Гуморальный иммунный ответ у больных диссеминированной меланомой в процессе вакцинотерапии тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.01.12, кандидат биологических наук Голубцова, Наталья Валерьевна

• Голубцова, Наталья Валерьевна
• кандидат биологических наук
• 2012

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Голубцова, Наталья Валерьевна

ОГЛАВЛЕНИЕ

Список сокращений

Введение

Глава 1. Обзор литературы

1.1. Биотерапия

1.2. Механизмы противоопухолевого иммунитета

1.3. Растворимые формы мембранных антигенов клеток иммунной 17 системы

1.3.1. Растворимые формы молекул главного комплекса 23 гистосовместимости HLAI класса

1.3.2. Растворимый сывороточный антиген CD8

1.3.3. Растворимый комплекс молекул HLA I класса и антиген CD8 27 (HLA I- CD8)

1.4. Цитокины

1.5. Гуморальный иммунный ответ 3

Глава 2. Материалы и методы исследования

2.1. Иммуноферментные методы определения растворимых форм 40 мембранных антигенов

2.1.1. Определение растворимых сывороточных антигенов

2.2. Иммуноферментные методы определения интерлейкинов

2.2.1. Определение Thl-типа цитокинов

2.2.2. Определение Th-2 типа цитокинов

2.3. Реакция непрямой иммунофлуоресценции

2.4. Флуоресцентный иммуноцитохимический анализ

2.4.1. Подготовка опухолевых клеток

2.4.2. Проведение флуоресцентного иммуноцитохимического анализа

2.5. Статистическая обработка результатов

Глава 3. Результаты исследований

3.1. Изменение сывороточного содержания растворимых молекул 48 Н1АI класса, антигена CD 8 и растворимого комплекса HLA-I-CD8 у больных диссеминированной меланомой

3.2. Прогностическое значение сывороточных уровней растворимых 55 молекул HLAI класса и антигена CD8 у больных меланомой

3.3. Изменение относительного содержания сывороточных уровней 63 цитокинов у больных диссеминированной меланомой в процессе вакцинотерапии

3.4. Изучение гуморального иммунного ответа у больных 70 диссеминированной меланомой в процессе вакцинотерапии

3.4.1. Определение противоопухолевых антител в сыворотке крови 70 больных диссеминированной меланомой иммунофлуоресцентным методом.

3.4.2. Определение противоопухолевых антител в сыворотке крови 73 больных диссеминированной меланомой флуоресцентным иммуноцитохимическим методом.

Обсуяедение результатов исследования

Выводы

Список литературы

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ

АПК Антигенпрезентирующие клетки

ГМ-КСФ Гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор

ДК Дендритные клетки

ИЛ Интерлейкин

ИФА Иммуноферментный анализ

ИФН Интерферон

МКА Моноклональные антитела

ME Международные единицы

ММ Молекулярная масса

МНС Major Histocompatibility Comple - главный комплекс

гистосовместимости

HLA Human Leukocyte Antigen - главный комплекс

гистосовместимости у человека

ОАА Опухолеассоциированные антигены

РИФ Реакция иммунофлуоресценции

РТА Раково-тестикулярный антиген

РЭА Раковоэмбриональный антиген

ФИЦХ Флуоресцентный иммуноцитохимический анализ

ФСР-Т Фосфатно-солевой раствор с твином

ЦТЛ Цитотоксические Т-лимфоциты

BSA Бычий сывороточный альбумин

CD Кластер дифференцировки

sCD Растворимая форма дифференцировочных молекул

sHLA Растворимая форма главного комплекса гистосовместимости

PBS Фосфатно-солевой буфер

NK Естественные киллерные клетки

TYR Тирозиназа

Th Т- хелперы

Ig иммуноглобулин

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Гуморальный иммунный ответ у больных диссеминированной меланомой в процессе вакцинотерапии»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Благодаря развитию биотехнологии активно разрабатываются новые методы, направленные на активацию естественного противоопухолевого иммунитета. В настоящее время прогресс в лечении онкологических заболеваний, в частности меланомы, связан с вакцинотерапией [6, 8, 23, 96, 100]. Принцип данного метода основан на индукции противоопухолевого иммунитета после введения в организм опухолевых антигенов [4, 19, 20, 22]. Т-лимфоциты, играющие роль в клеточно-опосредованном иммунитете, распознают аутологичные и аллогенные опухоли с рестрикцией по антигенам главного комплекса гистосовместимости [48, 52].

Меланома считается иммуногенной опухолью [12, 21], экспрессирующей опухолеассоциированные антигены: раково-тестикулярные антигены [25] (MAGE), меланоцитные дифференцирующие антигены (тирозиназа, тирозиназа-связанные белки TRP-1/-2, MelanA/MART-1, gp 100 и gp75) [10]. Специфический клеточный иммунный ответ на меланомные антигены происходит путем узнавания чужеродных пептидов рецепторами Т-клеток посредством молекул главного комплекса гистосовместимости (МНС) дендритных клеток [20, 52].

Характер опухолевого роста во многом зависит от эффективности

иммунологических защитных механизмов и от способности

трансформированных клеток уходить от иммунологического надзора. К

белкам, способным регулировать иммунные механизмы и выступать в

качестве факторов ухода опухоли от иммунологического контроля, относятся

растворимые формы мембранных антигенов клеток иммунной системы [32].

Каждая из растворимых дифференцировочных молекул или растворимых

молекул гистосовместимости может быть представлена несколькими

изоформами, образующимися за счет шеддинга с мембраны клетки или

альтернативного сплайсинга матричной РНК [27, 30, 31]. Они осуществляют

5

множественные функции, модулируя иммунные реакции путем связывания с лигандами своих мембранных гомологов на поверхности клеток, и являются межклеточными белковыми коммуникаторами. В норме растворимые формы мембранных антигенов находятся в равновесном состоянии. Нарушение их равновесного содержания в межклеточном пространстве и биологических жидкостях организма приводит к модуляции межклеточных мембранных взаимодействий и, соответственно, иммунного ответа. Уровень растворимых молекул HLA I класса, антигена CD8 и растворимого комплекса HLA I - CD8 показывает состояние Т-клеточного иммунного ответа [51, 59, 98, 119, 120].

Межклеточная сигнализация в иммунной системе осуществляется также с помощью цитокинов [16, 17, 38, 41]. Это белковые или полипептидные продукты активированных клеток иммунной системы, которые являются медиаторами межклеточных коммуникаций при иммунном ответе, осуществляют взаимосвязь между специфическим иммунитетом и неспецифическими защитными реакциями, действуя в обоих направлениях. Изменение равновесия клеточного Thl и гуморального Th2 звена приводит к существенным изменениям иммунных реакций у больных меланомой в процессе вакцинотерапии [13, 24, 33, 88, 108, 118].

В процессе противоопухолевой вакцинотерапии в сыворотке крови больных меланомой могут образовываться антитела против антигенов, которые экспрессируются в клетках, используемых для вакцины. По данным литературы, роль гуморальных антител в противоопухолевой защите неоднозначна [1, 35]. В некоторых работах выявлено их защитное действие, в других - противоопухолевые антитела содействуют прогрессивному росту опухоли [42, 61]. В связи с этим является актуальным изучение гуморального иммунного ответа при аллогенной и аутологичной вакцинации на основе опухолевых клеток у больных диссеминированной меланомой.

Цель работы

Изучить гуморальное звено противоопухолевого иммунитета в процессе вакцинотерапии больных с диссеминированной меланомой.

Задачи исследования

Оценить уровень растворимой формы молекулы HLA I класса в сыворотке крови у больных диссеминированной меланомой как предполагаемый прогностический маркер для контроля над состоянием иммунологической системы организма при вакцинотерапии.

2. Оценить значение содержания уровня растворимого антигена CD8 в сыворотке крови у больных диссеминированной меланомой в процессе вакцинотерапии.

3. Определить уровень растворимого комплекса HLA-I-CD8 в сыворотке крови у больных диссеминированной меланомой в процессе вакцинотерапии.

4. Определить уровни цитокинов ИЛ-2, ИЛ-12, ИЛ-4, ИЛ-10 у больных диссеминированной меланомой в процессе вакцинотерапии.

5. Определить появление в сыворотке крови у больных диссеминированной меланомой антител против опухолеассоциированных антигенов в процессе вакцинотерапии.

Научная новизна

Впервые исследованы растворимые молекулы HLA I, растворимый антиген CD8 и растворимый комплекс HLA I-CD8 в сыворотке крови больных диссеминированной меланомой в процессе вакцинотерапии.

Впервые выявлена прогностическая значимость повышенного уровня растворимых молекул HLA I класса, белка S-100 и интерлейкина-2 (ИЛ-2) у

больных диссеминированной меланомой в процессе вакцинотерапии аутоло-гичными дендритными клетками.

Впервые выявлено образование противоопухолевых антител в сыворотке крови больных диссеминированной меланомой в процессе вакцинотерапии вакциной Мелавак.

Научно-практическая значимость:

Обнаружены новые прогностические маркеры у больных меланомой: уровень растворимых сывороточных антигенов - растворимые молекулы HLA I, растворимый антиген CD8, белок S-100 и ИЛ-2. Полученные данные имеют мониторинговую значимость и могут быть использованы для разработки новых методов оценки эффективности терапии больных.

Целесообразно использовать образование специфических антител в сыворотке крови больных диссеминированной меланомой при оценке иммунологической эффективности противоопухолевой вакцинации.

Глава 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. БИОТЕРАПИЯ

Несмотря на успехи в хирургическом, химиотерапевтическом или радиологическом лечении злокачественных заболеваний, рак по-прежнему остается фатальной болезнью. На рубеже тысячелетия появилось новое направление в лечении опухолей - биотерапия, подразумевающая лечение опухолей препаратами биологического происхождения. Одним из ведущих направлений в биотерапии является вакцинотерапия рака [6, 7, 8, 19, 22, 26, 46, 47, 63]. Мечта иммунологов, родившаяся во времена Пауля Эрлиха, стимулировать иммунный ответ против оставшихся после хирургического и химиотерапевтического лечения опухолевых клеток, не смогла реализоваться в течение всего 20-го столетия. Однако бурный прогресс в молекулярной биологии и генетике, произошедший в течение последних 10 лет, дал возможность реализовать эту мечту, и сегодня онкоиммунология переживает настоящий ренессанс. Был достигнут прогресс в понимании основных иммунологических феноменов, отрывший подходы к механизмам регуляции иммунной системы. Появилась реальная возможность модифицировать опухо-леассоциированные антигены и сделать их более иммуногенными, а также модифицировать некоторые компоненты иммунного ответа и сделать его способным продуцировать цитотоксические опухолеспецифические клетки. На экспериментальных моделях, а затем в клинике показали возможность вакцинотерапии опухолей.

Противоопухолевые вакцины предполагается использовать в следующих случаях:

2. у больных, чьи опухоли только частично ответили на общепринятую терапию и есть шанс, что иммунизация убьет оставшиеся опухолевые клетки;

3. у больных, чьи опухоли полностью излечены, но есть риск развития метастазов;

4. у больных, чьи опухоли резистентные к общепринятой терапии [93]. Предполагается, что вакцинотерапия будет наиболее успешна у больных с минимальной остаточной болезнью, т.к. трудно предположить, что иммунная система может справиться с большой опухолевой массой.

В настоящее время идентифицированы различные опухоле-ассоциированные, опухолеспецифичные и опухолерестректированные антигены и пептиды [43, 50]. Потенциальными мишенями опухолеспецифичных Т-клеток могут быть:

A. Чужеродные пептиды (вирусные)

Б. Модифицированные аутопептиды:

1. Мутированные пептиды (ms, р53)

2. Рекомбинантные белки (bcl-abl)

B. Немутированные аутобелки:

1. Тканеспецифичные (меланоцит, ткань яичек)

2. Онкофетальные белки (альфа-фетопротеин)

3. Амплифицированный белок (Her-2/neu).

В ряде недавно проведенных исследований показано, что опухолеспецифичные Т-лимфоциты присутствуют у больных с опухолями разных типов, включая меланому, рак яичка и почки, саркому, карциномы головы и шеи, глиобластому и др.[57, 63, 65, 69, 104, 112, 113]. Наиболее хорошо изучены опухолеассоциированные антигены меланомы человека [6, 7, 103]. К ним относятся аутобелки (семейство MAGE), меланоцит- и меланомаспецифичные белки (тирозиназа, gplOO, MART-1). Аутобелки

распознаются в комплексе с антигеном HLA-A1, а меланомаспецифические белки тирозиназа, gplOO и MART - в комплексе с антигеном HLA-A2. Генное семейство MAGE включает 12 генов. Антиген MAGE-1 экспрессирован примерно у 40% больных меланомой. Антиген также представлен у некоторых больных раком молочной железы, легких, гортани и саркомой. Поскольку антиген HLA-A1 экспрессирован у 25% населения европеоидной расы, a MAGE-1 экспрессирован на 40% меланом, то иммунотерапию антигеном MEGE-1 можно проводить приблизительно у 10% больных меланомой.

Цитотоксические Т-лимфоциты (ЦТЛ) распознают немутированные пептиды тканеспецифического белка тирозиназы, которая в норме экспрессирована на ранних этапах дифференцировки миелоцита. Недостатком тирозиназы как мишени противоопухолевой терапии является то, что в процессе дифференцировки меланомных клеток она исчезает и не все опухолевые клетки ее экспрессируют. В первую очередь, это касается метастазов меланомы. ЦТЛ, кроме того, распознают гликопротеид gplOO, а также антиген MART-1, представленный на меланомных клетках, нормальных меланоцитах и в сетчатке глаза.

Некоторые опухолеассоциированные антигены выявляются с помощью моноклональных антител. Карциномы экспрессируют антигены TAG-72, HMW, Lex. Опухоли желудочно-кишечного тракта содержат белок 38 кД, gp72, высокомолекулярный гликопротеид, раково-эмбриональный антиген. При раке легких выявлен рецептор фактора роста эпидермиса. В опухолях яичника имеется гликопротеид 38-40 кД и антиген СА125. Маркером рака предстательной железы является простатоспецифический антиген. В меланомных клетках моноклональные антитела определяют gplOO, р97, HMW-MMA, ганглиазиды GD2 и GD3. Все перечисленные антигены являются мишенями при вакцинотерапии рака [6, 66].

За последнее десятилетие появились новые сведения о путях презентации антигенов, механизмах регуляции и реализации иммунного ответа [4, 6, 8, 9, 18, 20, 26], вселяющие оптимизм в способность индуцировать в организме иммунный ответ против опухоли и создать эффективные противоопухолевые вакцины [68, 72, 74, 78, 89, 96, 116].

Вакцинотерапия рака началась с применения цельноклеточной вакцины. В первых исследованиях по активной специфической противоопухолевой терапии, проведенных на экспериментальных животных и на человеке в 70-е годы, в качестве иммуногена использовались исключительно цельные опухолевые клетки. Последние были и остаются «золотым стандартом» при создании вакцин. Аутологичные цельные опухолевые клетки имеют практически все антигены, необходимые для создания вакцины. Однако терапевтический эффект при использовании цельноклеточных вакцин был редким и невоспроизводимым. Добавление микробных адъювантов повышало эффект цельноклеточных вакцин при меланоме до 10 - 20%. Цельноклеточные вакцины чаще всего применялись при меланоме, немелкоклеточном раке легких и аденокарциноме толстого кишечника. Меланома является наиболее излюбленной моделью при вакцинотерапии, т.к. хорошо известны случаи спонтанной регрессии первичных и метастатических опухолей, опухолевый материал легко доступен и отсутствуют альтернативные высокоэффективные способы лечения этого заболевания [7, 12, 20, 97].

В последние годы интерес к цельноклеточным вакцинам снова возрос, т.к. благодаря методам генной инженерии можно ввести в опухолевую клетку новые гены антигенов или гены цитокинов, повышающие их иммуногенность

Повысить эффективность противоопухолевых вакцин пытались с помощью вирусов. Вирусы, размножаясь в опухолевых клетках, индуцируют образование новых антигенов на поверхности опухолевых клеток. Идеолог

создания таких вакцин проф. Г.Я.Свет-Молдавский назвал этот феномен «искусственной гетерогенизацией опухолевых клеток под влияние вирусной инфекции», а В.Stuck и соавт. предложили термин «антигенная конверсия». Мышиные опухоли гетерогенизированные вирусом не растут у сингенных мышей. Защитный иммунитет против опухоли можно индуцировать у нормальных животных введением вирусного онколизата, продукта вирусного онколизиса, приготовленного из той же самой опухоли. В клинических исследованиях эти противоопухолевые вакцины назывались вирусными онколизатами. В настоящее время этот вид терапии применяется лишь для больных, имеющих опухоли, традиционно именуемые иммуногенными: меланома, рак толстой кишки и рак яичников. Большие возможности для получения вирусных онколизатов открывает рекомбинантная биотехнология. С ее помощью можно конструировать рекомбинантную вакцину, содержащую все потенциальные опухолеассоциированные антигены, способные создать эффективный противоопухолевый иммунитет, а также использовать рекомбинантные вирусы, например, рекомбинантный вирус осповакцины, включающий ген интерлейкина-2.

Третьим, более привлекательным подходом к конструированию противоопухолевых вакцин является их изготовление из чистых антигенов. В клинических исследованиях изучали вакцины, приготовленные из ганглиозидов, рекомбинантных белков, иммуногенных пептидов, углеводов муцина или антиидиотипических моноклональных антител. Основные преимущества этого подхода в том, что очищенные вакцины легче характеризовать, воспроизводить, контролировать, регистрировать. Недостатком является сложность в подборе пациента для вакцинации.

Перспективным является разработка геноинженерных противоопухолевых вакцин. Этот метод еще называют генотерапией рака. Генотерапия - это способ лечения, при котором функционирующий ген вводится в соматические клетки больного с целью исправления врожденных

генетических нарушений или для придания клеткам новых биологических качеств, которые позволяют добиться благоприятного терапевтического эффекта. Агент, который используется в качестве молекулярного носителя одного гена или комплекса генов и служит для переноса в реципиентные клетки, называется вектором. Вектор может представлять собой просто фрагмент ДНК или РНК, или те же молекулы, включенные в липосомы или вирусный вектор.

Перспективным представляется направление, при котором ген трансфекцируется в опухолевые клетки. С этой целью используются гены фактора некроза опухоли, интерлейкина-2, интерлейкина-4, интерферона-гамма, гранулоцитарно-макрафагального колониестимулирующего фактора (ГМ-КСФ), антигенов гистосовместимости. Большинство этих протоколов все еще продолжается. В нашей стране проходит испытание генно-инженерная вакцина, на основе гена Tag-7 [Георгиев Г.П. и др.]. Tag-7 - это цитокин, стимулирующий иммунный ответ. Очень перспективными являются дендритные вакцины [3, 4, 23, 26]. Дендритные клетки представляют лимфоцитам опухолеассоциированные антигены вместе с антигенами гистосовместимости. Таким образом, благодаря успехам в биотехнологии и молекулярной биологии появилась возможность конструировать противоопухолевые вакцины, способные индуцировать эффективный иммунный ответ у больного. Можно ожидать, что интенсивный поиск эффективной противоопухолевой вакцины приведет к созданию технологичного препарата, который займет достойное место в онкологической клинике [6].

1.2. МЕХАНИЗМЫ ПРОТИВООПУХОЛЕВОГО ИММУНИТЕТА

доказательство иммуногенности опухолей, в частности, выявление ОАА, способных индуцировать клеточный и гуморальный иммунные ответы; идентификация и характеристика цитокинов, участвующих в противоопухолевой защите; раскрытие клеточно-молекулярных механизмов ускользания опухоли от иммунного ответа [9, 35, 36, 38, 57, 66].

Исследования на экспериментальных моделях животных и у человека показали, что защита от опухоли осуществляется с помощью различных типов клеток (Т-лимфоциты, МС-клетки, макрофаги, нейтрофилы, эозинофилы, эритробласты, тромбоциты), обладающих специфическим и неспецифическим цитотоксическими эффектами, а также антител. Многие из клеточных эффектов реализуются через действие растворимых факторов -цитокинов [16, 17, 18].

Центральная роль в противоопухолевом ответе отводится клеточному иммунитету, опосредованному естественными киллерными клетками и специфическими цитотоксическими лимфоцитами (ЦТЛ). При этом считается, что наибольшим цитотоксическим потенциалом обладают ЦТЛ. Генерация ЦТЛ требует наличия 2-х сигналов. Первым сигналом служит распознавание СБ8+ Т-клетками опухолевых антигенов в комплексе с МНС-антигенами I класса. Вторым — продукция 1Ь-2 и других цитокинов СОА+ Т-клетками. Активация последних происходит в процессе распознавания СЭ4+ Т-клетками опухолевых антигенов в ассоциации с МНС-антигенами II класса. После полноценной активации ЦТЛ лизируют опухолевые клетки через высвобождение перфоринов, либо запускают программированную клеточную гибель опухолевых клеток через Раз/ГазЬ путь [95].

Участие клеток В-системы в противоопухолевом иммунитете может проявляться несколькими способами:

1) разрушением опухолевых клеток антителами, фиксирующими комплемент;

2) накоплением №С-клеток, которые имеют на своей поверхности цитофильные антитела.

Иммунный ответ организма на опухоль, по-видимому, мало чем отличается от реакции на какие-либо другие антигены, то есть, основными во всех случаях являются процессы регуляции иммунного ответа [29, 38]. В то же время процесс регуляции — положительный или отрицательный по отношению к опухолевому росту — зависит от комплекса взаимодействующих эффекторных и регуляторных клеток. Очевидно, что для обеспечения максимальной эффективности контроля регуляторные механизмы должны воздействовать на различные субпопуляции клеток-эффекторов, вовлекаемых в иммунный ответ. Особое значение в этой регуляции играют МС-клетки. Большинство проведенных исследований у онкологических больных показали снижение ЫК-активности в исследуемых группах по сравнению со здоровыми донорами, причем по данным различных авторов они выявлялись как на ранних стадиях, так и при диссеминации опухолевого процесса. С другой стороны, имеются данные об отсутствии подавления ЫК-активности у онкологических больных, а также данные, связывающие низкие показатели №С с плохим прогнозом заболевания [3, 106].

Несмотря на наличие в организме механизмов противоопухолевой защиты, существует проблема «ускользания» опухоли от иммунного надзора возможным объяснением которой может быть:

• низкая иммуногенность злокачественных опухолей;

• потеря антигенов некоторыми субпопуляциями опухолевых клеток;

• дефекты в механизме экспрессии антигенов главного комплекса гистосовместимости;

• периферическая локализация опухолевых клеток, затрудняющая попадание большого количества опухолевого антигена в лимфоидные органы, которая может приводить к презентации опухолевого антигена без костимулирующих сигналов, следствием чего является толерантность вместо активации [20, 21].

На основании вышеизложенного, интересы многих исследователей сфокусированы на разработке методов стимуляции/усиления иммунного ответа как одной из важных составляющих противоопухолевой терапии.

1.3. РАСТВОРИМЫЕ ФОРМЫ МЕМБРАННЫХ АНТИГЕНОВ КЛЕТОК ИММУННОЙ СИСТЕМЫ

Клетки иммунной системы характеризуются большим разнообразием поверхностных антигенов, экспрессирующихся на разных этапах гемопоэза и характеризующих направление дифференцировки. Каждой стадии дифференцировки соответствует собственный набор клеточных поверхностных антигенов [32]. Поверхностные антигены являются маркерами различных клеточных популяций. Тридцать лет назад было обнаружено, что у белков, присутствующих на мембране клеток иммунной системы, могут быть растворимые гомологи. Такие гомологи обнаруживаются в биологических жидкостях, в том числе в крови, в разных концентрациях [27, 30, 31]. Существует два основных способа образования растворимых форм мембранных антигенов клеток иммунной системы. Первый из них - это протеолитическое отщепление внеклеточной части мембранных белков с поверхности клеток, называемое шеддингом (протеолитическим отщеплением с мембраны клетки). В реализации шеддинга участвуют как внеклеточные цинкнезависимые матричные протеиназы, так и внутриклеточные протеолитические ферменты. Среди внутриклеточных протеиназ, осуществляющих отщепление мембранных

W С« /О

антигенов леикоцитов, можно назвать лейкоцитарную эластазу и катепсин Ст. Они запасаются во внутриклеточных гранулах и высвобождаются при активации клеток. Растворимая форма, образованная путем протеоли-тического шеддинга, характеризуется отсутствием внутриклеточного и трансмембранного доменов и вследствие этого имеет меньшую молекулярную массу, чем мембранная форма. Присутствующие в ее составе внеклеточные домены, как правило, сохраняют свои функциональные возможности, что существенно для выполнения биологической роли, связанной с регуляцией иммунного ответа. Шеддинг чаще всего является следствием активационных процессов, затрагивающих различные популяции клеток. Экспрессия мембранных и растворимых форм дифференцировочных антигенов имеет различные механизмы регуляции, а повышение уровня экспрессии мембранного антигена не обязательно влечет за собой увеличение уровня растворимой формы антигена во внеклеточном пространстве и наоборот [32].

Многие растворимые формы появляются за счет альтернативного сплайсинга матричной (информационной) РНК, приводящего к образованию укороченного транскрипта, соответствующего растворимой форме мембранного антигена. При сплайсинге матричной РНК (мРНК) чаще всего исключается экзон, кодирующий трансмембранный участок. В результате образуется форма белка, не способная заякориться на мембране и продуцирующая во внеклеточное пространство. Альтернативный сплайсинг мРНК известен для множества мембранных антигенов клеток иммунной системы, в том числе для таких широко известных и функционально важных антигенов, как Fas (CD95) антиген, опосредующий апоптоз, ICAM-1 (CD54) антиген адгезии, молекулы гистосовместимости I и II классов. Во многих случаях синтезируется несколько форм матричной РНК, соответствующих различным растворимым изоформам антигена.

Растворимые формы одного и того же мембранного антигена нередко могут образовываться и путем альтернативного сплайсинга, и за счет протеолитического шеддинга. В результате в крови могут обнаруживаться обе формы. Предполагается, что преобладание синтеза той или иной растворимой формы зависит от типа клетки и суммы поступающих в нее регуляторных сигналов. Известно также, что оба механизма могут участвовать в образовании растворимой молекулы одного и того же дифференцировочного антигена. Растворимая форма рецептора фактора стволовых клеток (CD117 антиген) появляется за счет последовательного включения альтернативного сплайсинга и протеолиза. В этом случае за счет альтернативного сплайсинга в участок полипептидной цепи между внеклеточным и трансмембранным участком включается 4 добавочных аминокислоты. Это создает сайт протеолитического отщепления с последующим образованием растворимой формы CD117 антигена [32].

Существует еще одна группа антигенов, которые условно также можно отнести к растворимым. В опытах in vitro исследователями было показано, что везикулы, несущие комплекс молекул HLA II класса с антигенным пептидом, способны отпочковываться от мембраны В-лимфоцитов и образовывать так называемые «экзосомы». Экзосомы, происходящие от человеческих и мышиных В-лимфоцитов, индуцировали антигенспецифичный рестриктированный по HLA II класса Т-клеточный ответ, являясь антигенпрезентирующимися везикулами [102]. Подобные везикулы с аналогичной функцией были обнаружены и при культивировании других антигенпрезентирующих клеток [49]. Везикулы настолько малы, что осаждаются только ультрацентрифугированием и, с точки зрения физики и химии, представляют собой взвешенные в растворе частицы. Кроме антигенов гистосовместимости, они несут на своей мембране другие белковые антигены, принимающие участие в межклеточных взаимодействиях. При наличии таких везикул в биологических жидкостях их

мембранные белки могут определяться иммуноферментным методом как растворимые антигены.

При наличии соответствующих моноклональных антител растворимые формы мембранных антигенов могут быть выявлены с помощью иммуноферментного анализа [5, 11, 32].^ Многие заболевания сопровождаются изменением их уровня в крови и других биологических жидкостях [28, 32, 120].

Растворимые формы мембранных антигенов участвуют в регуляции иммунологических механизмов на разных этапах реализации иммунного ответа. Нарушение их равновесного содержания в межклеточном пространстве и биологических жидкостях организма приводит к модуляции межклеточных мембранных взаимодействий и, соответственно, иммунного ответа. В связи с этим растворимые формы мембранных антигенов рассматривают в качестве эндогенных иммуномодуляторных молекул, интегрированных в глобальную иммунологическую сеть. В настоящее время охарактеризовано более 240 дифференцировочных антигенов лейкоцитов, классифицированных на международных семинарах [31].

Различают три основные группы мембранных белков клеток иммунной системы, имеющих растворимые формы.

Первая из них - это молекулы главного комплекса гистосовместимости. У человека продемонстрировано существование растворимых форм молекул HLA I и II классов. Они образуются тремя путями: с помощью протеолитического шеддинга, альтернативного сплайсинга мРНК, а также включаются в состав экзосом.

Экспериментально показано, что растворимые молекулы HLA I класса модулируют реактивность Т-клеток и стимулируют апоптоз in vitro. Так, сывороточный HLA I класса может связываться с CD8 молекулами на поверхности цитотоксических Т-клеток, препятствуя распознаванию презентируемых антигенных пептидов и вызывая продукцию растворимого

Fas-лиганда. Секретирующийся растворимый Fas-лиганд, выступая в роли аутокрииного фактора, способен взаимодействовать с мембранным Fas (CD95) антигеном на этих же клетках с последующей инициацией апоптоза цитотоксических CD8- положительных Т-лимфоцитов. При этом повышенная продукция растворимых молекул гистосовместимости может осуществляться одними клетками, а эффекторное воздействие может оказываться на другие клетки [119]. Известны молекулярные механизмы, вовлеченные в продукцию Т-клетками Fas-лиганда после взаимодействия растворимых молекул HLA I класса с CD8 антигеном на поверхности клетки. Они включают активацию протеинкиназ р56 и Zap-70, кальмодулина и образование факторов инициации транскрипции NF-AT и NF-kB [59]. Хорошо известны также растворимые формы неклассических молекул главного комплекса гистосовместимости, обозначаемых у человека как молекулы HLA класса G. Продемонстрирована их важная роль в поддержании иммунологической толерантности матери по отношению к плоду в ходе беременности [80].

Вторая группа мембранных белков клеток иммунной системы, имеющих растворимые формы - это рецепторы цитокинов. Для значительной части рецепторов цитокинов известны растворимые гомологи, образующиеся как путем шеддинга, так и путем альтернативного сплайсинга матричной РНК. К этой обширной группе растворимых антигенов относятся растворимые рецепторы интерлейкинов -1, -2, -4, -5, -6, -7, -9, рецептор интерферона-альфа, TNF-рецепторы и многие другие. Продемонстрировано иммуномодулирующее действие цитокиновых рецепторов, заключающееся в дозозависимом торможении или активации разных звеньев иммунной системы [75].

К третьей категории мембранных антигенов, имеющих растворимые изоформы, можно отнести обширную группу дифференцировочных антигенов, представленных разнообразными белками, принимающими

участие в созревании клеток иммунной системы и выполнении ими своих эффекторных функций. Примерами таких белков являются антигены группы ICAM (CD50, CD54), Fas (CD95) антиген и Fas-лиганд (CD154), CD14 антиген, связывающий бактериальный липосахарид в комплексе с другими белками. В 2003 году было показано существование растворимой формы CD18 антигена, являющегося общей цепью для (32-интегринов и многие другие [32].

В норме растворимые формы мембранных антигенов находятся в равновесном состоянии. Изменение концентрации растворимой формы какого-либо мембранного антигена может вызвать нарушение гомеостатического равновесия и модуляцию иммунного ответа. Обнаружено, что при урогенитальном хламидиозе происходит неравновесное повышение концентрации растворимого ICAM-1 антигена и растворимого CD18 антигена, входящего в состав его лиганда - LFA-1 антигена [67]. В результате регистрируется более высокий уровень растворимого ICAM-1 антигена, который не может быть нейтрализован его растворимым партнером и потенциально способен к иммуномодулирующим эффектам.

Изменения в концентрации растворимых антигенов обнаруживаются в крови и других биологических жидкостях организма при различных нарушениях гомеостаза, отражая активность патологических процессов, протекающих в организме. Сывороточное содержание растворимых дифференцировочных антигенов, растворимых рецепторов цитокинов, молекул главного комплекса гистосовместимости связано с патогенетическими механизмами развития многих иммуноопосредованных заболеваний, таких, например, как сахарный диабет, псориаз, бронхиальная астма, ожоговая травма, сердечно-сосудистые заболевания. В ходе исследований, проводимых различными лабораториями, показана несомненная прогностическая и мониторинговая значимость сывороточного уровня растворимых форм ряда мембранных антигенов [32, 75].

Таким образом, растворимые формы поверхностных антигенов клеток иммунной системы человека принимают участие в реализации различных звеньев иммунного ответа, являясь одновременно результатом реализации иммунологических механизмов. Изменение их концентрации в биологических жидкостях дает важную мониторинговую, прогностическую информацию при широком спектре иммуноопосредованных заболеваний. Пул растворимых антигенов клеток иммунной системы является важной составляющей глобальной иммунологической сети, функция которой в норме направлена на сохранение гомеостатического равновесия организма.

1.3.1. Растворимые формы молекул главного комплекса гистосовместимости НЬАI класса

Молекулы НЬА I класса (НЬА I) - чрезвычайно важные для осуществления иммунного ответа полиморфные трансмембранные белки, обеспечивающие распознавание иммунной системой чужеродных антигенов и аутоантигенов [45]. Они присутствуют на всех типах клеток, за исключением эритроцитов и клеток ворсинчатого трофобласта и построены из двух полипептидных цепей. Тяжелая цепь (а-цепь) имеет молекулярную массу 43 кДа и состоит из трех внеклеточных доменов а1, а2, аЗ, гидрофобного трансмембранного участка и короткой гидрофильной области, выходящей в цитоплазму. Тяжелая цепь молекулы НЬА I нековалентно связана с легкой цепью - [32-микроглобулином, имеющим молекулярную массу 12 кДа. Наиболее значимой особенностью молекулы НЬА является строение а1- и а 2-доменов, которые вместе образуют так называемую «щель Бьоркмана», стенки которой построены внутренними поверхностями а-спиралей, а дно - (3-слоем. Со стенками щели Бьоркмана связаны все гипервариабельные остатки молекулы. Эта щель заполняется пептидным фрагментом антигена и является структурной основой презентации антигена. Длина встраиваемого пептида составляет 7-13 остатков, закрепление пептида

происходит в двух краевых участках. Пептидные фрагменты белков, присутствующих в цитоплазме клетки, связываются молекулами гистосовместимости в цистернах шероховатого эндоплазматического ретикулума. Образовавшийся комплекс транспортируется на поверхность клетки, где происходит его представление CD8+-T-лимфоцитам. Распознавание комплекса осуществляется Т-клеточным рецепторным комплексом и корецептором CD8 [98, 119]. Молекулы HLA I класса распознаются также рецепторами натуральных киллеров. Природа и механизм распознавания рецепторов натуральных киллеров отличается от распознавания Т-клеточного рецептора.

В начале 80-х годов прошлого века было обнаружено существование растворимых форм молекул HLA I и II классов. Структура молекул sHLA оказалась сходной с таковой мембранных форм HLA. Растворимая форма HLA I класса была обнаружена в различных биологических жидкостях: сыворотке, плазме, перитонеальных диализатах, слюнной жидкости и моче [32, 98]. Известно, что растворимые молекулы HLA I класса могут существовать как в виде гетеромера « (32-микроглобулин - a-цепь», так и в виде a-цепи, свободной от р2-микроглобулина [99, 120]. Было установлено, что значительные количества sHLA I секретируются активированными лимфоцитами как in vitro, так и in vivo. Активация может происходить в результате воздействия митогенов, различных антигенов и аллоантигенов. Причем растворимую форму sHLA I секретируют in vivo как Т- так и В-лимфоциты Растворимая молекула HLA I класса может быть продуктом мембранного шеддинга, протеолиза и/или альтернативного сплайсинга матричной РНК [32].

Физиологическая концентрация sHLA I изменяется более чем в десять раз в зависимости от фенотипа человека и значительно повышается при различных болезнях и в процессе воспаления. Это говорит о том, что sHLA I может служить маркером различных патологических изменений в организме

[32]. Увеличение концентрации sHLA I происходит в случаях, когда активированы популяции Т-лимфоцитов. Повышенные уровни растворимых молекул HLA I класса наблюдаются при различных инфекционных, воспалительных и аутоиммунных заболеваниях. Кроме того, растворимые молекулы HLA I класса способны вызвать апоптотическую гибель натуральных киллеров, которые, подобно CD8 - положительным цитотоксическим Т-лимфоцитам, служат важными эффекторами противоопухолевого иммунитета. Изменение сывороточного уровня растворимых молекул HLA I класса наблюдается в организме человека при различных патологиях. Высокая концентрация растворимых молекул HLA I класса и растворимого Fas-лиганда обнаружены в крови больных острым миелобластным лейкозом. Сыворотка крови таких больных способна индуцировать синтез матричной РНК и секрецию Fas-лиганда в CD8 -положительных клетках и их апоптоз. Апоптоз цитотоксических клеток ингибировался моноклональными антителами против молекул HLA I класса. Это подтверждает данные о том, что растворимые молекулы HLA I класса ответственны за апоптотическую гибель цитотоксических клеток. В лимфоцитах периферической крови больных острым миелолейкозом повышен уровень транскрипции гена, кодирующего Fas-лиганд, количество мРНК антиапоптотических белков Bcl-2, Bcl-x (L) снижено. В CD8 -положительных клетках активированы каспазы 3 и 8. Полученные результаты демонстрируют, что у больных острым миелолейкозом повышенные уровни молекул HLA I класса вносят вклад в устранение потенциально антиопухолевых клеток через систему Fas/Fas-лиганд [59]. Уровень сывороточного HLA I является важным показателем для мониторинга больных с трансплантацией костного мозга. Увеличение уровня растворимых молекул HLA I выявлено при остром и хроническом гепатите. Выявлено пониженное по сравнению с нормой содержание сывороточного HLA I у больных инсулинзависимым сахарным диабетом. Выявлены

изменения сывороточного содержания HLA I при инфекционных заболеваниях урогенитального тракта. Изменения в сывороточном уровне HLA I обнаружены при ожоговой и черепно-мозговой травме. Установлено, что развитие рака легкого сопровождается понижением растворимых молекул HLA I класса [34]. Выявлено снижение повышенного сывороточного HLA I у больных раком молочной железы на фоне озонотерапии совместно с полихимиотерапией [2]. Уровни молекул HLA I класса повышены у пациентов, страдающих лимфомой Ходжкина и при неходжкинских лимфомах. Обнаружено снижение сывороточного HLA I при раке желудка по мере прогрессирования заболевания. При множественной миеломе сывороточный уровень HLA I значительно выше, чем у здоровых людей, и повышается с прогрессированием заболевания и увеличением объема опухоли, но не с клиническим течением заболевания [32]. В 2010 году израильские ученые под руководством Мишеля Бассани-Стернберга из Израильского технологического института (Techion-Israel Institute of Technology) предложили новый метод использования молекул sHLA. Авторы считают, что по специфичным белкам можно не только прогнозировать неблагоприятный исход болезни, но также диагностировать онкологические заболевания [51].

1.3.2. Растворимый сывороточный антиген CD8

CD8 антиген является поверхностным гликопротеином, найденным на мембране большинства цитотоксических Т-лимфоцитов и части натуральных киллеров. Он обеспечивает эффективное взаимодействие клеток при презентации антигенов цитотоксическим Т-лимфоцитам, является корецептором Т-клеточного рецептора и обеспечивает распознавание антигенов, презентируемых в контексте молекул главного комплекса системы гистосовместимости I класса. Растворимый CD8 антиген продуцируется активированными С08-положительными цитотоксическими

клетками. Сывороточный уровень растворимого CD8 антигена служит маркером активации цитотоксических клеток. В то же время, взаимодействуя с молекулами HLA I класса, он тормозит цитотоксическое действие клеток, препятствуя их активации и пролиферации. Добавление интерферона гамма к смешанной культуре лимфоцитов приводит к освобождению sCDS-молекул. При этом концентрация растворимых СБ4-молекул падает, что свидетельствует об активации цитотоксического звена клеточного иммунного ответа. Сумма накопленных к настоящему времени данных дает основание рассматривать растворимый CD8 антиген в качестве фактора супрессии иммунного ответа [96]. Обнаружено повышение растворимого CD8 антигена в сыворотке крови при ВИЧ-инфекции. Повышение сывороточного уровня CD8 отмечено при тяжелой механической травме. Снижение сывороточного уровня CD8 антигена является одним из показателей эффективности интерферонотерапии. Концентрация растворимого CD8 антигена повышена в крови у больных при инфекционном мононуклеозе, при болезни Лайма. Повышение его концентрации в крови указывает на участие CD8 - положительных лимфоцитов в иммунном ответе против возбудителей этих заболеваний. Повышен его уровень в крови больных при острой фазе псориаза, глюкокортикоиды, в частности дексаметазон, приводят к падению сывороточного содержания растворимого CD 8 антигена [32]. Изменения сывороточного уровня растворимого антигена CD8 обнаружены при многих онкогематологических заболеваниях [59]. При болезни Ходжкина и остром лимфобластном лейкозе его уровень имеет прогностическое значение [94].

1.3.3. Растворимый комплекс молекул HLA I класса и CD8 антиген

(HLA I - CD8)

партнеров подразумевает возможность существования в биологических жидкостях белковых комплексов, состоящих из взаимодействующих друг с другом растворимых антигенов. В составе таких комплексов растворимые дифференцировочные антигены взаимно нейтрализованы. В недавних исследованиях было обнаружено существование растворимых комплексов, построенных из 1САМ-1 и СБ 18 антигенов, 1САМ-3 и СБ 18 антигенов. Количественное содержание таких комплексов изменяется при развитии различных заболеваний, в частности вирусных гепатитов, и вносит свой вклад в иммуномодулирующий потенциал общего пула растворимых форм мембранных антигенов клеток иммунной системы [28].

Экспериментально продемонстрировано существование комплексов, состоящих из молекул НЬА I класса и СБ8 антигена (НЬА-1-СБ8) [32]. Количественное содержание таких растворимых ассоциатов молекул НЬА I класса и СЭ8 антигена изменяется при развитии заболеваний различной этиологии. Получены данные о повышении уровня растворимой формы НЬА I, СБ8 антигена, а также комплекса НЬА-1-С08 при хроническом миелолейкозе у пациентов, получавших препараты бета-интерферона в качестве предшествующей гливеку терапии [11].

1.4. ЦИТОКИНЫ

Цитокины представляют собой группу полипептидных медиаторов межклеточного взаимодействия, участвующих главным образом в формировании и регуляции защитных реакций организма при внедрении патогенов и нарушении целостности тканей, а также в регуляции ряда нормальных физиологических функций. В рамках иммунной системы цитокины осуществляют взаимосвязь между неспецифическими защитными реакциями и специфическим иммунитетом, действуя в обоих направлениях. Примером цитокиновой регуляции специфического иммунитета служит дифференцировка и поддержание баланса между Т-лимфоцитами хелперами

1-го и 2-го типов. В случае несостоятельности местных защитных реакций цитокины попадают в циркуляцию, и их действие проявляется на системном уровне, что приводит к развитию острофазного ответа на уровне организма [16, 17,41].

Межклеточная сигнализация в иммунной системе осуществляется посредством интерлейкинов при взаимодействии клеток с антигеном или друг с другом. Изучение цитокинов началось в 40-е годы XX века. Тогда впервые были описаны первые эффекты кахектина — фактора, присутствовавшего в сыворотке крови и способного вызывать кахексию или снижение массы тела. В дальнейшем этот медиатор был выделен и идентифицирован как фактор некроза опухоли (TNF). Название какого-либо медиатора проходило по изучению его одного биологического эффекта. Так в 50-е годы назвали интерферон (IFN) из-за способности интерферировать или повышать сопротивляемость при повторной вирусной инфекции. В 60-70-е годы был открыт Т-клеточный ростовой фактор [17], известный теперь как ИЛ-2, и целый ряд других молекул, стимулирующих рост и функциональную активность Т-, B-лимфоцитов и других типов лейкоцитов.

Термин «интерлейкин» был предложен в 1979 году для систематизации и обозначения медиаторов, осуществляющих связь между лейкоцитами. Однако вскоре выяснилось, что биологические эффекты этих белков распространяются за пределы иммунной системы, и поэтому более приемлемым стал ранее предложенный термин «цитокины» [60]. В девяностые годы XX века были открыты субъединичные строения рецепторов цитокинов, и сформировалось понятие «цитокиновая сеть», а в начале XXI века были открыты еще много новых цитокинов путем генетического анализа.

К цитокинам относят интерфероны, колониестимулирующие факторы (CSF), хемокины, трансформирующие ростовые факторы, фактор некроза опухолей, интерлейкины со сложившимися исторически порядковыми

номерами и некоторые другие эндогенные медиаторы. Они могут быть разделены на провоспалительные, ростовые и дифференцировочные факторы лимфоцитов, отдельные регуляторные цитокины [17, 41].

Классификация цитокинов может проводиться по их биохимическим и биологическим свойствам, а также по типам рецепторов, посредством которых цитокины осуществляют свои биологические функции. Классификация цитокинов по строению учитывает не только аминокислотную последова-тельность, но, прежде всего, третичную структуру белка, более точно отражающую эволюционное происхождение молекул.

Общие свойства цитокинов:

1. Цитокины — гликозилированные полипептиды или белки, с ММ от 5 до 50 к Да, состоящие из одной, двух, трех и более одинаковых или разных субъединиц.

2. Цитокины антигеннеспецифичны, но влияют на функциональную активность клеток и принимают участие в реакциях врожденного и приобретенного иммунитета, воздействуя на Т- и В-лимфоциты, стимулируют индуцированные антигенами процессы в иммунной системе.

3. Для генов цитокинов существует три варианта экспрессии: а) стадиоспецифическая экспрессия на определенных стадиях эмбрионального развития, б) конститутивная экспрессия для регуляции ряда нормальных физиологических функций, в) индуцибельный тип экспрессии, характерный для большинства цитокинов.

4. Цитокины синтезируются в ответ на стимуляцию на короткий промежуток времени.

5. Один и тот же цитокин может продуцироваться различными по гистогенетическому происхождению типами клеток организма в разных органах.

6. Цитокины, ассоциируясь с мембранами синтезирующих их клеток, обладают в виде мембранной формы полным спектром биологической активности и проявляют его при межклеточном контакте.

7. Биологические эффекты цитокинов опосредуются через специфические клеточные рецепторные комплексы. Цитокины, обладающие очень высокой аффинностью, связываются. Отдельные из них могут использовать общие субъединицы рецепторов. Рецепторы же могут существовать в растворимой форме, сохраняя способность связывать лиганды.

8. Цитокины обладают плейотропностью биологического действия. Один и тот же цитокин может действовать на многие типы клеток, вызывая различные эффекты в зависимости от вида клеток-мишеней. Плейотропность их действия обеспечивается экспрессией рецепторов цитокинов на разных по происхождению и функциях типов клеток и проведением сигнала с использованием нескольких разных внутриклеточных мессенджеров и транскрипционных факторов.

9. Для цитокинов характерна взаимозаменяемость биологического действия. Различные цитокины могут вызывать один и тот же биологический эффект либо обладать похожей активностью. Цитокины индуцируют либо подавляют синтез самих себя, других цитокинов и их рецепторов.

и на уровне организма зависят от присутствия и концентрации других цитокинов с синергичным, аддитивным или противоположным действием.

11. Цитокины могут влиять на пролиферацию, дифференцировку и функциональную активность клеток-мишеней.

12. Цитокины действуют на клетки различными путями: аутокринно — на клетку, синтезирующую и секретирующую этот цитокин; паракринно — на клетки, расположенные вблизи клетки-продуцента, например, в очаге воспаления или лимфоидном органе; эндокринно- дистантно на клетки любых органов и тканей после попадания в циркуляцию. В последнем случае действие цитокинов напоминает действие гормонов [17].

Изменение равновесия клеточного Thl и гуморального Th2 приводит к существенным изменениям иммунных реакций у больных с опухолями кожи [64, 88, 108, 118]. Пациенты с метастатической меланомой поздних стадий течения заболевания существуют в состоянии ТЪ2-опосредованного "хронического воспаления" [85, 87, 92], что обусловлено увеличением концентрации цитокинов ИЛ-4, -5, -6, -9, -10 в периферической крови и продукцией инфильтрирующих опухоль лимфоцитов. Преобладание данных цитокинов приводит к прогрессированию течения заболевания и увеличению процессов метастазирования [73, 84, 88, 91, 107, 110]. Процент IFN-гамма продуцирующих клеток значительно ниже у пациентов с меланомой независимо от стадии, чем у здоровых доноров[56, 101].

Пациенты с прогрессирующей меланомой имеют преобладающие реакции ТЪ2-типа против эпитопов MAGE-6, независимо от их стадии заболевания (стадия I в сравнении с IV), в то время как нормальные доноры и больные меланомой без текущего признака болезни имели выраженные Thl реакции или смешанные Thl/Th2 реакции на MAGE-6 пептиды [111].

По данным ряда авторов, при иммуногистохимическом сравнении регионарных лимфатических узлов от пациентов с меланомой (как с метастазами, так и без метастазов) и пациентов с инфекционным процессом, у обеих групп было снижено количество CD8 (+) Т-лимфоцитов, по сравнению с контрольной группой. При разгаре инфекционного процесса лимфатические узлы имели ТЬ2-опосредованные иммунные процессы, интактные лимфатические узлы имели Thl-иммунологический профиль. Показано, что похожие изменения в региональном иммунитете предшествовали процессу метастазирования при меланоме. Подобные иммунологические изменения могут объяснить процесс метастазирования меланомы лимфогенным путем [84].

Определение уровней цитокинов Th2 профиля в сыворотке пациентов с меланомой могут служить прогнозирующим фактором течения болезни [85].

Стимулирование экспрессии цитокинов Thl профиля (таких как ИЛ-2 и IFN-y) приводит к активации противоопухолевого клеточного иммунитета [71, 88]. Показано, что наличие цитокинов Thl в зоне опухолевого роста предотвращает прогрессию болезни и приводит к регрессу, в то время как инвазия ТЬ2-опосредованными клетками увеличивает потенциал для метастазирования. Худший прогноз имеют пациенты с высокими уровнями ИЛ-10 и ИЛ-6. Снижение в системном иммунном ответе могло бы быть связано с синтезом опухолевыми клетками цитокинов-иммуносупрессоров (ИЛ-10, TGF-бета, VEGF) и экспрессией на поверхности опухолевых клеток молекул FAS-L [105].

У пациентов с прогрессирующей меланомой циркулирующий профиль цитокинов отражает Th2- иммунные реакции, в то время как пациенты, отвечающие на терапию, имеют профиль Thl [86]. Предполагается, что тактика лечения, направленная на активацию и поддержку Thl-иммунного ответа, может иметь лучшую клиническую эффективность в отношении стабилизации и предотвращения опухолевого роста [107].

Иммунотерапевтические подходы должны быть направлены на преодоление системного Th2- хронического воспаления, вызванного прогрессией опухолевого роста и процессом метастазирования, для обеспечения оптимального клинического эффекта [111, 114].

По данным проведенных ранее исследований по изучению иммунотерапии с помощью IFN-alpha показано, что до начала лечения большинство пациентов с меланомой имели существенный дисбаланс Thl/Th2. Это выражалось в значительном снижении значений ИЛ-2 и IFN-гамма и выраженном увеличении уровней ИЛ-4, ИЛ-6, ИЛ-10 по сравнению со здоровыми донорами. Кроме того у некоторых пациентов были отмечено увеличенное содержание ИЛ-12 и ИЛ-15 (54% и 27%, соответственно). У всех пациентов, у которых на фоне IFN-alpha-иммунотерапии проявился ранний рецидив заболевания, были изначально значительно более низкие уровни содержания ИЛ-2 и ИЛ-12 в крови, чем у тех, кто оставался без прогрессии и, вероятно, имел более благоприятный прогноз. Динамический контроль содержания цитокинов во время IFN-alpha-иммунотерапии показал, что уменьшение концентрации ИЛ-2 и ИЛ-12 и увеличение ИЛ-6 и ИЛ-10 предшествуют рецидиву меланомы, по крайней мере за один месяц. Кроме того, постоянное увеличение TNF-альфа и sIL-2R наблюдалось у больных, которые оставались без прогрессии в течение 10-ти месячной иммунотерапии. Предполагается, что метастазирование меланомы протекает более агрессивно у пациентов, имеющих выраженный Th 2-иммунный ответ. Таким образом, изменение соотношения цитокинов Thl/Th2 может использоваться как ранний сигнал прогрессии болезни и для оценки реакции иммунотерапии [68, 85]. В проведенных ранее исследованиях показана корреляция между цитокинами Thl-профиля и случаями спонтанного репрессирования меланомы [115]. Однако достоверно не доказано, что подобные изменения иммунологического профиля вызывают регресс заболевания. В некоторых работах показано пониженное содержание ИЛ-2

до вакцинотерапии и дальнейшее его снижение в ходе лечения [82]. Существует гипотеза о том, что в основе противоопухолевого иммунного ответа лежит реакции Т-клеточно-опосредованного иммунного ответа [117]. Результаты многочисленных исследований поддерживают гипотезу, о том что можно вызвать регресс меланомы путем секреции цитокинов ТЫ-профиля активанными С04 +Т-лимфоцитами [83]. Изучение изменения уровня цитокинов в ходе вакцинотерапии у больных диссеминированной меланомой позволит использовать их в качестве одного из критериев иммунологической эффективности противоопухолевой вакцинации [24, 77, 82].

1.5. ГУМОРАЛЬНЫЙ ИММУННЫЙ ОТВЕТ

Иммунные реакции на чужеродные антигены происходят в организме при участии различных типов иммунокомпетентных клеток, таких как макрофаги, Т-хелперы, В-клетки и др. Макрофаги поглощают, перерабатывают и экспрессируют антиген в иммуногенной форме. Т-хелперы, после распознавания антигена начинают вырабатывать цитокины, обеспечивающие помощь В-клеткам. Последние, получив специфический стимул от антигена и неспецифический от Т-клеток, вступают в основной эффекторный процесс - продукцию антител. Прямое действие на чужеродные антигены без предварительной сенсибилизации оказывают естественные киллеры [38]. При опухолевом процессе в ряде случаев подобные механизмы иммунного надзора оказываются неэффективными. Поликлональность злокачественной опухоли, ее способность в процессе роста изменять антигенный состав приводят к подавлению местных иммунных реакций множественными супрессорными факторами. Изучение гуморального иммунного ответа к опухолеассоциированным антигенам (ОАА) привлекло внимание ученых еще сорок лет назад [1, 35, 36]. Многочисленные антигены на клеточной поверхности, включая муцин, онкопротеины индуцировали развитие

гуморального иммунного ответа, в некоторых случаях, появление циркулирующих иммунных комплексов. Появление методов анализа с применением количественных и полуколичественных аналитических систем позволило идентифицировать специфические антитела ко многим внутриклеточным и поверхностным опухолевым белкам. Следует отметить, что роль специфичных гуморальных факторов в противоопухолевом иммунитете неоднозначна [35]. Еще 30 лет назад была доказана природа блокирующего фактора. С учетом специфичности его действия была сформулирована концепция блокирующих антител. Согласно этой концепции, гуморальная и клеточная формы иммунного ответа на опухоль находятся в своеобразных антагонистических взаимоотношениях. Иммунные лимфоциты распознают антигенные детерминанты опухолевых клеток и уничтожают их. Гуморальные антитела, соединяясь с этими же детерминантами, не способны оказывать вредное влияние на опухолевые клетки, но экранируют их от цитопатогенного действия иммунных лимфоцитов [35]. В процессе опухолевой прогрессии, при угнетении или отсутствии киллерного эффекта Т-лимфоцитов, деструкция трансформированных клеток может осуществляться за счет цитотоксичности, опосредованной гуморальными антителами [1].

Большинство онкологов придают значение, в основном, клеточному звену иммунитета [6]. По мнению А.Ю. Барышникова, контроль за ростом и регрессией злокачественных опухолей осуществляют Т-лимфоциты, в то же время противоопухолевые антитела блокируют опухолеассоциированные антигены, тем самым способствуют ускользанию злокачественных клеток из-под иммунологического надзора. Регулируют развитие гуморального и клеточного ответа Т-хелперы. После презентации опухолевых антигенов Т-хелперы 1 типа (ТЬ-1) отвечают за развитие клеточного иммунитета, а Т-хелперы 2 (ТЬ-2) типа индуцируют гуморальный иммунитет. В зависимости от того, какой тип Т-хелперов преобладает, злокачественные клетки будут

убиты цитотоксическими Т-лимфоцитами или ускользнут от иммунного надзора. Отсутствие чужеродных генных продуктов, местная изоляция антигенов опухоли от иммунной системы, генерализованная иммуносупрессия на поздних стадиях развития опухолевого заболевания, утрата опухолевыми клетками антигенов комплекса гистосовместимости I и II классов, необходимых для презентации опухолевых антигенов, препятствуют развитию иммунного ответа и не дают возможности организму отторгнуть злокачественную опухоль [68, 70]. По мнению многих исследователей, активация естественных защитных иммунных механизмов может произойти при введении вакцин, содержащих опухолеассоциированные антигены [3, 4, 6, 20]. В некоторых работах было показано, что использование чужеродных опухолевых клеток значительно повышает иммуногенность вакцины и обеспечивает протекцию от опухолей за счет индукции у вакцинируемых животных специфического СБ8+ Т-кле-точного и гуморального ответа к ОАА собственных опухолей [70, 109]. При изучении эффективности вакцинотерапии у больных диссеминированной меланомой кожи, которые были вакцинированы полиантигенной вакциной, приготовленной на основе лизатов клеток опухолей меланомы В 16 и карциномы ЫС мыши было выявлено, что специфическая иммунотерапия с использованием данной вакцины способна стимулировать противоопухолевый клеточный иммунитет, причем наблюдалась стимуляция преимущественно меланомаспецифических Т-лимфоцитов, что обуславливало более выраженный иммунный ответ на меланомные вакцинальные антигены [42]. Однако во многих работах отмечено наличие прямой корреляции между величиной сывороточных ^М и ^О к опухолеассоциированным антигенам (ОАА) и уровнем общей и безрицидивной выживаемости пациентов [61] хотя имеются данные, опровергающие эти результаты. В работе М.А. Суровцевой [42] было показано отсутствие возрастания уровня специфических противоопухолевых

антител на фоне увеличения меланомаспецифического клеточного ответа у пациентов с достигнутым клиническим эффектом. С другой стороны, сдвиг иммунитета в сторону ТЪ 2-ответа до начала проведения лечения был характерен для группы пациентов, у которых не удалось достичь клинического эффекта на фоне проведения вакцинотерапии. У этих больных была выявлена тенденция к увеличению продукции антител как к опухолевым так и к неопухолевым антигенам контроля, так что, возможно, неблагоприятный исход заболевания связан со сдвигом ответа в сторону гуморального противоопухолевого ответа.

Большая роль системы иммунитета в борьбе со злокачественными заболеваниями не вызывает сомнений, но, на основании литературных данных [6, 7, 21], пока нет ответа на вопрос, почему при опухолевом заболевании не работают полноценно два звена иммунитета - клеточный и гуморальный. Для этого необходимы новые разработки методов определения иммуногенности опухолевых клеток, новые гипотезы и подходы к изучению развития эффективного специфического противоопухолевого иммунного ответа

Заключение диссертации по теме «Онкология», Голубцова, Наталья Валерьевна

выводы

1. Установлено, что уровни содержания растворимых молекул HLA I класса, CD8 антигена и комплекса HLA-I-CD8 в сыворотке крови у всех больных диссеминированной меланомой превышали значения содержания исследуемых растворимых антигенов в сыворотке крови здоровых доноров.

2. Выявлено, что при вакцинотерапии аутологичными дендритными клетками наблюдается снижение уровня растворимых молекул HLA I класса у больных с повышенными значениями и повышение до нормальных значений у больных с пониженным содержанием растворимого сывороточного HLA I.

3. Достоверных изменений в содержании растворимых форм CD8 антигена в образцах сыворотки крови пациентов с повышенными показателями выявлено не было, но была отмечена тенденция к понижению сывороточного содержания в группе с пониженными значениями относительно контрольной группы.

4. Выявлено понижение сывороточного содержания растворимого комплекса HLA-I-CD8 в образцах сыворотки крови больных диссеминированной меланомой в ходе вакцинотерапии в обеих группах

5. Установлено, что у пациентов с изначально повышенными значениями уровня S-100 в сыворотке крови продолжительность жизни меньше, чем у пациентов с пониженными значениями данного маркера.

6. Выявлено статистически достоверное повышение S-100 в ходе лечения у больных с пониженным HLA I и повышенным CD8. уровня S-100 в процессе вакцинотерапии аутологичными дендритными клетками менее выражено, чем у больных с пониженными значениями HLAI и повышенным CD8 в образцах сыворотки крови.

8. Установлено, что у больных с диссеминированной меланомой кожи при вакцинации аутологичной дендритной вакциной наблюдается снижение изначально повышенных сывороточных уровней относительного содержания ИЛ-4 и ИЛ-10 (ТЬ2-тип цитокинов) и повышение уровня относительного содержания ИЛ-2 (Thl-тип цитокинов), которое свидетельствует об активации клеточного звена противоопухолевого иммунитета

9. Выявлено, что у больных с диссеминированной меланомой кожи при вакцинации вакциной Мелавак образуются в сыворотке крови антитела против внутриклеточных антигенов.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Голубцова, Наталья Валерьевна, 2012 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Агеенко, А.И. Иммунитет и терапия экспериментальных опухолей /А.И. Агеенко, С.П. Гордиенко, О.Г. Саканделидзе. - Кишенев: Штиинца, 1982.-310 с.

2. Алясова, A.B. Растворимые формы молекул HLA I класса в сыворотке крови больных раком молочной железы и легкого / A.B. Алясова, Р.Г. Иегов, Е.М. Михайлова, В.В. Новиков, А.Ю. Барышников // Нижегородский медицинский журнал. - 2008. - №4. - С.98-103.

3. Балдуева, И. А. Разработка, обоснование и оценка современной биотерапии у больных солидными опухолями: Автореферат дис. докт. мед. наук: 14.00.14, 14.00.36 / И.А. Балдуева. - Санкт-Петербург, 2008. -45 с.

4. Балдуева, И.А. Противоопухолевые вакцины / И.А. Балдуева // Практическая онкология. - 2003. - Т.4, №3. - С. 157-166.

5. Барышников, А.Ю. Моноклональные антитела в лаборатории и клинике / А.Ю. Барышников, А.Г. Тоневицкий. - М.: Медицина, 1997. - 212 с.

6. Барышников, А.Ю. Принципы и практика вакцинотерапии рака / А.Ю.Барышников // Бюллетень Сибирского отделения Российской академии медицинских наук. - 2004. - Т. 2. - С. 59-63.

7. Барышников, А.Ю. Современные проблемы биотерапии злокачественных опухолей / А.Ю. Барышников, Л.В. Демидов, З.Г. Кадагидзе, И.Н. Михайлова, Г.Ю. Харкевич, Т.Н. Заботина, A.A. Борунова, И.В. Тимофеев, М.И. Лукашина, Г.З. Чкадуа, К.А. Барышников, H.H. Петенко // Вестник Московского онкологического общества. -2008.-Т. 1.-С. 6-10.

8. Барышников, А.Ю. Вакцинотерапия рака: от эксперимента к клинике / А.Ю. Барышников, Л.В. Демидов, И.Н. Михайлова, H.H. Петенко // Вестник Российской АМН. - 2007. - №10. - С.46-48.

9. Бережная, Н.М. Иммунология злокачественного роста / Н.М.Бережная,

B.Ф. Чехун В.Ф. - К.: Наук думка. - 2005. - 791 с.

10. Бурова, О.С. Получение и характеристика клеточных линий меланомы человека для создания противоопухолевых вакцин: Автореф. дис.канд. биол. наук: 14.01.12 / О.С. Бурова. - ML, 2010. - 26 с.

11. Гостюжова, Е.А. Особенности содержания растворимых молекул HLA I класса, CD8 антигена и их комплексов при хроническом миелолейкозе / Е.А. Гостюжова, В.Ф. Ликов, A.B. Караулов, В.В. Новиков // Иммунопатология, аллергология, инфектология. - 2008. - № 3. - С.ЗЗ-38.

12. Демидов, Л.В. Меланома кожи: стадирование, диагностика, лечение / Л.В. Демидов, Г.Ю. Харкевич // Русский медицинский журнал. - 2003. -Т. 11,№ 11.-С. 658-655.

13. Демидов, Л.В. Успехи и неудачи применения цитокинов в лекарственной терапии некоторых солидных опухолей / Л.В. Демидов, Г.Ю. Харкевич, И.В. Тимофеев // Практическая онкология. - 2003. -Т. 4, № 3. - С.140-146.

14. Егоров, A.M. Теория и практика иммуноферментного анализа /A.M. Егоров, А.П. Осипов, Б.Б. Дзантиев и др.- М.: Высшая школа, -1991.-288 с.

15. Жижин К.С. Медицинская статистика / К.С. Жижин. - Ростов н/Д.: изд. «Феникс», 2007. - 160 с.

16. Кадагидзе, З.Г. Цитокины / З.Г. Кадагидзе // Практическая онкология. -2003. - № 3. - С.131-139.

17. Кетлинский, С. А. Цитокины / С.А. Кетлинский, A.C. Симбирцев. -СПб: ООО «Издательство Фолиант». - 2008. - 552 с.

18. Козлов, В.А. Современные проблемы иммунотерапии в онкологии / В.А. Козлов, Е.Р. Черных // Бюллетень СО РАМН. - 2004. - № 2. -

C.13-19.

19. Коростелев С.А. Противоопухолевые вакцины / С.А. Коростелев // Современная онкология. - 2003. - № 4. - С. 1-19.

20. Моисеенко, В.М. Возможности вакцинотерапии меланомы кожи / В.М Моисеенко // Практическая онкология. - 2001. - Т. 8, № 4. - С. 5864.

21. Моисеенко, В.М. Проблемы иммунологии опухолевого роста и возможности вакцинотерапии / В.М. Моисеенко, И.А. Балдуева // Медицинский академический журнал. -2007. - Т. 7, № 4. - С. 17-35.

22. Моисеенко, В.М. Вакцинотерапия больных солидными опухолями / В.М. Моисеенко, И.А. Балдуева, К.П. Хансон // Вопросы онкологии. -1999. - Т.45 , № 3. - С. 327-332.

23. Михайлова, И.Н. Вакцинотерапия меланомы дендритными клет-ками / И.Н. Михайлова, H.H. Петенко, JI.B. Демидов // Российский биотерапевтический журнал. - 2007. - Т. 6, № 3. - С. 8-18.

24. Михайлова, И.Н. Динамика цитокинов у больных с диссемини-рованной меланомой в ходе вакцинотерапии аутологичными дендритными клетками / И.Н. Михайлова, К.А. Парсункова, И.В. Евсегнеева и др. // Иммунология.-2010,- №3-С. 131-135.

25. Михайлова, И.Н. Экспрессия раково-тестикулярных антигенов в клетках меланомы человека / И.Н. Михайлова, Д.А. Ковалевский, О.С. Бурова,

B. А. Голубева, Л.Ф. Морозова, Е.С. Воронина, И. А. Утяшев, Г.С. Аллахвердян, С. Субраманиан, Т.Т. Кондратьева, Е.А. Черемушкин, С.Л. Киселев, Л.В.Демимидов, А.Ю. Барышников, Р.ТТТ. Бибилашвили // Сибирский онкологический журнал. - 2010. - № 1 (37).-С. 29-39.

26. Москалева, Е.Ю. Перспективы создания противоопухолевых вакцин с использованием дендритных клеток человека / Е.Ю. Москалева,

C.Е. Северин // Иммунология. - 2002. - Т.23. - №1 - С. 8-15.

27. Новиков, B.B. Растворимые формы дифференцировочных антигенов гемопоэтических клеток / В.В. Новиков // Вопр. гематологии. - 1996. -№6.-С. 40-43.

28. Новиков В.В. Растворимые формы мебранных белков клеток иммунной системы при вирусных инфекциях / В.В. Новиков // Вестник Нижегор. ун-та им. Н.И. Лобачевского. - 2001. - С. 208-217.

29. Новиков, В.В. Иммунология / В.В. Новиков, H.A. Добротина,

A.A. Бабаев. - Н.Новгород: ННГУ, 2005. - 226 с.

30. Новиков, В.В. Растворимые формы мебранных антигенов клеток иммунной системы / В.В. Новиков, A.B. Караулов, А.Ю. Барышников // Иммунология. - 2007. - № 4. - С. 249-253.

31. Новиков, В.В. Новые дифференцировочные антигены человека, утвержденные на VII Международном воркшопе / В.В. Новиков, И.В. Евсегнеева // Росссийский биотерапевтический журнал. - 2003. -№3. - С. 3-6.

32. Новиков, В.В. Растворимые формы мембранных антигенов клеток иммунной системы / В.В. Новиков, A.B. Караулов, А.Ю. Барышников. -М.: изд. МИА. - 2008. - 243 с.

33. Парсункова, К.А. Цитокиновый профиль у больных с диссемини-рованной меланомой в ходе вакцинотерапии: Автореф. дис.канд. биол. наук: 14.01.12 /К.А. Парсункова. - М., 2010.-26 с.

34. Пегов, Р.Г. Содержание растворимой формы молекул HLA I класса в сыворотке крови больных раком лёгкого / Р.Г. Пегов, A.B. Алясова,

B.В. Новиков, А.Ю. Барышников // Клиническая лабораторная диагностика. - 2009. - №2. - С.38-40.

35. Петров, Р.В. Иммунология / Р.В. Петров. - М.: Медицина, 1987. - 415 с.

36. Петров, Р.В. Контроль и регуляция иммунного ответа / Р.В. Петров, P.M. Хаитов, В.М. Манько, A.A. Михайлова - Л.: Медицина. - 1981. -311 с.

37. Реброва, О.Ю. Статистический анализ медицинских данных. Применение пакета прикладных программ STATISTICA / О.Ю. Реброва. - М: МедиаСфера. - 2006. - 312 с.

38. Ройт, А. Иммунология / А.Ройт, Дж. Бростофф, Д. Мейл- М.: Мир, 2000. - 592 с.

39. Сергеева, Н.С. Значение уровня сывороточного белка S-100 при меланоме / Н.С. Сергеева, М.П. Мишунина, И.А. Силина и др. // Российский онкологический журнал. - 2007. - № 4. - С.13-16.

40. Сергеева, Н.С. Определение белка S-100 как серологического опухолеассоциированного маркера при меланоме / Н.С. Сергеева, Т.Н. Лазутина, М.П. Мишунина, и др. // Росссийский онкологический журнал. - 2008. - №2. - С. 19-22.

41. Симбирцев, A.C. Цитокины: классификация и биологические функции / A.C. Симбирцев // Цитокины и воспаление. - 2004. - Т. 3, № 2 - С. 1622.

42. Суровцева, М.А. Клинико-иммунологическая эффективность вакцинотерапии при диссеминированной меланоме кожи / М.А. Суровцева, A.A. Шишков, Г.В. Селедцова, В.А. Козлов // 2009. - № 6 (36). - С. 1218.

43. Тюряева, И.И. Опухолевые антигены // Цитология - 2008. - Т.50. - № 3. -С. 189-209.

44. Фримель, Г. Иммунологические методы / Г.Фримель, А.П. Тарасов. -М.: Медицина. - 1987. - 472 с.

45. Хаитов, P.M. Физиологическая роль главного комплекса гистосовместимости человека / P.M. Хаитов, Л.П. Алексеев // Иммунология - 2001. - № 3. - С. 4-12

47. Якубовская Р.И. Современные подходы к биотерапии рака. // Российский биотерапевтический журнал. - 2002. - №3. - С.5-14.

48. Aptsiauri, N. МНС class I antigens and immune surveillance in transformed cells / N. Aptsiauri, T. Cabrera, A. Carcia-Lora et. al. // Int. Rev.Cytol. -2007.-Vol. 256. - P.139-189.

49. Arnold, P.Y. Vesicles bearing MHC class II molecules mediate transfer of antigen from antigen-presenting cells to CD4+ T cells / P.Y. Arnold, M.D. Mannie // Eur. J. Immunol. - 1999. - Vol. 29, № 4. - P. 1363-1373.

50. Barrow, C. Tumor antigen expression in melanoma varies according to antigen and stage. / C. Barrow, J. Browning, D. MacGregor, I.D. Davis, S. Sturrock, A.A. Jungbluth // Cebón J Clin Cancer Res. - 2006. Feb. 1;12(3 Ptl).-P. 764-771.

51. Bassani-Strenberg, M. Soluble plasma HLA peptidome as a potential source for cancer biomarkers / M. Bassani-Strenberg, E. Barnea, I. Beer, I. Avivi et al.//PNAS.-2010.-Nov.-Vol. 107(44)-P. 18769-18776.

52. Beyer, M. Regulatory T cells in cancer / M. Beyer M, J.L. Schultze // Blood. -2006.-Vol. 108, N3,-P. 804-811.

53. Bonfrer, J.M. The luminescence immunoassay S-100: a sensitive test to measure circulating S-100: its prognostic value in malignant melanoma / J.M. Bonfrer, C.C. Korse, O.E. Nieweg et al. // British Journal of Cancer -1998.-Vol. 77(12).-P. 2210-2214.

54. Bonfrer, J.M. Monitoring malignant melanoma with the S-100B tumour marker / J.M. Bonfrer, C.M. Korse // Recent Results Cancer Res. - 2001. -158.-P. 149-157.

55. Bottoni, U. SI00 serum level: a tumour marker for metastatic melanoma / U. Bottom, P. Izzo A. Richetta, T.J. Mannooranparampil, V. Devirgiliis, M. Del Giudice et al. // Melanoma Res. - 2003. - 13:427-429.

56. Botella-Estrada, R. Cytokine production by peripheral lymphocytes in melanoma / R. Botella-Estrada, M. Escudero, J.E O'Connor, E. Nagore,

B. Fenollosa, O. Sanmartín, C. Requena, C. Guillén // Eur Cytokine Netw. -2005. - Jan-Mar; 16(1). - P. 47-55.

57. Boon, T. Cancer tumor antigens /T. Boon, L. Old // Curr Opin Immunol. -1997.-Vol. 9.-P. 681-683.

58. Bouwhuis, M.G. Immunologic function as prognostic indicators in melanoma / M.G. Bouwhuis, T. L. ten Hagen, A.M. Eggermont // Mol. Oncol. — 2011. — Vol. 5-P. 183-189.

59. Contini, P. In vivo apoptosis of CD8 (+) lymphocytes in acute myeloid leukemia patients involvement of soluble HLA-I and Fas ligand / P. Contini, M.R. Zochi, I. Pierri // Leukemia. - 2007. - Vol. 2. -P. 253-260.

60. Cohen, S. Characterization of the binding protein for epidermal growth factor / S. Cohen, J.M. Taylor, W.M. Mitchell // J. of boil, chemistry. - 1974. -Vol. 249(7)-P. 2188-94.

61. Chung, M.H. Humoral immune response to a therapeutic polyvalent cancer vaccine after complete resection of thick primary melanoma and sentinel lymphadenectomy / M.H. Chung, R.K. Gupta, E. Hsueh, R. Essner, W. Ye et al. // J. Clin Oncol. - 2003. -21:313-319.

62. Djureen-Martenson, E. Use of serum S-100 as a marker for prognosis and in the follow up of malignant melanoma / E. Djureen-Martenson, L.O. Hansson, B. Nilsson et al. // XXIXISOBM - 2001 - Meeting. - P. 44.

63. Dranoff, G. Vaccination with irradiated tumour cell engineered to secrete murine granulocyte-macrophage colony-stimulating factor stimulates potent, specific, and long-lasting anti-tumour immunity / G. Dranoff, E. Jaffee, A. Lazenby et al. // PNAS. - 1993. - Vol. 90. - P. 3539-3543.

64. Dranoff, G. Cytokines in cancer pathogenesis and cancer therapy / G. Dranoff// Nat. Rev. Cancer. - 2004. - Vol.4. - P. 11-22.

65. Disis, M. Oncogenic proteins as tumor antigens / M. Disis, M. Cheever // Cur. Opin. Immunol. - 1996. - Vol. 9. - P. 637-642.

66. Espinoza-Delgado, I. Cancer vaccines / I. Espinoza-Delgado // The Oncologist. - 2002. - Vol. 7. - P. 20-33.

67. Evans, B.J. Shedding of lymphocyte function-associated antigen-1 (LFA-1) in a human inflammatory response / B.J. Evans, A. McDowall, P. Taylor // Blood. - 2006. - Vol. 107. - P. 3593-3599.

68. Galili, U. Natural anti-Gal antibody as a universal augmenter of autologous tumor vaccine immunogenicity / U. Galili, D.C. LaTempe // Immunology Today.- 1997.-Vol. 18.-P. 281-285.

69. Gold, P. Specific carcinoembryonic antigens of the human digestive system /P. Gold P, S.J. Freeman // Exp. Med. - 1995. - Vol. 122. - P. 467.

70. Graf, N. Persistence of xenogenized vaccine cells in vivo /N. Graf,

C. Adam, R. Mocikat // Int. J. Cancer. - 2003. - Vol. 105. - P. 217-220.

71. Greenberg, P. Adoptive T-cell therapy of tumors: mechanisms operative in the recognition and elimination of tumor cells / P. Greenberg // Adv. Immunol. - 1991. - Vol. 49. - P. 281-355.

72. Greten, T.F. Cancer vaccines / T.F. Greten, E.M. Jaffee // J. Clin Oncol. -1999. - Vol. 17, № 3. - P. 1047-1060.

73. Green, D.S. Topical imiquimod and intralesional interleukin-2 increase activated lymphocytes and restore the Thl/Th2 balance in patients with metastatic melanoma / D.S. Green, A.G. Dalgleish, N. Belonwu, M.D.Fischer, M.D. Bodman-Smith // Br J Dermatol. - 2008. - Sep. -59(3):606-14.

74. Haupt, K. The potential of DNA vaccination against tumor-associated antigens for antitumor therapy / K. Haupt, M. Roggendorf, K. Mann // Exp. Biol. Med. - 2002. - Vol. 227. - P. 227-237.

75. Heaney, M.L Soluble receptors in human disease / M.L. Heaney,

D.W. Golde // J. of Leukoc. Biol. - 1998 - Vol. 64. - P. 135-146.

76. Henze, G. Serum S-100 - a marker for disease monitoring in metastatic melanoma / G. Henze, R. Dummer, H. Joller-Jtmelka et al. // Dermatology. -1997. - Vol. 194. - P. 208-212.

77. Hersey, P. Phase I/II study of treatment with dendritic cell vaccines in patients: with disseminated melanoma / P.Hersey, S.W. Menzies, G.M. Halliday et al //Cancer Immunol Immunother. - 2004. -Vol. 53(2).-P. 125-34.

78. Hsu, FJ. Vaccinacion of patients with B-cell lymphoma using autologius antigen-pulsed dendritic cells / F.J. Hsu, C. Benike, F. Fagnonin // Nat. Med. -1996.-Vol. 2.-P. 52-58.

79. Hung, K. The central role of CD4+T cells in the antitumor immune response / K. Hung, R. Hayashi, A. Lafond-Walker, C. Lowenstein, D. Pardoll, H.J. Levitsky // Exp. Med. - 1998. - Vol. 188. - P. 2357-2368

80. Hunt, J.S The role of HLA-G in human ptegnancy / J.S. Hunt, D.K. Langat, R.H. Mclntire, P.J. Morales // Reprod. Biol. Endocrinol - 2006. -Vol. 4.-P. 10

81. Jury, C.S. Rising levels of serum SI00 protein precede other evidence of disease progression in patients with malignant melanoma / C.S. Jury, Mc. E.J. Allister, R.M. MacKie // Br J. Dermatol. - 2000. - 143: 269-274.

82. Lauerova, L. Malignant melanoma associates with Thl/Th2 imbalance that coincides with disease progression and immunotherapy response / L. Lauerova, L. Dusek, M. Simickova et al. // Neoplasma. - 2002. -Vol. 49(3).-P. 159-66.

83. Lowes, M.A. T helper 1 cytokine mRNA is increased in spontaneously regressing primary melanomas / M.A. Lowes, G.A. Bishop, K. Crotty, R.S. Barnetson, G.M. Halliday// J. Invest Dermatol. - 1997. - Jun; 108(6):914-9.

84. Mansfield, A.S. Regional immunity in melanoma: immunosuppressive changes precede nodal metastasis / A.S. Mansfield, S.G. Holtan,

T.E. Grotz, J. B. Allred, J. W. Jakub, L. A. Erickson, S. N. Markovic // Mod. Pathol. - 2011. - Apr. - Vol. 24(4). - P. 487-494.

85. Martínez-Escribano, J.A. Prospective study of the levels of serum cytokines in patients with melanoma: prognostic value / J.A. Martínez-Escribano, J.A. Campillo, A. Piñero, J.F. Frías, P. Sánchez-Pedreño, R. Corbalán, A. Mingúela, M. Rocío Alvarez // Actas Dermosifiliogr. - 2005. - Mar. -96(2): 83-91.

86. Mc Carter, M. Melanoma skews dendritic cells to facilitate a T- helper 2 profile /M. Mc Carter, J. Clarke, D. Richter, C. Wilson // Surgery. - 2005 -Aug.-138(2): 32- 1-8.

87. Minkis, K. Type 2 Bias of T cells expanded from the blood of melanoma patients switched to type 1 by IL-12 p70 mRNA-transfected dendritic cells. / K. Minkis, D. G. Kavanagh, G. Alter, D. Bogunovic et al // Cancer Res. -2008.-Nov 15.-68(22): 9441-50.

88. Missima, F. The Effect of propolis on Thl/Th2 cytokine expression and production by melanoma-bearing mice submitted to stress / F. Missima, A.C. Pagliarone, C.L. Orsatti, J.P. Araújo Jr, J. M. Sforcin // Phytother Res. -2010. - Oct. - Vol. 24(10). - P. 1501-1507.

89. Melief, C.J. Peptide-based cancer vaccines / C.J. Melief, R. Offringa, R.E. Toes, W.M. Kast // Current Opinion in Immunology. - 1996. -Vol. 8. -P.651-657.

90. Morgan C.L. Soluble CD8 stabilizes the HLA class I molecule by promoting beta2M exchange: analysis in real-time / C.L. Morgan, C.P. Price, S.B. Cohen, J.A. Madrigal, D.J. Newman // Hum. Immunol. -1999. _ Vol. 60, №5. - P.442-449.

91. Nakai, N. Immunohistological analysis of peptide-induced delayed-type hypersensitivity in advanced melanoma patients treated with melanoma antigen-pulsed mature monocyte-derived dendritic cell vaccination

/ N. Nakai, N. Katoh, W.T. Germeraad, T. Kishida, E. Ueda, H. Takenaka, O. Mazda, S. J. Kishimoto // Dermatol Sci. - 2009. - Jan. - 53 (1): 40-7.

92. Nevala, W.K. Melanoma Study Group of the Mayo Clinic Cancer Center. Evidence of systemic Th2-driven chronic inflammation in patients with metastatic melanoma / W.K. Nevala, C.M. Vachon, A.A. Leontovich, G.G. Scott, M.A. Thompson, S.N. Markovic // Clin Cancer Res. - 2009. - Mar. 15.-15(6): 1931-9.

93. Ostrand-Rosenberg, S. Cell-based vaccines for the stimulation of immunity to metastatic cancer / S. Ostrand-Rosrnberg, B.A. Pulaski B.A, V. Clements et al.//Immunol. Reviews. - 1999. - Vol. 178,- P. 101-114.

94. Orditura, M. Soluble interleukin-2 receptor and soluble CD8 antigen levels in serum from patient with solid tumors / M. Orditura, F. De Vita, A. Roscigno // Int.J. Mol.Med. - 1998. - Vol. 2, №1. - P. 75-79.

95. Parmiani, G. Melanoma antigens and their recognition by T cells / G. Parmiani // Keio J. Med. - 2001. - Vol. 50. - P. 86-90.

96. Pilla, L. Parmiani G. Multipeptide vaccination in cancer patients / L. Pilla, L. Rivoltini L, R. Patuzzo, A. Marrari A, R. Valdagni, G. Parmiani // Expert Opin Biol Ther. - 2009. - Aug. 9(8). - P. 1043-1055.

97. Poehlein, C. Immunotherapy for melanoma: the good, the bad, and the future / C.H. Poehlein, D. Rittinger, J. Ma, H.M. Hu, B.A. Fox // Curr Oncol Rep. -2005. - Sep. 7(5). - P. 383-392.

98. Puppo, F. Soluble HLA antigens: new roles and uses / F. Puppo, F. Indiveri, M. Seudeletti, S. Ferrone // Immunol. Today. - 1997. -Vol. 18.-№4-P. 154-155.

99. Puppo, F. Immunoregulatory role of soluble HLA molecules: a new skin for an old subject? / F. Puppo F, M. Ghio, P. Contini et al .// Arch. Immunol. Ther. Exp. (Warsz). - 1998. - Vol. 46 (3). - P. 157-160.

100. Rass, K. Experimental treatment of malignant melanoma and its rationale / K. Rass, H. Diefenbacher, W. Tilgen // Hautarzt. - 2008. - V. 59 (6). -P. 475-483.

101. Rankin, E.B. An essential role of Thl responses and interferon gamma in infection-mediated suppression of neoplastic growth / E.B. Rankin, D. Yu, J. Jiang, H. Shen, E.J. Pearce, M.H. Goldschmidt, D.E. Levy, Golovkina TV, Hunter CA, Thomas-Tikhonenko A.Cancer Biol Ther. - 2003. - Nov-Dec. -2(6): 687-93.

102. Raposo, G. B lymphocytes secrete antigen-presenting vesicles / G. Raposo, H.W. Nijman, W. Stoorvogel et al. // J. Exp. Med. — 1996. — Vol. 183. №3,-P. 1161-1172.

103. Reynolds, S.R. HLA-independent heterogeneity of CD8+ T cell responses to MAGE-3, MelanA/MART-1, gp 100, tyrosinase, MCIR, and TRP-2 in vaccine-treated melanoma patients / S.R. Reynolds, E.Celis, A. Sette et al //J. Immunol. - 1998. -Vol. 161(12).- P. 6970-6976.

104. Robbins, P. Human tumor antigens recognaized T cells / P. Robbins, Y. Kawakami // Cur. Opin. Immunol. - 1996. - Vol. 8. - P. 628-636.

105. Redondo, P. Update on melanoma: incidence, development and biological aspects / P. Redondo // An Sist Sanit Navar. - 2000. - Jan-Apr. - 23(1): 6784.

106. Richards, J.O. Tumor growth impedes natural-killer-cell maturation in the bone marrow / J. O. Richards, X. Chang, B.W. Blaser, M.A. Caligiuri, P. Zheng, Y. Liu // Blood. - 2006 - Vol. 108(1). - P. 246-52.

107. Sasaki, K. IL-4 suppresses very late antigen-4 expression which is required for therapeutic Thl T-cell trafficking into tumors / K. Sasaki, A.D. Pardee, Y. Qu, X. Zhao, R. Ueda, G. Kohanbash, L.M. Bailey, H. Okada, R. Muthuswamy, P. Kalinski, P.H. Basse, L.D. Falo, W.J. Storkus // J. Immunother. - 2009. - Oct. - 32 (8): 793-802.

108. Sato, T. Human immune response to DNP-modified autologous cells after treatment with a DNP-conjugated melanoma vaccine / T. Sato, H.C.Jr.Maguire, MJ. Mastrangelo, D. Berd // Clin Immunol Immunopathol. -1995.- Jan.-Vol. 74(1).-P. 35-43.

109. Strehl, J. Gene therapy of B-cell lymphoma with cytokine gene-modified trioma cells /J. Strehl, M. Selmayr, J.P. Kremer, L. Hultner, H. Lindhofer, R. Mocikat// Int. J. Cancer. - 1999. - Vol. 83. -P. 113-120.

110. Schaefer, J.T. Dynamic changes in cellular infiltrates with repeated cutaneous vaccination: a histologic and immunophenotypic analysis / J.T. Schaefer, J.W. Patterson, D.H. Deacon, M.E. Smolkin, G.R. Petroni, E.M. Jackson, C.L. Slingluff Jr // J. Transl Med. - 2010. - Aug. - Vol. 8. - P. 79.

111. Tatsumi, T. Disease-associated bias in T helper type 1 (Thl)/Th2 CD4(+) T cell responses against MAGE-6 in HLA-DRB10401(+) patients with renal cell carcinoma or melanoma / T. Tatsumi, L.S. Kierstead, E. Ranieri, L. Gesualdo, F.P. Schena, J.H. Finke, R.M. Bukowski, J. Mueller-Berghaus, J.M. Kirkwood, W.W. Kwok, W.J. Storkus // J. Exp Med. - 2002. - Sep 2. -196(5): 619-28.

112. Tindle, R. Human papilomavirus vaccines for cervical cancer / R. Tindle // Cur. Opin. Immunol. - 1997. - Vol. 8. - P. 643 - 650.

113. Van den Eynde, B.J. T-cell defined tumor antigens / B.J. Van den Eynde, P. Van der Bruggen // Curr Opin Immunol. - 1997. - Vol. 9. -P. 684-693.

114. Verdegaal, E.M. Successful treatment of metastatic melanoma by adoptive transfer of blood-derived polyclonal tumor-specific CD4+ and CD8+ T cells in combination with low-dose interferon-alpha / E.M.Verdegaal, M. Visser, T.H. Ramwadhdoebe, C.E. van der Minne, J.A. van Steijn, E. Kapiteijn, J.B. Haanen, S.H. van der Burg, J.W. Nortier, S. Osanto // Cancer Immunol Immunother. - 2011. - Jul. - 60(7): 953-963.

115. Wagner, S.N. Immune response against human primary malignant melanoma: a distinct cytokine mRNA profile associated with spontaneous regression. // S.N. Wagner, T. Schultewolter, C. Wagner, L. Briedigkeit, J.C. Becker, H.M. Kwasnicka / Goos Lab Invest. - 1998. - May. - Vol.78(5). - P.541-550.

116. Wolchoh, J.D. Vaccines for melanoma: Teanslating basic immunology into new therapies / J.D. Wolchoh, P.O. Livingston // Lancet Oncol. - 2001. -Vol. 2(4).- P. 205-211.

117. Winter, H. Tumour-induced polarization of tumour vaccine-draining lymph node T-cells to a type 1 cytokine profile predicts inherent strong immunogenicity of the tumour and correlates with therapeutic efficacy in adoptive transfer studies / H. Winter, H.M. Hu, C.H. Poehlein, E. Huntzicker, J.J. Osterholzer, J. Bashy, D. Lashley, B. Lowe, J. Yamada, G. Alvord, W.J. Urba, B.A. Fox // Immunology. - 2003. - Mar. -108 (3): 409-419.

118. Wong, R. Immune responses to a class II helper peptide epitope in patients with stage III/IV resected melanoma / R. Wong, R. Lau, J. Chang, T. Kuus-Reichel, V. Brichard, C. Bruck, J. Weber // Clin Cancer Res. - 2004. - Aug 1. - 10(15): 5004-13.

119. Zavazava, N. Soluble HLA class I molecules induce apoptosis in alloreactive cytotoxic T-lymphocytes / N. Zavazava, M. Kronke // Nature Med. - 1996. -Vol. 2.-P. 1005-1007.

120. Zavazava, N. Soluble HLA revisited / N. Zavazava, W. B. Tabayo-yong // Leuk.Res.-2007.-31: 121-125.