Физико-химические исследования функциональных доменов ацетилхолинового рецептора Torpedo californica тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 02.00.10, кандидат химических наук Кривошеин, Аркадий Викторович

• Кривошеин, Аркадий Викторович
• кандидат химических наук
• 1998

Оглавление диссертации кандидат химических наук Кривошеин, Аркадий Викторович

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

1.1. Общие представления о структуре и функции никотинового ацетилхолинового рецептора

1.2. Изолированные субъединицы и пептидные фрагменты как модельные системы в исследованиях структуры никотинового ацетилхолинового рецептора

1.3. Изучение пространственной структуры нАХР и его доменов/фрагментов с помощью физико-химических методов

1.3.1. Электронная микроскопия

1.3.2. Спектроскопия ядерного магнитного резонанса (ЯМР)

1.3.3. Спектроскопия электронного парамагнитного резонанса (ЭПР)

1.3.4. Инфракрасная (ИК-) спектроскопия и спектроскопия комбинационного рассеяния (КР)

1.3.5. Спектроскопия кругового дихроизма (КД)

1.3.6. Люминесцентная спектроскопия и другие оптические методы

1.4. Заключение

2. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

2.1. Биохимическая характеристика рекомбинантных и синтетических фрагментов нАХР Т .calif omica

2.1.1. Подтверждение структуры и частичная характеристика синтетических пептидов

2.1.2. Очистка и характеристика рекомбинантных белков, включающих участки N-концевого внеклеточного домена й-субъединицы

2.1.2.1. Подтверждение структуры

2.1.2.2. Хроматографические и коллигативные свойства, ренатурация

2.1.2.3. Лиганд-связывающие свойства

2.1.3. Характеристика и очистка рекомбинантного белка, включающего участок Ó313-455

2.2.Вторичная структура рекомбинантных и синтетических фрагментов нАХР Torpedo californica по данным спектроскопии КД

2.2.1. Вторичная структура фрагментов N-концевого внеклеточного домена ОС-субъединицы

2.2.2. Вторичная структура рекомбинантного белка, представляющего основной внутриклеточный домен 5-субъединицы

2.2.3. Вторичная структура пептидов, соответствующих трансмембранным сегментам СС-субъединицы

2.2.4. Соотнесение вторичной структуры фрагментов нАХР с вторичной структурой интактного рецептора

2.3. Микроокружение остатков ароматических аминокислот в рекомбинантных белках СС1-209 и 6313-455

2.4. Спектроскопическое исследование взаимодействия фрагментов N-концевого внеклеточного домена ОС-субъединицы с лигандами

3.1. Синтетические пептиды

3.2. Рекомбинантные белки

3.3. Мембрано-связанный нАХР Torpedo californica

3.4. Препаративная офВЭЖХ

3.5. Ренатурация рекомбинантных белков СС1-209

3.6. Аффинная хроматография рекомбинантных белков GC1-209 на HTII-агарозе

3.7. Ренатурация рекомбинантного белка 6313-455

3.8. Определение концентрации белков и пептидов

3.9. Электрофорез в SDS-ПААГ

3.10. Аналитическая ВЭЖХ

3.11. Масс-спектрометрия

3.12. Определение N-концевой аминокислотной последовательности

3.13. УФ-спектрофотометрия

3.14. Флюоресцентная спектроскопия

3.15. Спектроскопия КД

3.16. Анализ спектров КД

3.17. Определение связывания лигандов с рекомбинантными белками ai-209

3.18. Химикалии, расходуемые материалы и бактериальные штаммы

ВЫВОДЫ

БЛАГОДАРНОСТИ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ДМСО - диметилсульфоксид

ДОВ - дисперсия оптического вращения

КД - круговой дихроизм

KP - комбинационное рассеяние

м.д. - миллионные доли

МЛР - множественная линейная регрессия

МХХ - металлохелатная хроматография

нАХР - никотиновый ацетилхолиновый рецептор

н.о. - не определялось

н.у. - не указано

HTA - нитрилотриацетат

HTII - нейротоксин II из яда Naja naja oxiana

ß-ОГ - ß-октилглюкозид

офВЭЖХ - обращенно-фазовая ВЭЖХ

ПААГ -полиакриламидный гель

РСА - рентгеноструктурный анализ

у.е. - условные единицы

ЭПР - электронный парамагнитный резонанс ACh - ацетилхолин Асш - ацетамидометил

вмакс " максимальное число участков связывания (X-Bgt - (Х-бунгаротоксин из яда Bungarus multicinctus Carb - карбамоилхолин

Cbt - кобротоксин из яда Naja naja atra

(X-Cbt - (Х-кобратоксин из яда Naja naja siamensis

CH - холестерин

CHAPS - 3-(3-холамидопропил)диметиламмоний-1-пропансульфонат

CPZ - хлорпромазин

Deca - декаметоний

DEPC - диэлаидоилфосфатидилхолин

DOPA - диолеилфосфатидная кислота

DOPC - диолеоилфосфатидилхолин

DTE - дитиоэритритол

DTNB - 5,51-дитио-бис(-2-нитробензойная кислота)

DTT - дитиотреитол

EDTA - этилендиаминтетраацетат

EGTA - этиленгликоль-бис(£-аминоэтиловый эфир)

N,N,N 1,N!-тетраацетат Еа - эрабутоксин а из яда Laticauda semifasciata

ESI-MS - масс-спектрометрия с электрораспылительной ионизацией

(англ. "electrospray ionization mass-spectrometry") FITC - флюоресцеинизотиоцианат GSH - восстановленный глютатион GSSG - окисленный глютатион GuCl - хлорид гуанидиния

HEPES - N-[2-гидроксиэтил]пиперазин-N1 -[4-бутансульфоновая кислота]

Неха - гексаметоний

I - интенсивность

1фЛ - интенсивность флюоресценции

1С50 - концентрация соединения, при которой происходит 50%-ное

ингибирование связывания лиганда Kd - равновесная константа диссоциации LDAO - лаурилдиметиламин-Ы-оксид ^-возб ~ длина волны возбуждающего света 1ИСП - длина волны испускаемого света

^макс ~ длина волны, соответствующая максимальной амплитуде мрасч ~ расчётная молекулярная масса

MALDI-MS - масс-спектрометрия с ионизацией посредством лазерной десорбции из матрицы (англ. "matrix-assisted laser desorption ionization mass-spectrometry") MIR - главный иммуногенный регион (англ. "main immunogenic region") NPS - нитрофенилсульфенил PA - фосфатидная кислота PC - фосфатидилхолин PCP - фенциклидин SDS - додецилсульфат натрия Tc - время вращательной корреляции

TAPS - Ы-трис[гидроксиметил]метил-3-аминопропансульфоновая кислота TES - Ы-трис[гидроксиметил]метил-2-аминоэтансульфоновая кислота Tet -тетракаин

TFA - трифторуксусная кислота TFE - трифторэтанол

TRITC - тетраметилродаминизотиоцианат dTc - d-тубокурарин

Тх СС - токсин (X из яда Naja nigricollis

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Физико-химические исследования функциональных доменов ацетилхолинового рецептора Torpedo californica»

ВВЕДЕНИЕ

Исследования нейрорецепторов на молекулярном уровне с 1970-х годов являются бурно развивающейся областью физико-химической биологии, которая вызывает большой интерес как в академическом, так и в прикладном плане.

Одним из важнейших семейств нейрорецепторов являются лигандоуправляемые ионные каналы; наиболее изученным их представителем является никотиновый ацетилхолиновый рецептор постсинаптической мембраны (см. обзоры [1-7]). За прошедшие три десятилетия для изучения молекулярной структуры этого рецептора (в частности, рецепторного белка из электрического органа Torpedo) были использованы практически все существующие биохимические и физико-химические методы. Однако размер (~270 кДа) и сложность (интегральный мембранный гетероолигомерный (О^Р^б) белок с различными посттрансляционными модификациями) этого белка ограничивают как приложимость к нему многих высокоразрешающих методов (таких, как РСА, спектроскопия ЯМР, избирательная химическая модификация), так и характер получаемой информации. Поэтому на сегодняшний день разумным компромиссом между интегративным и редукционистским подходами представляется более детальное биохимическое и физико-химическое изучение отдельных компонентов и доменов (таких, как изолированные субъединицы и достаточно протяжённые фрагменты) этого рецептора; такой подход можно считать довольно плодотворным в приложении и к другим мембранным белкам ( см., к примеру, [8-10]).

Целью данной диссертационной работы являлись физико-химические исследования функциональных доменов никотинового ацетилхолинового рецептора, представленных семью рекомбинантными и синтетическими фрагментами рецептора Torpedo californica, с помощью методов оптической спектроскопии. В качестве необходимой предпосылки для физико-химических (спектральных) исследований нами была проведена большая работа по очистке/ренатурации и хроматографической и биохимической характеристике этих фрагментов, что позволило получить высокоочищенные препараты с достаточно высокой концентрацией. Спектральные исследования проводились в нескольких направлениях:

1) развёрнутое КД-спектроскопическое изучение вторичной структуры и спектрофлюориметрическое и спектрофотометрическое

изучение микроокружения остатков ароматических аминокислот рекомбинантных белков (Х1-209 и синтетического пептида 0С125-145, представляющих N-концевой внеклеточный (лиганд-связывающий) домен (Х-субъединицы;

2) КД-спектроскопическое изучение вторичной структуры и спектрофотометрическое изучение микроокружения остатков ароматических аминокислот рекомбинантного белка Ö313-455, представляющего основной внутриклеточный домен ("цитоплазматическая петля" и амфипатическая спираль МА); этот домен играет важную роль в пост-трансляционной регуляции активности рецептора;

3) КД-спектроскопическое изучение вторичной структуры синтетических пептидов СС236-267 (М2) и (Х277-301 (МЗ) в трифторэтаноле;

4) изучение структурных основ лиганд-рецепторного взаимодействия для изолированного домена (XI-209 с помощью спектрофлюориметрии.

Рекомбинантные фрагменты продуцировались в нашей лаборатории Т.А.Алексеевым, к.х.н. А.Ф.Шевалье и О.В.Теляковой. Исследование фрагмента Ö313-455 проводилось совместно с лабораторией проф. F.Hucho (Свободный университет Берлина, Германия). Пептид (Х125-145 был синтезирован к.х.н. И.Л.Родионовым, пептид (Х236-267 Л.Д.Чикиным; пептид (Х277-301 был любезно предоставлен проф. D.В.Cohen'ом. КД-спектроскопические и спектрофлюориметрические эксперименты были выполнены совместно с к.х.н. И.А.Куделиной .

Заключение диссертации по теме «Биоорганическая химия», Кривошеин, Аркадий Викторович

выводы

1. Разработаны методы хроматографической очистки, ренатурации и характеристики рекомбинантных белков, включающих остатки 1-209 СС-субъединицы (N-концевой внеклеточный лиганд-связывающий домен) или 313-455 (основной внутриклеточный домен) 6-субъединицы нАХР Т.californica. Полученные высокоочищенные препараты связывают СС-нейротоксины и низкомолекулярные лиганды и пригодны для физико-химических иследований.

2. Посредством спектроскопии КД даны количественные оценки содержания различных вторичных структур во вне- и внутриклеточном доменах нАХР: первый из них (представленный фрагментами (XI-209) содержит 30-35% (Х-спиральной конформации и 45-60% ^-структуры, в то время как второй (представленный фрагментом 6313-455) - примерно 20% ОС-спирали и 25-35% f3-структуры.

3. С помощью спектроскопии КД и флюоресцентной спектроскопии исследованы структурные основы взаимодействия лигандов с нАХР. Показано, что вторичная структура изолированного N-концевого внеклеточного домена ОС-субъединицы не претерпевает существенных изменений при связывании с холинэргическими лигандами, d-тубокурарином или СС-бунгаротоксином. Показано также, что участки связывания СС-нейротоксинов и холинэргических лигандов включают остатки триптофана этого домена.

4. Посредством сопоставления спектральных данных для фрагментов CCl-209, СС236-267, (Х277-301 и 6313-455 и для интактного нАХР продемонстрирована адекватность использования рекомбинантных фрагментов (Х1-209 и 6313-455 в качестве моделей для исследования пространственной структуры нАХР.

БЛАГОДАРНОСТИ

Автор выражает глубочайшую признательность своему руководителю д.х.н. Ю.Н.Уткину, чей высокий научный уровень и прекрасные человеческие качества сделали возможным выполнение этой работы. Всемерная поддержка и плодотворное обсуждение результатов со стороны проф. В.И.Цетлина заслуживают большой благодарности. Автор также очень признателен к.х.н. И.А.Куделиной, результаты продуктивного сотрудничества с которой стали краеугольным камнем этой диссертации.

Я также признателен за сотрудничество Т.А.Алексееву и О.В.Теляковой и благодарен к.х.н. И.Е.Кашеверову за помощь в математической обработке экспериментальных данных.

Список литературы диссертационного исследования кандидат химических наук Кривошеин, Аркадий Викторович, 1998 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Heidmann Т., Changeux J. Р. // Ann.Rev.Biochem. 1978. Vol.47. P.317-357

2. Hucho F. // Eur.J.Biochem. 1986. Vol.158. P.211-226

3. Claudio Т. // Frontiers in molecular biology: molecular neurobiology volume (Glover D.M., Harnes B.C., eds.). IRL Press, Oxford, 1989, pp.63-142

4. Stroud R.M., McCarthy M.P., Shuster M. // Biochemistry. 1990. Vol.29. No.50. P.11009-11023

5. Galzi J.-L., Revah F., Bessis A., Changeux J.-P. // Annu.Rev.Pharmacol. 1991. Vol.31. P.37-72

6. Karlin A., Akabas M.H. // Neuron. 1995. Vol.15. P.1231-1244

7. Hucho F., Tsetlin V.l., Machold 3. // Eur.3.Biochem. 1996. Vol.239. P.539-557

8. de Vas A.M., Ultsch M., Kossiakoff A.A. // Science. 1992. Vol.255. P.306-312

9. Lange G., Lewis S.a., Murshudov G.N., Dodson G.G., Moody P.C., Turkenburg J.P., Barclay A.N., Brady R.L. // Structure. 1994. Vol.2. No.6. P.469-481

10. Xue H., Chu R., Hang 3., Lee P., Zheng H. // Protein Sei. 1998. Vol.7. No.1. P.216-219

11. Zeghloul S., Marchot P., Bougis P.E., Ronin С. // Eur.J.Biochem. 1988. Vol.174. P.543-550

12. Nöda M., Takahashi H., Tanabe Т., Toyosato M., Furutani Y., Hirobe I., Asai M., Inayama S., Miyata Т., Numa S. // Nature. 1982. Vol.299. P.793-797

13. Nöda M., Takahashi H., Tanabe Т., Toyosato M., Kikyotani S., Hirose Т., Asai M., Takashima H., Inayama S., Miyata Т., Numa S. // Nature. 1983. Vol.301. P.251-255

14. Nöda M., Takahashi H., Tanabe Т., Toyosato M., Kikyotani S., Furutani Y., Hirose Т., Takashima H., Inayama S., Miyata Т., Numa S. // Nature. 1983, Vol.302. P.528-532

15. Ortells M.O., Lunt F.G. // Trends Neurosci. 1995. Vol.18. P.121-127

16. Lindstrom Л., Shelton D., Fujii Y. // Adv.Immunol. 1988. Vol.42. P.233-284

17. Conti-Tronconi B.M., McLane K.E., Raftery M.A., Grando S.A., Protti M.P. // Crit.Rev.Mol.Biol. 1994. Vol.29. P.69-123

18. McCormick D.D., Atassi M.Z. // Biochem.a. 1984. Vol.224. Pt 3. P.995-1000

19. Fulachier M.-H., Mourier G., Cotton д., Servent D., Menez A. // FEBS Lett. 1994. Vol.338. No.3. P.331-338

20. Клукас О., Пешенко И.А., Родионов И.Л., Телякова О.В., Уткин Ю.Н., Цетлин В.И. // Биоорган.химия. 1995. Т.21. № 2. С.152-155

21. Dv/yer В.P. // Biochemistry. 1SSS. Vol.27. P.55S6-5592

22. Moore C.R., Yates J.R., Griffin P.R., Shabanowitz J. , Martino P.A., Hunt D.F., Cafiso D.S. // Biochemistry. 1989. Vol.29. P.9184-9191

23. Perez-Ramirez В., Iriarte A., Martinez-Carrion M. // 3.Protein Chem. 1994. Vol.13. No.l. P.67-76

24. Mund M., Weise С., Franke P., Hucho F. // J.Protein Chem. 1997. Vol.16. No.3. P.161-170

25. Go M. // Adv.Biophys. 1985. Vol.19. P.19-131

26. Doolitle R.F. // Annu.Rev.Biochem. 1995. Vol.64. P.287-314

27. Haggerty J.G., Froehner S.C. // J.Biol.Chem. 1981. Vol.256. No.16. P.8294-8297

28. Tarrab-Hazdai R., Goldfarb V. // Eur.J.Biochem. 1982. Vol.121. No.3. P.545-551

29. Tzartos S.O., Changeux J.-P. // EMBO J. 1983. Vol.2. No.3. P.381-387

30. Tzartos S.O., Changeux J.-P. // J.Biol.Chem. 1984. Vol.259. No.18. P.11512-11519

31. Wilson P.Т., Lentz T.L., Hawrot E. // Proc.Natl.Acad.Sei.USA. 1985. Vol.82. No.24. P.8790-8794

32. Wilson P.Т., Lentz T.L.//Biochemistry. 1988. Vol.27. No.18. P.6667-6674

33. Wilson P.Т., Hawrot E., Lentz T.L. // Mol.Pharmacol. 1988. Vol.34. P.643-650

34. Donnelly-Roberts D.L., Lentz T.L. // Biochemistry. 1991. Vol.30. P.7484-7491

35. Lentz T.L. // Biochemistry. 1995. Vol.34. No.4. P.1316-1322

36. Fujita N., Nelson N., Fox T.D., Claudio Т., Lindstrom J., Riezman H., Hess G.P. // Science. 1986. Vol.231. P.1284-1287

37. Barkas Т., Mauron A., Roth В., Alliod C., Tzartos S.J., Ballivet M. // Science. 1987. Vol.235. P.77-80

38. Gershoni J.M. // Proc.Natl.Acad.Sei.USA. 1987. Vol.84. P.4318-4321

39. Aronheim A., Eshel Y., Mosckovitz R., Gershoni J.M. // J.Biol.Chem. 1988. Vol.263. No.20. P.9933-9937

40. Oiki S., Danho W., Madison V., Montal M. // Proc.Natl.Acad.Sei.USA. 1988. Vol.85. No.22. P.8703-8707

41. Kersh G.J., Tomich J.M., Montal M. // Biochem.Biophys.Res.Commun. 1989. Vol.162. No.l. P.352-356

42. Oblatt Montal M., Iwamoto Т., Tomich J.M., Montal M. // FEBS Lett. 1993. Vol.320. No.3. P.261-266

43. Iwamoto Т., Grove A., Montal M.O., Tomich Э.М. // Int.J.Pept.Protein Res. 1994. Vol.43. No.6. P.597-607

44. Montal M. // Annu.Rev.Biophys.Biomol.Struct. 1995. Vol. 24.

P.31-57

45. Opella S.O., Gesell J., Valente A.P., Marassi F.M., Obiatt-Montal M., Sun W., Ferrer-Montiel A., Montal M. // Chemtracts-Biochemistry and Molecular Biology. 1997. Vol.10. P.153-174

46. Iizuka M., Fukuda K. // D.Biochem.(Tokyo). 1993. Vol.114. P.140-147

47. Gorne-Tschelnokow U., Strecker A., Kaduk C., Naumann D., Hucho F. // EMBO J. 1994. Vol.13. No.2. P.338-341

48. Dreger M., Krauss M., Herrmann A., Hucho F. // Biochemistry. 1997. Vol.36. No.4. P.839-847

49. Уткин Ю.Н., Мунд M., Хухо Ф., Цетлин В.И. // Биоорган.химия. 1996. Т.22. № 5. С.387-389

50. Roth U., Schonfeld G., Schroder В., Schrattenholz А. // Anal.Biochem. 1996. Vol.233. No.l. P.67-70

51. West A.P., Dr., Bjorkman P.J., Dougherty D.A., Lester H.A. // J.Biol.Chem. 1997. Vol.272. No.41. P.25468-25473

52. Corbin J., Methot N., Wang H.H., Baenziger D.E., Blanton M.P. // J.Biol.Chem. 1998. Vol.273. No.2. P.771-777

53. Kasheverov I., Utkin Yu., Weise С., Franke P., Hucho F., Tsetlin V. // Protein Express.Purif. 1998. Vol.12. No. 2. P.226-232

54. Takamori M. // Ann.N.Y.Acad.Sei. 1993. Vol.681. P.168-171

55. Klymkowsky M.W., Stroud R.M. // J.Mol.Biol. 1979. Vol.128. No.3. P.319-334

56. Bon F., Lebrun E., Gomel 0., van Rapenbusch R., Cartaud 3., Popot J.-L., Changeux J.-P. // J.Mol.Biol. 1984. Vol.176. No.l. P.205-238

57. Brisson A., Unwin P.N.T. // Nature. 1985. Vol.315. No.6019. P.474-477

58. Kubalek E., Ralston S., Lindstrom J., Unwin N. // O.Cell Biol. 1987. Vol.105. No.l. P.9-18

59. Toyoshima C., Unwin N. // Nature. 1988. Vol.336. No.6196. P.247-250

60. Unwin N., Toyoshima C., Kubalek E. // J.Cell Biol. 1988. Vol.107. No.3. P.1123-1138

61. Toyoshima C., Unwin N. // J.Cell Biol. 1990. Vol.111. No.6 (Pt 1). P.2623-2635

62. Unwin N. // 0.Mol.Biol. 1993. Vol.229. No.4. P.1101-1124

63. Unwin N. // Nature. 1995. Vol.373. P.37-43

64. Beroukhim R., Unwin N. // Neuron. 1995. Vol.15. No.2. P.323-331

65

66

67

68

69

70

71

72

73

74

75

76

77

78

79

80

81

82

83

84

Unwin N. // J.Mol.Biol. 1996. Vol.257. No.3. P.586-596 Beroukhim R., Unwin N. // Ultramicroscopy. 1997. Vol.70. No.1-2. P.57-81

Unwin N. /'/ j .Struct .Biol . 1398. Vol.121. No . 2 . P.181-190 Kay L.E. // Biochem.Cell Biol. 1997. Vol.75. No.1. P.1-15 Clore G.M., Gronenborn A.M. // Trends Biotechnol. 1998. Vol.16. No.1. P.22-34

Gettins P.G. // Int.J.Biol.Macromol. 1994. Vol.16. No.5. P.227-235

Cung M.T., Marraud M., Hadjidakis I., Bairaktari E., Sakarellos C., Kokla A., Tzartos S. // Biopolimers. 1989. Vol.28. P.465-478

Cung M. T. , Demange P., Marraud M., Tsikaris V., Sakarellos C., Papadouli I., Kokla A., Tzartos S.J. // Biopolymers. 1991. Vol.31. No.6. P.769-776

Cung M.T., Tsikaris V., Demange P., Papadouli I., Tzartos S.J., Sakarellos C., Marraud M. // Pept.Res. 1992. Vol.5. No. 1. P.14-24

Tsikaris V., Detsikas E., Sakarellos-Daitsiotis M., Sakarellos C. , Vatzaki E., Tzartos S.J., Marraud M., Cung M.T. // Biopolymers. 1993. Vol.33. No.7. P.1123-1134

Orlewski P., Marraud M., Cung M.T., Tsikaris V., Sakarellos-Daitsiotis M., Sakarellos C., Vatzaki E., Tzartos S.J. // Biopolymers. 1996. Vol.40. No.5. P.419-432 Song G.-Q., Armitage I.M., Hawrot E. // Biochem.Pharmacol.

1990. Vol.40. No.1. P.63-65

Basus V.J., Song G., Hawrot E. // Biochemistry. 1993. Vol.32. P.12290-12298

Gentile L.N., Basus V.J., Shi Q.L., Hawrot E. // Ann.N.Y.Acad.Sei. 1995. Vol.757. P.222-237 Gentile L.N., Hawrot E. // ibid. P.117-119

Bothner-By A.A., Mishra P.K., Low B.W. // Frontiers of NMR in Molecular Biology. 1990. New York, Alan R.Liss, Inc. P.15-25 Williamson P.T., Grobner G., Spooner P.J., Miller K.W., Watts A. // Biochemistry. 1998. Vol.37. No.30. P.10854-10859 Bechinger B., Kim Y., Chirlian L.E., Gesell J., Neumann J.M., Montal M., Tomich J., Zasloff M., Opella S.J. // J.Biomol.NMR.

1991. Vol.1. No.2. P.167-173

Lugovskoy A.A., Maslennikov I.V., Utkin Yu.N., Tsetlin V.l., Cohen J.B., Arseniev A.S. // Eur.J.Biochem. 1998. Vol.255. No.2. P.455-461

Fraenkel Y., Navon G., Aronheim A., Gershoni J.M. // Biochemistry. 1990. Vol.29. No.10. P.2617-1622

85. Fraenkel Y., Ohana В., Gershoni J.M., Navon G. // O.Basic CI in.Physiol.Pharmacol. 1991. Vol.2. No.3. P.207-215

86. Ohana В., Fraenkel Y., Navon G., Gershoni J.M. // Вiocnem.Biophys.Res.Commun. 1991. Vol.179. No.l. P.648-654

87. Fraekel Y., Shalev D.E., Gershoni J.M., Navon G. // Crit.Rev.Bichem.Mol.Biol. 1996. Vol.31. No.4. P.273-301

88. Rickert K.W., Imperiali B. // Chem.Biol. 1995. Vol.2. No.11. P.751-759

89. Лихтенштейн Г.И., Куликов А.В., Котельников А.И. // Метод спиновых меток и зондов: проблемы и перспективы. - М. : Наука, 1986. С.41-61

90. Кокорин А.И. // там же, с.61-79

91. Лившиц В.А. // там же, с.79-105

92. Millhauser G.L. // Trends Biochem.Sci. 1992. Vol.17. No.11. P.448-452

93. Marsh D. // Bras.J.Med.Biol.Res. 1996. Vol.29. No.7. P.863-871

94. Weiland G., Georgia В., Wee V.T., Chignell C.F., Taylor P. // Mol.Pharmacol. 1976. Vol.12. No.6. P.1091-1105

95. Tsetlin V.I., Karlsson E., Arseniev A.S., Utkin Yu.N., Surin A.M., Pashkov V.S., Pluzhnikov K.A., Ivanov V.T., Bystrov V.F., Ovchinnikov Yu.A. // FEBS Lett. 1979. Vol.106. No.l. P.47-52

96. Цетлин В.И., Овчинников Ю.А. // Метод спиновых меток и зондов: Проблемы и перспективы. - М.: Наука, 1986. С.105-124

97. Ellena 3.F., McNamee M.G. // FEBS Lett. 1980. Vol.110. No.2. P.301-304

98. Rousselet A., Faure G., Boulain J.С., Menez A. // Eur.J.Biochem. 1984. Vol.140. No. 1. P.31-37

99. Palma A.L., Wang H.H. // J.Membrane Biol. 1991. Vol.122. P.143-153

100". Baroin A., Thomas D.D., Osborne В., Devaux P.F. // Biochem. Biophys.Res.Commun. 1977. Vol.78. P.442-447

101. Rousselet A., Devaux P.F. // ibid. P.448-454

102. Rousselet A., Cartaud J., Devaux P.F. // Biochim.Biophys.Acta. 1981. Vol.648. No.2. P.169-185

103. Marsh D., Barrantes F.J. // Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 1978. Vol.75. P.4329-4333

104. Ellena J.F., Blazing M.A., McNamee M.G. // Biochemistry. 1983. Vol.22. P.5523-5535

105. Fraser D.M., Louro S.R.W., Horvath L.I., Miller K.W., Watts A. // Biochemistry. 1990. Vol. 29. P.2664-2669

106. Abadji V.C., Raines D.E., Watts A., Miller K.W. // Biochim.Biophys.Acta. 1993. Vol.1147. No.l. P.143-153

107. Raines D.E., Wu G., Dalton L.A., Miller K.W. // Biophys.J. 1995. Vol.69. P.498-505

108. Кэри П. Применения спектроскопии KP и РКР в биохимии: Пер. с англ. - М.: Мир, 1985. - 272 с.

109. Callender R., Deng Н. // Annu.Rev.Biophys.Biomol.Struct. 1994. vol.23. P.215-245

110. Miura Т., Thomas G.J., Jr. // Subcell.Biochem. 1995. Vol.24. P.55-99

111. Peticolas W.L. // Meth.Enzymol. 1995. Vol.246. P.389-416

112. Haris P.I., Chapman D. // Trends Biochem.Sei. 1992. Vol.17. P.328-333

113. Jackson M., Mantsch H.H. // Crit.Rev.Biochem.Mol.Biol. 1995. Vol.30. P.95-120

114. Cooper E.A., Knutson K. // Pharm.Biotechnol. 1995. Vol.7. P.101-143

115. Braiman M.S., Rothschild K.J. // Ann.Rev.Biophys.Chem. 1988. Vol.17. P.541-570

116. Aslanian D., Heidmann Th., Negrerie M., Changeux J.-P. // FEBS Lett. 1983. Vol.164. No.2. P.393-400

117. Yager P., Chang E.L., Williams R.W., Dalziel A.W. // Biophys.J. 1984. Vol.45. Pt 1. P.26-28

118. Fong T.M., McNamee M.G. // Biochemistry. 1987. Vol.26. No.13. P.3871-3880

119. Negrerie M., Aslanian D., Bouet F., Menez A., Nghiem H.O., Changeux J.P. // FEBS Lett. 1991. Vol.292. No.1-2. P.249-253

120. Fernandez-Ballester G., Castresana J., Arrondo J.-L.R., Feragut J.A., Gonzalez-Ros J.M. // Biochem.J. 1992. Vol.288. Pt 2. P.421-426

121. Castresana J., Fernandez-Ballester G., Fernandez A.M., Laynes J.L., Arrondo J.L.R., Ferragut J.A., Gonzalez-Ros J.M. // FEBS Lett. 1992. Vol.314. No.2. P.171-175

122. Artigues A., Villar M.T., Ferragut J.A., Gonzalez-Ros J.M. // Arch.Biochem.Biophys. 1987. Vol.258. No.l. P.33-41

123. Naumann D., Schultz С., Gorne-Tschelnokow U., Hucho F. // Biochemistry. 1993. Vol.32. No.12. P.3162-3168

124. Butler D.H., McNamee M.G. // Biochim.Biophys.Acta. 1993. Vol.1150. No.l. P.17-24

125. Aslanian D., Grof P., Galzi J.L., Changeux J.-P. // Biochim.Biophis.Acta. 1993. Vol.1148. No.2. P.291-302

126. Methot N., McCarthy M.P., Baenziger J.E. // Biochemistry. 1994. Vol.33. No.24. P.7709-7717

127. Ryan S.E., Demers C.N., Chew J.P., Baenziger J.E. // J.Biol.Chem. 1996. Vol.271. No.40. P.24590-24597

128. Yang J.Т., Wu C.-S., Martinez H.M. // Methods Enzymol. 1986. Vol.130. P.208-269

129. Johnson W.C., Jr. // Annu.Rev.Biophys.Chem. 1988. Vol.17. P.145-166

130. Greenfield N.J. // Anal.Biochem. 1996. Vol.235. No.l. P.l-10

131. Kelly S.M., Price N.C. // Biochi®.Biophys.Acta. 1997. Vol.1338. No.2. P.161-185

132. Jones C., Bolgiano B. // Nanobiology. 1996. Vol.4. No.l. P. 1-15

133. Glaeser R.M., Jap B.K. // Biochemistry. 1985. Vol.24. No.23. P.6398-6401

134. Park K., Perczel A., Fasman G.D. // Protein Sei. 1992. Vol.1. No.8. P.1032-1049

135. Fasman G.D. // Biopolymers (Peptide Science). 1995. Vol.37. P.339-362

136. Moore W.M., Holladay L.A., Puett D., Brady R.N. // FEBS Lett. 1974. Vol.45. P.145-149

137. Chen Y., Yang J.T., Martinez H.M. // Biochemistry. 1972. Vol.11. P.4120-4131

138. Puett D., Ascoli M., Holladay L.A. // Hormone Activation and Binding in Testis (Means, A.R. and Dufau M.L., eds.), Plenum Press, New York, 1974

139. Preuner J., Ruther T. // Biochem.Pharmacol. 1980. Vol.29. P.397-403

140. Imamura T., Konishi K., Konishi K. // J.Biochem.(Tokyo). 1982. Vol.92. No.6. P.1901-1910

141. Mielke D.L., Kaldany R.-R., Karlin A., Wallace B.A. // Ann.N.Y.Acad.Sei. 1986. Vol.463. P.392-395

142. Mao D., Wächter R., Wallace B.A. // Biochemistry. 1982. Vol.21. P.4960-4968

143. Mielke D.L., Wallace B.A. // J.Biol.Chem. 1988. Vol.263. No. 7. P.3177-3182

144. Wallace B.A., Teeters C.L. // Biochemistry. 1987. Vol.26. P .65-70

145. Chang C.R., Wu C.C., Yang J.T. // Anal.Biochem. 1978. Vol.91. P.13-31

146. Provencher S.W., Glockner J. // Biochemistry. 1981. Vol.20. P.33-37

147. Hennessey J.P., Jr., Johnson W.C., Jr. // Biochemistry. 1981. Vol.20. P.1085-1094

148. Wu C.-S.C., Sun X.H., Yang J.T. // J.Protein Chem. 1990. Vol.9. No.l. P.119-126

149. Perczel A., Hollosi M., Tusnady G., Fasman G.D. // Protein Eng. 1991. Vol.4. P.669-679

150. Manavalan P., Johnson W.C., Jr. // Anal.Biochem. 1987. Vol.167. P.76-85

151. Gotti С., Mazzola G., Longhi R., Fornasari D., Clementi F. // Neurosci.Lett. 1987. Vol.82. No.l. P.113-119

152. Conti-Tronconi B.M., Diethelm B.M., Wu X., Tang F., Bertazzon T. /'/' Biochemistry. 1991. Vol.30. No. 10. P. 2575-2584

153. Donnelly-Roberts D.L., Lentz T.L. // Mol.Brain Res. 1993. Vol.19. No.1-2. P.55-61

154. McCormick D.J., Liebenow J.A., Griesmann G.E., Lennon V.A. // J. Neurochem. 1993. Vol.60. No.5. P.1906-1914

155. Compton L.A., Johnson W.C., Jr. // Anal.Chem. 1986. Vol.155. P.155-167

156. Oiki S., Madison V., Montal M. // Proteins Struct.Funct.Genet. 1990. Vol.8. No.3. P.226-236

157. Montal M., Montal M.S., Tomich J.M. // Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 1990. Vol.87. No.18. P.6929-6933

158. Schneider A.S., Rosenheck K. // Techniques in Lipid and Membrane Biochemistry, Pt II, B424, Elsevier Science Publishers, Ireland, 1980, pp.1-26

159. Болотина И.А., Лугаускас В.И. // Молек.биол. 1985. Т.19. № 5. С.1409-1421

160. Woody R.W. // Eur.Biphys.J. 1994. Vol.23. No.4 . P.253-262

161. Krittanai C., Johnson W.C., Jr. // Anal.Biochem. 1997. Vol.253. No.l. P.57-64

162. Cascio M., Wallace B.A. // Anal.Biochem. 1995. Vol.227. No.l. P.90-100

163. Бурштейн Э.А. Собственная люминесценция белка: Природа и применения. Итоги науки и техники, Биофизика, Т.7. - М. : ВИНИТИ, 1977

164. Лакович Дж. Основы флуоресцентной спектроскопии. - М.: Мир, 1986. - 496 с.

165. Демченко А.П. Люминесценция и динамика структуры белков. Киев: Наук.думка, 1988. - 280 с.

166. Jiskoot W., Hlady V., Naleway J.J., Herron J.N. // Pharm.Biotechnol. 1995. Vol.7. P.1-63

167. Millar D.P. // Curr.Opin.Struct.Biol. 1996. Vol.6. No.5. P.637-642

168. Eldefrawi M.E., Eldefrawi А.Т., Wilson D . В.//Biochemistry. 1975. Vol.14. No.19. P.4304-4310

169. Grunhagen H.-H., Changeux J.-P. // J.Mol.Biol. 1976. Vol.106. No.3. P.497-516

170. Bonner R., Barrantes F.J., Jovin T.M. //Nature. 1976. Vol.263. No.5576. P.429-431

171. Barrantes F.J. // J.Mol.Biol. 1978. Vol.124. No.l. P.1-26

172. Kaneda N., Tanaka F., Kohno M. , Hayashi K., Yagi K. // Arch.Biochem.Вiophys. 1982. Vol.218. No.2. P.376-383

173. Endo T., Nakanishi M., Furukawa S., Joubert F.J., Tamiya N., Hayashi K. // Biochemistry. 1986. Vol.25. P.395-404

174. Chicheportiche R., Vincent J.-P., Kopeyan C., Schweitz H., Lazaunski M. // Biochemistry. 1975. Vol.14. No.10. P.2081-2091

175. Dunn S.M.J., Raftery M.A. // Biochemistry. 1982. Vol.21. P.6264-6272

176. Dunn S.M.J., Conti-Tronconi B.M., Raftery M.A. // Biochemistry. 1983. Vol.22. P.2512-2518

177. Dunn S.M.J., Raftery M.A.//Biochemistry. 1993. Vol.32. P.8608-8615

178. Weber G., Borris D.P., De Robertis E., Barrantes F,J., La Torre J.L., Llorente de Carl in M.C. // Mol.Pharmacol. 1971. Vol.7. No.5. P.530-537

179. Cohen J.B., Changeux J.-P. // Biochemistry. 1973. Vol.12. No.24. P.4855-4864

180. Raines D.E., Krishnan N.S. // Biochemistry. 1998. Vol.37. No.3. P.956-964

181. Schimerlik M., Quast U., Raftery M.A. // Biochemistry. 1979. Vol.18. No.10. P.1884-1890

182. Herz J.M., Johnsom D.A., Taylor P. // J.Biol.Chem. 1987. Vol.262. No.15. P.7238-7247

183. Lurtz M.M., Hareland M.L., Pedersen S.E. // Biochemistry. 1997. Vol.36. No.8. P.2068-2075

184. Suszkiw J.B., Ichiki M. // Anal.Biochem. 1976. Vol.73. P . 109-114

185. Tsetlin V.l., Karlsson E., Utkin Yu.N., Arseniev A.S., Surin A.M., Pashkov V.S., Pluznikov K.A., Ivanov V.T., Bystrov V.F., Ovchinnikov Yu.A. // FEBS Lett. 1979. Vol.106. No.l. P.47-52

186. Johnson D.A., Taylor P. // J.Biol.Chem. 1982. Vol.257. No.10. P.5632-5636

187. Garcia-Borron J.C., Chinchetru M.A., Martinez-Carrion M. // J.Protein Chem. 1990. Vol.9. Vol.9. No.6. P.683-693

188. Johnson D.A., Voet J.G., Taylor P. // J.Biol.Chem. 1984. Vol.259. No.9. No.5717-5725

189. Johnson D.A., Yguerabide J. // Biphys.J. 1985. Vol.48. No.6. P.949-955

190. Johnson D.A., Cushman R., Malekzadeh R. // J.Biol.Chem. 1990. Vol.265. No.13. P.7360-7368

191. Herz J.M., Johnson D.A., Taylor P. // J.Biol.Chem. 1989. Vol.264. No.21. P.12439-12448

192. Valenzuela F.C., Weign P., Yguerabide J., Johnson D.A. // Biophys.J. 1994. Vol.66. No.3. Pt 1. P.674-682

193. Lo M.M.S., Garland P.B., Lamprecht J., Barnard E.A. // FEBS Lett. 1980. Vol.111. No.2. P.407-412

194. Radding W., Corfield P.W.R., Levinson L.S., Hashim G.A., Low B.W. // FEBS Letters. 1988. Vol.231. No.l. P.212-216

195. Pearce S.F., Hawrot E. // Biochemistry. 1990. Vol.29. P.10649-10659

196. Pearce S.F., Preston-Hurlburt P., Hawrot E. // Proc.R.Soc.Lond.B. 1990. Vol.241. P.207-213

197. Schlyer B.D., Maki A.H., Hawrot E. // FEBS Letters. 1992. Vol.297. No.1,2. P.87-90

198. Tringali A.E., Pearce S.F.A., Hawrot E., Brenner H.C. // FEBS Lett. 1992. Vol.308. No.2. P.225-228

199. Crowe D., Dobeli H., Gentz R., Hochuli E., Stuber D., Henco K. // Methods Mol.Biol. 1994. Vol.31. P.371-387

200. Yip T.-T., Hutchens T.W. // Mol.Biotechnol. 1994. Vol.1. No.2. P.151-164

201. Kiss R.S., Kay C.M., Ryan R.O. // Protein Expr.purif. 1998. Vol.12. No.3. P.353-360

202. pET System Manual (5th Edition). Novagen, TB#55, 1995.

203. Hejnaes K.R., Bayne S., Norskov L., Sorensen H.H., Thomsen J., Schaffer L., Wollmer A., Skriver L. // Protein Eng. 1992. Vol.5. No.8. P.797-806

204. Yang Y., Sweeney W.V., Schneider K., Chait B.T., Tarn J.P. // Protein Sei. 1994. Vol.3. No.8. P.1267-1275

205. Jones M.D., Narhi L.O., Chang W.C., Lu H.S. // J.Biol.Chem.

1996. Vol.271. No.19. P.11301-11308

206. Fischer B., Sumner I., Goodenough P. // Biotechnol.Bioeng. 1993. Vol.41. P.3-13

207. Ahmed A.K., Schaffer S.W., Wetlaufer D.B. // J.Biol.Chem. 1975. Vol.250. P.8477-8482

208. Chang J.Y., Swartz J.R. // Protein Folding: In Vivo and In Vitro (J.Cleland and J.King, eds.), American Chemical Society, 1993, pp.178-188

209. Tarn J.P., Wu C.-R., Liu W., Zhang J.-W. // J.Am.Chem.Soc. 1991. Vol.113. P.6657-6662

210. Clark E.D.B. // Curr.Opin.Biotechnol. 1998. Vol.9. No. 2. P . 157-163

211. Dionisi H.M., Checa S.K., Krapp A.R., Arakaki A.K., Ceccarelli E.A., Carrillo N., Viale A.B. // Eur.J.Biochem. 1998. Vol. 251. No.3. P.724-728

212. Watt M.A., Lo R.Y., Mellors A. // Cell Stress Chaperones.

1997. Vol.2. No.3. P.180-190

213. Waheed A., Pham T., Won M., Okuyama T., Sly W.S. // Protein Expr.Purif. 1997. Vol.9. No.2. P.279-287

214. Helenius A., Simons K. // Biochim.Biophys.Acta. 1975. Vol.415. P.29-79

215. Karlsson E., Heilbronn E., Widlund L. // FEBS Lett. 1972. Vol.28. No.l. P.107-111

216. Moore W.M., Brady R.N. // Biochim.Biophys.Acta. 1977. Vol.498.

No.l. P.331-340

217. Lindstrom J., Anholt R., Einarson В., Engel A., Osame M. , Montal M. // J.Biol.Chem. 1980. Vol.255. No.17. P.8340-8350

218. Kalies I., Heinz F., Hohlfeld R., Wekerle H., Birnberger K.L., Kalden J.R. // Mol.Cell.Biochem. 1984. Vol.64. No.l. P.69-79

219. Kawanami S., Conti-Tronconi B.M., Raes J., Raftery M.A. // J.Neurol.Sei. 1988. Vol.87. No.2-3. P.195-209

220. Скок В.И. // Биол.мембраны. 1985. Т.2. С.245-255

221. Ortells М.О. // Proteins Struct.Funct.Genet. 1997. Vol.29. P.391-398

222. Gready J.E., Ranganathan S., Schofield P.R., Matsuo Y., Nishikawa K. // Protein Sei. 1997. Vol.6. P.983-998

223. Nelson J.W., Kallenbach N.R. // Biochemistry. 1989. Vol.28.

P.5256-5261

224. Li S.-C., Deber C.M. // J.Biol.Chem. 1993. Vol.268. No.31. P.22975-22978

225. Kemmink J., Creighton Т.Е. // Biochemistry. 1995. Vol.34. P.12630-12635

226. Li S.-C., Goto N.K., Williams K.A., Deber C.M. // Proc.Natl.Acad.Sei.USA. 1996. Vol.93. P.6676-6681

227. Sivaraman Т., Kumar Т.К., Yu C. // Int.J.Biol.Macromol. 1996. Vol.19. No.4. P.235-239

228. Provencher S.W. // Comput.Phys.Commun. 1982. Vol.27. P.213-227

229. Provencher S.W. // ibid. P.229-242

230. Sreerama N., Woody R.W. // Anal.Biochem. 1993. Vol.209. No.l. P.32-44

231. Sreerama N., Woody R.W. // J.Mol.Biol. 1994. Vol.242. No.4.

P.497-507

232. Pasta P., Carrea G., Longhi R., Zetta L. // Biochim.Biophys.Acta. 1990. Vol.1039. P.1-4

233. Manavalan P., Johnson W.C., Jr. // Nature. 1983. Vol.305. No.5937. P.831-832

234. Deber C.M., Li S.-C. // Biopolymers (Peptide Science). 1995. Vol.37. P.295-318

235. Wigley W.C., Vijayakumar S., Jones J.D., Slaughter C., Thomas P.J. // Biochemistry. 1998. Vol.37. P.844-853

236. Finer-Moore J., Stroud R.M. // Proc.Natl.Acad.Sei.USA. 1984. Vol.81. No.l. P.155-159

237. Tsigelny I., Sugiyama N., Sine S.M., Taylor P. // Biophys. J. 1997. Vol.73. P.52-66

238. Dunach M., Sabes M., Padros E. //Eur.J.Biochem. 1983. Vol.134. P.123-128

239. Mach H., Middaugh C.R. // Anal.Biochem. 1994. Vol.222. P.323-331

240. Lange R., Frank J., Saldana 3.-L., Balny C. // Eur.Biophys.J. 1996. Vol.24. P.277-283

241. Yamagishi T., Yamauchi F., Shibasaki K. // Agric.Biol.Chem. 1981. Vol.45. No.2. P.459-467

242. Chen Y., Barkley M.D. // Biochemistry. 1998. Vol.37. No.28. P.9976-9982

243. Jenkins B.G. // Life Sciences. 1991. Vol.48. No.13. P.1227-1240

244. Falke J.J., Luck L.A., Scherrer J. // Biophys.J. 1992. Vol.62. No.l. P.82-86

245. Gerig J.T. // Progress in NMR spectroscopy. 1994. Vol.26. Pt 4. P.293-370

246. Myers R.A., Zafaralla G.C., Gray W.R., Abbott J., Cruz L.J., Olivera B.M. // Biochemistry. 1991. Vol.30.P.9370-9377

247. Shiebler W., Lauffer L., Hucho F. // FEBS Lett. 1977. Vol.81. P . 39-42

248. Bradford M.M. // Anal.Biochem. 1976. Vol.72. P.248-254

249. Mach H., Middaugh C.R., Lewis R.V. // Anal.Biochem. 1992. Vol.200. P.74-80

250. Gill S.C., von Hippel P.H. // Anal.Biochem. 1989. Vol.182. No.2. P.319-326

251. Whitaker J.R., Granum P.E. // Anal.Biochem. 1980. Vol.109. P.156-159

252. Smith P.K., Krohn R.I., Hermanson G.T., Mallia A.K., Gartner F.H., Provenzano M.D., Fujimoto E.K., Goeke N.M., Olson B.J., Klenk D.C. // Anal.Biochem. 1985. Vol.150, o.l. P.76-85

253. Laemmli U.K. // Nature. 1970. Vol.227. P.680-685

254. Merril C.R., Goldman D., Sedman S.A., Ebert M.H. // Science. 1981. Vol.211. P.1437-1438

255. Gershoni J.M. // Methods Biochem.Anal. 1988. Vol.33. P.1-58

256. Perczel A., Park K., Fasman G.D. // Anal.Biochem. 1992. Vol.203. No.l. P.83-93

257. Johnson W.C., Jr. // Proteins Struct.Funct.Genet. 1990. Vol.7. P.205-214

258. Kabsch W., Sander C. // Biopolymers. 1983. Vol.22. No.12. P.2577-263

259. Wang J.-K., Schmidt J. // J.Biol.Chem. 1980. Vol.255. No.23. P.11156-11162

260. Schmidt J., Raftery M.A. // Anal.Biochem. 1973. Vol.52. P. 349-354

261. Kachalsky S.G., Jensen В.S., Barchan D., Fuchs S. // Proc.Natl.Acad.Sei.USA. 1995. Vol.92. No.23. P.10801-10805