РНК содержит на 5'-конце кэп-структуру, на 3'-конце - поли- А-последовательность и, как правило, 5 открытых рамок считывания (ОРС). 5'-проксимальный ген кодирует вирусную репликазу массой 165 кДа, транслирующуюся непосредственно с геномной РНК; три транспортных белка (ТБ1, ТБ2, ТБЗ - продукты «тройного блока генов») и белок оболочки транслируются с субгеномных РНК (Morozov et al., 1991). ОРС 5 на 3'-конце генома кодирует белок оболочки размером от 18 до 27 кДа.

Типовым представителем рода Potexvirus является X вирус картофеля (ХВК). Вирионы ХВК представляют собой гибкие нитевидные частицы длиной 515 нм и диаметром 13.5 нм. Вирион ХВК содержит около 1300 идентичных субъединиц белка оболочки (БО), упакованных в виде спирали, между оборотами которых заключена вирусная РНК (Tollin and Wilson, 1998). 8.9 субъединиц БО (каждая субъединица состоит из 236 аминокислотных остатков) приходится на один шаг спирали длиной 3,4 нм (Varma et al., 1968; Parker et al., 2002). Его геном представлен одноцепочечной «плюс» РНК длиной 6435 нуклеотидов (Skryabin et al., 1988). РНК ХВК кодирует пять белков: вирусную репликазу массой 165 кДа, три транспортных белка (ТБ1, ТБ2, ТБЗ массами 25 кДа, 12 кДа и 8 - кДа, соответсвенно) и БО массой 25 кДа (Morozov et al., 1991).

Для межклеточного транспорта ХВК необходимы все три транспортных белка (Morozov et al., 1991), а также БО (Chapman et al.,. 1992). Наиболее изученным является продукт первой ОРС ТБГ с молекулярной массой 25К (ТБ1). ТБ1 способен увеличивать пропускную способность плазмодесм (Lough et al., 2000); содержит последовательности, характерные для хеликаз (Gorbalenya et al., 1988); кроме того 25К обладает активностью ]\^2+-зависимой НТФазы и слабой РНК-связывающей активностью (Kalinina et al., 1996, 2002). Также ТБ1 является супрессором посттранскрипционного умолкания генов в растениях (Voinnet et al., 2000).

1. Сборка потексвирусов in vitro

Вирусы обладают уникальной способностью к самосборке in vitro. ХВК является первым нитевидным вирусом растений реконструированным in vitro из РНК и БО (Новиков и др., 1972; Goodman et al., 1975; Kaftanova et al., 1975; Dobrov and Atabekov, 1989; Goodman, 1977). Реконструкция вирусных частиц была наиболее эффективной при рН от 6,5 до 7,0 от 20 до 25°С и низкой ионной силе инкубационного буфера (0,01 М). В этих условиях выход реконструированных частиц составлял 40-60%. При повышении ионной силы при добавлении в инкубационную смесь NaCl или КС1 до концентрации 0,1 М сборка не происходила. По данным электронной микроскопии, полученные реконструированные частицы отличались от нативного вируса более рыхлой структурой и меньшей длиной частиц по сравнению с вирионами ХВК (Новиков и др., 1972). Однако в работе Kaftanova с соавторами (1975) не были обнаружены различия в структуре вириона и вирусного рибонуклеопротеида (вРНП), реконструированного из РНК и БО ХВК. Инфекционность таких частиц была ниже нативного ХВК (Dobrov and Atabekov., 1989).

Схожие результаты были получены Goodman с соавторами (Goodman et al., 1975, 1976, 1977), который использовал штамм XnR ХВК. Goodman с соавторами показал, что наиболее эффективно реконструкция идет при более низких рН (6,0 — 6,2), а в течение первых минут реконструкции мутность раствора увеличивается более чем на 50% (OD3i0)

Goodman et al., 1975). Было обнаружено, что, несмотря на то, что 0,1 М NaCl ингибирует сборку ХВК (Новиков и др., 1972), сборка не ингибировалась при добавлении в инкубационную смесь цвиттер-ионного буфера (например, бицин или морфолин) до конечной концентрации 0,2 М (Goodman et al., 1975).

Для другого потексвируса, вируса мозаики папайи (ВМП), обнаружено, что наиболее эффективно реконструкция происходит при рН 8.0, 25°С и низкой ионной силе. Эффективность образования реконструированных частиц в этих условиях достигала 90%, но инфекционность была низкой (всего несколько процентов) (Erickson and Bancroft, 1978), как и в случае реконструированных частиц ХВК. Показано, о что на первом этапе сборки ВМП формируются короткие (около 500А) частицы, независимо от температуры (от 1°С до 25°С), но элонгация происходит только при 25°С. При 1°С (или 25°С, но с небольшим количеством белка) образуются только короткие частицы. Фрагменты РНК, выделенные из этих частиц, имели длину около 200 нуютеотидов с 5'-конца. Определен нуклеотидный набор этих фрагментов. Было обнаружено, что эти фрагменты РНК богаты аденином (42% против 33% в тотальной РНК) и бедны гуанином (16 против 22%, соответственно) (Abou-Haidar and Bancroft, 1978).

Основные результаты по реконструкции потексвирусов были получены несколько десятилетий назад. С тех пор изменились методы получения чистых препаратов, компонентов вируса, не содержащих примеси клеточных ферментов. Недавние эксперименты показали, что в случае, если в инкубационную смесь добавляли ингибитор РНКаз, уровень специфической инфекционности на растениях Chenopodium amaranticor, зараженных реконструированным ХВК, собранным в 10 мм Трис-HCl, рН 7.0-7.5, был сопоставим с нативным ХВК (Atabekov et al., 2007).

При сборке ХВК, согласно Новикову с соавторами и Kaftanova с соавторами (Новиков и др., 1972; Kaftanova et al., 1975), БО ХВК присутствует в растворе в виде смеси небольших от 2S до 5S и 10-12S агрегатов, а согласно Goodman с соавторами - в форме 2.3S мономерных субъединиц (Goodman et al., 1975).

Было предпринято несколько попыток полимеризации БО ХВК в отсутствие РНК in vitro. Однако, обнаружить полимеры БО со спиральной структурой, идентичной структуре вириона и сопоставимых с ними по размерам не удалось (Новиков и др., 1972; Kaftanova et al., 1975; Goodman et al., 1975). Тем не менее, частичная полимеризация БО ХВК оказалась возможной при добавлении фосфатного буфера в инкубационную смесь, содержащую диализованный белок, до конечной концентрации 0,2 М (рН 7,0 -7,5) и выдерживании раствора в течение 24 ч при 4-20 °С. Образование одно- и двухслойных белковых дисков можно наблюдать методом электронной микроскопии (Kaftanova et al., 1975). Диаметр дисков и диаметр центрального канала был аналогичен интактным частицам ХВК и составлял около 4 нм. При дальнейшей инкубации раствора, содержащего БО в фосфатном буфере, диски начинали агрегировать в стопки, состоящие из 14-16 дисков. Показано, что образование стопок дисков предпочтительнее коротких спиральных структур (Kaftanova et al., 1975). Для ВМП было показано, что белок оболочки ВМП может реполимеризоваться в длинные вирусоподобные спиральные частицы в отсутствие РНК (Erickson et al. 1976; Tremblay et al. 2006). Вероятно, белки оболочки разных потексвирусов обладают разными свойствами: одни способны к эффективной полимеризации в отсутствии РНК, а другие нет.

На рисунке 1 показано изменение степени полимеризации БО ВМП в зависимости от рН и температуры. Показано, что в различных условиях может быть обнаружен БО в форме стопки дисков с коэффициентом седиментации 14S, представляющие собой результат полимеризации 18 субъединиц БО ВМП, из которых- формируются два витка вирусной спирали (Erickson et al., 1983). При значениях рН от 4,5 до 6,5 весь белок находится в этой форме. При низких и высоких значениях рН, независимо от температуры, обнаруживаются мономеры или димеры БО ВМП с коэффициентами седиментации 2-3S. При рН 4,0 и температуре выше 5°С в растворе, содержащем БО ВМП, формируются нитевидные палочковидные частицы со спиральной структурой и с коэффициентами седиментации от 100-120S и 230-250S. Другие промежуточные формы БО с коэффициентами седиментации от 14S до 25S можно наблюдать между значениями рН от 6,5 до 9,5 (Erickson et al., 1976, 1981).

3456789 10

РН

Рис. 1. Влияние температуры и рН на полимеризацию белка оболочки ВМП (Erickson et al., 1981 ).

Показана зависимость образования полимеров БО ВМП с различным коэффициентом седиментации от концентрации БО ВМП в растворе. При 0,1 мг/мл БО ВМП находится в форме 2-3S (мономеры и димеры), при 0,25 мг/мл появляются 14S агрегаты, и при концентрации более чем 1 мг/мл они преобразуются в агрегаты 27-3OS (Erickson et al., 1976, 1978). Впоследствии было показано, что 14S агрегаты соответствуют двухслойным дискам (18 субъединиц белка) или двойному обороту спирали (Erickson et al,, 1981, 1983), Переход из одной формы БО ВМП в другую при изменении концентрации происходит быстро. Мономеры и/или небольшие агрегаты БО ВМП, вероятно, используются в течение элонгации, а форма белка, использующаяся для инициации сборки, пока остается неизвестной.

Показана возможность полимеризации рекомбинантного БО ВМП, экспрессируемого в E.coli, содержащего на С-конце гистидины (Tremblay et al., 2006). Полимеры БО ВМП обладают высокой иммуногенностью и с успехом используются в качестве платформы, несущей гетерологичные эпитопы, с целью получения специфических антител (Denis et al., 2007). Получить мономеры рекомбинантного белка возможно только в случае делеции с N-конца 26 аминокислотных остатков, в результате чего БО ВМП теряет способность полимеризоваться и связывать РНК in vitro (Lecours et al., 2006).

Известно, что N-концевая часть белка оболочки ХВК экспонирована на поверхности вирусных частиц (Baratova et al., 1992) и участвует в образовании высоко иммуногенной антигенной детеминанты (Koenig and Torrance, 1986; Sober et al., 1988), тогда как С-конец БО скрыт внутри вирусной частицы.

Показано, что частицы ХВК формируют вокруг себя гидратную оболочку из связанных молекул воды. Этому способствует высокое содержание окси-аминокислот в расположенном на поверхности вириона N-конце БО и присутствие в нем остатков Сахаров (Baratova et al., 2004). Известно, что присутствие воды в непосредственной близости от поверхности белков существенно для их сворачивания, стабильности, узнавания и активности (Gerken et al., 1989). Вероятно, подобные взаимодействия имеют большое значение для формирования правильной структуры вириона.

Важным вопросом является локализация участка инициации сборки потексвирусов. Детально этот вопрос изучен на примере сборки ВМП. Показано, что первые 138 нуклеотидов на 5'-конце РНК ВМП содержат участок инициации сборки (Lok and AbouHaidar, 1986). Первые 40 нуклеотидов РНК ВМП богаты аденозином, бедны уридином, и содержат 8 следующих друг за другом повторяющихся пентамеров (GCAAA). Эти 8 пентамеров возможно взаимодействуют с субъединицами БО, расположенных на поверхности двухслойных дисков. Также как и в случае ВМП, 5'-концевая последовательность ХВК состоит из С/А-богатых участков и содержит следующие блоки: GAAAAA, АААСС, САССАА, АСАССАА, СААСА, ССААА (Skryabin et al, 1988). Вполне вероятно, что именно этот участок является участком инициации сборки вирусных частиц ХВК. Районы РНК, богатые аденином и цитозином не имеют вторичной структуры, что, вероятно, способствует взаимодействию БО с РНК и сборке дисков БО в спиральную структуру (Erickson et al., 1978; Abouhaidar and Bancroft, 1979; Abouhaidar and Bancroft, 1980; Erickson and Bancroft, 1980; Sit et al, 1994).

В 1996 году было высказано предположение, что 5'-район РНК ХВК участвует в координации вирусной сборки, транспорте и репликации (Kim and Hemenway, 1996). Kwon с соавторами (2005) обнаружили, что в ходе сборки ХВК вирусный БО специфично распознает район, расположенный в 5'-концевом stem-loop 1 (SL1) регионе (51-84 нт) РНК ХВК. Кроме того, регуляторные элементы, необходимые для связывания РНК с БО были локализованы в области 1-107 нт РНК ХВК (Lough et al, 2006). Было показано, что частицы, полученные при сборке полноразмерных транскриптов ХВК, синтезированных in vitro, короче частиц, собранных из вирусной РНК. Авторы предполагают, что есть еще неизвестные факторы, которые могут ограничивать восстановление полной длины частиц (Kwon et al, 2005).

Имеются данные, что в вирион потексвирусов вируса мозаики нарцисса и вируса мозаики бамбука помимо геномной РНК могут упаковываться субгеномные РНК (Annamalai and Rao, 2006; Cjoi and Rao, 2000; Lee et al, 1998; Short and Davies, 1983).

Для потексвирусов показана возможность реконструкции БО с гетерологичными РНК. В случае ВМП, при ионной силе 1=0,01 и рН 8,0,

БО ВМП формирует вирусоподобные, палочковидные частицы только с гомологичной РНК (РНК ВМП), РНК близкородственного вируса мозаики желтого клевера (ВМЖК), полиаденином и полицитозином. С РНК вируса табачной мозаики (ВТМ) и вируса мозаики костра (ВМК), а также с полиуридином и полигуанином, БО ВМП с большой скоростью формирует в этих условиях тонкие, чувствительные к РНКазам, частицы, которые авторы называют «растянутыми частицами» (Erickson et al., 1978). При более низких рН (6,0 - 7,5) БО ВМП формирует (с гомологичными и гетерологичными РНК) частицы другого, третьего типа, с таким же диаметром как у ВМП, но большим количеством изломов («kinked particles») (Erickson and Bancroft, 1978; Erickson et al., 1978). Авторы предполагают, что формирование подобных частиц является результатом множественной инициации. Другими словами, при рН<7,5 специфичность инициации сборки ВМП на 5'-конце теряется (Erickson et al., 1978). Показана возможность сборки БО ВМП с ДНК. Подобная сборка была осуществлена в условиях неспецифической сборки, т.е при рН 6,0 (Abouhaidar and Bancroft, 1979; Erickson and Bancroft, 1980).

Для ХВК показано, что в растворах с низкой ионной силой (0,0001-0,001 М трис-HCl), рН 6,8-7,3, при комнатной температуре, инкубация БО ХВК с гетерологичными вирусными РНК (ВТМ, ВМК) приводила к образованию палочковидных нуклеопротеидных частиц. Такие частицы характеризовались типичным для спиральных вирусных нуклеопротеидов спектром поглощения в УФ-свете, имели коэффициенты седиментации в интервале 55-63S (у нативного вируса 110S) и в иммунологическом отношении были сходны с нативным вирусным нуклеопротеидом и отличались от низкомолекулярного белка ХВК. Выход нуклеопротеида в этих условиях составил приблизительно 20-30% и резко снижался при повышении ионной силы (при добавлении хлористого натрия или фосфатного буфера) в инкубационной смеси. При изучении полученных препаратов в электронном микроскопе обнаруживали большое количество палочковидных частиц, различающихся по длине и имеющих диаметр, сходный с диаметром нативного вируса. Все полученные препараты нуклеопротеидов, содержащих БО ХВК и гетерологичные РНК, не обладали инфекционностью (Новиков и др., 1972).

Bancroft с соавторами (1979) изучали сборку другого потексвируса - вируса мозаики желтого клевера (ВМЖК). Было обнаружено, что процесс сборки ВМЖК очень похож на сборку ВМП и ХВК. При ионной силе 1=0,01 и рН 7,5 БО ВМЖК формировал нормальные палочковидные частицы не только с гомологичными РНК, но также с РНК ВМП и РНК сферического вируса мозаики костра (ВМК). Как в случае с ВМП, реконструкция ВМЖК ингибируется при низких температурах и инфекционность реконструированого вируса низка (не более нескольких процентов).

Показано, что скорость элонгации гомологичной сборки строго зависит от концентрации БО. При весовом соотношении РНК:БО 1:20 сборка проходит за 20 минут, а при соотношении 1:80 она занимает всего 5 минут. Но даже при соотношении РНК:БО 1:20 мутность раствора повышается примерно на 40% на первых минутах реакции. Неспецифичная сборка с множественной инициацией (при рН<7,5) происходит еще быстрее. (Erickson and Bancroft, 1978). Аналогичные результаты были получены при исследовании скорости элонгации при гомологичной реконструкции ХВК in vitro (Новиков и др., 1972).

Abou-Haidar с соавторами (1979) показали, что при реконструкции ВМП, в присутствие солей Na+ и Mg2+, происходило ингибирование сборки. Сборку нельзя было обнаружить при добавлении 0,06М NaCl или 0,001М MgC^ в инкубационную смесь, содержащую БО ВМП при рН 8.0. При этом, добавление солей существенно стабилизировало вторичную структуру РНК ВМП. С другой стороны, при добавлении катионов в концентрации, необходимой для ингибирования, не происходило изменение структуры субъединиц БО ВМП или их способности реполимеризоваться в отсутствие РНК. В случае ХВК, цвиттерионный буфер (бицин в концентрации 0.2М) не ингибировал сборку (Goodman, 1977). Исходя из этих данных, было предложено, что эффект ингибирования сборки потексвирусов in vitro катионами обусловлен стабилизацией вторичной структуры РНК (Abou-Haidar et al., 1979).

Показано, что БО потексвирусов обладает способностью плавить вторичную структуру РНК. Было высказано предположение, что активность плавления белками определялась их способностью неспецифически связывать РНК вдоль всей ее длины (Erickson and Bancroft, 1980). В результате такого связывания могут образовываться тонкие вытянутые частицы. Авторы предположили, что быстрое формирование вытянутых частиц в результате электростатического «налипания» БО ВМП к РНК является отдельным этапом сборки и предложили схему сборки потексвирусов, состоящую из трех стадий.

Первым этапом этого процесса является быстрое неспецифическое связывание БО со всей молекулой РНК, что приводит к плавлению РНК и формированию тонких длинных частиц. На втором этапе происходит инициация сборки, то есть формирование правильного палочковидного участка в районе 5'-конца РНК. Третьим этапом сборки, согласно этой модели, является элонгация, которая проявляется как волнообразная спиральная перестройка субъединиц БО в комплексе РНК-БО, начиная с 5'-конца РНК. Спиральная перестройка одного сегмента комплекса вызвана спиральной структурой предшествующего (5') сегмента. Такая модель сборки исключает использование больших белковых полимеров во время элонгации. Быстрое повышение мутности от 40 до 50% в конечном объеме, наблюдаемое при сборке ХВК и ВМП, в этом случае, соответствует первой стадии сборки, то есть формированию неспецифических растянутых комплексов РНК-БО.

Заключение диссертации по теме «Вирусология», Никитин, Николай Александрович

выводы

1. Показано, что при инкубации РНК, БО и ТБ1 ХВК in vitro формируются вирусные рибонуклеопротеиды (вРНП), 5'-конец РНК которых инкапсидирован БО в виде «головки» со структурой белковой спирали ХВК, а 3'- конец свободен («однохвостые» частицы).

2. При инкубации РНК, БО и ТБ1 ХВК in vitro не обнаружено структур невирионной природы.

3. Показано, что РНК ХВК в составе вРНП, образованного при различных молярных соотношениях РНК и БО, не способна транслироваться in vitro, но трансляционно активируется при фосфорилировании БО в составе вРНП или образовании комплекса вРНП с ТБ1.

4. Предположительно транспортной формой потексвирусов может являться вирион или вирусная РНК частично одетая белком оболочки («однохвостые» частицы).

5. Показана ключевая роль N-концевого участка БО в регуляции трансляции РНК в составе вирусного рибонуклеопротеида.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Никитин, Николай Александрович, 2008 год

1. Карпова О.В., Козловский С.В., Архипенко М.В., Заякина О.В., Решетникова В.Г., Родионова Н.П., академик Атабеков И.Г. (2002) Сравнительная характеристика протеинкиназ, фосфорилирующих in vitro транспортный белок ВТМ. Докл. Акад. Наук 386(6), 825-827.

2. Козловский С.В., Карпова О.В., Архипенко М.В., Заякина О.В., Родионова Н.П., академик Атабеков И.Г. (2003) Влияние N-концевой области белка оболочки X вируса картофеля на структуру вирусных частиц. Доклады Академии Наук 391(1), стр. 1-3.

3. Новиков В.К., Кимаев В.З., Атабеков И.Г. (1971). Реконструкция нуклеопротеида вируса X картофеля. Доклады Академии наук СССР. 204, (5), 1259-1262.

4. AbouHaidar М. and Bancroft J.B. (1978) The initiation of papaya mosaic virus assembly. Virology, 90, 54-59.

5. Abouhaidar M. and Bancroft J.B. (1979) Sequential encapsidation of heterologous RNAs with papaya mosaic virus protein. Virology 93(1), 253-258.

6. AbouHaidar M., Erickson J.W. and Bancroft J.B. (1979) The inhibition of papaya mosaic virus assembly related to the effect of cations on its RNA. Viology 98,116-120.

7. Abouhaidar M.G. and Bancroft J.B. (1980) The polarity of assembly of papaya mosaic-virus and tobacco mosaicvirus RNAs with PMV-protein under conditions of nonspecificity. Virology 107, 202-207.

8. AbouHaidar M.G. and Erickson J.W. (1985). Structure and in vitro assembly of papaya mosaic virus. In Molecular Plant Virology, Vol.1 85121, CRC Press, Boca Raton, FL.

9. Annamalai P., and Rao A.L. (2006) Delivery and Expression of functional viral RNA genomes in planta by agroinfiltration, Curr Pro toe Microbiol. 16(B), 2.

10. Andreev I.A, Kim S.H., Kalinina N.O., Rakitina D.V., Fitzgerald A.G., Palukaitis P. and Taliansky M.E. (2004) Molecular interactions between a plant virus movement protein and RNA: force spectroscopy investigation. J. Mol. Biol. 339, 1041-1047.

11. Angell S.M., Davies C. and Baulcombe D.C. (1996) Cell-to-cell movement of potato virus X is associated with a change in the size exclusion limit of plasmodesmata in trichome cells of Nicotiana clevelandii. Virology 215, 197—201.

12. Atabekov J.G., Dorokhov Yu.L. (1984) Plant virus-specific transport function and resistance of plants to viruses. Adv Virus Res 29: 313-364.

13. Atabekov I. G., Rodionova N. P., Karpova О. V., Kozlovsky S. V., Poljakov V. Yu. (2000) The movement protein triggered in situ conversion of potato virus X virion RNA from a nontranslatable into a translatable form. Virology, 271, 259-263.

14. Atabekov J.G., Rodionova N.P., Karpova O.V., Kozlovsky S.V., Novikov, V.K., Arkhipenko M.V. (2001) Translational activation of encapsidated potato virus X RNA by coat protein phosphorylation. Virology, 286, 466474.

15. Atabekov J., Dobrov E., Karpova O. And Rodionova N. (2007) Potato virus X: structure, disassembly and reconstitution. Molecular Plant Patalogy 8(5 ), 667-675.

16. Bancroft J.B., AbouHaidar M. and Erickson J.W. (1979) The assembly of clover yellow mosaic virus and its protein. Virology 98, 12 1-130.

17. Baratova L.A., Grebenshchikov N.I., Shishkov A.V., Kashirin I.A., Radavsky J.I., Jarvekulg L., Saarma M. (1992) J.Gen. Virol., 73, 229-235.

18. Batten J.S., Yoshinari S. and Hemenway C. (2003) Potato virus X: a model system for virus replication, movement and gene expression. Molecular Plant Pathology 4(2), 125-131.

19. Beck D.L., Guilford P.J., Voot D.M., Andersen M.T. and Forster R.L.S. (1991) Triple gene block proteins of white clover mosaic potexvirus are required for transport. Virology 183(2), 695-702

20. Brakke M.K., Ball E.M., Langenberg W.G. (1988) A non capsid protein associated with unencapsidated virus RNA in barley infected with barley stripe mosaic virus. Journal of General Virology 69, 481-491.

21. Brisco M.J., Hull R., Wilson T.M. (1985) Southern bean mosaic virus-specific proteins are synthesized in an in vitro system supplemented with intact, treated virions. Virology 143(2), 392-398.

22. Brisco M.J., Hull R., Wilson T.M.A. (1986a) Swelling of isometric and of bacilliform plant virus nucleocapsids is required for virus-specific protein synthesis in vitro. Virology, 148.

23. Brisco M.J., Haniff C., Hull R., Wilson T.M.A., Sattelle D.B. (1986b) The kinetics of swelling of southern bean mosaic virus: a study using photon corrlation spectroscopy. Virology, 148.

24. Carrington J.C., Kasschau K.D., Mahajan S.K., Schaad M.C. (1996) Cell-to-Cell and Long-Distance Transport of Viruses in Plants. Plant Cell 8(10), 1669-1681.

25. Chapman S., Hills G., Watts J., Baulcombe D. (1992) Mutational analysis of the coat protein gene of potato virus X: effects on virion morphology and viral pathogenicity. Virology 191, 223-230.

26. Choi Y.G., Rao A.L. (2000) Packaging of tobacco mosaic virus subgenomic RNAs by brome mosaic virus coat protein exhibits RNA controlled polymorphism. Virology 275, 249-257.

27. Citovsky V., Knorr D., Schuster G. and Zambryski P. (1990) The p30 movement protein of tobacco mosaic virus is a single-strand nucleic acid binding protein. Cell 60, 637-647.

28. Citovsky Vitaly, Wong Mei Lie, Shaw Andrea L., Venkataram Prasad B. V. and Zambryski Patricia (1992) Visualization and Characterization of Tobacco Mosaic Virus Movement Protein Binding to Single-Stranded Nucleic Acids. The Plant Cell 4, 397-411.

29. Citovsky V. (1993) Probing plasmodesmal transport with plant viruses. Plant Physiol. 102,1071-1076.

30. Denis J, Majeau N, Acosta-Ramirez E, Savard C, Bedard MC, Simard S. (2007) Immunogenicity of papaya mosaic virus-like particles fused to a hepatitis С virus epitope: evidence for the critical function of multimerization. Virology 363(1), 59-68.

31. Ding В., Li Q., Nguyen L., Palukaitis P., Lucas W.J. (1995) Cucumber mosaic virus 3a protein potentiates cell-to-cell trafficking of CMV RNA in tobacco plants. Virology 207, 345-353.

32. Dobrov E.N. and Atabekov J.G. (1989) Reconstitution of plant viruses. In Plant Viruses (Mandahar, C.L., ed) 1, 173-205, CRC Press, Inc. Boca Raton, FL.

33. Donald R.G.K., Lawrence D.M. and Jackson A.O. (1997) The barley stripe mosaic virus 58-kilodalton B-protein is a multifunctional RNA binding protein. Jornal of Virology, 1538-1546.

34. Dawson W.O., Bubrick P., and Grantham G.L. (1988) Modifications of the tobacco mosaic virus coat protein gene affecting replication, movement and symptomatology. Phytopathology 78, 783-789.

35. Erhard M.,Stussi-Garaud C., Guilley H., Richards K.E., Jonard G., Bouzoubaa S. (1999) The first triple gene block protein of peanut clump virus localizes to the plasmodesmata during virus infection. Virology 264, 220-229.

36. Erickson J.W., Bancroft J.B. and Home R.W. (1976) The assembly of papaya mosaic virus protein. Virology 72, 514-517.

37. Erickson J.W. and Bancroft J.B. (1978a) The self-assembly of papaya mosaic virus. Virology 90, 36-46.

38. Erickson J.W., Bancroft J.B. (1978b) The kinetics of papaya mosic virus assembly. Virology 90(1), 47-53.

39. Erickson J. W. and Bancroft J. B. (1980) The assembly of papaya mosaic virus coat protein with DNA. Prog Clin Biol Res 40, 293-300.

40. Erickson J.W., Bancroft J.B. and Stillman M.J. (1981) Circular dichroism studies of papaya mosaic virus coat protein and its polymers. J Mol Biol 147, 337-349.

41. Erickson J.W., Hallett F.R. and Bancroft J.B. (1983) Subassembly Aggregates of papaya mosaic-virus protein. Virology 129, 207—211.

42. Finney J.L., Gellatly B.J., Golton I.C., Goodfellow J. (1980) Solvent effects and polar interactions in the structural stability and dynamics of globular proteins. Biophys. J. 32,17—33.

43. Forster R.L.S., Beck D.L., Guilford P.J., Voot D.M., Van Dolleweerd C.J., Andersen M.T. (1992) The coat protein of white clover mosaic potexvirus has a role in facilitating cell-to-cell transport in plants. Virology 191, 480484.

44. Fraenkel-Conrat H., Singer В., Tsugita A. (1961) Purification of viral RNA by means of bentonit. Virology 14, 54-58.

45. Gerken T.A., Butenhof K.J., Shogren R. (1989) Effects of glycosylation on the conformation and dynamics of O-linked glycoproteins: carbon-13 NMR studies of ovine submaxillary mucin. Biochemistry 28(13), 5536— 5543.

46. Goodman RM. (1975) Reconstitution of potato virus X in vitro. I. Properties of the dissociated protein structural subunits. Virology 68(2), 287-298

47. Goodman R.M., Home R.W., Hobart J.M. (1975) Reconstruction of potato virus X in vitro. II. Characterization of the reconstituted product. Virology 68(2), 299-308.

48. Goodman R.M., McDonald J.G., Home R.W., Bancroft J.B. (1976) Assembly of flexuous plant viruses and their proteins. Philos. Trans. R. Soc. (London) B276(943), 173.

49. Goodman R.M. (1977) Reconstitution of potato virus X in vitro. III. Evidence for a role for hydrophobic interactions. Virology 76, 72- 78.

50. Gorbalenya A.E. and Koonin E.V. (1993) Helikases: amino acid sequence comparisons and structure-function relationships. Curr Opin Struct Biol 3, 419-429.

51. Herzog E., Hemmer O., Hauser S., Meyer G., Bouzoubaa S., Fritsch C. (1998) Identification of genes involved in replication and movement of peanut clump virus. Virology 248(2). 312-322.

52. Ivanov K.I., Puustinen P., Merits A., Saarma M., and Makinen K. (2001) Phosphorylation down-regulates the RNA binding function of the coat protein of potato virus A. J. Biol. Chem. 276,13530-13540.

53. Kaftanova A.S., Kiselev N.A., Novikov V.K. and Atabekov J.G. (1975) Structire of products of protein reassembly and reconstruction of potato virus X. Virology 65, 283-287.

54. Kalinina N.O., Fedorkin O.N., Samuilova O.V., Maiss E., Korpela Т., Morozov S.Yu., Atabekov J.G. (1996) Expression and biochemical analyses of the recombinant potato virus X 25K movement protein. FEBS Letters 397, 75-78.

55. Kalinina N.O., Rakitina D.V., Solovyev A.G., Schiemann J., Morozov S.Y. (2002) RNA helicase activity of the plant virus movement proteins encoded by the first gene of the triple gene block. Virology 296(2), 321329.

56. Karpova O.V., Ivanov K.I., Rodionova N.P., Dorokhov Yu.L., Atabekov J.G. (1997) Nontranslatability and dissimilar behavior in plants and protoplasts of viral RNA and movement protein complexes formed in vitro. Virology 230,11-21.

57. Karpova O.V., Rodionova N.P., Ivanov K.I., Kozlovsky S.V., Dorokhov Y.L., Atabekov J.G. (1999) Phosphorylation of tobacco mosaic virus movement protein abolishes its translation repressing ability. Virology 261(l):20-24.

58. Kim., K.-H. and Hemenway C. (1996) The 5 nontranslated region of potato virus X RNA affects both genomic and subgenomic RNA synthesis. J. Virol. 70, 5533-5540.

59. Kiselyova O.I., Yaminsky I.V., Karger E.M., Frolova O., Dorokhov Yu.L., and Atabekov J.G. (2001) Visualization by atomic force microscopy of tobacco mosaic virus movement protein-RNA complexes formed in vitro. J. Gen. Virol. 82, 1503-1508.

60. Kiseleva O.I., Yaminsky I.V., Karpova O.V., Rodionova N.P., Kozlovsky S.V., Arkhipenko M.V. and Atabekov J.G. (2003) AFM study of potato virus X disassembly induced by movement protein. J. Mol. Biol. 332, 321325.

61. Koenig R., Stegemann M.E., Francksen H., and Paul H.L. (1970) Protein subunits in potato virus X group. Determination of the molecular weightsby polyacrylamide electrophoresis. Biochemica et Biophysica Acta 207, 184-189.

62. Koenig R., Nremain J.H. and Shepard J.F. (1978) In situ degradation of the protein chain of potato virus X at the N- and C-termini. J. Gen. Virol. 38, 329-337.

63. Koenig R. and Torrance L. (1986) Antigenic analysis of potato virus X by means of monoclonal antibodies. J. Gen. Virol. 67, 2145-2151.

64. Kwon S.J., Park M.R., Kim K.W., Plante C.A., Hemenway C.L., Kim K.H. (2005) cis-Acting sequences required for coat protein binding and in vitro assembly of Potato virus X. Virology 334(1), 83-97.

65. Laemmli U.K. (1970) Cleavage of structufal protein during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 277, 680-685.

66. Lecours K., Tremblay M.H., Gagne M.E., Gagne S.M. and Leclerc D. (2006) Purification and biochemical characterization of a monomeric form of papaya mosaic potexvirus coat protein. Protein Expr Purif47, 273-280.

67. Lee Y.S., Lin B.Y., Hsu Y.H., Chang B.Y. and Lin N.S. (1998) Subgenomic RNAs of bamboo mosaic potexvirus-V isolate are packaged into virions. J Gen Virol 79,1825-1832.

68. Lok S. And AbouHaidar M.G. (1986) The nucleotide sequence of the 5' end of Papaya Mosaic Virus RNA: site of in vitro assembly initiation. Virology 153, 289-296.

69. Lough T.J., Lee R.H., Emerson S.J., Forster R.L.S. and Lucas W.J. (2006) Functional analysis of the 5 untranslated region of potexvirus RNA reveals a role in viral replication and cell-to-cell movement. Virology, 351, 455465.

70. McGeachy K.D. and Barker H. (2000) Potato mop-top virus RNA can move long distance in the absence of coat protein: evidence from resistant, transgenic plants. Mol. Plant Microbe Interact. 13, 125-128.

71. Morozov S.Y., Dolia V.V., Atabekov I.G. (1989) Probable reassortment of genomic elements among elongated RNA-containing plant viruses. J. Mol. Evol. 29, 52-62.

72. Morozov S.Yu., Miroshnichenko N.A., Zelenina D.A., Fedorkin O.N., Solovyev A.G., Lukasheva L. I., Karasev A.V., Dolja V.V. and Atabekov J.G. (1991) Expression strategy of the potato virys X triple gene block. Jornal of General Virology 12, 2039-2043.

73. Morozov S.Yu., Solovyev A.G., Kalinina N.O., Fedorkin O.N., Samuilova O.V., Schiemann J., and Atabekov J.G. (1999) Evidence for Two Nonoverlapping Functional Domains in the Potato Virus X 25K Movement Protein. Virology 260, 55-63.

74. Morozov S.Y., and Solovyev A.G., (2003) Triple gene blok: modular design of a multifunctional machine for plant virus movement. Jornal of General Virology 84,1351-1366.

75. Nicolaisen M., Nielsen S.L. (2001) Analysis of the triple gene block and coat protein sequences of two strains of Kalanchoe latent carlavirus. Virus Genes. 22(3), 265-270.

76. Oparka K.J., Roberts A.G., Roberts I.M., Prior D.A.M., Santa Cruz S. (1996) Viral coat protein is targeted to, but does not gate, plasmodesmata during cell-to-cell movement of potato virus X. Plant Journal 10, SOS-SB.

77. Orlov V.N., Kust S.V., Kalmykov P.V., Krivosheev V.P., Dobrov E.N., Drachev V.A. (1998) A comparative differential scanning calorimetric study of tobacco mosaic virus and of its coat protein ts mutant. FEBS Lett. 433, 307-311.

78. Osman T.A., Hayes R.J., and Buck K.W. (1992) Cooperative binding of the red clover necrotic mosaic virus movement protein to single-stranded nucleic acids. J. Gen. Virol. 73, 223-227.

79. Palukaitis P. and Garcia-Arenal F. (2003) Cucumoviruses. Adv. Virus Res. 62, 241-323.

80. Parker L., Kendall A. and Stubbs G. (2002) Surface features of potato virus X from fiber diffraction. Virology 300, 291-295.

81. Petty I.T.D., and Jackson A.O. (1990) Mutational analysis of barley stripe mosaic virus RNA p. Virology 179, 712-718.

82. Richard K.E. and Tamada T. (1992) Mapping functions on the multiparite genome of beet necrotic yellow vein virus. Annual Review Phytopathology. 30, 291-313.

83. Privalov P.L., Gill S.J. (1988) Stability of protein structure and hydrophobic interaction. Adv. Protein Chem. 39, 191-234.

84. Rodionova N.P., Karpova O.V., Kozlovsky S.V., Zayakina O.V., Arkhipenko M.V. and Atabekov J.G. (2003) Linear remodeling of helical virus by movement protein binding. J. Mol. Biol. 333, 565-572.

85. Rouleau M., Smith R.J., Bancroft J. В., and Mackie G.A. (1995) Subcellular Immunolocalization of the Coat Protein of Two Potexviruses in Infected Chenopodium quinoa. Virology 214, 314-318.

86. Santa Cruz S., Roberts A.G., Prior D.A.M., Chapman S., Oparka K.J. (1998) Cell-to-cell and phloem-mediated transport of potato virus X: the role of virions. PlantCel, 10, 495-510.

87. Short M.N. and Davies J.W. (1983) Narcissus mosaic virus: a potexvirus with an encapsidated subgenomic messenger RNA for coat protein. Biosci Rep 3, 837-846.

88. Sit T.L., Leclerc D. and AbouHaidar M.G. (1994) A minimal 5-sequence for in vitro initiation of papaya mosaic potexvirus assembly. Virology 199, 238-242.

89. Skryabin K.G., Morozov S.Yu., Kraev A.S., Rozanov M.N., Chernov B.K., Lukasheva L.I. and Atabekov J.G. (1988) Conserved and variable elements in RNA genomes of potexviruses. FEBS Lett. 240, 33-40.

90. Sober J., Jarvekulg L., Toots I., Rodavsky J., Villems R., and Saarma M. (1988) Antigenic characterization of potato virus X with monoclonal antibodies. J. Gen. Virol. 69, 1799-1807.

91. Solovyev A.G., Savenkov E.I., Grdzelishvili V.Z., Morozov S.Yu., Lesemann D.E., Maiss E., Casper, Atabekov J.G. (1996) Movement of a barley stripe mosaic virus chimera with a tobacco mosaic virus movement protein. Virology 217, 435-441.

92. Taliansky M, Torrance L, Kalinina NO. (2008) Role of plant virus movement proteins. Methods Mol Biol. 451, 33-54.

93. Tollin P. and Wilson H.R. (1988) Particle structure. In: The Filamentous Plant Viruses in the Plant Viruses 4 (Milne, R.C., ed.), 51-83.

94. Tremaine J.H., Agrawal H.O. (1972) Limited proteolysis of potato virus X by trypsin and plant proteases. Virology 49(3):735-744.

95. Varma A., Gibbs A.J., Woods R.D. and Finch J.T. (1968) Some observations on the structure of the filamentous particles of several plantviruses. J. Gen. Virol. 2, 107-114.

96. Verchot-Lubicz J. (2005) A new cell-to-cell transport model for Potexviruses. Mol. Plant—Microbe Interact. 18, 283-290.

97. Voinnet O, Lederer C, Baulcombe DC. (2000) A viral movement protein prevents spread of the gene silencing signal in Nicotiana benthamiana. Cell. 103(1):157-167.

98. Waigmann, E., Ueki, S., Trutnyeva, K., Citovsky, V. (2004). The Ins and Outs of nondestructive cell-to-cell and systemic movement of plant viruses. Critical Reviews in Plant Sciences 23(3), 195-250.

99. Wilson T.M.A. (1984) Cotranslation disassembly of tobacco mosaic virus in vitro. Virology 137, 255-265.

100. Wilson T.M.A, Watkins P.A.C. (1985) Influence of exogenous viral coat protein on the cotranslational disassembly of tobacco mosaic virus (TMV) particles in vitro. Virology, 149.

101. Wilson M. A., Shaw J. G. (1987) Cotranslational disassembly of filamentous plant virus nucleocapsids in vitro and in vivo. In Positive Strand RNA Viruses, Alan R. Liss, Inc., 159-181.

102. Wolf S., Deom C.M., Beachy R.N., Lucas W.L. (1989) Movement protein of tobacco mosaic virus modifies plasmodesmatal size exclusion limit. Science 246, 337-339.

103. Yang Y., Ding В., Baulcombe D.C., Verchot J. (2000) Cell-to-cell movement of the 25K protein of potato virus X is regulated by three other viral proteins. Molecular Plant-Microbe Interactions 13 (b), 599-605.

104. Zhu D.M., Evans R.K. (2006) Molecular mechanism and thermodynamics study of plasmid DNA and cationic surfactants interactions. Langmuir. 22, 3735-3743.