Свойства некоторых белков вируса клещевого энцефалита тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.06, доктор биологических наук Морозова, Ольга Владимировна

• Морозова, Ольга Владимировна
• доктор биологических наук
• 2001

Оглавление диссертации доктор биологических наук Морозова, Ольга Владимировна

Список сокращений. 2

Введение. 7

Обзор литературы.

Глава 1. Белки флавивирусов.

1.1. Молекулярная организация генома флавивирусов.

1.2. Белки вирионов.

1.2.1. Белок нуклеокапсида С.

1.2.2. Белок М.

1.2.3. Гликопротеин оболочки вирионов Е/

1.3. Неструктурные белки флавивирусов.

1.3.1. Неструктурный гликопротеинN81.

1.3.2. Малые неструктурные белки.

1.3.3. Неструктурный белок N83.

1.3.4. Неструктурный белок N85.

Глава 2. Вакцины против флавивирусных инфекций.

2.1. Применяемые вакцины.

2.1.1. Живые аттенюированные вакцины.

2.1.2. Инактивированные вакцины.

2.2. Новые подходы к созданию вакцин.

2.2.1. Рекомбинантные белки.

2.2.2. Рекомбинантные ДНК.

2.2.3. Рекомбинантные бактерии.

2.2.4. Трансгенные растения.

Глава 3. Экспериментальная часть.

3.1. Материалы. 81 3.2. Методы.

3.2.1. Генетический анализ штаммов ВКЭ.

3.2.2. Иммуноферментный анализ белков ВКЭ.

3.2.3. Выделение и изучение свойств внутриклеточного комплекса вирусных и клеточных белков.

3.2.4. Фотоаффинное мечение.

3.2.5. Фосфорилирование белков.

3.2.6. Выделение комплекса гликопротеинов Е и NS1 ВКЭ.

3.2.7. Получение рекомбинантных белков.

3.2.8. Анализ стабильности плазмид в клетках.

3.2.9. Иммунизация мышей.

3.2.10. Методы детекции антител к ДНК.

3.2.11. Оценка защитных свойств белков ВКЭ.

Глава 4. Результаты и обсуждение.

4.1. Генетический анализ штаммов ВКЭ.

4.2. Исследование вариабельности белков различных 105 штаммов ВКЭ.

4.3. Внутриклеточный комплекс белков ВКЭ.

4.4. Синтез РНК ВКЭ in vitro.

4.5. Функции вирусных белков в катализе синтеза геномных

РНК ВКЭ.

4.6. Фосфорилирование белка NS5 ВКЭ.

4.7. Изменение состава внутриклеточного комплекса белков 134 ВКЭ.

4.8. Антигенные свойства белков ВКЭ.

4.8.1. Антитела к неструктурным белкам ВКЭ у больных клещевым энцефалитом с различной тяжестью заболевания.

4.8.2. Комплекс гликопротеинов Е и NS1 ВКЭ.

4.9. Исследование защитных свойств белков ВКЭ.

4.9.1. Стабильность плазмид в эукариотических клетках.

4.9.2. Изучение экспрессии генов ВКЭ в эукариотических клетках.

4.9.3. Защитные свойства белков ВКЭ.

4.9.4. Влияние различных способов введения плазмид в ткани мышей на защитный эффект.

4.9.5. Экспрессия гена NS1 ВКЭ в рекомбинатных бактериях-обитателях слизистой оболочки носоглотки мышей.

4.10. Изучение зависимости защитного эффекта от способа представления неструктурного белка NS1 ВКЭ иммунной системе мышей.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Свойства некоторых белков вируса клещевого энцефалита»

Актуальность проблемы. Вирус, клещевого энцефалита (ВКЭ) вызывает заболевание центральной нервной системы людей с уровнем смертности 1-30% (Злобин и Горин, 1996). Постоянная циркуляция вируса в природных очагах приводит к периодическому сезонному росту заболеваемости населения. Освоение новых районов Сибири и Дальнего Востока приводит к повышению количества больных весенне-летним клещевым энцефалитом. Вирусная природа клещевого энцефалита была открыта в 1937 г. советскими учёными под руководством Л.А. Зильбера (Злобин и Горин, 1996). Однако поиск эффективных профилактических, диагностических и терапевтических средств продолжается и до сих пор. Сложность исследований обусловлена высокой патогенностью ВКЭ для человека и опасностью работ с вирусным материалом. Для " решения задач практического здравоохранения необходимо изучение не только структуры вирионов, но и функций всех вирусных белков и молекулярных механизмов репродукции ВКЭ. Очищенная инактивированная вакцина против ВКЭ была разработана в конце 70-ых годов и применяется в России и в странах Европы. Регулг ая иммунизация населения является дорогостоящей процедурой, поскольку при производстве инактивированной вакцины используют культуры клеток, а необходимость повторных инъекций увеличивает стоимость. Частичная денатурация вирусных антигенов формальдегидом (ТзекЬапоуэкауа е/ а!., 1993) может приводить к снижению эффективности инактивированной вакцины. Кроме того, индукция преимущественно гуморального иммунного ответа экзогенными антигенами инактивированных вакцин приводит к недостаточно эффективной элиминации инфицированных клеток, для которой необходим клеточный иммунитет (Сартакова и Коненков, 1997). Диагностика ВКЭ иммунологическими методами может приводить как к ложноположительным результатам из-за перекрёстных серологических реакций (Матвеева и др., 1998), так и к ложноотрицательным данным у серонегативных пациентов. Кроме того, иммуноферментные методы детекции из-за относительно низкого порога чувствительности не обеспечивают выявления возбудителя клещевого энцефалита в течение первых дней после заражения. Генодиагностика ВКЭ методами молекулярной гибридизации нуклеиновых кислот и ОТ-ПЦР при высоких уровнях чувствительности может приводить к ошибкам, обусловленным многочисленными мутациями вирусных геномных РНК (Цилинский, 1988; Steinhauer A. and Holland J.J., 1987; Bakhvalova et al, 2000). Используемые в настоящее время методы лечения основаны на использовании противовирусных иммуноглобулинов, РНК-азы и индукторов интерферона. Однако антитела не проникают в заражённые клетки, поэтому нейтрализуют только внеклеточные вирионы. Более того, после проникновения нейротропного вируса через гематоэнцефалический барьер ВКЭ становится недоступным для иммуноглобулинов крови. Действие РНК-азы и индукторов интерферона, таких как ридостин, неспецифично и поэтому недостаточно эффективно.

В связи с этим для разработки современных диагностических систем было необходимо получить информацию о генетическом разнообразии штаммов ВКЭ в природной популяции. С целью поиска ингибиторов репродукции ВКЭ для лечения заболевания необходимо изучение функций вирусных белков и образуемых ими комплексов. Выделение и идентификация вирусных белков из инфицированных клеток является актуальной задачей, поскольку позволяет получить неинфекционный материал для дальнейших исследований. Изучение иммуногенных и защитных свойств белков ВКЭ при различных способах индукции гуморального и клеточного иммунитета может быть использовано при конструировании эффективных вакцин.

До выполнения настоящей работы были определены нуклеотидные последовательности геномных РНК штаммов ВКЭ, выделенных на Дальнем Востоке (штаммы Софьин и 205) (Pletnev et al, 1990; Safronov et al, 1991) и в Западной Европе (штаммы Найдорф, Хипр и 263) (Mandl et al, 1989; Wallner et al., 1996). Клонирование генов NS1 и NS3 в бактериальных экспрессирующих векторах позволило исследовать иммуногенные свойства белка NS1 и протеазные свойства белка NS3 ВКЭ (Пугачёв, 1992; Pressman et al., 1993а). Получены поли- и моноклональные антитела, направленные к белкам ВКЭ (штамм Софьин) (Морозова, 1991; Матвеева и др., 1998). Ранее нами было показано, что инициация репликации вирусных РНК катализируется неструктурными белками NS5 и NS3 ВКЭ на ранней и поздней стадиях инфекции, соответственно (Морозова, 1991).

Цель работы состояла в изучении свойств ряда белков ВКЭ и их комплексов в зависимости от гомологии, локализации и иммуногенности. Исследование проводилось в трёх основных направлениях.

- Изучение вариабельности белков различных штаммов ВКЭ из природных популяций.

- Исследование функций индивидуальных белков ВКЭ в репродукции вируса и их способности к образованию кбмплексов с другими вирусными и клеточными белками и нуклеиновыми кислотами.

Сравнительный анализ иммуногенных и защитных свойств белков ВКЭ в зависимости от их способа взаимодействия с иммунной системой организма хозяина. Развитие исследований в перечисленных выше направлениях определило конкретные задачи настоящей работы.

1. Определить внутрипопуляционную и внутривидовую вариабельность геномных РНК и белков ВКЭ.

2. Методом аффинной хроматографии на иммуносорбентах с иммобилизованными моноклональными антителами к белкам ВКЭ выделить вирусные белки и их комплексы.

3. Исследовать функции белков ВКЭ и их комплексов.

4. Выявить зависимость тяжести заболевания от наличия антител к различным белкам ВКЭ у больных клещевым энцефалитом.

5. Изучить зависимость защитных свойств белков ВКЭ от способа представления антигенов иммунной системе.

Научная новизна и практическая ценность работы. В данной работе впервые определены нуклеотндные последовательности фрагмента гена Е (1376-1474 н.о.) западносибирских штаммов ВКЭ. Стабильность антигенных структур поверхностных гликопротеинов Е и NS1 показана для штаммов ВКЭ из разных популяций при помощи иммуноферментного анализа с моноклональными антителами. Методом аффинной хроматографии с использованием моноклональных антител против вирусных белков выделены 2 комплекса - внутриклеточный комплекс вирусных и клеточных белков с РНК и секретируемый комплекс гликопротеинов Е и NS1 ВКЭ. Впервые определены белки репликативного комплекса, участвующие в катализе синтеза РНК. Доказанное отсутствие корреляции между наличием антител к различным белкам ВКЭ и тяжестью заболевания позволяет сделать вывод о необходимости клеточного иммунного ответа для эффективной 9 профилактики и лечения этого вирусного заболеванйя. Проведённое исследование генной i и мукозальной иммунизаций может быть использовано для создания вакцин нового поколения при профилактике клещевого энцефалита. Оценка стабильности плазмид и возможности их встраивания в клеточные хромосомы : .обходима для генной иммунизации и терапии.

Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 20 статей. Результаты исследований представлены на международной научной конференции "Вирусные, риккетсиозные и бактериальные инфекции, переносимые клещами" (Иркутск, 1996 г.), 4 международном симпозиуме по гепатиту С и родственным вирусам (Япония, Киото, 1997), на научной конференции "Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера" (Новосибирск, 1998), VIII конференции "Новые направления биотехнологии" (Москва, 1998), 1 совещании американского общества по генной терапии (США, Сиэттл, 1998), 5 международном симпозиуме по гепатиту С и родственным вирусам (Италия, Венеция, 1998), на девятой итоговой конференции "Геном человека - 99" (Москва, 1999), на научной конференции "Оценка спонсируемых биологических исследований в России в новом тысячелетии" (Новосибирск, 1999), на Ш съезде иммунологов и аллергологов СНГ (Сочи, 2000) и на международной конференции "Направления в химии нуклеиновых кислот" (Москва, 2000).

Объём и структура работы. Диссертация изложена на 216 страницах, включающих 38 рисунков, 6 таблиц и список литературы (250 ссылок). Работа состоит из введения, четырёх глав и выводов. Глава I - "Белки флавивирусов" (обзор литературы). Глава 2 -"Вакцины против флавивирусных инфекций" (обзор литературы). Глава 3 -экспериментальная часть. Глава 4 содержит изложение и обсуждение результатов, полученных в работе.

Заключение диссертации по теме «Вирусология», Морозова, Ольга Владимировна

Выводы.

1. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей фрагмента гена Е 1376-1474 н.о. штаммов вируса клещевого энцефалита из дальневосточных, сибирских и европейских популяций выявил уровень внутрипопуляционной гомологии 89-98%, а межпопуляционное сходство не превышало 83%. Методом иммуноферментного анализа с использованием панелей моноклональных антител показана консервативность гликопротеина Е оболочки вирионов и относительная вариабельность неструктурного белка N81.

2. Выделены неструктурные белки вируса клещевого энцефалита из культуральных жидкостей и заражённых клеток при помощи аффинной хроматографии с использованием моноклональных антител. Обнаружена способность вирусных белков к образованию комплексов. Один из комплексов содержит клеточные и вирусные неструктурные белки N83, р49, фосфопротеин N85 и РНК. Второй комплекс состоит из структурного Е и неструктурного N81 вирусных гликопретеинов и секретируется из клеток на поздней стадии инфекции.

3. С помощью методов фотоаффинной аутокаталитической модификации и иммуноблотинга с использованием моноклональных антител доказано участие больших неструктурных белков N85 и N83 вируса клещевого энцефалита в синтезе вирусных РНК. Предложена модель регуляции репликации геномных РНК вируса клещевого энцефалита посредством посттрансляционного фосфорилирования инициирующей субъединицы - белка N85 и выхода из состава внутриклеточного комплекса, связанного с ядерными мембранами, на поздней стадии острой формы инфекции. При персистентной инфекции обнаружено уменьшение количеств белка N83.

4. Доказана иммуногенность всех белков вируса клещевого энцефалита независимо от молекулярной массы, локализации и функции. Показано отсутствие корреляции между наличием вирус-специфических антител и формами заболевания клещевым энцефалитом. Исследована зависимость защитного иммунитета против вирусных белков от способа представления антигена NS1 иммунной системе.

5. Для определения защитных свойств индивидуальных белков вируса клещевого энцефалита гены prM, Е, NS1 и NS3 клонированы в эукариотических экспрессирующих векторах pSVK3 и pcDNAI. Показана экспрессия вирусных генов в трансфицированных культурах клеток и индукция антител у мышей. Обнаружен защитный эффект индивидуальных плазмид pSVK3-ENSl, pSVK3-E и pSVK3-prME, содержащих вирусные гены Е, NS1 и ргМ, от летальных доз вируса клещевого энцефалита при отсутствии защиты векторной ДНК pSVK3 и плазмидой pcDNAI-NS3 с геном NS3.

Заключение.

Суммируя полученные результаты, необходимо подчеркнуть, что несмотря на вариабельность геномных РНК штаммов ВКЭ из природной популяции, аминокислотные последовательности соответствующих вирусных белков остаются относительно консервативными в течение 12-летнего периода. Такая гомология, вероятно, свидетельствует о важности их функций для сохранения вида. Из-за компактности вирусного генетического материала свойства индивидуальных белков ВКЭ разнообразны. Помимо полифункциональности флавивирусных белков нами обнаружена их способность к образованию комплексов. Один из таких комплексов, состоящий из клеточных и вирусных неструктурных белков NS5, NS3 и РНК, находится в околоядерной области заражённых клеток. Ассоциация его с мембранами эндоплазматического ретикулума ф хозяйских клеток исключает возможность контактов с иммунной системой и обеспечивает репродукцию ВКЭ в организме. Изменение соотношения составляющих субъединиц могут вызывать переключение синтеза РНК с цепей отрицательной полярности на цепи положительной полярности, а также острую или персистентную формы инфекции. Второй комплекс, образованный структурным Е и неструктурным NS1 гликопротеинами, отсутствует в заражённых клетках, несмотря на накопление индивидуальных составляющих его субъединиц, и секретируется в сыворотку крови. Внеклеточная локализация комплекса белков Е и NS1 ВКЭ на поздних стадиях инфекции исключает его участие в созревании вирионов и создаёт оптимальные условия для индукции образования антител. Очевидно, секретируемый комплекс флавивирусных гликопротеинов E-NS1 индуцирует развитие иммунного ответа по Т-хэлперному пути второго типа. Преимущественно гуморальный иммунитет не обеспечивает элиминации инфицированных клеток и, следовательно, не устраняет причину развития заболевания. Кроме того, конкурентное связывание этого комплекса со специфическими антителами также способствует сохранению внеклеточных вирионов и заражённых клеток. Для структурных белков С, M и малых неструктурных белков NS2A, NS2B, NS4A, NS4B показаны иммуногенные свойства. Изучение функций этих белков ВКЭ может стать темой дальнейших исследований при наличии специфических моноклональных антител.

Исходя из вышесказанного, при создании вакцин нового поколения против ВКЭ необходимо включать в их состав неструктурные антигены и, особенно, гликопротеин NS1. Желательно обеспечить представление антигенов иммунной системе в ассоциированном состоянии с основным комплексом гистосовместимости I типа для индукции преимущественно клеточного защитного иммунитета, поскольку наличие антител в крови и спинномозговой жидкости не предотвращает развития тяжёлых форм клещевого энцефалита. Диагностические системы будущего следует разрабатывать на основе полученной информации о генетической вариабельности и антигенной # стабильности ВКЭ. Специфические терапевтические методы, по-видимому, должны быть направлены на разрушение репликативного комплекса ВКЭ, не нарушая структуру отдельных субъединиц, поскольку последнее может привести к хронизации инфекции.

Список литературы диссертационного исследования доктор биологических наук Морозова, Ольга Владимировна, 2001 год

1. Берги (1980) Краткий определитель бактерий, "Мир", Москва, 495 с.

2. Верета J1.A. и Воробьёва М.С. (1990) Природная гетерогенность и целенаправленный отбор штаммов вируса клещевого энцефалита. Москва, "Медицина", 124 с.

3. Вершинский Б.В. (1984) Палеографические факторы становления природных очагов клещевого энцефалита и современная структура нозоареала. Паразитологический сборник. Ленинград, Наука, Вып. 32, С. 124-138.

4. Волкова Т.Д., Вольпина О.М., Иванова В.Т., Рубин С.Г., Семашко И.В., Караванов A.C. (1998) Изучение антигенной структуры вируса клещевого энцефалита с помощью синтетических пептидов. Биоорганическая химия, Т. 24, N2, С. 100-111.

5. Гендон Ю.З. (1999) Вирусные мукозальные вакцины. Вопросы вирусологии, Т. 3, С. 100-105.

6. Дебабов В.Г. (1997) ДНК-вакцинация и генотерапия на основе транзиентной экспрессии нуклеиновых кислот в соматических клетках человека и животных. -Молекулярная биология, Т. 31, N2, С. 209-215.

7. Добрикова Е.Ю., Плетнёв А.Г., Шаманин В.А. (1986) Обнаружение вируса клещевого энцефалита в крови людей и в индивидуальных клещах методом молекулярной гибридизации нуклеиновых кислот. Вопросы вирусологии, № 6, С. 739-742.

8. Добрикова Е.Ю. и Плетнёв А.Г. (1995) Полноразмерная ДНК-копия генома вируса клещевого энцефалита. I. Анализ 5'- и З'-концевых некодирующих областей генома. -Биоорганическая химия, Т. 21, N 7, С. 528-534.

9. Жданов В.М., Гаврилов В.И., Клименко С.М., Богомолова H.H., Анджапаридзе О.Г. (1973) Хроническая инфекция культур клеток вирусом клещевого энцефалита: рибонуклеопротеидные структуры в клетках. Вопросы вирусологии, №1, С. 17-23.

10. Жимулёв И.Ф. (2000) Молекулярная и генетическая организация гетерохроматина вхромосомах дрозофилы. Соросовский образовательный журнал, Т. 6, N2, С. 76-82.

11. Кульберг А.Я. (1978)—Антииммуноглобулины,—Антиидиотипические антитела— Мое к на. "Медицина", С. 51-76.

12. Лакин Г.Ф. (1980) Биометрия. Москва, "Высшая школа", 293 с.

13. Лактионов П.П., Рыкова Е.Ю., Крепкий Д.В., Брыксин A.B., Власов В.В. (1997) Взаимодействие олигонуклеотидов с белками барьерных жидкостей. Биохимия, Т. 62, N6, С. 613-618.

14. Леонова Г.Н., Матвеев Л.Э., Плетнев А.Г. (1990) Изучение с помощью моноклональных антител штаммов вируса клещевого энцефалита, изолированных на юге Дальнего Востока. Вопросы вирусологии, №5, С. 421-423.

15. Лурия С., Дарнелл Дж., Балтимор Д., Кэмпбелл Э. (1981) Общая вирусология, Москва, "Мир", 680 с.

16. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. (1984) Молекулярное клонирование. Москва, "Мир", 480 с.

17. Матвеев Л.Э., Караванов A.C., Рубин С.Г., Семашко И.В., Прессман Е.К. (1989) Сравнительная оценка двух иммуноферментных тест-систем для выявления антител к вирусу КЭ. Вопросы вирусологии, Т. 34, С. 488-491.

18. Матвеева В.А., Добрикова Е.Ю., Цехановская H.A., Попова Р.В., Прессман Е.К., Караванов A.C., Матвеев Л.Э. (1998) Получение и свойства моноклональных антител к неструктурным белкам вируса клещевого энцефалита. Вопросы вирусологии, № 3, С. 134-137.

19. Морозова О.В., Белявская H.A., Матвеев Л.Э., Кветкова Э.А., Плетнёв А.Г. (1990) Репликативный комплекс вируса клещевого энцефалита. II. Влияние белка оболочки Е--и антител к нему на синтез РНК in vitro. Биоорганическая химия, Т. 16, №9, С. 1277-1279.

20. Морозова O.B. (1991) Состав и функции белков репликативного комплекса вируса клещевого энцефалита. Диссертация кандидата биологических наук, Новосибирск, Новосибирский институт биоорганической химии СО РАН, 102 с.

21. Погодина В.В., Бочкова Н.Г., Корешкова Г.В. (1981) Свойства штаммов серотипа Айна/1448 вируса клещевого энцефалита. Вопросы вирусологии, N 6, С. 741-746.

22. Погодина В. В., Фролова М.П., Ерман Б. А. (1986) Хронический клещевой энцефалит. Новосибирск, "Наука", 232 с.

23. Попова H.A. (2000) Иммунология. Новосибирск, Новосибирский государственный университет, 139 с.

24. Протопопова Е.В., Коновалова С.Н., Локтев В.Б. (1997) Выделение клеточногорецептора для вируса клещевого энцефалита при помощи антиидиотипических$антител. Вопросы вирусологии, Т.42, № 6, С. 264-268.

25. Протопопова Е.В. (1998) Поиск и выделение клеточного рецептора для вируса клещевого энцефалита при помощи антиидиотипических антител. Диссертация кандидата биологических наук, Новосибирск, Кольцово, 120 с.

26. Пугачёв К.В. (1992) Генно-инженерные аналоги неструктурных белков NS1 и NS3 вируса клещевого энцефалита. Диссертация кандидата биологических наук, Новосибирск, Новосибирский институт биоорганической химии СО РАН, 155 с.

27. Сафронов (1999) Конструирование фотоаффинных реагентов для исследования матрично-зависимого синтеза нуклеиновых кислот. Производные d(NTP), несущиеперфторазидоарильные группы. Диссертация кандидата химических наук,

28. Новосибирск, Новосибирский институт биоорганической химии СО РАН, 110 с.

29. Цилинский Я.Я. (1988) Стабильность вида у РНК-геномных вирусов. Место вида среди биологических систем. - Вильнюс, С. 126-144.

30. Шапот B.C. (1968) Нуклеазы. Москва, "Медицина", 211с.

31. Abrignani S. (1997) Immune responses throughout hepatitis С virus (HCV) infection: HCV from immune system point of view. Springer Seminars in immunophatalogy, V, 19, P. 4755.

32. Amberg S.M., Nestorowicz A., McCourt D.W. and Rice C.M. (1994) NS2B-3 proteinase-mediated processing in the yellow fever virus structural region: in vitro and in vivo studies. -Journal of Virology, V. 68, №6, P. 3794-3802.

33. Anderson R., King A.D., Innis B.L. (1992) Correlation of E protein binding with celltsusceptibility to dengue 4 virus infection. Journal of General Virology, V. 73, Pt. 8, P." 2155-2159.

34. Argos P. (1988) A sequence motif in many polymerases. Nucleic Acids Research, V. 16, P. 9909-9916.

35. Arntzen C.J. (1997) Edible vaccines. Public Health Report, V. 112, N3, P. 191-197.

36. Bakhvalova V.N., Rar V.A., Tkachev S.E., Matveeva V.A., Matveev L.E., Karavanov A.S., Dobrotvorsky A.K. and Morozova O.V. (2000) Tick-borne encephalitis virus strains of Western Siberia. Virus Research, V. 70 , № 1-2, P. 1-12.

37. Barrett A.D., Mathews J.H., Millen B.R., Ledger T.N., and Roehring J.T. (1990) Identification of monoclonal antibodies that distinguish between 17D-204 and other strains of yellow fever virus. Journal of General Virology, V. 71, P. 13-18.

38. Barry M.A., Lai W.C., Johnston S.A. (1995) Protection against mycoplasma infection using expression-library immunization. Nature, V. 377, P. 632-635.1.tervirology, V. 40, P. 378-393.

39. Bartholomcusz A.I, and Wright P.J. (1993) Synthesis of dengue virus RNA in vitro: initiation and the involvement of protein NS3 and NS5. Archives of Virology, V. 128, P. 111-121.

40. Behrens S.-E., Grassmann C.W., Thiel H.-J., Meyers G. and Tautz N. (1998) Characterization of an autonomous subgenomic pestivirus RNA replicon. Journal of Virology, V. 72, N 3, P. 2364-2372.

41. Blackwell J.L. and Brinton M.A. (1997) Translation elongation factor-1 alpha interacts with the 3' stem-loop region of West Nile virus genomic RNA. Journal of Virology, V. 71, № 9, P. 6433-6444.

42. Blitvich B.J., Mackenzie J.S., Coehen R.J., Howard M.J., Hall R.A. (1995) A novel complex formed between the flavivirus E and NS1 proteins: analysis of its structure and function. -Archives of Virology, V. 140, P. 145-156.t

43. Boege U., Heinz F.X., Wengler G., Kunz C. (1983) Amino acid compositions and amino- * terminal sequences of the structural proteins of a flavivirus, European tick-borne encephalitis virus. Virology, V. 126, N4, P. 651-657.

44. Bot A. Bot S., Garcia-Sastre A. and Bona C. (1996) DNA immunization of newborn mice with a plasmid-expressing nucleoprotein of influenza virus. Viral Immunology, V. 9, N4, P. 207-210.

45. Bray M. and Lai C.-J. (1991) Dengue virus premembrane and membrane proteins elicit a protective immune response. Virology, V. 185, P. 505-508.

46. Brinkworth R.I., Fairlie D.P., Leung D., Young P.R. (1999) Homology model of the dengue 2 virus NS3 protease: putative interactions with both substrate and NS2B cofactor. Journal of General Virology, V. 80, Pt.5, P. 1167-1177.

47. Brinton M.A., Fernandez A.A., Dispoto J.H. (1986) The 3'-nucleotides of flavivirus genomic RNA form a conserved secondary structure. Virology, V. 153, N1, P. 113-121.

48. Brinton M.A. and Dispoto J.H. (1988) Sequence and secondarjLstructure analysis of the 5'-terminal region of flavivirus genome RNA. Virology, V. 162, N2, P. 290-299.

49. Brinton M.A., Kuranc I., Mathew A., Zeng L., Shi P.Y., Rothman A., Ennis F.A. (1998) Immune mediated and inherited defences against flaviviruses. Clinical and Diagnostic Virology, V. 10, P. 129-139.

50. Brower V. (1998) Naked DNA vaccines come of age. Nature Biotechnology, V. 16, P. 1304-1305.

51. Cahour A., Falgout B., Lai C.-J. (1992) Cleavage of the dengue virus polyprotein at the NS3/NS4A and NS4B/NS5 junctions is mediated by viral protease NS2B-NS3, whereas

52. NS4A/NS4B may be processed by a cellular protease. Journal of Virology, V. 66, P. 1535*1542.

53. Cahour A., Pletnev A., Vazeille-Falcoz M., Rosen L. and Lai C.-J. (1995) Growth-restricted Dengue virus mutants containing deletions in the 5' noncoding region of the RNA genome. -Virology, V. 207, P. 1-9.

54. Calos M.P. (1996) The potential of extrachromasomal replicating vector for gene therapy. -Trends Genet., V 12, P. 463-466.

55. Cammack N. and Gould E.A. (1985) Conditions for haemolysis by flaviviruses and characterization of the haemolysin. Journal of General Virology, V. 66, N10, P 2291-2296.

56. Carr J.P. and Zaitlin M. (1993) Replicase-mediated resistance. Seminars in Virology, V. 4, P. 339-347.

57. Catty D. (1991) Antibodies. A practical approach. Birmingham.

58. Chambers T.J., Grakoui A., Rice C. M. (1991) Processing of yellow fever virus nonstructural polyprotein: a catalytically active NS3 proteinase domain and NS2B are required for -deavage-a^dibasie-sites. Journal of Virology, V. 65, P. 6042-6050,

59. Chen Y., Maguire T., Marks R.M. (1996) Demonstration of binding of dengue virus . envelope protein to target cells. Journal of Virology, V. 70, N12, P. 8765-8772.

60. Chen C.-J., Kuo M.-D., Chien L.-J., Hsu S.-L., Wang Y.-M., Lin J.-H. (1997) RNA-protein interactions: involvement of NS3, NS5 and 3-noncoding regions of Japanese encephalitis virus genomic RNA. Journal of Virology, V. 71, №5, P. 3466-3473.

61. Chin J., Turner B., Barchia I. And Mullbacher A. (2000) Immune response to orallyconsumed antigens and probiotic bacteria. Imminology and Cell Biology, V. 78, P. 55-66.

62. Chu P.W.G. and Westaway E.G. (1987) Characterization of Kunjin virus RNA-dependent RNA polymerase: reinitiation of synthesis in vitro. Virology, V. 157, P. 330-337.

63. Chung C.T., Niemela S.L. and Miller R.H. (1989) One-step preparation of competent Escherichia coli transformation and storage of bacterial cells in the same solution. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, V. 86, P. 2172-2175.

64. Churdboonchart V., Bhamarapravati N., Peampramracha S., Sirinavin S. (1991) Antibodies against dengue viral proteins in primary and secondary dengue hemorrhagic fever. -American Journal of Tropical Medicine and Hygiene, V. 44, №5, P. 481-493.

65. Cohen J. (1993) Naked DNA points way to vaccines. Science, V. 259, P. 1691-1692.

66. Crooks A.J., Lee J.M., Dowsett A.B., Stephenson J.R. (1990) Purification and analysis of infectious virions and native non-structural antigens from cells infected with tick-borne encephalitis virus. Journal of Chromatography, V. 502, N1, P. 59-68.

67. Crooks A.J., Lee J.M., Easterbrook L.M., Timofeev A.V., Stephenson J.R. (1994) The NS1 protein of tick-borne encephalitis virus forms multimeric species upon secretion from the host cells. Journal of General Virology, V. 75, N12, P. 3453-3460.

68. Cui T., Sugrue R.J., Xu Q., Lee A.K., Chan Y.C., Fu J. (1998) Recombinant dengue virus type 1 NS3 protein exhibits specific viral RNA binding and NTPase activity regulated by the NS5 protein. Virology, V. 246, N2, P. 409-417.

69. Darquet A.-M., Rangara R., Kreiss P., Schwartz B., Naimi S., Delaere P., Crouzet J. (1999) Minicircle: an improved DNA molecule for in vitro and in vivo gene transfer. Gene Therapy, V. 6, №6, P. 209-218.

70. Despress P., Girard M., Bouloy M. (1991) Characterization of yellow fever virus proteins E and NS1 expressed in Vero and Spodoptera frugiperda cells. Journal of General Virology, V. 72, P. 1331-1342.

71. Deubel V., Digoutte J.-P., Monath T.P., Girard M. (1986) Genetic heterogeneity of yellow fever virus strains from Africa and the America. Journal of General Virology, V. 67, P. 209-213.

72. Dowty M.E., Williams P., Zhang G. (1995) Plasmid DNA entry into postmitotic nuclei of primary rat myotubes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, V. 92, P. 4572-4576.

73. Ecker M., Allison S.L., Meixner T., Heinz F.X. (1999) Sequence analysis and genetic classification of tick-borne encephalitis viruses from Europe and Asia. Journal of General Virology, V. 80, P. 179-185.

74. Failla C., Tomei L., Francesco R. (1994) Both NS3 and NS4 are required for proteolytic3753-3760.

75. Finn G.K., Kurz B.W., Cheng R.Z., Shmookler R.J. (1989) Homologous plasmid recombination is elevated in immortally transformed cells. Mol. Cell. Biol., V. 9, P. 40094017.

76. Gould E.A. and Buckley A. (1989) Antibody-dependent enhancement of Yellow fever and Japanese encephalitis virus neurovirulence. Journal of General Virology, V. 70, P. 16051608.

77. Gritsun T.G., Venugopal K., de Zanotto P.M.A., Mikhailov M.V., Sail A.A., Holmes E.C.,

78. Polkinghorne I., Frolova T.V., Pogodina V.V., Lashkevich V.A., Gould E.A. (1997)

79. Complete sequence of two tick-borne flaviviruses isolated from Siberia and the UK: analysisfand significance of the 5' and 3'-UTRs. Virus Research, V. 49, P. 27-39.

80. Gruenberg A. And Wright P.J. (1992) Processing of dengue virus type 2 structural proteins containing deletions in hydrophobic domains. Archives of Virology, V. 122, № 1-2, P. 7794.

81. Grun J.B. and Brinton M.A. (1986) Characterization of West Nile virus RNA-dependent RNA polymerase and cellular terminal adenylil and uridylil transferase in cell-free extract. -Journal of Virology, V.60, N3, P.l 113-1124.

82. Grun J.B. and Brinton M.A. (1987) Dissociation of NS5 from cell fractions containing West Nile virus-specific polymerase activity. Journal of Virology, V. 61, № 11, P. 3641-3644.

83. Guirackhoo F., Radda A.C., Heinz F.X., Kunz C. (1987) Evidence for antigenic stability of tick-borne encephalitis virus by the analysis of natural isolates. Journal of General Virology, V. 68, P. 859-864.

84. Gunneriusson E., Samuelson P., Uhlen M., Nygren P.-A., Stahl S. (1996) Surface display of a functional single-chain Fv antibody on staphylococci. Journal of Bacteriology, V. 178, P.1341-1346.

85. Hames B.D. and Higgins S.J. (1984) Transcription and translation: a practical approach. Oxford: JRL Press.

86. Harase I., Moriyama T., Kaneko T., Kita H., Nomura M., Suzuki G., Ohnishi H., Muto Ya., Yazaki Yo., Imawari M. (1995) Immune response to hepatitis C virus core protein in mice. Immunology and cell biology, V. 73, P. 346-352.

87. Heinz F.X. and Kunz C. (1981) Homogeneity of the structural glycoprotein from European isolates of tick-borne encephalitis virus: comparison with other flaviviruses. -Journal of General Virology, V. 57, P. 263-274.

88. Heinz F.X., Tuma W., Kunz C. (1981) Antigenic and immunogenic properties of defined physical forms of TBEV structural proteins. Infectious Immunology, V. 33, N1, P.250-257.

89. Heinz F.X. and Mandl C.W. (1993) The molecular biology of tick-borne encephalitis virus. Apmis, N101, P. 735-745.

90. Hewson R. A. (2000) RNA viruses: emerging vectors for vaccination and gene therapy. -Molecular Medicine Today, V.6, P. 28-35.

91. Hofmann H., Frisch-Niggemeyer W., Heinz F., Kunz C. (1979) Immunoglobulins to tickborne encephalitis in the cerebrospinal fluid of man. Journal of Medical Virology, V. 4,

92. N3; P. 241^245. ---- - ---—

93. Hommcl-Berrey G.A. and Schloemer R.H. (1986) Inhibition of Banzi viral RNA synthesis in BHK-21 cells by Banzi virion matrix protein. Intervirology, V. 25, N1, P. 38-47.

94. Ilyin Y.V. and Georgiev G.P. (1982) The main types of organization of genetic material in eukaryotes. CRC Crit. Rev. Biochem., V. 12, P. 237.

95. Jacobs S.C., Stephenson J.R. and Wilkinson W.G. (1994) Protection elicited by a replication-defective adenovirus vector expressing the tick-borne encephalitis virus nonstructural glycoprotein NS1. Journal of General Virology, V. 75, P. 2399-2402.

96. Jurka J. and Smith T. (1988) A fundamental division in the Alu family of repeated sequences. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, V. 85, P. 4775-4778.

97. Kailasapathy K. and Chin J. (2000) Survival and therapeutic potential of probiotic organisms with reference to Lactobacillus acidophilus and Bifidobactrium spp. -Immunology and Cell Biology, V. 78, P. 80-88.

98. Karlin S., Doerfler W.and Cardon L.R. (1994) Why is CpG suppressed in the genomes of virtually all small eukaryotic viruses but not in those of large eukaryotic viruses? -Journal of Virology, V.68, N5, P.2889-2897.

99. Khromykh A.A. and Westaway E.G. (1996) RNA binding properties of core protein of the flavivirus Kunjin. Archives of Virology, V. 141, № 3-4, P. 685-699.

100. Khromykh A.A., Sedlak P.L., Westaway E.G. (1999) Trans-Complementation analysis of the flavivirus Kunjin NS5 gene reveals an essential role for translation of its N-terminal half in RNA replication. Journal of Virology, V. 73, N11, P. 9247-9255.

101. Kim D.W., Gwack Y., Han J.H., Choe J. (1997) Towards defining a minimal functional domain for NTPase and RNA helicase activities of the hepatitis C virus NS3 protein. -Virus Research, V. 49, №1, P. 17-25.

102. Kit Yu. Ya., Kim A.A., and Sidorov V.N. (1991) Affinity-purified secretory immunoglobulin A possesses the ability to phosphorylate human milk casein. -Biomedical Science, V. 2, P. 201-204.

103. Koonin E.V. and Dolja V.V. (1993) Evolution and taxonomy of positive-strand RNA viruses: implications of comparative analysis of amino acid sequences. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology, V. 28, №5, P. 375-430.

104. Lai C.-J., Zhao B., Hon H., Bray M. (1991) Infectious RNA transcribed from stably cloned full-length cDNA of dengue type-4 virus. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, V. 88, P. 5139-5143.

105. Laktionov P.P., Dazard J.E., Vives E., Rykova E.Y., Piette J., V'lassov V.V., Lebleu B. (1999) Characterisation of membrane oligonucleotide-binding proteins and oligonucleotide uptake in keratinocytes. Nucleic Acids Research, V. 27, N11, P. 23152320.

106. Lancaster M.U., Hodgetts S.I., Mackenzie J.S., Urosevic N. (1998) Characterization of defective viral RNA produced during persistent infection of Vero cells with Murray Valley encephalitis virus. Journal of Virology, V. 72, N3, P. 2474-2482.

107. Lee J.M., Crooks A.G., Stefenson J.R. (1989) The synthesis and maturation of a nonstructural extracellular antigen from TBEV and its relationship to the intracellular NS1 protein. Journal of General Virology, V. 70, N2, P. 335-343.

108. Liljeqvist S. and Stahl S. (1999) Production of recombinant subunit vaccines: protein immunogens, live delivery systems and nucleic acid vaccines. Journal of Biotechnology, V. 73, P. 1-33.

109. Lindenbach B.D. and Rice C.M. (1997) Trans-complementation of yellow fever virus NS1 reveals a role in early RNA replication. Journal of Virology,V.71, N12, P. 96089617. •

110. Lindenbach B.D. and Rice C.M. (1999) Genetic interaction of flavivirus nonstructural proteins NS1 and NS4A as a determinant of replicase function. Journal of Virology, V. 73, N6, P. 4611-4621.

111. Locht C. (2000) Live bacterial vectors for intranasal delivery of protective antigens. -Pharmaceutical Science and Technology Today, V. 3, P. 121-128.

112. Loke S.L., Stein C.A., Zhang X.H., Mori K., Nakanishi N. Subasinghe S., Cohen J.S. and Neckers L.M. (1989) Characterization of oligonucleotide transport into living cells. -Proc. Natl. Acad. Sci. USA, V. 86, P. 3474-3478.

113. MacGregor G.R., James M.R., Arlett C.F., Burke J.F. (1987) Analysis of mutations occurring during replication of SV-40 shuttle vector in mammlian cells. Mutat. Res., V. 183, P. 273-278.

114. Mackenzie J.M., Jones M.K., Young P.R. (1996) Immunolocalization of the dengue virus — nonstructural-glycoprotein NS1 suggest a role in viral RNA replication. Virology, V.220, N1, P. 232-240.

115. Mackenzie J.M., Khromykh A.A., Jones M.K. and Westaway E.G. (1998) Subcellular localization and some biochemical properties of the flavivirus Kynjin nonstructural proteins NS2A and NS4A. Virology, V. 245, P. 203-215.

116. Mackow E., Makino Y., Zhao B., Zhang Y.-M., Markoff L., Buckeer-White A., Guiler M., Chanock R., Lai C.-J. (1987) The nucleotide sequence of Dengue type 4 virus: analysis of genes coding for nonstructural proteins. Virology, V. 159, P. 217-228.

117. Mandl C.W., Heinz F.X., Stockl E. and Kunz C. (1989) Genome sequence of tick-borne encephalitis virus (Western sybtype) and comparative analysis of nonstructural proteins with other flaviviruses. Virology, V. 173, N1, P. 291-301.

118. Mandl C.W., Holzmann H., Kunz C., Heinz F.X. (1993) Complete genomic sequence of Powassan virus: evaluation of genetic elements in tick-borne versus mosquito-borne flaviviruses. Virology, V. 194, P. 173-184.

119. Mason M.S. llaq T.A., Clements J.D. and Arntzen C.J. (1998) Edible vaccine protects mice against Escherichia coli heat-labile enterotoxin (LT): potatoes expressing a synthetic LT-B gene. -Vaccine, V. 16, N13, P. 1336-1343.

120. Matsumoto M., Hwang S.B., Jeng K.-S., Zhu N. and Lai M.C. (1996) Homotypic interaction and multimerization of hepatitis C virus core protein. Virology, V. 218, №1, P.43-51.

121. Monath T.P. (1986) Pathobiology of the flaviviruses. Plenum Press, New York-London,1. P. 375-440.

122. Mondelli M.V., Cividini A. and Cerino A. (1995) Role of humoral immune responses in hepatitis B and C virus infection. European Journal of Clinical Investigation, V. 25, P. 543-547.

123. Moreau J., Marcaud L., Maschat F., Kejzlarova-Lepesant J., Lepesant J.A. and Scherrer K. (1982) A+T-rich linkers define functional domains in eukaryotic DNA. Nature, V. 295, P. 260-262.

124. Morrow C.D., Gibbons G.F., Dasgupta A. (1985) The host protein required for in vitro replication of poliovirus is a protein kinase that phosphorylates eukaryotic initiation— fac-tor-2^-CeIl,\L40,-P,91^-92-L

125. Muylaert I.R., Chambers T.J., Caller R., Rice C.M. (1996) Mutagenesis of the N-linked glycosylation sites of the yellow fever virus NS1 protein: effects on virus replication and mouse neurovirulence. Virology. V. 222, N1, P. 159-168.

126. Muylaert I.R., Galler R., Rice C.M. (1997) Genetic analysis of the yellow fever virus NS1protein: identification of a temperature-sensitive mutation which blocks RNA accumulation. Journal of Virology, V. 71, N1, P.291-298.

127. Ng M.L. and Hong S.S. (1989) Flavivirus infection: essential ultrastructural changes and association of Kunjin virus NS3 protein with microtubules. Archives of Virology, V. 106, № 1-2, P.103-120.

128. Nichols W.W., Ledwith B.J., Manam S.V., Troilo P.J. (1995) Potential DNA vaccine integration into host cell genome. Ann. NY Acad. Sci., V. 772, P. 30-39.

129. Nowak T. and Wengler G. (1987) Analysis of disulfides present in the membrane proteins of the West Nile flavivirus. Virology, V. 156, P. 127-137.

130. O'Sullivan D.J. and Klaenhammer T.R. (1993) High- and low-copy-number Lactococcusshuttle cloning vectors with features for clone screening. Gene, V. 137, N2, P. 227-231.

131. Palukaitis P. and Zaitlin M. (1997) Replicase-mediated resistance to plant virus disease.

132. Adv. Vir. Res., V. 48, P. 349-377.

133. Peiris J.S.M. and Porterfield J.S. (1979) Antibody-mediated enhancement of flavivirusreplication in macrophage cell lines. Nature (London), V. 282, P. 509.

134. Phillpotts R.J., Stephenson J.R., Porterfield J.S. (1985) Antibody-dependent enhancementof tick-borne encephalitis virus infectivity. Journal of General Virology, V. 66, N8, P. 1831-1837.

135. Phillpotts R.J., Venugopal K., Brooks T. (1996) Immunization with DNA polynucleotidesprotects mice against lethal challenge with St. Louis encephalitis virus. Archives of Virology, V. 141, N3-4, P. 743-749.

136. Pletnev A.G., Yamshchikov V.F., Blinov V.M. (1990) Nucleotide sequence of the genome and complete amino acid sequence of the polyprotein of TBE. Virology, V. 174, P. 250-263.

137. Poidinger P.A., Coelen, Mackenzie J.S. (1991) Persistent infection of Vero cells by the flavivirus Murray Valley encephalitis virus. Journal of General Virology, V. 72, P. 573578.

138. Powell S., Whitaker S., Peacock J., and Mcmillan T. (1993) Ataxia telangiectasia: an investigation of the repair defect in cell line AT5BIVA by plasmid reconstitution. -Mutât. Res., V. 294, P. 9-20.

139. Pressman E.K. (1993) Heterocomplexes of TBEV structural and non-structural proteins. FEBS Letters, V. 333, N3, P. 268-270.

140. Pressman E.K, Malenko G.V. and Pogodina V.V. (1993a) Variabilités in the antigenic structure of persisting tick-borne encephalitis virus strain. Virus Research, V. 30, P. 250-257.

141. Preughschat F. and Lenches E.M. (1991 ) Flavivirus enzyme-substrate interactions studied with chimeric proteinases: identification of an intragenic locus important for substrate recognition. Journal of Virology, V. 65, N9, P. 4749-4758.

142. Pryor M.J. and Wright P.G. (1993) The effects of site-directed mutagenesis on the dimerization and secretion of the NS1 protein specified by dengue virus. Virology, V. 194, P. 769-780.

143. Pugachev K.V., Nomokonova N.Yu., Morozova O.V., Pletnev A.G. (1992) A short form of the tick-borne encephalitis virus NS3 protein. FEBS Letters, V. 297, №1-2, P. 67-69.

144. Randolph V.B., Winkler G., Stollar V. (1990) Acidotropic amines inhibit proteolytic processing of flavivirus prM protein. Virology, V. 174, N2, P. 450-458.

145. Reed K.E., Gorbalenya A.E., Rice C.M. (1998) The NS5A/NS5 proteins of viruses from three genera of the family Flavivirirae are phosphorylated by associated serine/threonine kinases. Journal of Virology, V. 72, N7, P. 6199-6206.

146. Rey F.A., Heinz F.X., Mandl C., Kunz C„ Harrison S.C. (1995) The envelopefglycoprotein from tick-borne encephalitis virus at 2 A resolution. Nature, V. 375, P. 291-298.

147. Sanger F., Nicklen S., Coulson A.R. (1977) DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, V. 74, №. 12, P. 5463-5467.

148. Santolini E., Migliaccio G. and La Monica N. (1994) Biosynthesis and biochemical properties of the hepatitis C virus core protein. Journal of Virology, V. 68, P. 36313641.

149. Schlesinger J.J., Brandriss M.W., Cropp C.B., Monath T.P. (1986) Protection against yellow fever in monkeys by immunization with yellow fever virus nonstructural protein NS1.-Journal of Virology, V. 60, N3, P. 1153-1155.

150. Schwartz R.S. (1988) Polyvalent anti-DNA autoantibodies: immunochemical and biological significance. Int. Rev. Immunol., V. 3, P. 97-115.

151. Shamanin V.A., Pletnev A.G., Rubin S.G. and Zlobin V.I. (1990) Differentiation of strains of tick-borne encephalitis virus by means of RNA-DNA hybridization. Journal of General Virology, V. 71, P. 1505-1515.

152. Shi P.Y., Li W., Brinton M.A. (1996) Cell proteins bind specifically to West Nile virus minus-strand 3' stem-loop RNA. Journal of Virology, V. 70, № 9, P. 6278-6287.

153. Shiu St.Y., Ayres M.D., Gould E.A. (1991) Genomic sequence of the structural proteins of louping ill virus: comparative analysis with tick-borne encephalitis virus. Virology, V. 180, № 1, P. 411-415.

154. Sparwasser T., Miethke T., Lipford G., Erdmann A., Hacker H., Heeg K., Wagner H. (1997) Macrophages sense pathogens via DNA motifs: induction of tumor necrosis factor a-mediated shock. European Journal of Immunology, V. 27, N7, P. 1671-1679.

155. Speight G. and Westaway E.G. (1989) Carboxy-terminal analysis of nine proteinsspecified by the flavivirus Kunjin: evidence that only the intracellular core protein is truncated. Journal of General Virology, V. 70, Pt. 8, P. 2209-2214.

156. Steffens S., Thiel H.J., Behrens S.E. (1999) The RNA-dependent RNA polymerases of different members of the family Flaviviridae exhibit similar properties in vitro. Journal of General Virology, V. 80, Pt.10, P. 2583-2590.

157. Steinhauer A. and Holland J.J. (1987) Rapid evolution of RNA viruses. Annual Review of Microbiology, V. 41, P. 409-433.

158. Stephenson J.R., Cropks A.J., Lee J.M. (1987) The synthesis of immunogenic polypeptides encoded by tick-borne encephalitis virus. Journal of General Virology, V. 68, N5, P. 1307-1316.

159. Strauss A. and Gotz F. (1996) In vivo immobilization of enzymatically active polypeptides on the cell surface of Staphylococcus carnosus. Mol. Microbiol., V. 21, P. 491-500.

160. Suzuki K., Doi T., Imanishi T., Kodama T., Tanaka T. (1999) Oligonucleotide aggregates bind to the macrophage scavenger receptor. European Journal of Biochemistry, V. 260, N3, P. 855-860.

161. Takegami T., Washizu M., Yasui IC. (1986) Nucleotide sequence at the 3'-end of Japanese encephalitis virus genomic RNA. Virology, V. 152, N2, P. 483-486.

162. Takegami T. and Hotta S. (1989) In vitro synthesis of Japanese encephalitis virus (JEV) RNA: membrane and nuclear fractions of JEV-infected cells possess high levels of virus-specific RNA-polymerase activity. Virus Research. V.13, N4, P. 337-350.

163. Takegami T., Sakamuro D., Furukawa T. (1994) Japanese encephalitis virus nonstructural protein NS3 has RNA binding and ATPase activity. Virus Genes, V. 9, №2, P. 105112.

164. Tan B-H., Fu J., Sugrue R.J., Yap E.-H., Chan Y-C., Tan Y.H. (1996) Recombinant Dengue 1 virus NS5 protein expressed in Escherichia coli exhibits RNA-dependent RNA polymerase activity. Virology, V. 216, P. 317-325.

165. Tang D., DeVit M., Johnston S.A. (1992) Genetic immunization is a simple method for eliciting an immune response. Nature, V. 356, P. 152-154.

166. Taubes G. (1997) Salvation in a snippet of DNA? Science, V. 278, P. 1711-1714.

167. Teo K.F. and Wright P.J. (1997) Internal proteolysis of the NS3 protein specified by dengue virus 2. Journal of General Virology, V. 78, Pt.2, P. 337-341.

168. Thomas D.B. (1993) Viruses and the cellular immune response. New York, Basel, Hong Kong.

169. Tighea H., Corra M., Romanb M. and Raz E. (1998) Gene vaccination: plasmid DNA is more than just a blueprint. Immunology Today, V. 19, P. 89-97.

170. Towbin H., Staehelin T. and Gordon J. (1979) Electrophoretic transfer of proteins from Polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, V. 76, P. 4350-4354.

171. Treib J., Haass A., Mueller-Lantzsch N., Ehrfeld H., Mueller-Rheiland D., Woessner R., Holzer G., Schimrigk A.(1996) Tick-borne encephalitis in the Saarland and the Rhineland-Palalinate. Infection, V. 24, № 3, P. 242-244.

172. Trepo C., Vierling J., Zeytin F.N/, Gerlich W.H. (1997) The first Flaviviridae symposium Intervirology, V. 40, P. 279-288.

173. Ulmer J.B. (1997) Elegantly presented DNA vaccines. Nature biotechnology, V. 15, P. 842-843.

174. Vorndam V., Mathews J.H., Barrett A.D.T. (1993) Molecular and biological characterization of a non-glycosylated isolate of Saint Louis encephalitis virus. Journal of General Virology, V. 74, P. 2653-2660.

175. Warrener P. and Collet M.S. (1995). Pestivirus NS3 protein posseesses RNA helicase activity. Journal of Virology, V. 69, N3, P. 1720-1726.

176. Wengler G. and Wengler G. (1993) The NS3 nonstructural protein of flaviviruses contains an RNA triphosphotase activity. Virology, V. 197, P. 265-273.

177. Westaway E.G. (1980) Replication of flaviviruses. In: "The Togaviruses" (Ed. R.W. Schlesinger). Academic Press, New York, P. 531-583.

178. Winegar R.A., Monforte J.A., Suing K.D. (1996) Determination of tissue distribution of *an intramuscular plasmid vaccine using PCR- and" in situ DNA hybridization. Hum. Gene Ther., V. 7, P. 2185-2194.

179. Winkler G., Heinz F., Kunz C. (1987) Characterization of a disulfide bridge-stabilized antigenic domain of the TBEV structural glycoprotein. Virology, V. 159, N1, P. 237243.

180. Winkler G., Maxwell S.E., Ruemmler Ch., Stollar V. (1989) Newly synthesized Dengue-2 virus nonstructural protein NS1 is a soluble protein but becomes partially hydrophobic and membrane-associated after dimerization. Virology, V. 171, N1, P. 302-305.

181. Wolff J.A., Malone R.W., Williams P. (1990) Direct gene transfer into mouse muscle in vivo. Science, V. 247, P. 1465-1468.

182. Wolff J.A., Dowty M.E., Jiao S. (1992) Expression of naked plasmids by culturedmyotubcs and entry of plasniids into T tubules and caveolae of mammalian sceletal muscle. Journal of Cellular Science, V. 103, P. 1249-1259.

183. Wong S.Y., Ho K.S., Mason H.S., Arntzen C.J. (1998) Edible vaccines. Science and Medicine, V. 36, P. 36-45.

184. Xie H., Cass A.R., Barrett A.D. (1998) Yellow fever 17D vaccine virus isolated from healthy vaccinees accumulates very few mutations. Virus Research, V. 55, N1, P. 9399.

185. Xiong S., Gerloni M., Zanetti M. (1997) In vivo role of B lymphocytes in somatic transgene immunization. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, V. 94, P. 6352-6357.

186. Yakubov L.A., Deeva E.A., Zarytova V.F., Vlassov V.V. (1989) Mechanism ofoligonucleotide uptake by cells: involvement of specific receptors? Proc. Natl. Acad.

187. Sci. USA, V.86, P. 6454-6458.

188. Yamshchikov V.F. and Compans R.W. (1994) Processing of the intracellular form of the West Nile virus capsid protein by the viral NS2B-NS3 protease: an in vitro study. -Journal of Virology, V. 68, № 9, P. 5765-5771.

189. Yansura D.G. and Henner D.J. (1984) Use of the Escherichia coli lac repressor and operator to control gene expression in Bacillus subtilis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, V. 81, P. 439-443.

190. Yates J.L., Warren N., Sugden B. (1985) Stable replication of plasmid derived from Epstein-Barr virus in various mammalian cells. Nature, V. 313, P. 812-815.

191. Yatsuhashi H., Inokuchi K., Inoke 0., Matsumura N., Koga M., Kosakai Y. and Yauo M. (1993) The clinical significance of reactivity to individual epitopes of hepatitis C viralgenome. Gastroenterologia Japonica, V, 28, № 5, P. 6-11.

192. Zeng L., Falgout B. And Markoff L. (1998) Identification of specific nucleotide sequences within the conserved 3'-SL in the dengue type 2 virus genome required for replication. Journal of Virology, V. 72, № 9, P. 7510-7522.

193. Zhang F., Andereassen P., Fender P., Geissler E., Hernandez J.-P. and Chroboczek J. (1999) A transfecting peptide derived from adenovirus fiber protein. Gene Therapy, V. 6, №2, P. 171-181.

194. Zhu N., Liggitt T., Liu Y., Debs R. (1993) Systemic gene expression after intravenous DNA delivery into adult mice. Science, V.261, P. 209-211.