Рекомбинантные фрагменты альфа-фетопротеина человека для создания лекарств адресной доставки тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.04, кандидат биологических наук Шарапова, Ольга Андреевна

• Шарапова, Ольга Андреевна
• кандидат биологических наук
• 2012

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Шарапова, Ольга Андреевна

Содержание

Список использованных сокращений

Введение

I. Обзор литературы

1. Проблема злокачественных новообразований и способы их лечения

Проблема злокачественных новообразований

Способы лечения раковых заболеваний

2. Лекарства адресного действия

Принцип адресной доставки лекарств

Использование антител в качестве молекул-носителей для адресной

доставки лекарств

Использование белков, связывающихся с раковыми клетками, в качестве молекул-носителей для адресной доставки лекарств

3. Альфа-фетопротеин человека - его строение и функциональные свойства

Введение

Строение алъфа-фетопротеина человека

Функциональные свойства алъфа-фетопротеина человека

4. Ренатурация рекомбинантных белков

Причины агрегации рекомбинантных белков при экспрессии в

бактериальной системе

Общие представления о ходе сворачивания белковой молекулы

Общие представления о процессе ренатурации белков

5. Основные методы ренатурации рекомбинантных белков

Ренатурация методом разбавления

Ренатурация методом пульс-разбавления

Ренатурация методом диализа

Основные параметры условий ренатурации

6. Ренатурация белков, иммобилизованных на твердом носителе

II. Материалы и методы

1. Препаративные методы

Получение нуклеотидной последовательности, кодирующей

полноразмерный АФП

Создание генно-инженерных конструкций для экспрессии вариантов С-

концевого домена АФП

Продукция гАРРЗИ595 и гАРРЗИбОЯ

Выделение и очистка ТВ, содержащих целевой белок, из клеток Е. соИ

2. Ренатурация гАРРЗБ595 и гАЕРЗБ609

Ренатурация очищенного на Ж-смоле белка методом быстрого

разбавления

Ренатурация очищенного белка методом диализа

Ренатурация белка, иммобилизованного на кремниевой металло-хелатной смоле

3. Аналитические методы

Масс-спектрометрия

Анализ N-концевой последовательности аминокислот белка

Определение свободных сулъфгидрилъных групп

Аналитическая хроматография

Круговой дихроизм (КД)

SDS-электрофорез в полиакриламидном геле

Определение концентрации белка

4. Исследование функциональных свойств rAFP3D595 и rAFP3D609

Конъюгирование rAFP3D595/rAFP3D609 с флуоресцентной метой

Клеточные линии

Анализ связывания и эндоцитоза rAFP3D595/rAFP3D609- ФИТЦ в

опухолевых клетках и лимфоцитах

Микроскопия

Конъюгирование rAFP3D609 с ципрофлоксацином

Анализ цитотоксической активности конъюгата rAFP3D с цитостатиком в опухолевых клетках и лимфоцитах

III. Результаты и обсуждение

1. Клонирование и экспрессия вариантов С-концевого домена АФП

Экспрессия с помощью ИПТГ

Автоиндукция

2. Выделение и очистка ТВ

3. Ренатурация фрагментов С-концевого домена АФП

Ренатурация методом разбавления

Ренатурация методом диализа

Ренатурация фрагментов АФП на твердой фазе

Сравнениеренатурации методом разбавления и с помощью IMAC

4. Физико-химический анализ ренатурированных фрагментов АФП

Подтверждение идентичности полученного целевого белка методом масс-

спектрометрии

Анализ N-концевой последовательности фрагмента АФП

Хроматографический анализ олигомерного состояния белка

Определение числа сулъфгидрилъных групп с помощью реактива Эллмана 88 Анализ вторичной структуры ренатурированных фрагментов методом КД

5. Анализ функционально свойств рекомбинантных фрагментов АФП

Распределение флуоресцентно меченных фрагментов АФП в

экспериментах in vitro

Химическое конъюгирование rAFP3D609 с ципрофлоксацином

Цитотоксическая активность конъюгата rAFP3D609-Cipro

Заключение

Выводы

Список литературы

Список использованных сокращений

АГ антиген

а.о. аминокислотные остатки

АТ антитело

АФП альфа-фетопротеин человека

БСА бычий сывороточный альбумин

ЖК жирная кислота

ИПТГ изопропил-Р-Б-1 -тиогалактопиранозид

КД круговой дихроизм

кДНК кодирующая дезоксирибонуклеиновая кислота

МЛУ множественная лекарственная устойчивость

МоАТ моноклональные антитела

МоАТ-РАФП моноклональные антитела к рецептору альфа-фетопротеина человека

мРНК матричная рибонуклеиновая кислота

ОЕ оптические единицы

ПСА персульфат аммония

РАФП рецептор альфа-фетопротеина человека

РНК рибонуклеиновая кислота

ТВ тельца включения

ТЕМЕД ' ' -тетраметилэтилендиамин

5

Трис-HCl трис-гирдоксиметиламинометана хлорид

тРНК транспортная рибонуклеиновая кислота

УЗ ультразвук

ФБС фетальная бычья сыворотка

ФИТЦ флуоресцеинизотиоцианат

ФСБ фосфатно-солевой буфер

ЧСА человеческий сывороточный альбумин

ВСА бицинхониевая кислота (Bicinchoninic Acid)

CD20 антиген В-лимфоцитов, кластер дифференцировки 20 (cluster of differentiation 20)

CD30 белок семейства рецепторов фактора некроза опухоли, кластер дифференцировки 30 (cluster differentiation 30)

DMEM модифицированная по способу Дульбекко среда Игла (Dulbecco's modified Eagle medium)

EDC 1 -этил-З-(З-диметиламинопропил) карбодиимид

IMAC ренатурация иммобилизованных белков на металло-аффинной смоле (immobilized metal affinity chromatography)

MALDI матрично-активированная лазерная десорбция/ионизация (matrix assisted laser desorption/ionization)

SDS додецилсульфат натрия (sodium dodecyl sulfate)

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Рекомбинантные фрагменты альфа-фетопротеина человека для создания лекарств адресной доставки»

Введение

Широко применяемым методом в противораковой терапии является химиотерапия. Эффективность химиопрепаратов обеспечивается тем, что все они, в силу природы своего действия, особенно эффективно убивают активно делящиеся и метаболизирующие клетки. К сожалению, помимо раковых клеток, такими же характеристиками в норме обладают клетки костного мозга, желудочно-кишечного тракта и волосяных фолликул [1]. Как следствие, весь спектр побочных эффектов от химиотерапии связан с воздействием препарата на нормальные активно делящиеся клетки организма.

Одним из перспективных способов повышения эффективности химиопрепаратов является их адресная доставка к раковым клеткам. Суть метода состоит в том, что химиопрепарат пришивается к векторной молекуле, которая обеспечивает доставку лекарства к определенному виду клеток. Адресность доставки обеспечивается за счет специфических, характерных только для клеток мишеней молекул на их поверхности. В связи с этим в качестве векторной молекулы могут быть использованы моноклональные антитела (МоАТ), полученные к какой-либо молекуле на поверхности клетки мишени, либо белки, рецепторы которых должны присутствовать на поверхности клеток мишеней.

Одним из перспективных кандидатов, способных обеспечить адресность доставки лекарства является альфа-фетопротеин человека (АФП). АФП является белком, характерным для эмбрионального периода развития человека [2]. В постэмбриональный период развития этот белок начинает синтезироваться только в процессе канцерогенеза [3, 4]. АФП проникает в клетки с помощью рецептор-опосредованного эндоцитоза [5]. Рецептор АФП (РАФП) так же является онкофетальным белком, т.е. в постэмбриональный период развития экс-прессируется только на поверхности раковых клеток [6, 7]. Этот факт позволяет использовать АФП как векторную молекулу для адресной доставки химиопрепаратов к раковым клеткам. Показано, что конъюгаты природного АФП с цито-статиками ингибировали рост раковых клеток in vivo и in vitro [8-10].

Использование природного АФП ограничено техническими и этическими причинами, так как его единственным источником является абортивный материал. По этой причине необходимо использовать его рекомбинантные формы. Известно, что участок связывания с рецептором находится в С-концевом домене, поэтому для целей адресной доставки является оптимальным использование рекомбинантных белковых фрагментов на основе С-концевого домена АФП [11].

Одной из главных проблем при использовании рекомбинантных белков является их получение в функциональной форме. В большинстве случаев, при продукции белков в больших количествах в бактериальной системе, они формируют в клетках так называемые тельца включения (ТВ), которые состоят из белка в агрегированном состоянии [12, 13]. Для получения функционально активного белка необходимо проводить процедуру его ренатурации. К сожалению, не существует универсальных и эффективных методик ренатурации. Это ограничивает круг рекомбинантных белков, используемых в производстве и научных исследованиях. Для гидрофобных белков с большим количеством ди-сульфидных связей эта проблема является особенно сложной. Именно такими характеристиками обладает С-концевой домен АФП. Разработка эффективной методики его ренатурации является основной трудностью при получении его в функциональной форме. Решение этой проблемы носит не только частный характер. Разработка, на примере АФП, общей методики ренатурации, подходящей для схожих по свойствам белков, позволит существенно расширить круг белков, получаемых с помощью рекомбинантных технологий в бактериальных системах экспрессии. В отношении АФП это позволит получать функциональный белок в достаточных количествах для создания его конъюгатов с цитоста-тиками, что само по себе также является сложной задачей.

Научная новизна и практическая ценность работы.

На основании анализа первичной структуры АФП и его модели пространственной структуры был отобран С-концевой домен белка, соответствующий третьему домену. Были клонированы и экспрессированы два варианта С-

концевого фрагмента АФП в клетках Е. coli: с 404 по 595 а.о. (аминокислотных остатка) (rAFP3D595) и с 404 по 609 а.о. (rAFP3D 609) полноразмерного белка. Белки экспрессировались в виде ТВ, т.е. в денатурированной форме.

Была отработана методика ренатурации с помощью быстрого разбавления в большом избытке ренатурирующего буфера. Выход белка составил не менее 50% с чистотой порядка 95%.

В качестве альтернативного метода ренатурации была выбрана ренатура-ция иммобилизованного на смоле белка. Для ренатурации рекомбинантных фрагментов АФП была использована металло-аффинная Ni-смола. Было показано, что выход ренатурированного белка сильно зависел от химической природы основы смолы: при переходе от агарозных оснований к оксиду кремния выход ренатурированного белка возрастал значительно. Выход ренатурированного белка составил порядка 100% с чистотой не менее 98%.

При разработке методик ренатурации фрагментов особое внимание уделялось не только эффективности процедуры, но и ее продуктивности, т.е. потраченным времени и материалам на единицу ренатурированного белка. При сравнении этих характеристик ренатурация на смоле была значительно более продуктивна, чем ренатурация разбавлением.

Созданная методика ренатурации иммобилизованного белка на смоле на основе оксида кремния впервые обеспечила высокоэффективную ренатурацию сложного для сворачивания белка. Разработанный подход позволит расширить спектр рекомбинантных белков, используемых в научных исследованиях и в промышленном производстве.

Было показано, что фрагменты rAFP3D595 и rAFP3D609 in vitro проникали в клетки, несущие РАФП, также как и природный АФП. При этом в нормальные клетки организма они не проникали.

Была разработана методика получения конъюгата фрагмента АФП с ци-профлоксацином, который in vitro подавлял рост раковых клеток в концентрациях на порядок меньше чем для свободного ципрофлоксацина и не влиял на рост нормальных клеток.

Полученные данные свидетельствуют о том, что С-концевой фрагмент АФП может быть использован в качестве векторной молекулы для адресной доставки химиопрепаратов к раковым клеткам. Создание лекарств на его основе будет способствовать значительному повышению эффективности применяемых химиопрепаратов и позволит начать использовать новые не применявшиеся ранее.

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Шарапова, Ольга Андреевна

Выводы

1. Получены штаммы-продуценты Е. соИ ВЬ21 (БЕЗ) для получения двух вариантов С-концевого домена АФП: соответствующий структурному С-концевому домену (с 404 по 595 а.о. - гА1ФЗВ595) и дополнительно содержащий не структурированный С-конец белка (с 404 по 609 а.о. - гАЕРЗВ609).

2. Разработана эффективная методика ренатурации рекомбинантных фрагментов гАРРЗБ595 и гАЕРЗЭ609 методом быстрого разбавления. Выход ренатурированного белка составил не менее 50% с чистотой порядка 95%.

3. Впервые показана возможность высокоэффективной ренатурации гидрофобного белка с большим количеством дисульфидных связей, иммобилизованного на металло-хелатной смоле. Выход ренатурированного белка составил порядка 100% с чистотой не менее 98%. Продуктивность ренатурации иммобилизованных фрагментов АФП на два порядка превышала продуктивность ренатурации методом разбавления.

4. Показано соответствие структур рекомбинантных ренатурированных фрагментов АФП и природного белка несколькими независимыми методами. Установлено, что ренатурированные фрагменты АФП представляют собой белки в форме мономеров. Показано, что все остатки цистеинов вовлечены в образование дисульфидных связей, как и в природном белке. Вторичная структура обоих фрагментов состоит преимущественно из а-спиралей и соответствует вторичной структуре нативного полноразмерного АФП.

5. Показано, что оба фрагмента АФП связывались и подвергались рецептор-опосредованному эндоцитозу линией опухолевых клеток, несущих РАФП, и не проникали в нормальные клетки, не несущие РАФП (лимфоциты периферической крови человека). По способности проникать в клетки они были близки к природному АФП.

6. В экспериментах на клеточных культурах показано, что конъюгат фрагмента АФП с ципрофлоксацином подавлял рост раковых клеток в концентрации на порядок меньше, чем свободный ципрофлоксацин (1С50 5 0 мкМ для конъюгата и >1000 мкМ для свободного ципрофлоксацина). Конъюгат оказывал специфический цитотоксический эффект именно на раковые клетки и, в отличие от свободного ципрофлоксацина, не влиял на рост нормальных клеток.

Заключение

Нуклеотидная последовательность, кодирующая третий домен АФП, была оптимизирована для экспрессии в бактериальной системе. Были созданы две плазмиды для экспрессии двух фрагментов АФП на основе третьего домена. Уровень индукции белка составил от 150 до 250 мг с литра культуры при разных способах индукции. Была разработана эффективная методика ренатурации белка методом разбавления, с итоговым выходом мономерной формы не менее 50% с чистотой 95%. Была разработана высокоэффективная методика ренатурации иммобилизованного на металло-хелатной смоле фрагмента АФП. Данный способ ренатурации впервые применен с высокой эффективностью для гидрофобного белка с большим количеством дисульфидных связей. Использование смолы на основе силикагеля, вместо традиционно используемых агароз-ных смол, позволило значительно улучшить эффективность ренатурации (от практически 0 до -100%). Выход ренатурированного белка составил порядка 100% с чистотой 98%. Ренатурация белка на твердой фазе по продуктивности на два порядка превосходила ренатурацию методом разбавления. В экспериментах на клеточных культурах in vitro было показано, что по своим функциональным свойствам, т.е. способности связываться с рецептором на поверхности клеток и проникать внутрь, ренатурированные обоими способами фрагменты не уступали нативному полноразмерному АФП.

Была разработана методика конъюгирования фрагмента rAFP3D609 с ципрофлоксацином. 1С50 ципрофлоксацина в форме конъюгата (50 мкМ) была в 20 раз меньше, чем для свободного цитостатика (>1000 мкМ) по отношению к раковым клеткам. Таким образом, отобранный фрагмент АФП в форме конъюгата обеспечивал специфическую доставку цитостатика к раковым клеткам. Процедура конъюгирования не повлияла на биологические свойства ни белкового фрагмента, ни цитостатика.

Подытожив вышесказанное, можно заключить, что отобранные в данной работе фрагменты АФП являются перспективными носителями для адресной доставки цитостатиков к раковым клеткам. Конъюгат фрагмента АФП с цитостатиком ципрофлоксацином как модельного объекта продемонстрировал перспективность дальнейшей разработки и исследования лекарств адресного действия на основе фрагментов АФП.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Шарапова, Ольга Андреевна, 2012 год

Список литературы

[1]Албертс Б, Брей Д, Льюис Дж, Рэфф М, Роберте К, Уотсон

Дж. Молекулярная биология клетки: В 3-х т. Москва: Мир, 1993.

[2] Bergstrand CG, Czar В. Factors influencing the serum haptoglobin level in infancy. ScandJ Clin Lab Invest 8: 174, 1956.

[3]Abelev GI. Alpha-fetoprotein in ontogenesis and its association with malignant tumors. Adv Cancer Res 14: 295-358, 1971.

[4] Gillespie JR, Uversky VN. Structure and function of alpha-fetoprotein: a biophysical overview. Biochim Biophys Acta 1480: 41-56, 2000.

[5] Villacampa MJ, Moro R, Naval J, Failly-Crepin C, Lampreave F, Uriel J.

Alpha-fetoprotein receptors in a human breast cancer cell line. Biochem Biophys Res Commun 122: 1322-1327, 1984.

[6]Geuskens M, Dupressoir T, Uriel J. A study, by electron microscopy, of the specific uptake of alpha-fetoprotein by mouse embryonic fibroblasts in relation to in vitro aging, and by human mammary epithelial tumour cells in comparison with normal donors' cells. J Submicrosc Cytol Pathol 23: 59-66, 1991.

[7]Ницветов МБ, Москалева ЕЮ, Посыпанова ГА, Макарова ОВ, Степанов ВА, Рогов КА, Коромыслова ИА, Караулов АВ, Северин СЕ, Северин

ЕС. Изучение экспрессии рецептора альфа-фетопротеина в опухолевых и нормальных тканях человека с помощью иммуногистохимического метода. Иммунология 26: 122-125,2005.

[8] Ницветов МБ, Родина АВ, Москалева ЕЮ, Посыпанова ГА, Попова ОН, Сологуб ВК, Коромыслова ИА, Шмырев ИИ, Сотниченко АИ, Заболотнев ДВ, Караулов АВ, Северин СЕ. Характеристика моноклональных антител к рецептору АФП в сравнении с АФП по их взаимодействию с опухолевыми клетками человека. Вопр Биол Мед Фарм Химии 3: 19-25, 2001.

[9]Severin SE, Posypanova GA, Shmyrev II, Gerasimova GK, Zhukova OS, yorozhtsov GN, Kaliya OL, Lukyanets EA, Severin ES. Antitumor activity of conjugates of the oncofetal protein alpha-fetoprotein and phthalocyanines in vitro. Biochem Mol Biol Int 43: 1081-1089, 1997.

[10] Северин СЕ, Посыпанова ГА, Сотниченко АИ, Москалева ЕЮ, Фельдман НБ, Григорьев МИ, Северин ЕС, Петров РВ. Противоопухолевая активность ковалентного конъюгата ендиинового антибиотика эсперамицина Ai с альфа-фетопротеином человека. Докл Акад Наук 366: 561-564, 1999.

[11] Mizejewski GJ. Alpha-fetoprotein structure and function: relevance to isoforms, epitopes, and conformational variants. Exp Biol Med (Maywood) 226: 377408,2001.

[12] Bowden GA, Paredes AM, Georgiou G. Structure and morphology of protein inclusion bodies in Escherichia coli. Biotechnology (NY) 9: 725, 1991.

[13] Ventura S, Villaverde A. Protein quality in bacterial inclusion bodies. Trends Biotechnol 24: 179, 2006.

[14] LeMarbre P, Greonwald S. Biology of cancer. In: Cancer Nursing: Principles and practice, edited by Greonwald S, Frogge M, Goodman M, Yarbro C. Boston, MA: Jones & Bartlett, 2000.

[15] Klein CA. Cancer. The metastasis cascade. Science 321: 1785-1787, 2008.

[16] Chiang AC, Massague J. Molecular basis of metastasis. The New England Journal of Medicine 359: 2814-2823, 2008.

[17] Cartmel B, Reid M. Cancer control and epidemiology. In: Cancer Nursing: Principles and practice, edited by Greonwald S, Frogge M, Goodman M, Yarbro C. Boston, MA: Jones & Bartlett, 2000.

[18] Yarbro J. Carcinogensis. In: Cancer Nursing: Principles and practice, edited by Greonwald S, Frogge M, Goodman M, Yarbro C. Boston, MA: Jones & Bartlett, 2000.

[19] Horton-Taylor D. Cancer and epidemiology. In: Cancer Nursing: Care in context, edited by Corner J, Bailey C. Oxford: Blackwell Scientific, 2001

[20] Hausen L. Viruses in human cancers. Science 254: 1167-1173, 1999.

[21] Munoza N, Castellsagueb X, Berrington de Gonzälezc A, Gissmann L. Chapter 1: HPV in the etiology of human cancer. Vaccine 24: S1-S10, 2006.

[22] Morris JL, Gordon OK. Chapter 5: Understanding Hereditary Cancer Risk. In Positive Results: Making the Best Decisions When You're at High Risk for Breast or Ovarian Cancer. Amherst, N.Y.: Prometheus Books, p. 89-111, 2010.

[23] Chen S, Parmigiani G. Meta-analysis of BRCA1 and BRCA2 penetrance. J Clin Oncol 25: 1329-33, 2007.

[24] Corner J. What is cancer? In: Cancer Nursing: Care in context edited by Corner J, Bailey C. Oxford: Blackwell Scientific, 2001.

[25] Facts & Statistics. The Leukemia and Lymphoma Society. 2009

[26] Horner MJ, Ries LAG, Krapcho M, Neyman N, Aminou R, Howlader N, Altekruse SF, Feuer EJ, Huang L, Mariotto A, Miller BA, Lewis DR, Eisner MP, Stinchcomb DG, Edwards BK (eds). SEER Cancer Statistics Review, 19752006". Surveillance Epidemiology and End Results (SEER). Bethesda, MD: National Cancer Institute, 2009.

[27] Ставровская AA. Клеточные механизмы множественной лекарственной устойчивости опухолевых клеток. Биохимия 65: 112-126, 2000.

[28] Köhler G, Milstein С. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature 256: 495-497, 1975.

[29] Stern M, Herrmann R. Overview of monoclonal antibodies in cancer therapy: present and promise. Crit Rev Oncol Hematol 54: 11-29, 2005.

[30] Hudson PJ, Souriau C. Engineered antibodies. Nat Med 9: 129-134, 2003

[31] Janeway CA, Jr, Travers P, Walport M, Shlomchik MJ. Immunobiology. (5th ed.). NY: Garland Science, 2001.

[32] Los M, Roodhart JML, Voest EE. Target Practice: Lessons from Phase III Trials with Bevacizumab and Vatalanib in the Treatment of Advanced Colorectal Cancer. The Oncologist 12: 443-50, 2007.

[33] Milenic DE, Brady ED, Brechbiel, Martin W. Antibody-targeted radiation cancer therapy. Nat Rev Drug Discov 3: 488^99, 2004.

[34] Zee-Cheng RK, Cheng CC. Delivery of anticancer drugs. Methods Find Exp Clin Pharmacol 11: 439-529, 1989.

[35] Torchilin VP. Liposomes as targetable drug carriers. Crit Rev Ther Drug Carrier Syst 2: 65-115, 1985.

[36] Sezaki H, Hashida M. Macromolecule-drug conjugates in targeted cancer chemotherapy. Crit Rev Ther Drug Carrier Syst 1: 1-38, 1984.

[37] Freeman AI, Mayhew E. Targeted drug delivery. Cancer 58:573-83, 1986.

[38] Takeshita A, Shinjo K, Yamakage N, Ono T, Hirano I, Matsui H, Shigeno K, Nakamura S, Tobita T, Maekawa M, Ohnishi K, Sugimoto Y, Kiyoi H, Naoe T, Ohno R. CMC-544 (inotuzumab ozogamicin) shows less effect on multidrug resistant cells: analyses in cell lines and cells from patients with B-cell chronic lymphocytic leukaemia and lymphoma. BrJHaemat 146: 34-43, 2009.

[39] Tse KF, Jeffers M, Pollack VA,McCabe DA, Shadish ML, Khramtsov NV, Hackett CS, Shenoy SG, Kuang B, Boldog FL, MacDougall JR, Rastelli L, Herrmann J, Gallo M, Gazit-Bornstein G, Senter PD, Meyer DL, Lichenstein HS, LaRochelle WJ. CR011, a fully human monoclonal antibody-auristatin E conjugate, for the treatment of melanoma. Clinical Cancer Research 12: 1373-82, 2006.

[40] Francisco JA, Cerveny CG, Meyer DL, Mixan BJ, Klussman K, Chace DF, Rejniak SX, Gordon KA, DeBlanc R, Toki BE, Law CL, Doronina SO,Siegall CB, Senter PD, Wahl AF. cAClO-vcMMAE, an anti-CD30-monomethyl auristatin E conjugate with potent and selective antitumor activity. Blood 102: 1458-1465, 2003

[41] Tijink BM, Buter J, De Bree R, Giaccone G, Lang MS, Staab A, Leemans CR, Van Dongen GA. A phase I dose escalation study with anti-CD44v6 bivatuzumab mertansine in patients with incurable squamous cell carcinoma of the head and neck or esophagus. Clin Cancer Res 12: 6064-6072, 2006.

[42] Smith SV. Technology evaluation: cantuzumab mertansine, ImmunoGen. Curr Opin Mol Ther 6: 666-674, 2004.

[43] Kratz F, Beyer U. Serum proteins as drug carriers of anticancer agents: a review. DrugDeliv 5: 281-299, 1998.

[44] Stehle G, Sinn H, Wunder A, Schrenk HH, Stewart JC, Hartung G, Maier-Borst W, Heene DL. Plasma protein (albumin) catabolism by the tumor itself - implications for tumor metabolism and the genesis of cachexia. Crit Rev Oncol 26: 77-100, 1997.

[45] Wiedenmann N, Valdecanas D, Hunter N, Hyde S, Buchholz TA, Milas L, Mason KA. 130-nm albumin-bound paclitaxel enhances tumor radiocurability and therapeutic gain. Clin Cancer Res 13: 1868-1874, 2007.

[46] Hortobagyi GN. Overview of new treatments for breast cancer. Breast Cancer Res Treat 2: 3-13, 1992.

[47] Aapro M, Tjulandin S, Bhar P, Gradishar W. Weekly nab-paclitaxel is safe and effective in >65 years old patients with metastatic breast cancer: a post-hoc analysis. Breast 20: 468-474, 2011.

[48] Weintraub BD, Rosen SW. Competitive radioassays and "specific" tumor markers. Metabolism 22: 1119-1127, 1973.

[49] Landon J, Ratcliffe JG, Rees LH, Scott AP. Tumour-associated hormonal products. J Clin Pathol Suppl 7: 127-134, 1974.

[50] Bergstrand CG, Czar B. Demonstration of a new protein fraction in serum from the human fetus. Scand J Clin Lab Invest 8: 174, 1956.

[51] de Muralt, Roulet DL. Immunological study of human fetal serum proteins. Helv Paediatr Acta 16: 517-533, 1961.

[52] Abelev GI, Perova SD, Khramkova N1, Postnikova ZA, Irlin IS. Production of embryonal alpha-globulin by transplantable mouse hepatomas. Transplantation 1: 174-180, 1963.

[53] Татаринов ЮС, Ассекритова ИВ, Масюкевич ВН, Перова СД. Имму-нохимические пробы на эмбрноспецифнческие глобулины в дифференциальной диагностике первичного рака печени. Терапевт арх 8: 47-51, 1967.

[54] Gitlin D, Boesman М. Serum alpha-fetoprotein, albumin, and gamma-G-globulin in the human conceptus. J Clin Invest 45: 1826-1838, 1966.

[55] Ruoslahti E, Seppala M. Alpha-Foetoprotein in normal human serum. Nature 235: 161-162, 1972

[56] Bellini C, Bonacci W, Parodi E, Serra G. Serum alpha-fetoprotein in newborns. Clin Chem 44: 2548-2550, 1998.

[57] Ruoslahti E, Seppala M. Studies of carcino-fetal proteins. 3. Development of a radioimmunoassay for -fetoprotein. Demonstration of -fetoprotein in serum of healthy human adults. Int J Cancer 8: 374-383, 1971.

[58] Ruoslahti E, Seppala M. Alpha-Fetoprotein in cancer and fetal development. Adv Cancer Res 29: 275-346, 1979.

[59] Jones EA, Clement-Jones M, James OF, Wilson DI. Differences between human and mouse alpha-fetoprotein expression during early development. J Anat 198: 555-559,2001.

[60] Seppala M. Fetal pathophysiology of human alpha-fetoprotein. Ann N Y Acad Sci 259: 59-73, 1975.

[61] Brock DJ, Scrimgeour JB, Nelson MM. Amniotic fluid alphafetoprotein measurements in the early prenatal diagnosis of central nervous system disorders. Clin Genet 7: 163-169, 1975.

[62] Татаринов ЮС. Обнаружение эмбриоспецифического а-глобулина в сыворотке крови больного первичным раком печени. Воп мед химии. 1:90-91, 1964.

[63] Abelev GI. Alpha-fetoprotein in ontogenesis and its association with malignant tumors. Adv Cancer Res 14: 295-358, 1971.

[64] Morinaga T, Sakai M, Wegmann TG, Tamaoki T. Primary structures of human alpha-fetoprotein and its mRNA. Proc Natl Acad Sci USA 80: 4604-4608, 1983.

[65] PucciP, Siciliano R, Malorni A, Marino G, Tecce MF, Ceccarini C, Terr ana B. Human alpha-fetoprotein primary structure: a mass spectrometric study. Biochemistry 30:5061-5066, 1991.

[66] Dudich I, Tokhtamysheva N, Semenkova L, Dudich E, Hellman J, Korpela

T. Isolation and structural and functional characterization of two stable peptic fragments of human alpha-fetoprotein. Biochemistry 38:10406-10414, 1999.

[67] Weitkamp LR, Rucknagel DL, Gershowitz H. Genetic linkage between structural loci for albumin and group specific component (Gc). Am J Hum Genet 18: 559-571, 1996.

[68] Harper ME, Dugaiczyk A. Linkage of the evolutionarily-related serum albumin and alpha-fetoprotein genes within qll-22 of human chromosome 4. Am J Hum Genet 35: 565-572, 1983.

[69] Mikkelsen M, Jacobsen P, Henningsen K. Possible localization of Gc-System on chromosome 4. Loss of long arm 4 material associated with father-child incompatibility within the Gc-System. Hum Hered 27: 105-107,1977.

[70] Yang F, Luna VJ, McAnelly RD, Naberhaus KH, Cupples RL, Bowman ВН. Evolutionary and structural relationships among the group-specific component, albumin and alpha-fetoprotein. Nucleic Acids Res 13: 8007-8017, 1985.

[71] Nahon JL, Tratner I, Poliard A, Presse F, Poiret M, Gal A, Sala-Trepat JM, Legres L, Feldmann G, Bernuau D. Albumin and alpha-fetoprotein gene expression in various nonhepatic rat tissues. J Biol Chem 263: 11436-11442,1988.

[72] Ruoslahti E, Terry WD. Alpha foetoprotein and serum albumin show sequence homology. Nature 260: 804-805, 1976.

[73] Cooke NE, David EV. Serum vitamin D-binding protein is a third member of the albumin and alpha fetoprotein gene family. J Clin Invest 76: 2420-2424, 1985.

[74] Lichenstein HS, Lyons DE, Wurfel MM, Johnson DA, McGinley MD, Leidli JC, Trollinger DB, Mayer JP, Wright SD, Zukowski MM. Afamin is a new member of the albumin, alpha-fetoprotein, and vitamin D-binding protein gene family. J Biol Chem 269: 18149-18154, 1994.

[75] Luft A J, Lorscheider FL. Structural analysis of human and bovine alpha-fetoprotein by electron microscopy, image processing, and circular dichroism. Biochemistry 22: 5978-5981, 1983.

[76] Zizkovsky V, Strop P, Korcakova J, Havranova M, Mikes F. Fluorescence spectroscopy, fluorescence polarization, and circular dichroism in studies on pH-dependent changes in the alpha-fetoprotein molecule. Ann N Y Acad Sci 417: 49-56, 1983.

[77] He XM, Carter DC. Atomic structure and chemistry of human serum albumin. Nature 358: 209-215, 1992.

[78] Mizejewski GJ. Alpha-fetoprotein structure and function: relevance to isoforms, epitopes, and conformational variants. Exp Biol Med (Mawyood) 226: 377408,2001.

[79] Breborowicz J. Microheterogeneity of human alphafetoprotein. Tumour Biol 9: 3-14, 1988.

[80] AlpertE. Alpha-1-fetoprotein: serologic marker of human hepatoma and embryonal carcinoma. Natl Cancer Inst Monogr 35: 415-420, 1972.

[81] Alpert E, Perencevich RC. Human alpha-fetoprotein. Immunochemical analysis of isoproteins. N YAcad Sci 259: 131-135, 1975.

[82] Lester EP, Miller JB, Yachnin S. Human alpha-fetoprotein as a modulator of human lymphocyte transformation: correlation of biological potency with electropho-retic variants. Proc Natl Acad Sci USA 73: 4645-4648, 1976.

[83] Parmelee DC, Evenson MA, Deutsch HF. The presence of fatty acids in human alpha-fetoprotein. J Biol Chem 253: 2114-2119, 1978.

[84] Carter DC, He XM, Munson SH, Twigg PD, Gernert KM, Broom MB, Miller TY. Three-dimensional structure of human serum albumin. Science 244: 1195-1198, 1989.

[85] Carter DC, He XM. Structure of human serum albumin. Science 249: 302303, 1990.

[86] Brown JR. Structural origins of mammalian albumin. Fed Proc 35: 21412144, 1976.

[87] Law SW, Dugaiczyk A. Homology between the primary structure of alpha-fetoprotein, deduced from a complete cDNA sequence, and serum albumin. Nature 291: 201-205, 1981.

[88] Strop P, Zizkovsky V, Korcakova J, Havranova M, Mikes F. Conformational transitions of human alpha-1 fetoprotein and serum albumin at acid and alkaline pH. Int JBiochem 16: 805-813, 1984.

[89] Feldhoff RC, Peters T Jr. Fragments of bovine serum albumin produced by limited proteolysis. Isolation and characterization of peptic fragments. Biochemistry 14:4508-4514, 1975.

[90] Reed RG, Feldhoff RC, Clute OL, Peters T Jr. Fragments of bovine serum albumin produced by limited proteolysis. Conformation and ligand binding. Biochemistry 14: 4578-4583, 1975.

[91] Feldhoff RC, Ledden D J. Evidence for the spontaneous formation of interspecies hybrid molecules of human, rat and bovine serum albumins. Biochem Biophys Res Commun 114: 20-27, 1983.

[92] Geisow MJ, Beaven GH. Physical and binding properties of large fragments of human serum albumin. Biochem J163: 477-484, 1977.

[93] Gibbs PE, Zielinski R, Boyd C, Dugaiczyk A. Structure, polymorphism, and novel repeated DNA elements revealed by a complete sequence of the human alpha-fetoprotein gene. Biochemistry 26: 1332-1343, 1987.

[94] Nishio H, Dugaiczyk A. Complete structure of the human alpha-albumin gene, a new member of the serum albumin multigene family. Proc Natl Acad Sci USA 93: 7557-7561, 1996.

[95] Mizejewski GJ. Alpha-fetoprotein as a biologic response modifier: relevance to domain and subdomain structure. Proc Soc Exp Biol Med 215: 333-362, 1997.

[96] Mizejewski GJ. The phylogeny of alpha-fetoprotein in vertebrates: survey of biochemical and physiological data. Crit Rev Eukaryot GeneExpr 5: 281-316, 1995.

[97] Ptisyn OB. In: Protein Folding, edited by Creighton TE. NY: W. H. Freeman & Co, 1992, p. 243-300.

[98] Ptitsyn OB. Molten globule and protein folding. Adv Protein Chem 47: 83229, 1995

[99] Uversky VN, Narizhneva NY, Ivanova TV, Kirkitadze MD, Tomashevski

AYu. Ligand-free form of human alpha-fetoprotein: evidence for the molten globule state. FEBSLett 410: 280-284, 1997.

[100] Semenkova LN, Dudich EI, Dudich IV. Induction of apoptosis in human hepatoma cells by alpha-fetoprotein. Tumour Biol 18: 261-273, 1997.

[101] Semenkova LN, Dudich EI, Dudich IV, Shingarova LN, Korobko VG. Al-

pha-fetoprotein as a TNF resistance factor for the human hepatocarcinoma cell line HepG2. Tumour Biol 18: 30-40, 1997.

[102] Fasano M, Curry S, Terreno E, Galliano M, Fanali G, Narciso P, Notari S, Ascenzi P. The extraordinary ligand binding properties of human serum albumin. IUBMB Life 57: 787-796, 2005.

[103] Klein G, Weinhouse S. Advances in Cancer Research. NY: Academic press,

1979, p. 305-313.

[104] Krauer B, Dayer P, Anner R. Changes in serum albumin and alpha 1-acid glycoprotein concentrations during pregnancy: an analysis of fetal-maternal pairs. Br J Obstet Gynaecol 91: 875-881, 1984.

[105] Deutsch HF. Chemistry and biology of alpha-fetoprotein. Adv Cancer Res 56: 253-312, 1991.

[106] Benassayag C, Vallette G, Delorme J, Savu L, Nunez EA. High affinity of nonesterified polyunsaturated fatty acids for rat alpha-fetoprotein (AFP). Oncodev Biol Med 1: 27-36, 1980.

[107] Carlsson RN, Estes T, Degroot J, Holden JT, Ruoslahti E. High affinity of alpha-foetoprotein for arachidonate and other fatty acids. Biochem J190: 301-305,

1980.

[108] Ingvarsson BI, Carlsson RN. Binding of fatty acids and tryptophan to alpha-fetoprotein from fetal pigs. Biochim Biophys Acta 537: 507-509, 1978.

[109] Savu L, Benassayag C, Vallette G, Christeff N, Nunez E. Mouse alpha 1-fetoprotein and albumin. A comparison of their binding properties with estrogen and fatty acid ligands. J Biol Chem 256(: 9414-9418, 1981.

[110] Deutsch HF. Some biological roles for alpha-fetoprotein-unsaturated fatty acid complexes. Ann N YAcadSci 417: 39-48, 1983.

[111] AusselC, Masseyeff R. Human alpha-fetoprotein-fatty acid interaction. Biochem Biophys Res Commun 115: 38-45, 1983.

[112] Aussel C, Uriel J, Mercier-Bodard C. Rat alpha-fetoprotein: isolation, characterization and estrogen-binding properties. Biochimie 55: 1431-1437, 1973.

[113] Nunez E, Valletec G, Benassayag C, Jayle MF. Comparative study on the binding of estrogens by human and rat serum proteins in development. Biochem Biophys Res Commun 57: 126-133, 1974

[114] Savu L, Crepy O, Guerin MA, Nunez E, Engelmann F, Benassayag C, Jayle MF. Etude des constants de liaison entre les oestrogines et alpha-foetoproteine de rat. FEBS Lett 22: 113-116, 1972.

[115] Uriel J, de Nechaud B, Dupiers M. Estrogen-binding propertiesof rat, mouse and man fetospecific serum proteins. Demonstration by immuno-autoradiographic methods. Biochem Biophys Res Commun 46: 1175-1180, 1972.

[116] Benassayag C, Vallette G, Cittanova N, Nunez E, Jayle MF. Isolation of two forms of rat alpha-fetoprotein and comparison of

their binding parameters withestradiol-17beta. Biochim Biophys Acta 412: 295-305, 1975.

[117] Arnon R, Teicher E, Bustin M, Sela M. Preparation of antisera to alpha-fetoprotein marking use of estradiol affinity column. FEBS Lett 32: 335-338, 1973.

[118] Uriel J, Bouillon D, Aussel C, Dupiers M. Alpha-fetoprotein: The major high-affinity estrogen binder in ratuterine cytosols. Proc Natl Acad Sci USA 73: 1452-1456, 1976.

[119] Gabant P, Forrester L, Nichols J, Van Reeth T, De Mees C, Pajack B, Watt A, Smitz J, Alexandre H, Szpirer C, Szpirer J. Alpha-fetoprotein, the major fetal serum protein, is not essential for embryonic development but is required for female fertility. Proc Natl Acad Sci USA 99: 12865-12870, 2002.

[120] Camper SA, Tilghman SM. Postnatal repression of the alpha-fetoprotein gene is enhancer independent. Genes Dev 3: 537-546, 1989.

[121] Bakker J, De Mees C, Douhard Q, Balthazart J, Gabant P, Szpirer J, Szpirer C. Alpha-fetoprotein protects the developing female mouse brain from masculinization and defeminization by estrogens. Nat Neurosci 9: 220-226, 2006.

[122] Esumi H, Takahashi Y, Sato S, Nagase S, Sugimura T. A seven-base-pair deletion in an intron of the albumin gene of analbuminemic rats. Proc Natl Acad Sci USA 80: 95-99,1983.

[123] Baldo-Enzi G, Baiocchi MR,Vigna G,Andrian C, Mosconi C, Fellin R.

Analbuminaemia: a natural model of metabolic compensatory systems. J Inherit MetabDis 10: 317-329, 1987.

[124] Nagase S, Shimamune K, Shumiya S. Albumin-deficient rat mutant: an animal model for analbuminemia. Jikken Dobutsu 29: 33-38, 1980.

[125] Koot BG, Houwen R, Pot DJ, Nauta J. Congenital analbuminaemia: biochemical and clinical implications. A case report and literature review. Eur J Pediatr 63: 664-670, 2004.

[126] Basteris B. Immunofluorescent localization of alphafetoprotein and albumin in embryonic fetal and newborn rat. In: Carcinoembryonic Proteins edited by Lehman FG, Amsterdam: Elsevier/North-Holland Biomedical Press, 1979, p. 353-356.

[127] Dziadek K, Adamson E. Localization and synthesis of alphafetoprotein in postimplantation mouse embryos. JErnbryol Exp Morphol 43: 289-313, 1978.

[128] Dziadek MA, Andrews GK. Tissue specificity of alpha-fetoprotein messenger RNA expression during mouse embryogenesis. EMBOJ2: 549- 554, 1983

[129] Moro R, Uriel J. Early localization of alphafetoprotein in the developing nervous system of the chicken. Oncodev Bid Med 2:391-398, 1981.

[130] Selten GC, Princen HM, Selten-Vestergreen AM, Mol-Backx GP, Yap SH. Sequence content of a-fetoprotein, albumin and fibrinogen polypeptide mRNAs in different organs, developing tissues and in liver during carcinogenesis in rats. Biochim Biophys Acta 699: 131-137, 1982.

[131] Trojan J, Uriel J. Immunocytochemical localization of alpha-fetoprotein (AFP) and serum albumin (Alb) in ecto-, meso- and endodermal tissue derivatives of the developing rat. Oncodev Biol Med 3: 13-22, 1982.

[132] Van Blerkom J, Jansen R, and Runner MN. The patterns of protein synthesis during foetal and neonatal organs development in the mouse are remarkably similar. JEmbryol Exp Morphol 72: 97-116, 1982.

[133] Uriel J, Poupon M F, Geuskens M. Alphafoetoprotein uptake by cloned cell lines derived from a nickel-induced rat rhabdomyosarcoma. Br J Cancer 48: 261-269, 1983.

[134] Uriel J, Failly-Crepin C, Villacampa MJ, Pineiro A, Geuskens M. Incorporation of alphafetoprotein by the MCF-7 human breast cancer cell line. Tumor Biol 5: 41-51, 1984.

[135] Geuskens M, Naval J, Uriel J. Ultrastructural studies of the intracellular translocation of endocytosed alpha-foetoprotein (AFP) by cytochemistry and of the uptake of 3H-arachidonic acid bound to AFP by autoradiography in rat habdomyosarcoma cells. J Cell Physiol 128: 389-396, 1986.

[136] Laborda J, Naval J, Allouche M, Calvo M, Georgoulias V, Mishal Z, Uriel J. Specific uptake of alpha-fetoprotein by malignant human lymphoid cells. Int J Cancer 40: 314-318, 1987.

[137] Torres JM, Laborda J, Naval J, Darracq N, Calvo M, Mishal Z, Uriel J.

Expression of alpha-fetoprotein receptors by human T-lymphocytes during blastic transformation. Mol Immunol 26: 851-857, 1989.

[138] Moskaleva EYu, Posypanova GA, Shmyrev II, Rodina AV, Muizhnek EL, Severin ES, Katukov VYu, Luzhkov YM, Severin SE. Alpha-fetoprotein-mediated targeting—a new strategy to overcome multidrug resistance of tumour cells in vitro. Cell Biol Int 21: 793-799, 1997.

[139] Biddle W, Sarcione EJ. Specific cytoplasmic alpha-fetoprotein binding protein in MCF-7 human breast cancer cells and primary breast cancer tissue. Breast Cancer Res Treat 10: 279-286, 1987.

[140] Suzuki Y, Zeng CQ, Alpert E. Isolation and partial characterization of a specific alpha-fetoprotein receptor on human monocytes. J Clin Invest 90: 1530-1536, 1992.

[141] Schnitzer JE, Sung A, Horst R, Bravo J. Preferential interaction of albumin binding proteins, gp30 and gpl8 with conformationally modified albumins. J Biol Chem 267: 24544-24553, 1992.

[142] Schnitzer JE, Bravo J. High affinity binding, endocytosis, and degradation of conformationally modified albumins. J Biol Chem 268: 7562-7570, 1993.

[143] Schnitzer JE, Carley WW, Palade GE. Albumin interacts specifically with a 60 kD microvascular endothelial glycoprotein. Proc Natl AcadSci USA 85: 67736777, 1988.

[144] Schnitzer JE, Ulmer JB, Palade GE. A major endothelial plasmalemmal sialoglycoprotein, gp60, is immunologically related to glycophorin. Proc Natl Acad Sci USA 87: 6843-6847, 1990.

[145] Kanevsky VY, Pozdnyakova LP, Aksenova OA, Severin SE, Karakov VY, Severin ES. Isolation and characterization of AFP binding proteins from tumor and fetal tissues. Biochem Mol Biol Internl 41: 1143-1151, 1997.

[146] Moro R, Tamaoki T, Wegmann TG, Longenecker BM, Laderoute MP.

Monoclonal antibodies directed against a widespread oncofetal antigen: The Alpha-Fetoprotein Receptor. Tumor Biol 14: 116-130,1993.

[147] Ницветов МБ, Москалева ЕЮ. Посыпанова ГА, Макарова ОВ, Степанов ВА, Рогов КА, Коромыслова ИА, Караулов АВ, Северин СЕ, Северин ЕС. Изучение экспрессии рецептора альфа-фетопротеина в опухолевых и нормальных тканях человека с помощью иммуногистохимического метода. Иммунология, 2: 122-125, 2005.

[148] Uriel J, Villacampa MJ, Moro R, Naval J, Failly-Crepin C. Uptake of radiolabeled a-fetoprotein by mouse mammary carcinomas and its usefulness in tumor scientigraphy. Cancer Res 44: 5314-5319, 1984.

[149] Severin SE, Posypanova GA, Katukov VU, Shmyrev II, Luzhkov YuM, Gerasimova GK, Zhukova OS, Vorozhtsov GN, Kaliya OL,Lukyanets EA, Severin ES. Antitumor activity of conjugates of the oncofetal protein alpha-fetoprotein and phthalocyanines in vitro. Biochem Mol Biol Int 43: 873-881, 1997.

[150] Lutsenko SY, Feldman NB,Finakova GV, Gukasova NV, Petukhov SP, Posypanova GA, Skryabin KG, Severin SE. Antitumor activity of alpha fetoprotein and epidermal growth factor conjugates in vitro and in vivo. Tumour Biol 21: 367-374, 2000.

[151] Савицкий AA, Гукасов HB, Туманов СГ, Фельдман НБ, Лукьянец ЕА, Миронов АФ, Якубовская РИ, Луценко СВ, Северин СЕ. Цитотоксиче-ское действие конъюгатов альфа-фетопротеина и эпидермального фактора роста с фотогемом, хлоринами и фталоцианинами. Биохимия 65: 859-864, 2000.

[152] Bennett JA, Semeniuk DJ, Jacobson HI, Murgita RA. Similarity between natural and recombinant human alpha-fetoprotein as inhibitors of estrogen-dependent breast cancer growth. Breast Cancer Res Treat 45: 169-179, 1997.

[153] Marston FA. The purification of eukaryotic polypeptides synthesized in Escherichia coli. Biochem J240: 1-12, 1986.

[154] Festin SM, Bennett JA, Fletcher PW, Jacobson HI, Shaye DD, Andersen

TT. The recombinant third domain of human alpha-fetoprotein retains the antiestrotrophic activity found in the full-length molecule. Biochim Biophys Acta 1427: 307-314, 1999.

[155] Line BR, Feustel PJ, Festin SM, Andersen TT, Dansereau RN, Lukasiewicz RL, Zhu S, Bennett JA. Scintigraphic detection of breast cancer xenografts with Tc-99m natural and recombinant human alpha-fetoprotein. Cancer Biother Radiopharm 14: 485-494, 1999.

[156] Posypanova GA, Gorokhovets NV, Makarov VA, Savvateeva LV, Kireeva NN, Severin SE, Severin ES. Recombinant alpha-fetoprotein C-terminal fragment: the new recombinant vector for targeted delivery. J Drug Target 16: 321-328, 2008.

[157] Schein CH. Solubility as a function of protein structure and solvent components. Biotechnology (NY) 8: 308-317, 1990.

[158] Hartley DL, Kane JF. Properties of inclusion bodies from recombinant Escherichia coil. Biochem Soc Trans 16: 101-102, 1988.

[159] Wilkinson DL, Harrison RG. Predicting the solubility of recombinant proteins in Escherichia coil. Biotechnology (NY) 9: 443-448, 1991.

[160] Gribskov M, Burgess RR. Overexpression and purification of the sigma subunit of Escherichte, cdi RNA polymerase. Gene 26: 109-118, 1983.

[161] Kiefhaber T, Rudolph R, Kohler HH, Buchner J. (1991) Protein aggregation in vitro and in viva: a quantitative model of the kinetic competition between folding and aggregation. Biotechnology (NY) 9: 825-829, 1991.

[162] Kopetzki E, Schumacher C, Bucket P. (1989) Control of formation of active soluble or inactive insoluble baker's yeast alpha-glucosidase PI in Escherichia coli by induction and growth conditions. Mol Gen Genet 216: 149-155, 1989.

[163] Schein CH, Notebom MHM. Formation of soluble recombinant proteins in Escherichia coil is favored by lower growth temperature. Biotechnology (NY) 6: 291294, 1988.

[164] Cabilly S. Growth at sub-optimal temperatures allows the production of functional antigen-binding Fab fragments in Escherichia coil. Gene 85: 553-557, 1989.

[165] Goloubinoff P, Christeller JT, Gatenby AA, Lorimer CH. Reconstitution of active dimenc ribulose bisphosphate carboxylase from an unfolded state depends on the chaperonin proteins and Mg-ATP. Nature (London) 342: 884-889, 1989.

[166] Buchner J. Supervising the fold: functional principles of molecular chaper-ones. FASEBJ10: 10-19,1996.

[167] Langer T, Lu C, Echols H, Flanagan I, Hayer MK, Haiti FU. Successive action of DnaK, DnaJ and CroEL along the pathway of protein folding. Nature (London) 356: 683-689,1992.

[168] Rudolph R, Fuchs I. (1983) Influence of glutathione on the reactivation of enzymes containing cysteine. Hoppe-Seyler's ZPhysiol Chem 364: 813-820, 1983.

[169] Skerra A, Pluckthun A. Assembly of a functional immunoglobulin Fv fragment in Escherichia coli. Science 240: 1038-1042, 1988.

[170] Pluckthun A. Antibody engineering: Advances from the use of Escherichia coil expression systems. Biotechnology (NY) 9: 545-551, 1991.

[171] Carter P, Kelley RF, Rodrigues ML, Snedecor B, Covarrubias M, Velligan M, Wong WL, Rowland AM, Kotts CL, Carver ME, Yang M, Bourell JH, Shepard HM, Henner D. High level Escherichia coil expression and production of a bivalent humanized antibody fragment. Biotechnology (NY) 10: 163-167, 1992.

[172] Bardwel JCA, McGovemK, Beckwith J. Identification of a protein required for disulfide bond formation in viva. Cell 61: 581-589, 1991.

[173] Kamitani S, Akiyama Y, Ito K. Identification and charactenzation of an Escherichia coil gene required for the formation of correctly folded alkaline phosphatase, a periplasmic enzyme. EMBO J11: 57-62, 1992.

[174] Missiakas D, Schwager F, Raina S. (1995) Identification and characterization of a new disulfide isomerase-like protein (DsbD) in Escherichia coil. EMBO J 14: 3415-3424, 1995.

[175] Kane JF, Hartley DL. In: Purification and analysis of recombinant proteins edited by Seetharam R, Sharma SK, New York: Marcel Dekker Inc, 1991, p. 121146.

[176] Misawa S, Kumagai I. Refolding of therapeutic proteins produced in Escherichia coli as inclusion bodies. Biopolymers (Peptide Science) 51: 297-307, 1999.

[177] Fischer B, Sumner I, Goodenough P. Isolation and renaturation of bioactive proteins expressed in Escherichia coli as inclusion bodies. Arzneimittelforschung 42: 1512-1515, 1992.

[178] Datar RV, Cartwright T, Rosen CG. Process economics of animal cell and bacterial fermentations: a case study analysis of tissue plasminogen activator. Biotechnology (NY) 11: 349-357, 1993.

[179] Anfinsen CB. Principles that govern the folding of protein chains. Science 181:223-230, 1973.

[180] Levinthal C. Are there pathways for protein folding? J Chim Phys 65: 44- 45, 1968.

[181] Burgess RR. Refolding solubilized inclusion body proteins. Methods Enzymol 463: 259-82, 2009.

[182] Anson ML. Protein denaturation and the properties of protein groups. Adv Protein Chem 2: 361-386, 1945.

[183] Jaenicke R. Folding and association of proteins. Prog Biophys Mol Biol 49: 117-237, 1987.

[184] Fischer G, Schmid FX. The mechanism of protein folding. Implications of in vitro refolding models for de novo protein folding and translocation in the cell. Biochemistry29: 2205-2212, 1990.

[185] Ellis RJ, van der Vies SM. Molecular chaperones. Annu Rev Biochem 60: 321-347, 1991.

[186] Schmid FX. Catalysis and assistance of protein folding. Curr Opin Struct Biol 1:36-41, 1991.

[187] Jaenicke R. Protein folding: local structures, domains, subunits, and assemblies. Biochemistry 30: 3147-3161, 1991.

[188] Chaudhuri JB. Refolding recombinant proteins: process strategies and novel approaches. Ann N YAcad Sei 721: 374-385, 1994.

[189] Tsumoto K, Ejima D, Kumagai I, Arakawa T. Practical considerations in refolding proteins from inclusion bodies. Protein Expr Purif: 1-8, 2003.

[190] Zettimeissl C, Rudolph R, Jaenicke R. Reconstitution of lactic dehydrogenase. Noncovalent aggregation vs. reactivation. 1. Physical properties and kinetics of aggregation. Biochemistry 18: 5567-5557, 1979.

[191] Rudolph R, Lilie H. In vitro folding of inclusion body proteins. FASEB J10: 49-56, 1996.

[192] Jaenicke R, Rudolph R. Folding proteins. In: Protein Structure: A Practical Approach edited by Creighton TE. Oxford, New York, Tokyo: IRL Press, 1989, p. 191-223.

[193] Rudolph R. Successful protein folding on an industrial scale. In: Protein Engineering: Principles and Practices edited by Cleland JL, Craik ChS. New York: John Wiley & Sons, 1995, p. 283-298.

[194] Rudolph R. Renaturation of recombinant, disulfide-bonded proteins from inclusion bodies. In: Modern Methods in Protein and Nucleic Acid Research edited by Tschesche H. New York: Walter de Cruyter, 1990, p. 149-172.

[195] Rudolph R, Fischer S. United States Patent Application No 4933 434, 1990.

[196] Fischer B, Perry B, Summer I, Goodenough P. A novel sequential procedure to enhance the renaturation of recombinant protein from Escherichia coil inclusion bodies. Protein Eng 6: 593-596, 1992.

[197] Schumann J, Böhm G, Schumacher C, Rudolph R, Jaenicke R. Stabilization of creatinase from Pseudomonas putida by random mutagenesis. Protein Sei 2: 1612-1620, 1993.

[198] Ahmed AK, Schaffer SW, Wetlaufer DB. Nonenzymatic reactivation of reduced bovine pancreatic ribonuclease by air oxidation and by glutathione oxidoreduction buffers. J Biol Chem 250: 8477-8482, 1975.

[199] Sela M, White FH, Anfinsen CB. Reductive cleavage of disulfide bridges in ribonuclease. Science 16: 691-692, 1957.

[200] Creighton TE. Folding of proteins absorbed reversibly to ion-exchange resins. In: UCLA Symposia on molecular and cellular biology new series edited by Oxender DL, 1985, p. 249-258.

[201] Jungbauer A, Kaar W, Schlegl R. Folding and refolding of proteins in chromatographic beds. Curr Opin Biotechnol 15: 487-494, 2004.

[202] Glynou K, Ioannou PC, Christopoulos N. One-step purification and refolding of recombinant photoprotein aequorin by immobilized metal-ion affinity chromatography. Protein Expr. Purif 27: 384-390, 2003.

[203] Shi Y, Jiang C, Chen Q, Tang H. One-step on-column affinity refolding purification and functional analysis of recombinant human VDAC1. Biochem Biophys Res Commun 303: 475-482, 2003.

[204] Rehm BHA, Qi Q, Beermann BB, Hinz HJ, Steinbüchel A. Matrix-assisted in vitro refolding of Pseudomonas aeruginosa class II polyhydroxyalkanoate synthase from inclusion bodies produced in recombinant Escherichia coli. Biochem J 358: 263-268,2001.

[205] Lemercier G, Bakalara N, Santarelli X. On-column refolding of an insoluble histidine tag recombinant exopolyphosphatase from Trypanosoma brucei overex-pressed in Escherichia coli. J Chromatogr B 786: 305-309, 2003.

[206] Stempfer G, Höll-Neugebauer B, Rudolph R. Improved refolding of an immobilized fusion protein. Nat Biotechnol 14: 329-34, 1996.

[207] Ellman GL. Tissue sulfhydryl groups. Arch Biochem Biophys 82: 70-77, 1959.

[208] Böyum A. Isolation of mononuclear cells and granulocytes from human blood. Scand J Clin Lab Invest Suppl 97: 77-89, 1968.

[209] Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. J Immunol Methods 65: 55-63, 1983.

[210] Laemmli UK. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227: 680-685, 1970.

[211] Ivanov I, Alexandrova R, Dragulev B, Saraffova A, AbouHaidar MG. Effect of tandemly repeated AGG triplets on the translation of CAT-mRNA in E. coli. FEBS Lett 301: 173- 176, 1992.

[212] Studier FW. Protein production by auto-induction in high density shaking cultures. Prot Expr Purif 41: 207-234, 2006.

[213] Boismenu R, Semeniuk D, Murgita RA. Purification and characterization of human and mouse recombinant alpha-fetoprotein expressed in Escherichia coli. Protein Expr Purif 10: 10-26, 1997.

[214] Leong SSJ, Middelbegr AP. A simplified bioprocess for human alpha-fetoprotein production from inclusion bodies. Biotechnol Bioemg 97: 99-117, 2007.

[215] Chen Y, Leong SSJ. Adsorptive refolding of a highly disulfide-bonded inclusion body protein using anion-exchange chromatography. J Chromatogr A 1216: 4877-4886, 2009.

[216] Langenhof M, Leong SS J, Pattenden LK, Middelberg AP. Controlled oxidative protein refolding using an ion-exchange column. J Chromatogr A 1069: 195201,2005.

[217] Nakanishi K, Berova N, Woody RW. Circular Dichroism: Principles and Applications. New York: VCH Publishers, 1994.

[218] Parker MH, Birck-Wilson E, Allard G, Masiello N, Day M, Murphy KP, Paragas V, Silver S, Moody MD. Purification and characterization of a recombinant version of human alpha-fetoprotein expressed in the milk of transgenic goats. Protein ExprPurif 38: 177-183, 2004.