Идентификация генетических маркеров, ассоциированных с предрасположенностью к сахарному диабету тиа 1, на хромосомах 1,2,5 и 16 тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.03, кандидат биологических наук Чернышева Ана

• Чернышева Ана
• кандидат биологических наук
• 2007

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Чернышева Ана

ВВЕДЕНИЕ Цель работы Научная новизна работы Практическая ценность работы

1. Обзор литературы

1.1 Общая характеристика СД типа

1.2 Концентрация СД типа 1 в семьях больных

1.3 Вклад генетических и негенетических факторов в развитие

СД типа

1.4 Полиморфные участки ДНК

1.4.1 Типы полиморфизма

1.4.2 Методы выявления полиморфизма ДНК

1.5 Стратегии изучения мультифакторных заболеваний 1.5.1 Тест на неравновесную передачу аллелей

1.6 Молекулярно-генетические маркеры СД типа

1.7 Молекулярные механизмы возникновения аутоиммунной реакции при СД типа

1.8 Характеристика исследуемых в работе локусов и генов

1.8.1 Локус lq42 на хромосоме 1 и ген TAF5L

1.8.2 Локус IDDM7 на хромосоме 2q31-q

1.8.3 Локус IDDM13 на хромосоме 2q34-q

1.8.4 Локус IDDM18 и ген IL-12B

1.8.5 Локус 16q22-q24 Заключение

2. Материалы и методы

2.1 Реактивы и ферменты

2.2 Буферные растворы

2.3 Формирование группы пациентов

2.4 Выделение геномной ДНК человека методом фенол/ хлороформной экстракции

2.5 Амплификация ДНК

2.6 Расщепление продуктов амплификации рестриктазами

2.7 Электрофоретическое разделение ДНК

2.8 Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей

2.9 Статистическая обработка результатов

2.9.1 Проверка на подчинение равновесию Харди-Вайнберга и неравновесие по сцеплению

2.9.2 Методы анализа сцепления генетического маркера с заболеванием

2.9.3 Поправка Бонферрони

3. Результаты и обсуждение

3.1 Изучение сцепления полиморфных маркеров в хромосомной области lq42 с СД типа

3.1.1 Выбор полиморфных маркеров в области lq

3.1.2 Идентификация аллелей полиморфных микросателлитных маркеров в хромосомной области lq

3.1.3 Изучение сцепления полиморфных маркеров в области lq42 с СД типа

3.1.4 Изучение ассоциации аллелей полиморфных маркеров в области lq42 с СД типа

3.1.5 Выбор гена-кандидата, продукт экспрессии которого может быть задействован в механизме развития СД типа 1 в области lq42 у русских

3.1.6 Выбор точечных полиморфных маркеров для изучения сцепления в хромосомной области lq42 с СД типа

3.1.7 Изучение сцепления аллелей нуклеотидных полиморфных маркеров в хромосомной области lq42 с СД типа 1 у русских

3.2 Изучение сцепления полиморфных маркеров в хромосомной области 16q22-q24 с СД типа

3.2.1 Выбор полиморфных маркеров в области 16q22-q

3.2.2 Идентификация аллелей полиморфных микросателлитных маркеров хромосомной области 16q22-q

3.2.3 Изучение сцепления полиморфных маркеров в области 16q22-q24 с СД типа

3.2.4 Изучение ассоциации аллелей полиморфных маркеров в области 16q22-q24 с СД типа

3.3 Изучение сцепления полиморфных маркеров в хромосомной области 2q31-q33 с СД типа

3.3.1 Выбор полиморфных маркеров в области 2q31-q

3.3.2 Идентификация аллелей полиморфных микросателлитных маркеров хромосомной области 2q31-q

3.3.3 Изучение сцепления полиморфных маркеров в области 2q31-q33 с СД типа

3.3.4 Изучение ассоциации аллелей полиморфных маркеров в области 2q31-q33 с СД типа

3.4 Изучение сцепления полиморфных маркеров в хромосомной области 2q35 с СД типа

3.4.1 Выбор полиморфных маркеров в области 2q

3.4.2 Идентификация аллелей полиморфных микросателлитных маркеров в хромосомной области 2q

3.4.3 Изучение сцепления полиморфных маркеров в области 2q35 с СД типа

3.4.4 Изучение ассоциации аллелей полиморфных маркеров в области 2q35 с СД типа

3.5 Изучение сцепления полиморфных маркеров в хромосомной области 5q31.1-q33.

3.5.1 Выбор полиморфных маркеров в области 5q31.1-q33.

3.5.2 Идентификация аллелей полиморфных микросателлитных маркеров в хромосомной области 5q31.1-q33.

3.5.3 Изучение сцепления полиморфных маркеров в области 5q31.1-q33.1 сСДтипа

3.5.4 Изучение ассоциации аллелей полиморфных маркеров в области 5q31.1-q33.1 с СД типа

ВЫВОДЫ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Идентификация генетических маркеров, ассоциированных с предрасположенностью к сахарному диабету тиа 1, на хромосомах 1,2,5 и 16»

Сахарный диабет (СД) типа 1 является распространенным и тяжелым наследственным заболеванием человека. Нарушение метаболизма глюкозы при СД типа 1 возникает из-за аутоиммунного разрушения бета-клеток поджелудочной железы, вследствие чего они теряют способность вырабатывать инсулин. Пути развития заболевания к настоящему времени изучены неполностью, но известно, что СД типа 1 формируется при взаимодействии нескольких генетических компонент и факторов внешней среды.

Как правило, при наличии генетической предрасположенности, СД типа 1 развивается в раннем возрасте и вызывает поражения кровеносных сосудов, почечную недостаточность, слепоту, гангрены и другие тяжелые осложнения. С помощью своевременной профилактики заболевания у пациентов с повышенным генетическим риском можно значительно отсрочить появление симптомов СД и снизить опасность развития осложнений. Поэтому в настоящее время главным является разработка стратегии ранней диагностики, прогнозирования и превентивной терапии заболевания с использованием генетических маркеров.

Полигенная природа СД типа 1 доказана последними работами по поиску локусов предрасположенности к заболеванию с использованием мультилокусного анализа сцепления. Удалось обнаружить более 20 локусов предрасположенности к СД типа 1. К сожалению, результаты оказались противоречивыми и сильно зависели от этно-территориальной принадлежности использованных выборок. Только для двух локусов существуют четкие доказательства их связи с СД типа 1. Это главный комплекс гистосовместимости (МНС) и полиморфный повтор в гене инсулина (INS). Поскольку в процесс формирования патологии вовлечены полиморфные маркеры в нескольких генах, в настоящее время проводятся крупномасштабные исследования множества генов-кандидатов и хромосомных областей с использованием выборок из различных этнических групп. Каждая из таких работ вносит свой вклад в понимание процессов, приводящих к СД типа 1.

К настоящему времени усилиями зарубежных исследовательских групп с использованием семей с сибсами, больными СД типа 1, проведено генетическое картирование и анализ сцепления этих локусов с СД типа 1 в этнических группах Европы, Северной Америки и Азии. Показано, что значимыми локусами по вкладу в семейный риск развития заболевания являются, IDDM13 (2q34-q35), IDDM18 (5q31.1-q33.1), IDDM7 (2q31-q33), а также хромосомные области 16q22-q24 и lq42. Однако для популяций России подобные исследования ранее не проводились.

Установление сцепления полиморфных маркеров с СД типа 1 поможет разработать дифференцированный подход к профилактике и лечению данной патологии.

10

Цель работы

Целью данной работы являлся поиск полиморфных маркеров, сцепленных с СД типа 1, в хромосомных областях lq42, 2q31-q33, 2q35, 5q31.1-q33.1 и 16q22-q24 .

Для ее достижения были поставлены следующие задачи:

1. Провести анализ сцепления и ассоциации с сахарным диабетом типа 1 группы полиморфных маркеров в хромосомной области lq42 с использованием семей с наличием заболевания у сибсов.

2. Провести анализ сцепления и ассоциации с сахарным диабетом типа 1 группы микросателлитных полиморфных маркеров в хромосомной области 16q22-24.

3. Провести анализ сцепления и ассоциации с сахарным диабетом типа 1 группы микросателлитных полиморфных маркеров в хромосомных областях 2q31-33 и 2q35.

4. Провести анализ сцепления и ассоциации с сахарным диабетом типа 1 однонуклеотидного полиморфного маркера в гене IL12B в хромосомной области 5q31.1-33.1.

5. При наличии ассоциации проанализировать функции генов в областях lq42 и 16q22-24, определить гены, которые по своим функциям могут быть задействованы в развитии СД типа 1.

Научная новизна работы

В данной работе впервые была изучена ассоциация полиморфных маркеров в хромосомных областях lq42, 2q31-33, 2q35, 5q31.1-33.1 и 16q22-24 с сахарным диабетом типа 1 у пациентов из городских популяций России. Обнаружена статистически достоверная ассоциация с СД типа 1 в областях lq42 и 2q35.

Проводились исследования функций генов в хромосомной области lq42 в связи с их возможным участием в развитии сахарного диабета типа 1. На роль генов-кандидатов предложены гены TAF5L, АВСВ10 и KIAA0133, связанные с предрасположенностью к СД типа 1.

Практическая ценность работы

Изучение ассоциации полиморфных маркеров с сахарным диабетом типа 1 позволит оценить относительный (популяционный) и абсолютный (индивидуальный) риск развития заболевания в популяциях России, прогнозировать его развитие и прогрессирование задолго до клинического проявления и, наконец, правильно формировать группы риска. Эти исследования также могут способствовать наиболее эффективному проведению профилактики сахарного диабета (мониторинг лиц группы риска, использование иммуномодуляторов и/или иммуносупрессоров, превентивной инсулинотерапии и др.), а также обучению лиц, уже заболевших СД, самоконтролю уровня глюкозы в крови, проведению интенсивной инсулинотерапии и т.д.

1.0Б30Р ЛИТЕРАТУРЫ.

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Чернышева Ана

ВЫВОДЫ

1. Изучена передача в 107 семьях больных сахарным диабетом типа 1 аллелей полиморфных маркеров D1S1644, D1S1617, D1S2847, D1S1668, D1S103 и D1S225, расположенных в хромосомной области lq42. Показано наличие высоко достоверной ассоциации с заболеванием для полиморфных маркеров D1S1617 и D1S2847.

2. Исходя из результатов, полученных при анализе сцепления и ассоциации полиморфных маркеров, расположенных в хромосомной области lq42, высказано предположение о возможной роли генов TAF5L, АВСВ10 и KIAA0133 в патогенезе сахарного диабета типа 1. Проведен анализ сцепления и ассоциации однонуклеотидных полиморфных маркеров, расположенных в этих генах. Для полиморфного маркера A454G в экзоне гена TAF5L, получена значимая ассоциация с заболеванием, по данным о всех 107 семьях с наличием заболевания у сибсов. Аллель А этого маркера чаще передавался больным сибсам, что говорит о том что данный аллель или аллель который с ним находится в неравновесии по сцеплению, является фактором повышенного риска развития заболевания.

3. Проанализированы сцепление и ассоциация с сахарным диабетом типа 1 пяти полиморфных микросателлитных маркеров, расположенных в области 16q22-24, в 107 семьях больных сахарным диабетом типа 1. Сцепление и ассоциация с заболеванием в хромосомной области 16q22-24 не обнаружены, по данным о всех 107 семьях с наличием заболевания у сибсов.

4. Изучены сцепление и ассоциация с сахарным диабетом типа 1 двух полиморфных микросателлитных маркеров, расположенных в хромосомной области 2q31-33 (IDDM7) в 107 семьях больных сахарным диабетом типа 1. Обнаружено слабое сцепление с сахарным диабетом типа 1 полиморфного микросателлитного маркера D2S152. Не показано положительной ассоциации данного маркера, по данным о всех 107 семьях с наличием заболевания у сибсов.

5. Изучены сцепление и ассоциация с сахарным диабетом типа 1 пяти полиморфных микросателлитных маркеров, расположенных в хромосомной области 2q35 (IDDM13) в 107 семьях больных сахарным диабетом типа 1. Обнаружено сцепление с сахарным диабетом типа 1 полиморфного микросателлитного маркера D2S137. Показана положительная ассоциация аллеля 152 данного маркера с сахарным диабетом типа 1, по данным о всех 107 семьях с наличием заболевания у сибсов. Данный аллель является фактором повышенного риска развития патологии.

6. Изучены сцепление и ассоциация с сахарным диабетом типа 1 полиморфного микросателлитного маркера D5S2060 и однонуклеотидного маркера С1159А в З'-нетранслируемой области гена IL12B, расположенных в хромосомной области 5q31.1-33.1 (1DDM18). Сцепление и ассоциация с заболеванием в данной хромосомной области не обнаружены, по данным о всех 107 семьях с наличием заболевания у сибсов.

Заключение.

В обзоре литературы дана характеристика СД типа 1, характера его наследования и метаболических изменений. Подробно рассмотрены аутоиммунные механизмы формирования патологии, ее основные этапы и участвующие в этом гены по данным о модельных организмах.

Во втором разделе приведены характеристики полиморфизма ДНК, типов полиморфных участков и различных методических подходов по их обнаружению и исследованию. Рассмотрены аспекты практического использования полиморфных маркеров для генетического анализа наследственных заболеваний.

Большое внимание уделялось принципам картирования локусов предрасположенности к наследственным заболеваниям.

Наконец, в последних разделах охарактеризованы использованные в работе локусы и некоторые расположенные в них или по соседству гены и полиморфные маркеры.

Несмотря на недостаток и противоречивость литературного материала о роли исследуемых в работе локусов в патогенезе СД типа 1, в обзоре литературы предпринята попытка достаточно полно описать объекты исследования, а также систематизировать и обобщить накопленные по теме исследований данные.

2.МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1 Реактивы и ферменты.

ДНК-полимераза Taq, рестриктазы TaqI, Hin6I и Xapl -производства НПО "Ферментас" (Литва). Рестриктазы BstDEI, BstFNI, BsoMAI и BstSFI - производства ООО "СибЭнзим". Синтез олигонуклеотидов выполнен НПО «Литех» (Москва).

Дрожжевая тРНК, ДСН, бромистый этидий, NaCl -производства фирмы "Serva" (Германия). dATP, dCTP, dTTP, dGTP -производства НПО "Ферментас" (Литва). Протеиназа К, сахароза, БСА, Тритон Х-100®, Твин-20, ДТТ, хлорид магния, сульфат аммония - фирмы "Sigma" (США). Легкоплавкая агароза Seakem LE, трис, ДМСО, минеральное масло, ЭДТА, акриламид, метилен-бисакриламид, TEMED, бикарбонат натрия - фирмы "Диаэм"(Москва). Уксусная кислота, азотная кислота, NaOH, НС1, фенол, хлороформ, этанол, ацетат натрия - производства фирмы "Реахим" (Россия). КС1 - производства фирмы "Merck" (Германия), а персульфат аммония - фирмы "Реонал" (Венгрия).

2.2. Буферные растворы (1х):

Буфер ТАЕ — 40 мМ Трис-ацетат, 2 мМ ЭДТА.

Буфер ТВЕ — 0.089 МТрис, 0.89 М борная кислота, 0.002 М EDTA (рН=8.0).

Буферы для рестрикции (1х):

Буфер Y+ (yellow) - 33 мМ трис-ацетат (рН 7.9), 10 мМ ацетат магния, 66 мМ ацетат калия, 0.1мг/мл БСА

Буфер SE 2 (G) - ЮмМ трис-HCl (рН 7.6 при 25°С), ЮмМ MgCl2,50мМ NaCl, 1мМ ДТТ

Буфер SE 4 (W) - ЮмМ трис-HCl (рН 8.5 при 25°С), ЮмМ MgCl2, 150мМ NaCl, 1мМ ДТТ

Буфер SE 5 (Y) - 33 мМ трис-ацетат (рН 7.9 при 25°С), 10мМ ацетат магния, 66мМ ацетат калия, 1мМ ДТТ

Буферы для амплификации (1х): Буфер Al: 0.5М КС1,0.1М трис - НС1 (рН 9.2), 15мМ MgCl2 Буфер А2: 0.5М КС1,0.1М трис - НС1 (рН 8.3), 15мМ MgCl2 Буфер Taq: 67мМ трис - НС1 (рН 8.8), 16.6мМ сульфат аммония, 0.1% твин-20

2.3. Формирование группы пациентов.

Выборка была сформирована из 35 семей с конкордантными парами сибсов и 72 семей с дискордантными парами сибсов городского населения Москвы и Самары. Каждая семья с конкордантными парами сибсов содержала как минимум двоих сибсов с СД типа 1, каждая семья с дискордантными парами сибсов -одного больного и одного здорового. У больных детей СД был обнаружен в возрасте до 18 лет. Образцы крови были предоставлены сотрудниками Эндокринологического научного центра РАМН (г.Москва) и Самарского диабетического центра.

2.4. Выделение геномной ДНК человека методом фенол/хлороформной экстракции.

200 мкл венозной крови человека смешивали с равным объемом лизирующего буфера (10 мМ Трис-HCl (рН=8.0), 0.32 М сахароза, 10 мМ ЭДТА, 100 мМ NaCl, 0.1%-ный тритон Х-100), добавляли ДТТ, ДСН и протеиназу К в конечной концентрации 0.2%, 40 мМ и 20 мкг/мл соответственно и инкубировали при 37°С в течение ночи. Затем последовательно обрабатывали фенолом, смесью фенол/хлороформ (1:1) и хлороформом (дважды на каждой стадии). ДНК осаждали добавлением 1 мл 96%-ного этанола в присутствии 0.3 М ацетата натрия и тРНК дрожжей (10 мкг/мл) с последующей инкубацией при -70°С. Осадок ДНК промывали 80%-ным этанолом, сушили на воздухе и растворяли в 50 мкл бидистиллированной воды. Препараты ДНК хранили при -70°С.

2.5. Амплификация ДНК.

ПЦР проводили на амплификаторе РНС-2 ('Techne", Великобритания) или "Терцик" ("ДНК- Технология", Москва) в 25 мкл реакционной смеси, содержащей буфер для амплификации, 0.2 мМ каждого dNTP, по 10 пикомолей каждого из праймеров, 100-200 нг геномной ДНК и 2.0 ед. ДНК-полимеразы Taq. Концентрацию хлорида магния варьировали в зависимости от амлифицируемого локуса. При необходимости в реакционную смесь вносили ДМСО в конечной концентрации 10%.

На начальной стадии ПЦР денатурировали ДНК при 94°С в течение 3 мин, на конечной - проводили синтез второй цепи при 72°С в течение 7 мин. В промежутке между данными стадиями осуществляли 35 циклов ПЦР по трехступенчатой программе, включающей денатурацию ДНК (94°С/45с), отжиг праймеров в течение 45с и синтез второй цепи (72°С/45с). Температуру отжига праймеров вариировали в зависимости от амлифицируемого локуса. Условия ПЦР и последовательности праймеров для амплификации исследованных локусов приведены в табл. 3 и 4.

2.6. Расщепление продуктов амплификации рестриктазами.

SNP маркеры исследовали, обрабатывая соответствующими рестриктазами продукты ПЦР, содержащие полиморфный участок. К 6 мкл амплифицированного фрагмента ДНК добавляли 1 мкл 10-кратного буфера, 2 мкл воды и 2-3 ед. фермента. Расщепление ДНК рестриктазами Hin6I и Xapl проводили в буфере Y+, Taql - в буфере для Taql, BstFNI - в буфере SE 5 (Y), BstDEI - в буфере SE 2 (G), BsoMAI- в буфере SE 4 (W) с добавлением 100мкг/мл БСА, a BstSFI в буфере SE 3 (О). Рестрикцию проводили в течение ночи при 37°С СHin6I, ХарГ), 55°С СBsoMAI), 60°С (BstDEI, BstFNI и BstSFI) или при 65°С (TaqI).

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Чернышева Ана, 2007 год

1. Бочков Н.П., Гинтер Е.К., Сергеев А.С. Генетика сахарного диабета: итоги и перспективы исследований. // Вест. АМН СССР. 1989. N5. С. 17-22.

2. Leslie R.D.G., Elliott R.B. Early environmental events as a cause of IDDM. Evidence and implications. // Diabetes. 1994. V. 43. P. 843-850.

3. Hawa M.I., Beyan H., Buckley L.R., Leslie R.D.G. Impact of Genetic and Non-Genetic Factors in Type 1 Diabetes // Amer J Med Gen (Semin. Med. Genet.). 2002. V.115. P. 8-17

4. Wagener D.K., Sacks J.M., LaPorte R.E., Macgregor J.M. The Pittsburgh study of insulin-dependent diabetes mellitus: Risk for diabetes among relatives of IDDM. // Diabetes. 1982. V. 31. P. 136-144.

5. Diabetes Epidemiology Research International Group. Geographic patterns of childhood insulin-dependent diabetes mellitus. Diabetes. 1988. V. 37. P. 1113-1119.

6. Warrant J.H., Krolewski A.S., Gottllieb M.S., Kahn C.R. Differences in risk of insulin- dependent diabetes in offspring of diabetic mothers and diabetic fathers.//N.Engl. J.Med. 1984. V. 311. N. 11. P. 657-673.

7. Vadheim СМ., Rotter J.I., Maclaren N.K., Riley W.J., Anderson C.E. Preferential transmission of diabetic alleles within the HLA gene complex. // N. Engl. J. Med. 1986. V. 315. N. 19. P. 1314-1318.

8. McCarthy М.1., Kruglyak L., Lander E.S. Sib pair collection strategies for complex diseases. // Genetic Epidemiology. 1998. V. 15. P. 317-340.

9. McCarthy B.J., Dorman J.S., Aston C.E. Investigating genomic imprinting and susceptibility to insulin-dependent diabetes mellitus (IDDM): An epidemiological approach// Genetic Epidemiol. 1991. V. 8. P. 177-86.

10. Warrant J.H., Martin B.C., Krolewski A.S. Risk of IDDM in Children of diabetic mothers descreases with oncreasing maternal age at pregnancy. // Diabetes. 1991. V. 40. P. 1679-1684.

11. Кураева Т.П. Популяционно-генетические и иммуногенетические аспекты риска развития инсулинзависимого сахарного диабета. Дисс. докт. мед. наук, Москва, 1997,208 стр.

12. Chern М.М., Anderson V.E., Barbosa J. Empirical Risk for Insulin -dependent Diabetes (IDD) in Sibs. // Diabetes. 1982. V. 31. P. 11151118.

13. Eisenbarth G.S., Ziegler A.G., Colman P.A. Pathogenesis of insulin-dependent (type I) diabetes mellitus. In: Joslins Diabetes Mellitus. Edd. Kahn C.R., Weir G.C. Philadelphia, Baltimore, Hong Kong, London, Munich, Sydney, Tokyo. 1994. P. 216-239

14. Darlow J.M., Smith C.H., Duncan L.J.P. A statistical and genetical study of diabetes. III. Empiric risks to relatives. // Ann. Hum.Genet. 1973. Vol. 37. N2. P. 157-174.

15. Salvetti M., Ristori G., Bomprezzi R., Pozzilli P., Leslie R.D.G. Twins: mirrors of the immune system. // Immunol Today. 2000. V. 21. P. 342347.

16. Redondo M. U., Yu L., Hawa M., Mackenzie Т., Руке D.A., Eisenbarth G.S., Leslie R.D.G. Heterogeneity of type 1 diabetes: analysis of monozygotic twins in Great Britain and the United States. // Diabetologia. 2001. V. 44. P. 354-362.

17. Smith C. Statistical resolution of genetic heterogeneity in familial disease. // Ann. Human Genet. 1976. V. 39. N. 3. P. 281-291.

18. Мушкамбаров H.H., Кузнецов C.C. Молекулярная биология. ООО "Медицинское информационное агентство", Москва, 2003,544 с.

19. Singer М. Highly repeated sequences in mammalian genomes // Int. Rev. Cytol. 1982. V. 76. P. 67-112.

20. Jelinek W., Schmid C. Repetitive sequences in eukaryotic DNA and their expression // Ann. Rev. Biochem. 1982. V. 51. P. 813-844.

21. Warburton P.E., Willard H.F. Genomic analysis of sequence variation in tandemly repeated DNA. Evidence for localized homogenious sequence domain within arrays of alpha-satellite DNA // J.Mol.Biol. 1990. V. 216. P. 3-16.

22. Lund J.A., Bostock C., Leth-Bak A. Chromosome-specific subfamilies within human alphoid repeatitive DNA // J. Mol. Biol. 1986. V. 187. P. 185-196.

23. Jeffreys A.J., Wilson V., Thein S.L. Hypervariable 'minisatellite' regions in human DNA // Nature. 1985. V. 316. P. 67-73.

24. Nakamura Y„ Leppert M., 0'Cornell P., Wolff R., Holm Т., Culver M., Martin C., Fujimoto E., HoffM., Kumlin E., White R. Variable number of tandem repeats (VNTR) markers for human genome mapping // Science. 1987. V. 235. P. 1616-1622.

25. Miesfield R., Krystal M., Arnheim N. A member of new repeated sequence family which is conserved eucaryotic evolution is found between the human delta- and beta-globin genes // Nicleic Acids Res. 1981. V. 9. P. 5931-5947.

26. Hamada H., Petrino M., Kakunaga Т., Seidman M., Stollar B. Characterization of genomic Poly(dT-dG) Poly(dC-dA) sequences: structure, organization and conformation // Mol. Cell. Biol. 1984. V. 4. P. 2610-2621.

27. Hamada H., Seidman M., Howard В., Gorman C. Enchanced gene expression by Poly(dT-dG) Poly(dC-dA) sequence // Mol. Cell. Biol. 1984. V. 4. P. 2622-2630.

28. Edwards A., Hammond H.A., Jin L., Caskey C.T., Chakraborty R. DNA typing and genetic mapping with trimeric and tetrameric tandem repeats // Am. J. Hum Genet. 1991. V. 49. P. 746-756.

29. Saiki R.K., ScharfS., Faloona F., Mullis K.B., Horn G.T., Erlich H.A., Arnheim N. Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for sickle cell anemia // Science. 1985. V. 230. P. 1350-1354.

30. Decorte R., Cuppens H., Marinen P., Cassiman J.-J. Rapid detection of hypervariable regions by the polymerase chain reaction technique // DNA Cell Biol. 1990. V. 9. P. 461-469.

31. Li H., Gyllensten U.B., Gui X., Saiki P.K., Erlich H.A., Arncheim N. Amplification and analysis of DNA sequences in single human sperm and diploid cells // Nature. 1988. V. 335. P. 414-417.

32. Jouquand S„ Cheron A., Galibert F. Microsatellite analysis using two-step procedure for fluorescent labeling of PCR products // Biotechniques. 1999. V. 26. P. 902-905.

33. Hayashi K. PCR-SSCP: a simple and sensitive method for detection of mutation in the genomic DNA // PCR Methods Appl. 1991. V. 1. P. 3438.

34. Sanger F, Nicklen S, Coulson A.R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. // Proc Natl Acad Sci USA. 1977. V. 74. N. 12. P. 5463-5467.

35. Vink J.M., Boomsma D.I. Gene finding strategies // Biol sychology. 2002. V. 61. P. 53-71

36. McCarthy M.I. Susceptibility gene discovery for common metabolic and endocrine traits // Journ Molec Endocrin. 2002. V. 28. P. 1-17

37. Risch N., Merikangas K. The future of genetic studies of complex human deseases// Science. 1997. V.275. P. 1516-1517.

38. Risch N., Zhang H. Extreme discordant sib pairs for mapping quantitative trait loci in humans// Science. 1995. V. 268. P. 1584-1589.

39. Risch N. Linkage strategies for genetically complex traits. II. The power of affected relative pairs. // Am. J. Hum. Genet. 1990. V. 46. P. 229-241.

40. Risch, N. Linkage strategies for genetically complex traits. III. The effect of marker polymorphism on analysis of affected relative pairs. // Am. J. Hum. Genet. 1990. V. 46. N. 242-253.

41. Risch N. Linkage strategies for genetically complex traits. I. Multilocus models. // Am J Hum Genet. 1990. V. 46. P. 222-228.

42. RojfD.A., Bentzen P. The statistical analysis of mitochondrial DNA polymorphisms: chi 2 and the problem of small samples// Mol.Biol.Evol. 1989. V.6. P. 539-45.

43. Ionnidis J.P.A., Ntzani E.E., Trikalinos T.A. Contopoulos-Ioannidis D.G. Replication validity of genetic association studies. // Nat. Genet. 2001. V. 29. P. 306-309.

44. Schulze T.G., McMahon F.J. Genetic association mapping at the crossroads: which test and why? Overview and practical guidelines. // Am. J. Hum. Genet. 2002. V. 114. N. 1. P. 1-14.

45. Spielman R.S., McGinnis R.E., Evens W.J. Transmission test for linkage disequlibrium: the insulin gene region and insulin-dependent diabetes mellitus (IDDM) // Am. J. Hum. Genet. 1993. V. 53. P. 506-516.

46. Spielman R.S., Evens W.J. A sibship test for linkage in the presence of association: the sib transmission/disequilibrium test // Am. J. Hum. Genet. 1998. V. 62. P. 450-558.

47. Threadgill D.W., Hunter K.W., Williams R.W. Genetic dissection of complex and quantitative traits: from fantasy to reality via a community effort // Mamrn Genome. 2002. V. 13. P. 175-178.

48. Whittemore A.S. Genome scanning for linkage: an overview. Am J Hum Genet. 1996. V. 59. P. 276-287

49. Lander E., Kruglyak L. Genetic dissection of complex traits: guidelines for interpreting and reporting linkage results. // Nat Genet 1995. V. 11. P. 241-247.

50. Lander E.S., Schork N.J. Genetic dissection of complex traits// Science. 1994. V. 265. P. 2037-48.

51. Altmuller J., Palmer L.J., Fischer G., Scherb H., Wjst M. Genomewide Scans of Complex Human Diseases: True Linkage Is Hard to Find // Am. J. Hum. Genet. 2001. V. 69. P. 936-950

52. Owerbach D., Gabbay K.H. Localization of a type 1 diabetes susceptibility locus to the variable tandem repeat region flanking the insulin gene. // Diabetes. 1993. V. 42. P. 1708-1714.

53. Xiong M., Jin L. Comparison of the Power and Accuracy of Biallelic and Microsatellite Markers in Population-Based Gene-Mapping Methods // Am. J. Hum. Genet. 1999. V. 64. P. 629-640

54. Lonjou C., Collins A., Morton N.E. Allelic association between marker loci// Proc.Natl.Acad.Sci. 1999. V. 96. P. 1621-26.

55. International SNP Map Working Group. A map of human genome sequence variation containing 1.42 million single nucleotide polymorphisms// Nature. 2001. V. 409. P. 928-933.

56. Fulker D.W., Cherny S.S., Sham P.C., Hewitt J.K. Combined linkage and association sib-pair analysis for quantitative traits. // Am J Hum Genet. 1999. V. 64. P. 259-267.

57. Cardon L.R., Abecasis G.R. Some properties of a variance. Null components model for fine-mapping quantitative trait loci. II Behav Genet. 2000. V. 30. P. 235-243

58. Sun L.,Cox N.J., McPeek M.S. A Statistical Method for Identification of Polymorphisms That Explain a Linkage Result // Am. J. Hum. Genet. 2002. V. 70. P. 399-411

59. Bell G.I., Horita S., Karam J.H. A polymorphic locus near the human insulin gene is associated with insulin-dependent diabetes mellitus // Diabetes. 1984. V. 33. N. 2. P. 176-183.

60. Simpson N.E. The genetics of diabetes mellitus in man. // J. Genet, and Cytol. 1980. V. 22. N. 4. P. 497-506. predict insulin-dependent diabetes mellitus: a study of identical twins// Diabetologia. 1990. V. 33. P. 497-502.

61. Beer S.F., Heaton D.A., Alberti K.G.M.M., Руке D.A., Leslie R.D.G. Impaired glucose tolerance precedes but does not predict insulin-dependent diabetes mellitus: a study of identical twins// Diabetologia. 1990. V. 33. P. 497-502.

62. Reed P.W. Davies J.L. Copeman J.B. Chromosome specific microsatellite sets for fluorescence based, semi-automated genome mapping// Nature Genet. 1994. V. 7. P. 390-5.

63. Ott J. Analysis of Human Genetic Linkage// The Johns Hopkins University Press. Baltimore. 1999.

64. International Human Genome Sequencing Consortium. Initial sequencing and analysis of the human genome// Nature. 2001. V. 409. P. 860-921.

65. European Consortium for IDDM Genome Studies. A genomewide scan for type I diabetes susceptibility in Scandinavian families: identification of new loci with evidence of interactions// Am.J.Hum.Genet. 2001. V.69. P. 1301-13.

66. Bertrams J., BaurM.P. Histocompatibility testing. New York. 1984. P. 348-358.

67. Owerbach D., Nerup J. Restriction fragment length polymorphism of the insulin gene in diabetes mellitus. // Diabetes. 1982. Vol. 31. P. 275-277

68. Postigo A.A., Dean D.C. Independent Repressor Domains in ZEB Regulate Muscle and T-Cell Differentiation // Molec Cell Biol. 1999. P. 7961-7971

69. Hayashi Т., Faustman D. NOD mice are defective in proteasome production and activation of NF-kB// Mol Cell Biol. 1999.V. 19. P. 86468659

70. Faustman D., Li X., Lin H.Y., Fu Y., Eisenbarth G., Avruch J., Guo J. Linkage of faulty major histocompatibility complex class I to autoimmune diabetes. // Science. 1991. V. 254. P. 1756-1761.

71. Aldrich C.J., Ljunggren H.G., Van Kaer L., Ashton-Rickardt P.G., Tonegawa S., Forman J. Positive selection of self- and alloreactive CD8+ T cells in TAP-1 mutant mice. // Proc Natl Acad Sci USA. 1994. V. 91. P. 6525-6528

72. Glas R., Ohlen C., Hoglund P., Karre K. The CD8+ T cell repertoire in p2-microglobulindeficient mice is biased towards reactivity against self-major histocompatibility class I. //J Exp Med. 1994. V. 179. P. 661-672

73. Goldberg A.L., Rock K.L. Proteolysis, proteosomes and antigen presentation. // Nature. 1992. V. 357. P. 375-379.

74. Monaco J.J. A molecular model of MHC class I restricted antigen processing. //Immunol Today. 1992. V. 13. P. 173-179.

75. Yowdell J.W., Bennink J.R. Cell biology of antigen processing and presentation to major histocompatibility complex class I molecule restricted T lymphocytes. // Adv Immunol. 1992. V. 52. P. 1-123.

76. Owens G.P., Hahn W.E., Cohen JJ. Identification of mRNAs associated with programmed cell death in immature thymocytes// Mol.Cell Biol. 1991. V. 11(8). P. 4177-88.

77. Orlowski M. The multicatalytic proteinase complex, a major extralysosomal proteolytic system. // Biochemistry. 1990. V. 29. P. 1028910297.

78. Yan G., Fu Y., Faustman D.L. Reduced expression of Tapl and Lmp2 antigen processing genes in the nonobese diabetic (NOD) mouse due to a mutation in their shared bidirectional promoter. // J Immunol. 1997. V. 159. P. 3068-3080

79. Dianzani U., Chiocchetti A., Ramenghi U. Role of inherited defects decreasing Fas function in autoimmunity // Life Sciences. 2003. V.72. P.2803-2824

80. Amrani, A., Verdaguer J., Anderson В., Utsugi Т., Bou S., Santamaria P. Perforin-independent (3 cell destruction by diabetogenic CD8+ T lymphocytes in transgenic nonobese diabetic mice. // J. Clin. Invest. 1999. V. 103. P. 1201-1209.

81. Silva D.G., Petrovsky N., Socha L, Slattery R., Gatenby P., Charlton B. Mechanisms of Accelerated Immune-Mediated Diabetes Resulting from Islet p Cell Expression of a Fas Ligand Transgenel // J Immunol. 2003. V. 170. N. 10. P. 4996-5002.

82. Hayashi Т., Faustman D. Role Of Defective Apoptosis In Type 1 Diabetes And Other Autoimmune Diseases // Recent Prog Horm Res. 2003. V. 58. P. 131-53.

83. Hsu S.C., Gavrilin M.A., Lee H.H., Wu C.C., Han S.H., Lai M.Z. NF-kB-dependent Fas ligand expression // Eur J Immunol. 1999 V. 29. P. 2948-2956

84. Green JM. The B7/CD28/CTLA4 T-cell activation pathway. Implications for inflammatory lung disease. // Am J Respir Cell Mol Biol. 2000. V. 22. N. 3. P. 261-264.

85. Ewens K.G., Johnson L.N., Wapelhorst В., O'Brien K., Gutin S., Morrison V.A., Street C., Gregory S.G., Spielman R.S., Concannon P. Linkage and association with type I diabetes on chromosome lq42 // Diabetes. 2002. V. 51(11). P. 3318-25.

86. Harland L., Crombie R., Anson S., deBoer J., Ioannou P.A., Antoniou M. Transcriptional regulation of the human TATA binding protein gene// Genomics. 2002. V.79(4). P. 479-82.

87. Copeman J.B.,Cucca F., Hearne C.M., Cornall R.J., Reed P.W., Ronningen K.S., Undlien D.E., Nistico L, Buzzetti R„ Tossi R. Linkage disequilibrium mapping of T1D susceptibility gene (IDDM7) to chromosome 2q31-q33 // Nat Genet. 1995. V. 9(1). P. 80-5.

88. Luo D.F., Maclaren N.K., Huang H.S., Muir A., She J.X. Intrafamilial and case-control association analysis of D2S152 in insulin-dependent diabetes mellitus // Autoimmunity. 1995. V. 21(2). P. 143-7.

89. Dupont S., Dina C., Hani E.H., Froguel P. Absence of replication in the French population of the association between beta2/NEUROD-A45T polymorphism and type I diabetes // Diabetes Metab. 1999. V. 25(6). P. 516-7.

90. Morahan G., Huang D., Tait B.D., Colman P.G., Harrison L.C. Markers on distal chromosome 2q linked to insulin-dependent diabetes mellitus // Science. 1996. V. 272(5269). P. 1811-3.

91. Bosi E., Sarugeri E. Advances and controversies in ethiopathogenesis of type I (insulin-dependent) diabetes mellitus// J. Pediatr.Endocrinol.Metabol. 1998. V.ll(2). P. 293-305.

92. Adorini L. Interleukin 12 and autoimmune diabetes I I Nat. Genet.2001. V. 27(2). P. 131-132.

93. Seegers D., Zwiers A., Strober W., Репа A.S., Bouma G. A Taql polymorphism in the З'-UTR of the IL-12 p40 gene correlates with increased IL-12 secretion // Genes Immun. 2002. V. 3(7) P. 419-23.

94. Nistico L., Giorgi G., Giordano M., Galgani A., Petrone A., D'Alfonso S., Federici M., Di Mario U., Pozzilli P., Buzzetti R., Cascino I. IL12B polymorphism and type I diabetes in the Italian population // Diabetes.2002. V.51. P. 1649-1650.

95. Holm P., Luthman H, Kockum /. No evidence for linkage in Swedish multiplex T1D familied IL12B on chromosome 5q33-34 // Ann.N Y

96. AI o„: ЛПЛ1 Л 1 1 ЛАС г» о CI с

97. McCormack R.M., Maxwell A.P., Carson D.J., Patterson C.C., Middleton D., Savage D.A. The IL12B 3' untranslated region DNA polymorphism is not associated with early onset type I diabetes // Genes Immun. 2002. V.3.P. 433-5.

98. Davoodi-Semiromi A., Yang J. J., She J.X. IL12p40 is associated with type I diabetes in Caucasian-American families // Diabetes. 2002. V.51. P.2334-6.

99. Kristiansen O.P., Larsen Z.M., Johannesen J., Nerup J., Mandrup-Poulsen Т., Pociot F. No linkage of P187S polymorphism in NAD(P)H:quinone oxidoreductase (NQ01/DIA4) and type I diabetes in the Danish population // Hum. Mutat. 1999. V. 14(1). P. 67-70.