Иммуномодулирующее действие внеклеточных дезоксирибонуклеиновых кислот тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.04, кандидат биологических наук Черепанова, Анна Витальевна

• Черепанова, Анна Витальевна
• кандидат биологических наук
• 2013

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Черепанова, Анна Витальевна

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Иммуностимулирующие эффекты нуклеиновых кислот

1.2. Активация врожденного иммунитета олигонуклеотидами

1.3. Паттерн-распознающие рецепторы нуклеиновых кислот

1.3.1. Toll-like рецепторы

1.3.2. RIG-1-like рецепторы

1.3.3. NOD-like рецепторы

1.3.4. Рецепторы двуцепочечной ДНК

1.4. Внеклеточные нуклеиновые кислоты

1.4.1. Циркулирующие НК-содержащие комплексы

1.4.2. Связанные с поверхностью клеток нуклеиновые кислоты

1.4.3. Происхождение и состав циркулирующих нуклеиновых кислот

1.4.4. Внеклеточные ДНК в норме и при патологиях

1.5. Роль эндогенных внеклеточных нуклеиновых кислот в активации иммунной системы человека

Глава 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

2.1. Реактивы и материалы

2.1.1. Реактивы

2.1.2. Олигонуклеотиды

2.1.3. Клетки и условия их культивирования

2.2. Методы

2.2.1. Гель-электрофорез нуклеиновых кислот и белков

2.2.2. Получение двуцепочечных олигонуклеотидов

2.2.3. Получение и очистка 32Р-меченых олигонуклеотидов

2.2.4. Исследование стабильности олигонуклеотидов при инкубации с культивируемыми клетками

2.2.5. Получение фракций, содержащих внеклеточные ДНК

2.2.6. Выделение ДНК из клеточных фракций и определение ее концентрации

2.2.7. Выделение геномной ДНК и получение фрагментированной геномной 45 ДНК

2.2.8. Анализ содержания бактериального эндотоксина в реагентах, 46 контактирующих с клетками

2.2.9. Стимуляция клеток под действием свободных и 46 трансфицированных НК

2.2.10. Количественный анализ жизнеспособности клеток

2.2.11. Иммуноферментное определение концентрации интерлейкинов

2.2.12. Получение меченой родамином ро!у(1:С) (ро1у(1:С)-11Ь)

2.2.13. Приготовление слайдов и микроскопия

2.2.14. Выделение РНК из клеток

2.2.15. Реакция обратной транскрипции

2.2.16. Полимеразная цепная реакция

2.2.17. Получение клеточных фракций

2.2.18. Ступенчатое фракционирование белков мембранно-цитозольного 51 экстракта сульфатом аммония

2.2.19. Формирование комплексов ОДН с белками экстрактов клеток с ^ последующей задержкой олигонуклеотид-содержащих комплексов в геле при электрофорезе (ЕМ8А)

2.2.20. Определение величин констант диссоциации (Кй) олигонуклеотид- ^ белковых комплексов

2.2.21. Выделение олигонуклеотид-связывающих белков

2.2.22. Масс-спектрометрия

2.2.23. Изготовление конъюгата антител с пероксидазой хрена

2.2.24. Идентификация взаимодействующих с ОДН белков мембранно- 54 цитозольного экстракта при помощи Вестерн-блот гибридизации

2.2.25. Статистика

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ЭКСПЕРИМЕНТОВ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Клетки для исследования иммуномодулирующего действия ДНК и ^ условия их культивирования

3.1.1. Условия культивирования клеток

3.1.2. Экспрессия ТЫ19 в ШУЕС и ОБ

3.2. Исследование шшуномодулирущего действия ДНК различного происхождения

3.2.1. Влияние очищенных препаратов ДНК и олигодезоксирибонуклеотидов 62 на продукцию провоспалительных интерлекинов первичными фибробластами и эндотелиоцитами

3.2.2. Влияние ДНК на активацию клеток под действием ро1у(1:С) или ЛПС

3.2.3. Олигодезоксирибонуклеотиды сиквенс-специфично ингибируют 69 ро1у(1:С)-индуцированный иммунный ответ

3.2.4. Влияние ДНК на транспорт ро1у(1:С) в клетки

3.2.5. Олигодезоксирибонуклеотиды ингибируют ро1у(1:С)-индуцированную 76 продукцию интерлейкинов после липофекции

3.2.6. Олигодезоксирибонуклеотиды ингибируют ро1у(1:С)-индуцированную 79 экспрессию мРНК генов, активируемых при воспалении

3.3. Поиск клеточных белков - мишеней иммуномодулирующих олигонуклеотидов

3.3.1. Связывание олигодезоксирибонуклеотидов с белковыми факторами 83 живых клеток и клеточных экстрактов

3.3.2. Выделение и идентификация олигонуклеотид-связывающих белков

3.3.3. Ки белок как основная мишень иммуномодулирующих ДНК

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Иммуномодулирующее действие внеклеточных дезоксирибонуклеиновых кислот»

В соответствии с современными представлениями эндогенные нуклеиновые кислоты (НК) иммунологически инертны и не вызывают иммунных реакций в физиологически нормальном состоянии у млекопитающих. Однако, при определенных условиях «неузнавание» нуклеиновых кислот иммунной системой может быть нарушено, в результате чего в крови больных появляются антитела против эндогенных нуклеиновых кислот и их комплексов. Общеизвестными примерами аутоиммунных заболеваний, при которых собственная ДНК выступает аутоантигеном, являются системная красная волчанка и ревматоидный артрит.

В отличие от эндогенных НК вирусные и бактериальные НК активируют врожденный иммунитет млекопитающих, взаимодействуя с паттерн-распознающими рецепторами (РШ^). Врожденный иммунитет является эволюционно более ранним и консервативным механизмом защиты, направлен на узнавание общих структур патогенов и активирует развитие адаптивного иммунного ответа. Распознавание экзогенных нуклеиновых кислот РШ^ осуществляется за счет специфических химических и структурных особенностей, характерных для вирусных и бактериальных ДНК и РНК. К числу таких особенностей относятся преимущественное содержание неметилированных цитозинов в составе СрС динуклеотидов бактериальной ДНК и двуцепочечная структура вирусных РНК. Однако, в отличие от специфических структурных компонентов иммуногенов, таких как липид А или О-антиген бактериального липополисахарида, структура эндогенных, иммунологически инертных и прокариотических иммуностимулирующих нуклеиновых кислот отличается незначительно, а сигналом для активации иммунной системы служит нетипичная локализация нуклеиновых кислот, например, присутствие дцДНК в цитоплазме. Одним из примеров неканонической локализации нуклеиновых кислот является их присутствие во внеклеточной среде, где они могут появляться в результате процессов некроза, апоптоза и активной секреции клетками и находятся в свободной форме, в составе нуклеопротеиновых комплексов и мембранных структур, или в составе комплексов, связанных с поверхностью клеток. В норме концентрация НК во внеклеточной среде невысока, они быстро деградируют и элиминируются из биологических жидкостей, однако ряд патологий сопровождается ростом концентрации внеклеточных нуклеиновых кислот, что может приводить к образованию нехарактерных низкоаффинных комплексов, неканонической внутриклеточной локализации НК и индукции иммунных реакций. С другой стороны, внеклеточные НК в норме могут конкурировать с экзогенными НК модулируя их действие на иммунокомпетентные клетки. Исследование роли внеклеточных ДНК в реакциях врожденного иммунитета позволит установить их значение для нормального функционирования организма и развития иммунопатологических состяний, сопровождающихся повышенным уровнем внеклеточных нуклеиновых кислот. Представленная работа посвящена исследованию иммуномодулирующих эффектов внеклеточных дезоксирибонуклеиновых кислот, а также поиску потенциальных мишеней внеклеточных ДНК в клетках, взаимодействие с которыми опосредует их иммуномодулирующее действие.

Таким образом, целью работы является исследование иммуномодулирующего действия внеклеточных дезоксирибонуклеиновых кислот и поиск клеточных мишеней иммуномодулирующей ДНК.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

- исследовать влияние геномной и внеклеточной ДНК на продукцию провоспалительных интерлейкинов клетками, участвующими в генерации врожденного иммунного ответа;

- исследовать костимулирующее действие ДНК с лигандами ТЬЮ и ТЫ14 - ро1у(1:С) и липополисахарида (ЛПС), а также его зависимость от внутриклеточной локализации ДНК и костимуляторных сигналов;

- провести поиск потенциальных клеточных мишеней иммуномодулирующих ДНК при помощи выявления и идентификации белков, формирующих прочные комплексы с иммуномодулирующими олигодезоксирибонуклеотидами (ОДН).

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Черепанова, Анна Витальевна

Выводы

1. Свободные от эндотоксина очищенные препараты бактериальных и эндогенных ДНК (геномной, свободной внеклеточной и связанной с поверхностью клеток), а также одно- и двуцепочечные олигодезоксирибонуклеотиды различной последовательности (свободные и в комплексах с трансфицирующими реагентами) не активируют продукцию провоспалительных интерлейкинов ИЛ-6 и ИЛ-8 в первичных эндотелиоцитах и фибробластах в широком диапазоне концентраций, несмотря на экспрессию в клетках рецептора Т1Л9.

2. ДНК не влияют на ЛПС-индуцированную секрецию провоспалительных интерлейкинов, однако ингибируют ро1у(1:С)-индуцированную секрецию ИЛ-6 и ИЛ-8. Ингибирующее действие ДНК не связано с метилированием СрС пар и зависит от степени фрагментации ДНК. Внеклеточная ДНК, связанная с поверхностью клеток, является более эффективным ингибитором ро1у(1:С)-индуцированной секреции провоспалительных интерлейкинов по сравнению с геномной и свободной внеклеточной ДНК.

3. Добавленные в культуральную среду или трансфицированные в клетки одноцепочечные и двуцепочечные олигодезоксирибонуклеотиды ингибируют ро1у(1:С)-индуцированную секрецию интерлейкинов, а также экспрессию их генов. Эффективность ингибирования зависит как от последовательности, так и от концентрации олигонуклеотидов и не связана с ингибированием транспорта ро1у(1:С) в клетки.

4. Инкубация первичных эндотелиоцитов и их мембранно-цитозольных экстрактов с одноцепочечным и двуцепочечным ОДН14 (аналогами связанной с клеточной поверхностью ДНК) приводит к формированию нуклеопротеиновых комплексов с константами диссоциации 6 ± 0.8 х 10-10 М и 4 ± 0.5 х 10-10 М, соответственно. ОДН-связывающие белки были выделены из мембранно-цитозольного экстракта клеток и идентифицированы методом МАЦЛ-ТОБ масс-спектрометрии как белки Ки70 и Ки80. С помощью моноклональных антител к Ки70 показано, что Ки белок является основной клеточной мишенью иммуномодулирующих ОДН и, таким образом, может принимать участие в регуляции иммуномодулирующего действия ДНК.

Заключение

В представленной работе впервые проведено исследование иммуномодулирующего действия внеклеточных ДНК in vitro в культурах первичных эндотелиоцитов и фибробластов. Было показано, что ДНК из различных источников (бактериальная, геномная, свободная и связанная с поверхностью клеток внДНК) не активирует клетки, несмотря на экспрессию ДНК-распознающих рецепторов, в частности TLR9.

Отсутствие иммуностимулирующей активности эукариотической ДНК имеет важное биологическое значение, более того, эндогенная ДНК должна обладать иммуноингибирующим действием. Действительно, концентрация цирДНК может существенно возрастать при «стерильных» повреждениях, таких как травма, инфаркт, и, ингибирующие последовательности в составе цирДНК должны предотвращать активацию иммунных клеток. Обнаруженный эффект ингибирования ро1у(1:С)-индуцированной продукции провоспалительных медиаторов под воздействием ДНК из различных источников свидетельствует о возможной роли цирДНК в регуляции неспецифического противовирусного иммунного ответа. Все исследованные препараты ДНК в той или иной степени обладают эффектом, который не зависит от CpG состава и статуса метилирования ДНК, однако зависит от длины и последовательности ДНК. Наиболее эффективным ингибитором ро1у(1:С)-индуцированного иммунного ответа является скпДНК, что свидетельствует о присутствии в ее составе специфических структур или последовательностей, обладающих более выраженным ингибирующим действием, по сравнению с фрагментированной геномной ДНК. Действительно, ранее было показано, что ДНК, связанная с поверхностью клеток отличается по своему составу от геномной ДНК [128]. Вероятно, повышенная концентрация определенных последовательностей в составе ДНК из трипсинового элюата клеток позволяет ДНК более эффективно связываться с клеточной поверхностью и далее взаимодействовать с внутриклеточными медиаторами иммунного ответа. Поскольку концентрация скпДНК, обладающей эффектом (100 нг/мл) близка к физиологической концентрации внеклеточных ДНК в крови человека (10-500 нг/мл), скпДНК может обладать эффектом не только in vitro, но и in vivo, регулируя противовирусный иммунный ответ.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Черепанова, Анна Витальевна, 2013 год

1. Akira, S., Uematsu, S., Takeuchi, O. Pathogen recognition and innate immunity // Cell. 2006. V. 124. P. 783-801.

2. Isaacs, A., Cox, R., Rotem, Z. Foreign nucleic acids as the stimulus to make interferon // Lancet. 1963y V. 7299. P. 113-116.

3. Rotem, Z., Cox, R., Isaacs, A. Inhibition of virus multiplication by foreign nucleic acid // Nature. 1963. V. 197. P. 564-566.

4. Field, A.K., Tytell, A.A., Lampson, G.P., Hilleman, M.R. Inducers of interferon and host resistance. II. Multistranded synthetic polynucleotide complexes // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1967. V. 58. P. 1004-1010.

5. Wang, Q., Carmichael, G. Effect of length and location on the cellular response to double-stranded RNA // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2004. V. 68. P. 423-452.

6. Krieg, A., Yi, A., Matson, S., Waldschmidt, T., Bishop, G., Teasdale, R., Koretxky, G., Klinman, D. CpG DNA motifs in bacterial DNA trigger B-cell activation // Nature. 1995. V. 374. P. 546-549.

7. Krieg, A.M. Mechanisms and applications of immune stimulatory CpG oligodeoxynucleotides /1 Biochim. Biophys. Acta. 1999. V. 1489. P. 107-116.

8. Hornung, V., Latz, E. Intracellular DNA recognition // Nature Rev. Immunol. (2010) V. 10. P. 123-130.

9. Bortoluci, K., Medzhitov, R. Control of infection by pyroptosis and autophagy: role ofTLR and NLR // Cell. Mol. Life Sci. 2010. V. 67. P. 1643-1651.

10. Krieg, A. CpG motifs in bacterial DNA and their immune effects // Annu. Rev. Immunol. 2002. V. 20. P. 709-760.

11. Stein, C., Subasinghe, C., Shinozuka, K., Cohen, J. Phisico-chemical properties of phosphorothioate oligodeoxynucleotides. // Nucleic Acid Res. 1988. V. 16. P. 3209-3221.

12. Suzuki, K., Mori, A., Ishii, K.J., Saito, J., Singer, D.S., Klinman, D.M., Krause, P.R., Kohn, L.D. Activation of target-tissue immune-recognition molecules by double-stranded polynucleotides // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1999. V. 96. P. 2285-2290.

13. Krieg, A., Wu, T., Weeranta, R., Efler, S., Love-Homan, L., Yang, L., Yi, A., Short, D., Davis, H. Sequence motifs in adenoviral DNA block immune activation by stimulatory motifs II Microbiology. 1998. V. 95. P. 12631-12636.

14. Pisetsky, D., Reich, C. Inhibition of murine macrophage IL-12 production by natural and synthetic DNA // Clin. Immunol. 2000. V. 96. P. 198-204.

15. Lenert, P., Rasmussen, W., Ashman, R., Ballas, Z. Structural characterization of the inhibitory DNA motif for the type A(D)-CpG-induced cytokine secretion and NK-cell lytic activity in mouse spleen cells // DNA Cell. Biol. 2003. V. 22. P. 621-631.

16. Peter, M., Bode, K., Lipford, G., Eberle, F., Heeg, K., Dalpke, A. Characterization of suppressive oligodeoxynucleotides that inhibit Toll-like receptor-9-mediated activation of innate immunity // Immunology. 2007. V. 123. P. 118-128.

17. Gursel, I., Gursel, M., Yamada, H., Ishii, K., Takeshita, F., Klinman, D. Repetitive elements in mammalian telomeres suppress bacterial DNA-induced immune activation // J. Immunol. 2003. V. 171. P. 1393-1400.

18. Krieg, A. Development ofTLR9 agonists for cancer therapy II J. Clin. Invest. 2007. V. 117. P.1184-1194.

19. Akira, S., Takeda, K. Toll-like receptor signaling // Nat. Rev. Immunol. 2004. V. 4. P. 499-511.

20. Jin, M.S., Kim, S.E., Heo, J.Y., Lee, M.E., Kim, H.M., Paik, S.G., Lee, H., Lee, J.O. Ciystal structure of the TLR1-TLR2 heterodimer induced by binding of a tri-acylated lipopeptide // Cell. 2007. V. 130. P. 1071-1082.

21. Guan, Y., Ranoa, D.R., Jiang, S., Mutha, S.K., Li, X., Baudry, J., Tapping, R.I. Human TLRs 10 and 1 share common mechanisms of innate immune sensing but not signaling I I J. Immunol. 2010. V. 184. P. 5094-5103.

22. Park, B.S., Song, D.H., Kim, H.M., Choi, B.S., Lee, H., and Lee, J.O. The structural basis of lipopolysaccharide recognition by the TLR4-MD-2 complex // Nature. 2009. V. 458. P.1191-1195.

23. Hayashi, F., Smith, K.D., Ozinsky, A., Hawn, T.R., Yi, E.C., Goodlett, D.R., Eng, J.K., Akirak, S., Underbill, D.M., Aderem, A. The innate immune response to bacterial flagellin is mediated by Toll-like receptor 5 // Nature. 2001. V. 410. P. 1099-1103.

24. Alexopoulou, L., Holt, A., Medzhitov, R., Flavell, R. Recognition of double-stranded RNA and activation ofNF-kappaB by Toll-like receptor 3 // Nature. 2001. V. 413. P. 732-738.

25. Matsumoto, M., Kikkawa, S., Kohase, M., Miyake, K., Seya, T. Establishment of a monoclonal antibody against human Toll-like receptor 3 that blocks double-stranded RNA-mediated signaling II Biochem. Biophysl. Res. Commun. 2002. V. 293. P. 1364-1396.

26. Matsumoto, M., Funami, K., Oshiumi, H., Seya, T. Toll-like receptor 3: a link between Toll-like receptors, interferon and viruses // Microbiol. Immunol. 2004. V. 48. P. 147-154.

27. Liu, L., Botos, I., Wang, Y., Leonard, J.N., Shiloach, J., Segal, D.M., Davies, D.R. Structural basis of toll-like receptor 3 signaling with double-stranded RNA // Science. 2008. V. 320. P. 379-381.

28. Heil, F., Hemmi, H., Hochrein, H., Ampenberger, F., Kirschning, С., Akira, S., Lipford, G., Wagner, H., Bauer, S. Species-specific recognition of single-stranded RNA via toll-like receptor 7 and 8 // Science. 2004. V. 303. P. 1526-1529.

29. Karikô, К., Buckstein, M., Ni, H., Weissman, D. Suppression of RNA recognition by Tolllike receptors: the impact of nucleoside modification and the evolutionary origin of RNA // Immunity. 2005. V. 23. P. 165-175.

30. Krieg, A., Vollmer, J. Toll-like receptors 7, 8, and 9: linking innate immunity to autoimmunity // Immunol. Rev. 2007. V. 220. P. 251-269.

31. Takeuchi, O., Itagaki, S., Kumar, N. Toll-like receptor 9 mediates innate immune activation by the malaria pigment hemozoin I I J. Exp. Med. 2005. V. 201. P. 19-25.

32. Ewaschuk, J., Backer, J., Churchill, T., Obermeier, F., Krause, D., Madsen, К. 2007. Surface expression of Toll-like receptor 9 is upregulated on intestinal epithelial cells in response to pathogenic bacterial DNA // Infect. Immun. V. 75. P. 2572-2579.

33. Rutz, M., Metzger, T., Geliert, T., Luppa, P., Lipford, G., Wagner, H., Bauer, S. Toll-like receptor 9 binds single-stranded CpG-DNA in a sequence- and pH-dependent manner // Eur. J. Immunol. 2004. V. 34. P. 2541-2550.

34. Kim, Y.M., Brinkmann, M.M., Paquet, M.E., and Ploegh, H.L. UNC93B1 delivers nucleotide-sensing toll-like receptors to endolysosomes // Nature. 2008. V., 452. P. 234-238.

35. Lamphier, M., Sirois, C., Verma, A., Golenbock, D., Latz, E. TLR9 and the recognition of self and non-self nucleic acids. Ann. N. Y. Acad. Sei. 2006. V. 1082. P. 31-43.

36. Черепанова, A.B., Тамкович, C.H., Власов, B.B., Лактионов, П.П. Активность дезоксирибонуклеаз крови в норме и при патологии // Биомед. Хим. 2007. V. 53. Р. 488-496.

37. Lee, H.K., Lund, J.M., Ramanathan, B., Mizushima, N., and Iwasaki, A. Autophagy-dependent viral recognition by plasmacytoid dendritic cells // Science. 2007. V. 315. P. 1398-1401.

38. Kagan, J.C., Medzhitov, R. Phosphoinositide-mediated adaptor recruitment controls Tolllike receptor signaling // Cell. 2006. V. 125. P. 943-955.

39. Takeuchi, O., Akira, S. Pattern recognition receptors and inflammation // Cell. 2010. V. 140. P. 805-820.

40. Xia, Z.P., Sun, L., Chen, X., Pineda, G., Jiang, X., Adhikari, A., Zeng, W., Chen, Z.J. Direct activation of protein kinases by imanchored polyiibiquitin chains // Nature. 2009. V. 461. P. 114-119.

41. Kagan, J.C., Su, T., Horng, T., Chow, A., Akira, S., Medzhitov, R. TRAM couples endocytosis of Toll-like receptor 4 to the induction of interfer on-bet a // Nat. Immunol.2008. V. 9. P. 361-368.

42. Pobezinskaya, Y.L., Kim, Y.S., Choksi, S.,Morgan,M.J., Li, T., Liu, C., Liu, Z. The function of TRADD in signaling through tumor necrosis factor receptor I and TRIF-dependent Toll-like receptors II Nat. Immunol. 2008. V. 9. P. 1047-1054.

43. Annane, D., Bellissant, E., Cavaillon, J.M. Septic shock // Lancet. 2005. V. 365. P. 63-78.

44. Kobayashi, K., Hernandez, L.D., Galán, J.E., Janeway, C.A., Medzhitov, R., Flavell, R.A. IRAK-M is a negative regulator of Toll-like receptor signaling II Cell. 2002. V. 110. P. 191-202.

45. Préle, C.M., Woodward, E.A., Bisley, J., Keith-Magee, A., Nicholson, S.E., Hart, P.H. SOCS1 regulates the IFNbut not NFkappaB pathway in TLR-stimulated human monocytes and macrophages // J. Immunol. 2008. V. 181. P. 8018-8026.

46. Wald, D., Qin, J., Zhao, Z., Qian, Y., Naramura, M., Tian, L., Towne, J., Sims, J.E., Stark, G.R., Li, X. SIGIRR, a negative regulator of Toll-like receptor-interleukin 1 receptor signaling II Nat. Immunol. 2003. V. 4. P. 920-927.

47. Zhang, Y.B., He, F.L., Fang, M., Hua, T.F., Hu, B.D., Zhang, Z.H., Cao, Q., Liu, R.Y. Increased expression of Toll-like receptors 4 and 9 in human lung cancer // Mol. Biol. Rep. 2009. V. 36. P. 1475-1481.

48. Hedayat, M., Takeda, K., Rezaei, N. Prophylactic and therapeutic implications of toll-like receptor ligands // Med. Res. Rev. 2012. V. 32. P. 294-325.

49. Takeuchi, O., Akira, S. Innate immunity to virus infection // Immunol. Rev. 2009. V. 227. P. 75-86.

50. Okabe, Y., Sano, T., Nagata, S. Regulation of the innate immune response by threonine-phosphatase of Eyes absent // Nature. 2009. V. 460. P. 520-524.

51. Michallet, M.C., Meylan, E., Ermolaeva, M.A., Vazquez, J., Rebsamen, M., Curran, J., Poeck, H., Bscheider, M., Hartmann, G., König, M., Kalinke, U., Pasparakis, M., Tschopp,

52. J. TRADD protein is an essential component of the RIG-like helicase antiviral pathway // Immunity. 2008. V. 28. P. 651-661.

53. Ishikawa, H., Barber, G.N. STING is an endoplasmic reticulum adaptor that facilitates innate immune signalling I I Nature. 2008. V. 455. P. 674-678.

54. Franchi, L., Warner, N., Viani, K., Nunez, G. Function of Nod-like receptors in microbial recognition and host defense // Immunol. Rev. 2009. V. 227. P. 106-128.

55. Ting, J.P., Duncan, J.A., Lei, Y. How the noninflammasome NLRs function in the innate immune system // Science. 2010. V. 327. P. 286-290.

56. Sabbah, A., Chang, T.H., Harnack, R., Fröhlich, V., Tominaga, K., Dube, P.H., Xiang, Y., Bose, S. Activation of innate immune antiviral responses by Nod2 // Nat. Immunol. 2009. V. 10. P. 1073-1080.

57. Stetson, D.B., Medzhitov, R. Recognition of cytosolic DNA activates an IRF3-dependent innate immune response 11 Immunity. 2006. V. 24. P. 93-103.

58. Chiu, Y.H., Macmillan, J.B., Chen, Z.J. RNA polymerase III detects cytosolic DNA and induces type I interferons through the RIG-I pathway 11 Cell. 2009. V. 138. P. 576-591.

59. Ablasser, A., Bauernfeind, F., Hartmann, G., Latz, E., Fitzgerald, K.A., Hornung, V. RIG-I-dependent sensing of poly(dA:dT) through the induction of an RNA polymerase Ill-transcribed RNA intermediate // Nat. Immunol. 2009. V. 10. P. 1065-1072.

60. Zaros, C., Thuriaux, P. Rpc25, a conserved RNA polymerase III subunit, is critical for transcription initiation // Mol. Microbiol. 2005. V. 55. P. 104-114.

61. Muruve, D.A., Petrilli, V., Zaiss, A.K., White, L.R., Clark, S.A., Ross, P.J., Parks, R.J., Tschopp, J. The inflammasome recognizes cytosolic microbial and host DNA and triggers an innate immune response // Nature. 2008. V. 452. P. 103-107.

62. Fernandes-Alnemri, Т., Yu, J.W., Datta, P., Wu, J., Alnemri, E.S. AIM2 activates the inflammasome and cell death in response to cytoplasmic DNA // Nature. 2009. V. 458. P. 509-513.

63. Hornung, V., Ablasser, A., Charrel-Dennis, M., Bauernfeind, F., Horvath, G., Caffrey, D.R., Latz, E., Fitzgerald, K.A. AIM2 recognizes cytosolic dsDNA and forms a caspase-1-activating inflammasome withASC// Nature. 2009. V. 458. P. 514-518.

64. Pawlotsky, J.M., Bastie, A., Lonjon, I. What technique should be used for routine detection and quantification of HBV DNA in clinical samples? // J. Virol. Methods. 1997. V. 65. P. 245-253.

65. Silva, J.M., Dominguez, G., Garcia, J. Presence of tumor DNA in plasma of breast cancer patients: clinicopathological correlations // Cancer Res. 1999. V. 59. P. 3251-3256.

66. Sozzi, G., Conte, D., Mariani, L., Vullo S., Roz, L., Lombardo, C., Pierotti, M., Tavecchio, L. Analysis of circulating tumor DNA in plasma at diagnosis and during follow-up of lung cancer patients // Cancer Res. 2001. V. 61. P. 4675-4678.

67. Holdenrieder, S., Stieber, P., Bodenmüller, H., Busch, M., Von Pawel, J., Schalhorn, A., Nagel, D., Seidel, D. Circulating nucleosomes in serum // Ann. N. Y. Acad. Sei. 2001. V. 945. P. 93-102.

68. Holdenrieder, S., Stieber, P., Chan, L.Y., Geiger, S., Kremer, A., Nagel, D., Lo, Y.M. Cellfree DNA in serum and plasma: comparison of ELISA and quantitative PCR // Clin. Chem. 2005. V. 51. P. 1544-1546.

69. Holdenrieder, S., Stieber, P., Bodenmüller, H., Fertig, G., Fürst, H., Schmeller, N., Untch, M., Seidel, D. Nucleosomes in serum as a marker for cell death // Clin. Chem. Lab. Med. 2001. V. 39. P. 596-605.

70. Chelobanov, B.P., Laktionov, P.P., Vlasov, V.V. Proteins involved in binding and cellular uptake of nucleic acids I I Biochemistry (Mose). 2006. V. 71. P. 583-596.

71. Zhang, W., Wu, J., Qiao, В., Xu, W., Xiong, S. Amelioration of lupus nephritis by serum amyloid P component gene therapy with distinct mechanisms varied from different stage of the disease // PLoS One. 2011 V. 6. P. e22659.

72. Radic, M., Herrmann, M., van der Viag, J., Rekvig, O.P. Regjdatoiy and pathogenetic mechanisms of autoantibodies in SLE // Autoimmunity. 2011. V. 44. P. 349-356.

73. Krasnorutskii, M.A., Buneva, V.N., Nevinsky, G.A. DNase, RNase, and phosphatase activities of antibodies formed upon immunization by DNA, DNase I, and DNase II // Biochemistry (Mose). 2011. V. 76. P. 1065-1072.

74. Mathivanan, S., Ji, H., Simpson, R.J. Exosomes: extracellular organelles important in intercellular communication //J Proteomics. 2010. V. 73. P. 1907-1920.

75. Fietta, P. Many ways to die: passive and active cell death styles // Riv. Biol. 2006 .V. 99. P. 69-83.

76. Vlassov, V.V., Laktionov, P.P., Rykova, E.Y. Extracellular nucleic acids // Bioessays. 2007. V. 29. P. 654-667.

77. Juckett, D.A., Rosenberg, B. Actions of cis-diamminedichloroplatinum on cell surface nucleic acids in cancer cells as determined by cell electrophoresis techniques // Cancer Res. 1982. V. 42. P. 3565-3573.

78. Belyaev, N.D., Budker, V.G., Dubrovskaya, V.A., Khristoljubova, N.B., Kiseleva, E.V., Matveeva, N.M., Sukojan, M.A. Membrane-mediated changes in the structure of chromosomes // Chromosoma. 1985. V. 92. P. 193-199.

79. Aggarwal, S.K., Wagner, R.W., McAllister, C.K., Rosenberg, B. Cell-surface-associated nucleic acid in tumorigenic cells made visible with platinum-pyrimidine complexes by electron microcopy // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1975. V. 72. P. 928-932.

80. Chan, T.M., Frampton, G., Cameron, J.S. Identification of DNA-bindingproteins on human umbilical vein endothelial cell plasma membrane // Clin. Exp. Immunol. 1993. V. 91. P. 110-114.

81. Frampton, G., Hobby, P., Morgan, A., Staines, N.A., Cameron, J.S. A role for DNA in anti-DNA antibodies binding to endothelial cells // J. Autoimmun. 1991. V. 4. P. 463-478.

82. Irache, J.M., Merodio, M., Arnedo, A., Camapanero, M.A., Mirshahi, M., Espuelas, S. Albumin nanoparticles for the intravitreal delivery of anticytomegaloviral drugs // Mini Rev. Med. Chem. 2005. V. 5. P. 293-305.

83. Bergsmedh, A., Ehnfors, J., Kawane, K., Motoyama, N., Nagata, S., Holmgren, L. DNase II and the Chkl DNA damage pathway form a genetic barrier blocking replication of horizontally transferred DNA // Mol. Cancer Res. 2006. V. 4. P. 187-195.

84. Mal'shakova, V.S., Pyshnyi, D.V., Bondar, A.A., Vlassov, V.V., Laktionov, P.P. Isolation and sequencing of short cell-surface-bound DNA // Ann. N. Y. Acad. Sci. 2008. V. 1137. P. 47-50.

85. Raptis, L., Menard, H. Quantitation and characterization of plasma DNA in normals and patients with systemic lupus erythematosus // J. Clin. Invest. 1980. V. 66. P. 1391-1399.

86. Pisetsky, D., Fairhurst, A. The origin of extracellular DNA during the clearance of dead and dying cells // Autoimmunity. 2007. V. 40. P. 281-284.

87. Su, K.Y., Pisetsky, D.S. The role of extracellular DNA in autoimmunity in SLE // Scand. J. Immunol. 2009. V. 70. P. 175-183.

88. Kolodny, G., Culp, L., Rosenthal, L. Secretion of RNA by normal and transformed cells II Experimental Cell. Res. 1972. V. 73. P. 65-72.

89. Stroun, M., Anker, P., Beljanski, M., Henri, J., Lederrey, C., Ojha, M., Maurice, P. Presence of RNA in the nucleoprotein complex spontaneously released by human lymphocytes andfrog auricles in culture // Cancer Res. 1978. V. 38. P. 3546-3554.

90. Anker, P., Stroun, M., Maurice, P. Spontaneous Extracellular synthesis of DNA released by human blood lymphocytes // Cancer Res. 1976. V. 36. P. 2832-2839.

91. Morozkin, E.S., Babochkina, T.I., Vlassov, V.V., Laktionov, P.P. The effect of protein transport inhibitors on the production of extracellular DNA 11 Ann. N. Y. Acad. Sei. 2008. V. 1137. P. 31-35.

92. Beck, J., Urnovitz, H.B., Riggert, J., Clerici, M., Schütz, E. Profile of the circulating DNA in apparently healthy individuals I I Clin. Chem. 2009. V. 55. P. 730-738.

93. Valgardsdottir, R., Chiodi, I., Giordano, M., Rossi, A., Bazzini, S., Ghigna, C., Riva, S., Biamonti, G. Transcription of Satellite III non-coding RNAs is a general stress response in human cells // Nucleic Acids Res. 2008. V. 36. P. 423-434.

94. Kopreski, М., Vorhees, С., Zhang, J. Detection of tumor mRNA in the serum of patients with malignant melanoma // Clin. Cancer Res. 2001. V. 36. P. 6584-6588.

95. Chen, X., Deshusses, J., Cattaneo, A., Henri, J. Telomerase RNA as a detection marker in the serum of breast cancer patients // Clin. Cancer. Res. 2006. V. 56. P. 3823-3826.

96. Dasi, L. Lam K., Chan, K., Luk, J. Real-time quantification in plasma of human telamerase reverse transcription mRNA: a simple blood test to monitor disease in cancer patients // Lab. Invest. 2001. V. 6. P. 3823-3829.

97. Silva, J., Pandey, S., Walker, P. Detection of epithelial mRNA in the plasma of breast cancer patients is associated with poor prognosis tumor characteristics // Clin. Cancer Res. 2001. V. 7. P. 282-295.

98. Lo, K., Lo, Y., Leung, S., Tsang, Y., Chan, L., Johnson, P., Hjelm, N., Lee, J., Huang, D. Analysis of cell-free epshtein Bar virus assosiated RNA in the plasma of patients nonsopharingeal carcinoma // Clin. Chem. 1999. V. 59. P. 3251-3566.

99. Calvet, J., Pederson, T. Secondary structure of heterogenous nuclear DNA: two classes of double-stranded RNA in native ribonucleoprotein // Proc. Nat. Acad. Sei. 1977. V. 74. P. 3705-3709.

100. Kumar, M., Carmichael, G. Antisense RNA: function and fate of duplex RNA in cells of higher eukaryotes // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 1998. V. 62. P. 1415-1434.

101. Medzhitov, R. Recognition of microorganisms and activation of the immune response // Nature. 2007. V. 449. P. 819-826.

102. Rifkin, I., Leadbetter, E., Busconi, L., Viglianti, G., Marshak-Rothstein, A. Toll-like receptors, endogenous ligands, and systemic autoimmune disease // Immunol. Rev. 2005. V. 204. P. 27-42.

103. Napirei, M., Holger, K., Zevnik, В., Stephan, H., Mannherz, H., Moroy, T. Features of systemic lupus erythematosus in DNAsel deficient mice // Nature. 2000. V. 25. P. 177181.

104. Huck, S., Deveaud, E., Namane, A., Zouali, M. Abnormal DNA methylation and deoxycytosine-deoxyguanine content in nucleosomes from lymphocytes undergoing apoptosis IIFASEB J. 1999. V. 13. P. 1415-1422.

105. Lunec, J., Herbert, K., Blount, S., Griffiths, H., Emery, P. 8-Hydroxydeoxyguanosine: a marker of oxidative DNA damage in systemic lupus erythematosus // FEBS J. 1994. V. 348. P. 131-138.

106. Pisetsky, D. The role of nuclear macromolecules in innate immunity II Proc. Am. Thorac. Soc. 2007. V. 4. P. 258-262.

107. Bell, D., Morrison, В., VandenBygaart, P. Immunogenic DNA-related factors // J. Clin. Invest. 1990. V. 85. P. 1487-1496.

108. Kariko, K., Ni, H., Capodici, J., Lamphier, M., Weissman, D. mRNA is an endogenous ligandfor Toll-like receptor 3II J. Biol. Chem. 2004. V. 279. P. 12542-12500.

109. Christensen, S., Kashgarian, M., Alexopoulou, L., Flavell, R., Akira, S., Shlomchik, M. Toll-like receptor 9 controls anti-DNA autoantibody production in murine lupus II J. Exp. Med. 2005. V. 202. P. 321-331.

110. Deng, G., Nilsson, I., Verdrengh, M., Collins, L., Tarkovsky, A. lntra-articularly localized bacterial DNA containing CpG motifs induce arthritis // Nature. 1999. V. 5. P. 702-705.

111. Wagner, H. The immunobiology of the TLR9 subfamily // Trends Immunol. 2004. V. 25. P. 381-386.

112. Pisetsky, D., Drayton, D., Wu, Z. Specificity of autoantibodies to bacterial DNA in the sera of healthy human subjects and patients with SLE/f J. Reumatol. 1999. V. 26. P. 1934-1938.

113. Ronaghy, A., Prakken, В., Takabayashi, K., Firestein, G., Boyle, D., Zvailfler, N., Roord, S., Albani, S., Carson, D., Raz, E. Immunostimiilatory DNA sequences influence the course of adjuvant arthritis // J. Immunol. 2002. V. 168. P. 51-56.

114. Jaffe, E.A., Nachman, R.L., Becker, C.G., Minick, C.R. Culture of human endothelial cells derived from umbilical veins. Identification by morphologic and immunologic criteria // J. Clin. Invest. 1973. V. 52. P. 2745-2756.

115. Schiigger, H. Tricine-SDS-PAGE // Nature Protocols. 2006. V. 1. P. 16-23.

116. Kovarik, A., Ondrkalova, M., Prachar, J., Stofko, J. Rapid and sensitive colloidal silver staining on cellulose acetate membranes // Clin. Chim. Acta. 1992. V. 208. P. 137-139.

117. Karran, P. Lindahl, T. Enzymatic excision of free hypoxanthine from polydeoxynucleotides and DNA containing deoxyinosine monophosphate residues // J. Biol. Chem. 1978. V. 253. P. 5877-5879.

118. Maniatis, Т., Fritsch, E.F., Sambrook, J. Molecular cloning. A laboratory manual. 2nd ed. // Cold Spring Harbor, N.Y. 1989.

119. Лактионов, П.П., Тамкович, C.H., Симонов, П.А., Рыкова, Е.Ю., Власов, В.В. Способ выделения дезоксирибонуклеиновых кислот // Патент на изобретение № 2232768. Приоритет от 02.10.2002.

120. Livak, K.J., Schmittgen, T.D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method /I Methods. 2001. V. 25. P. 402-408.

121. Scopes, R.K. Protein purification: principles and practice. 3rd ed ed. 11 Springer-Verlag, New York. 1994.

122. Laktionov, P.P., Dazard, J.E., Vives, E., Rykova, E.Y., Piette, J., Vlassov, V.V., Lebleu, B. Characterisation of membrane oligomicleotide-binding proteins and oligonucleotide uptake in keratinocytes // Nucleic Acids Res. 1999. V. 27. P. 2315-2324.

123. Speicher, K.D., Kolbas, O., Harper, S., Speicher, D.W. Systematic analysis of peptide recoveries from in-gel digestion for protein identifications in proteome studies H J. Biomol. Tech. 2000. V. 5. P. 74-86.

124. Chen, C., Manning, A. TGF-beta 1, IL-10 and IL-4 differentially modulate the cytokine-induced expression of IL-6 and IL-8 in human endothelial cells // Cytokine. 1996. V. 8. P. 58-65.

125. Uehara, A., Takada, H. Functional TLRs and NODs in Human Gingival Fibroblasts // J. Dent. Res. 2007. V. 86. P. 249-254.

126. Kiszel, P., Mako, V., Prohaszka, Z., Cervenak, L. Interleukin-6 174 promoter polymorphism does not influence IL-6 production after LPS and IL-ip stimulation in human umbilical cord vein endothelial cells // Cytokine. 2007. V. 40. P. 17-22.

127. Nyhlen, K., Gautam, C., Andersson, R., Srinivas, U. Modulation of cytokine-indiced production of IL-8 in vitro by interferons and glucocorticosteroids // Inflammation. 2004. V. 28. P. 77-88.

128. Huschtscha, L., Noble, J., Neumann, A., Moy, E., Barry, P., Melki, J., Clark, S., Reddel, R. Loss of pi 6INK4 expression by methilation is assosiated with life expansion of human mammary epithelial cells // Cane. Res. 1998. V. 58. P. 3508-3512.

129. Cockerill, G., Meyer, G., Noak, L., Vadas, M., Gamble, J. Characterisation of spontaneously transferred human endothelial cell line // Lab. Invest. 1994. V. 71(4). P. 497-509.

130. Hanagata, N. Structure-dependent immunostimulatoiy effect of CpG oligodeoxynucleotides and their delivery system // Int. J. Nanomedicine. 2012. V. 7. P. 2181-2195.

131. Sester, D.P., Naik, S., Beasley, S.J., Hume, D.A., Stacey, K.J. Phosphorothioate backbone modification modulates macrophage activation by CpG DNA // J. Immunol. 2000. V. 165. P. 4165^1173.

132. Peddada, L.Y., Harris, N.K., Devore, D.I., Roth, C.M. Novel graft copolymers enhance in vitro delivery of antisense oligonucleotides in the presence of serum // J. Control. Release. 2009. V. 140. P. 134-140.

133. Mahanonda, R., Sa-Ard-Iam, N., Montreekachon, P., Pimkhaokham, A., Youngvanichit, K., Fukuda, M., Pichyangkul, S. IL-8 and IDO expression by human gingival fibroblasts via TLRs II J. Immunol. 2007. V. 178. P. 1151-1157.

134. Nonnenmacher, C., Dalpke, A., Zimmermann, S., Flores-De-Jacoby, L., Mutters, R., Heeg, K. DNA from periodontopathogenic bacteria is immunostimidatory for mouse andhuman immune cells // Infect. Immun. 2003. V. 71. P. 850-856.

135. Bailas, Z., Rasmussen, W., Krieg, A. Induction of NK activity in murine and human cells by CpG motifs of oligodeoxynucleotides and bacterial DNA // J. Immunol. 1996. V. 157. P. 1840-1845.

136. Morozkin, E.S., Laktionov, P.P., Rykova, E.Y., Vlassov, V.V. Extracellular nucleic acids in cultures of long-term cultivated eukaryotic cells // Ann. N. Y. Acad. Sei. 2004. V. 1022. P. 244-249.

137. Stacey, K.J., Young, G.R., Clark, F., Sester, D.P., Roberts, T.L., Naik, S., Sweet, M.J., Hume, D.A. The molecular basis for the lack of immunostimulatoiy activity of vertebrate DNA //J. Immunol. 2003. V. 170. P. 3614-3620.

138. Lenert, P., Goeken, A.J., Ashman, R.F. Extended sequence preferences for oligodeoxyribonucleotide activity /I Immunology. 2006. V. 117. P. 474-481.

139. Wu-Pong, S., Weiss, T.L., Hunt, C.A.Antisense c-myc oligonucleotide cellular uptake and activity // Antisense Res. Dev. 1994. V. 4. P. 155-163.

140. Hanss, В., Leal-Pinto, E., Bruggeman, L.A., Copeland, T.D., Klotman P.E. Identification and characterization of a cell membrane nucleic acid channel II Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1998. V. 95. P. 1921-1926.

141. Overhoff, M., Sczakiel, G. Phosphorothioate-stimidated uptake of short interfering RNA by human cells II EMBO Rep. 2005. V. 6. P. 1176-1181.

142. Opitz, В., Eitel, J., Meixenberger, К., Suttorp, N. Role of Toll-like receptors, NOD-like receptors and RIG-I-like receptors in endothelial cells and systemic infections // Thromb. Haemost. 2009. V. 102. P. 1103-1109.

143. Кочетков H.K., Будовский Э.И., Свердлов Е.Д., Симукова H.A., Турчинский М.Ф., Шибаев В.Н. Органическая химия нуклеиновых кислот // «Химия». Москва. 1970.

144. Rädler, J.O., Koltover, I., Salditt, Т., Safinya, C.R. Structure of DNA-cationic liposome complexes: DNA intercalation in multilamellar membranes indistinct interhelical packing regimes // Science. 1997. V. 275. P. 810-814.

145. Froy, O. Regulation of mammalian defensin expression by Toll-like receptor-dependent and independent signalling pathways // Cell Microbiol. 2005. V. 7. P. 1387-1397.

146. Zhuravel, E., Shestakova, T., Efanova, O., Yusefovich, Y., Lytvin, D., Soldatkina, M., Pogrebnoy, P. Human beta-defensin-2 controls cell cycle in malignant epithelial cells: in vitro study H Exp. Oncol. 2011. V. 33. P. 114-120.

147. Downs, J.A., Jackson, S.P. A means to a DNA end: the many roles of Ku // Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 2004. V. 5. P. 367-78.

148. Blier, P.R., Griffith, A.J., Craft, J., Hardin, J.A. Binding of Ku protein to DNA. Measurement of affinity for ends and demonstration of binding to nicks // J. Biol. Chem. 1993. V. 268. P. 7594-7601.

149. Collis, S.J., DeWeese, T.L., Jeggo, P.A., Parker, A.R. The life and death of DNA-PK // Oncogene. 2005. V. 24. P. 949-961.

150. Paupert, J., Dauvillier, S., Salles, B., Muller, C. Transport of the leaderless protein Ku on the cell surface of activated monocytes regulates their migratory abilities // EMBO Rep. 2007. V. 8. P. 583-588.

151. Monferran, S., Paupert, J., Dauvillier, S., Salles, B., Muller, C. The membrane form of the DNA repair protein Ku interacts at the cell surface with metalloproteinase 9 // EMBO J. 2004. V. 23. P. 3758-3768.

152. Lucero, H., Gae, D., Taccioli, G.E. Novel localization of the DNA-PK complex in lipid rafts. A putative role in the signal transduction pathway of the ionizing radiation response ü J. Biol. Chem. 2003. V. 278. P. 22136-22143.

153. Subramanian, C., Opipari, A.W. Jr., Bian, X., Castle, V.P., Kwok, R.P. Ku70 acetylation mediates neuroblastoma cell death induced by histone deacetylase inhibitors // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2005. V. 102. P. 4842-4847.

154. Rathaus, M., Lerrer, B., Cohen, H.Y. DeubiKuitylation: A novel DUB enzymatic activity for the DNA repair protein, Ku70 // Cell. Cycle. 2009. V. 8. P. 1843-1852.