Получение и характеристика клеточных линий меланомы человека для создания противоопухолевых вакцин тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.01.12, кандидат биологических наук Бурова, Ольга Семеновна

• Бурова, Ольга Семеновна
• кандидат биологических наук
• 2010

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Бурова, Ольга Семеновна

Список сокращений

Введение

Глава 1. Обзор литературы

1.1. Клеточные линии как основа для противораковых вакцин и вакцинотерапии

1.2. Антигены опухолей человека, распознаваемые Т-клетками \ ^

1.3. Презентация антигенов

1.4. Меланомаспецифические антигены

1.5. Раково-тестикулярные антигены ]

§

1.6. Дифференцировочные антигены

1.7. Противоопухолевые вакцины созданные на основе клеточных линии

1.8. Безопасность применения клеточных культур в медицине

Глава 2. Материалы и методы исследования

2.1 Получение первичной культуры меланомных клеток

2.2. Культивирование клеток меланомы человека

2.3. Условия криоконсервации и создание банка клеточных культур

2.4. Морфологическое исследование

2.5. Кариологическое исследование 3 ^

2.6. Иммуноцитохимическое исследование

2.7. Иммунофенотипическое исследование

2.8. Полимеразная цепная реакция, совмещенная с обратной транскрипциеи

2.9. Тканеспецифическое исследование

2.10. Статистическая обработка результатов

§ Глава 3. Результаты и обсуждение исследований

3.1. Характеристика полученных культур меланомных клеток

3.2. Цитоморфология клеточных линий ¿ц

3.3. Иммуноцитохимическое исследование клеточных линий

3.4. Кариотип полученных клеточных линий

3.5. Проточно-цитометрический анализ

3.6. Исследование НЬА-фенотипа I класса клеточных линий

3.7. Экспрессия раково-тестикулярных антигенов на клеточных линиях

3.8. Клеточный банк полученных клеточных линий

3.9. Клеточные вакцины, созданные на основе клеточных линий 70 Заключение

Выводы

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Получение и характеристика клеточных линий меланомы человека для создания противоопухолевых вакцин»

Актуальность темы. Одним из направлений в лечении онкологических заболеваний является иммунотерапия [9]. Благодаря развитию биотехнологии, активно разрабатываются новые методы, направленные на активацию естественного противоопухолевого иммунитета. Большое место в исследованиях этой области занимает создание противоопухолевых вакцин и вакцинотерапия [4, 5, 9, 139, 141, 180]. Вакцины создаются с использованием модифицированных аутологичных или аллогенных опухолевых клеток [7, 23, 24, 36, 58, 95]. Широко исследуются вакцины с использованием дендритных клеток [4, 10, 22, 25, 123, 171].

Принцип вакцинотерапии основан на индукции противоопухолевого иммунитета после введения в организм опухолевых антигенов.[4, 5, 20, 23] Т-клетки, играющие роль в клеточно-опосредованном иммунитете, распознают аутологичные и аллогенные опухоли с рестрикацией по антигенам главного комплекса гистосовместимости (ГКГ) [35, 44, 46]. Поэтому идентификация опухолевых антигенов и молекул ГКГ"представляет несомненный интерес для разработки вакцин с использованием линий клеток, полученных из опухолей человека.

Одним из объектов для изучения вакцинотерапии является меланома - опухоль, растущая из меланоцитов [1]. На ранних стадиях меланома эффективно лечится с помощью хирургического метода. Однако диссеминированная меланома поддается терапии чрезвычайно плохо. Только у очень ограниченной группы больных с помощью стандартной химио-, лучевой и биотерапии удается добиться лечебного эффекта. Меланома считается «антигенной опухолью», экспрессирующей опухолеассоциированные антигены. Этот факт послужил основанием в выборе меланомных клеток для создания противоопухолевых вакцин.

За последние годы достигнут значительный прогресс в идентификации антигенов, ассоциированных с меланомой, узнаваемых цитотоксическими лимфоцитами (ЦТЛ) [34, 42]. Антигены можно разделить на три главные группы: опухолеассоциированные, раково-тестикулярные и дифференцировочные антигены [28].

Цельные опухолевые клетки, как правило, содержат большое количество разнообразных опухолевых антигенов [12, 13], часть из которых может быть иммуногенной, что является важным условием для создания вакцины.

Использование аллогенных опухолевых вакцин базируется на представлении, что клетки опухоли от разных индивидуумов могут иметь общие опухолеассоциированные антигены [2, 12, 28, 116], которые способны индуцировать значимый иммунный ответ. Аллогенные вакцины получают из клеточных линий, подобранных таким образом, чтобы обеспечивать максимальное представительство опухолеассоциированных антигенов [4, 20, 23].

В связи с этим получение клеточных линий меланомы, изучение их антигенной структуры, определение иммуногенности является актуальной задачей.

Цель исследования: получение и характеристика клеточных линий, адаптированных к росту in vitro, из образцов меланомы человека, пригодных для создания противоопухолевых вакцин.

Задачи исследования

1. Получить клеточные линии из образцов хирургически удаленной опухолевой ткани пациентов с диссеминированной меланомой и создать клеточный банк для наработки вакцин.

2. Изучить морфологический, и кариологический фенотип полученных клеточных линий.

3. Определить экспрессию опухолеассоциированных антигенов, раково-тестикулярных антигенов и их генов.

4. Изучить в динамике экспрессию антигена главного комплекса гистосовместимости первого класса и определить аллели антигена — главного комплекса гистосовместимости первого класса.

Научная новизна

Полученные клеточные линии меланомы человека охарактеризованы по ряду многочисленных параметров: морфологических, кариологических и иммунологических.

12 клеточных линий защищены патентами Российской Федерации, из них 5 патентов вошли в 100 лучших изобретений России за 2009 год.

Научно-практическая значимость

Создан рабочий и посевной банк 19 полученных клеточных линий. Линии охарактеризованы по морфологическим, кариологическим, иммунологическим и генным параметрам, что позволяет проводить адекватный их выбор для создания противоопухолевых вакцин. На базе коллекции получены две генномодифицированные клеточные вакцины с использованием клеточных линий mel Kor и mel Р. Вакцины прошли первую фазу клинических испытаний и получили разрешение в Этическом комитете и ФГУНЦ ЭСМП РОСЗ ДРАВ НАДЗОР А на проведение второй фазы клинических испытаний.

Заключение диссертации по теме «Онкология», Бурова, Ольга Семеновна

выводы

1. Создан клеточный банк на основе полученных из меланомы кожи человека 19 аттестованых клеточных линий, необходимый для создания противоопухолевых вакцин.

2. Выявлена стабильная экспрессия меланомаассоциированного антигена CD63 во всех полученных клеточных линиях и, в части, из них меланома-ассоциированных антигенов тирозиназы, Melan А и НМВ-45.

3. Показано, что уровень хромосомных нарушений в клетках увеличивается по мере снижения уровня морфологической дифференцировки от высокодифференцированных до низкодифференцированных.

4. Выявлена неоднородная иммунофенотипическая характеристика клеточных линий, что позволяет использовать их для получения опухолевых лизатов в различных комбинациях.

5. Выявлено возрастание экспрессии антигенов гистосовместимости II класса. 11 из 19 клеточных линий, антиген-негативных на первых пассажах, к 10-му пассажу стали антиген-позитивными. В одной клеточной линии отсутствовали антигены гистосовместимости I и II класса. Выявлено, что клеточные линии неоднородны по гаплотипу антигенов гистосовместимости I класса.

6. Показана высокая гетерогенность клеточных линий по иммунологическому фенотипу клеток и по экспрессии мРНК раково-тестикулярных антигенов.

8. Отобраны клеточные линии для создания противоопухолевых вакцин «Аллоген» (mel Р) и «Мелавак» (mel Kor).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Целью данной работы явилось получение клеточных линий, адаптированных к росту in vitro из образцов опухолевых тканей человека (меланома), для создания противоопухолевых вакцин. В ходе данного исследования была проведена адаптация клеток к росту in vitro, выделенных из образцов хирургически удаленной опухолевой ткани. Полученные 19 стабильных клеточных линий охарактеризованы по- морфологическим, кариологическим, иммунологическим и генетическим параметрам. Это позволило создать рабочий и посевной банк стабильно растущих клеточных линий, используемый для разработки противоопухолевых вакцин. Материалом для исследований послужили образцы опухолевых тканей человека, взятых из метастатических очагов пациентов с диссеминированной меланомой. Полученные клеточные линии1 прошли более 30 пассажей, это характеризует клетки как обладающие неограниченным жизненным потенциалом. Клеточные линии были адаптированы к среде RPMI-1640 и активно росли в присутствии 10% эмбриональной сыворотки, что является приемлемым фактором в создании вакцин, что отмечено также и в работе А.О. Данилова и др. [11] Полученные клеточные линии хранятся в банке криоконсервации биоматериалов Российского онкологического научного центра имени Н.Н.Блохина РАМН, в жидком азоте при температуре минус 196°С, в созданном рабочем и посевном банке. 16 клеточных линий хранятся специализированной в коллекции клеточных культур Института цитологии РАН (г.Санкт-Петербург).

При кариологическом исследовании 19 клеточных линий выявлены значительные хромосомные аномалии генетического аппарата клеток (до 11 на клетку) и различный набор хромосом (триплоидный, тетраплоидный, околодиплоидный). В исследуемых линиях часто встречались аномалии 1, 6, 1,9, 10 хромосом, что является характерными нарушениями для меланомы [38, 91] и связывается с наличием в указанных хромосомах генов, участвующих в инициации или прогрессии меланомы [152]. По некоторым данным, определенные аберрации коррелируют с неблагоприятным прогнозом - выживаемостью и метастазированием опухоли. В работе Balazs et al. [39] показано, что агрессивное поведение меланомы сопровождается накоплением множественных генетических повреждений.

По морфологическим признакам клеточные линии были разделены на три группы высокодифференцированные, умереннодифференцированные и низкодифференцированные. Данная характеристика отражала не только морфологические, но и сочеталась с кариологическими и генными чертами. Умереннодифференцированные и низкодифференцированные клеточные линии характеризовались бойлыпим объёмом кариологических нарушений и боПлыпей экспрессией раково-тестикулярных генов по сравнению с умеренно- дифференцированными линиями.

Проведено исследование иммунофенотипа клеточных линий. Отмечено отсутствие маркеров CD3 и CD20, характеризующих лимфоидную специфичность. При имммуноцитологическом исследовании все клеточные линии экспрессировали дифференцировочные меланомные маркеры (CD63, MelanA/MARTl, НМВ45), что является характерным для меланомы [115].

Ко-стимулирующие молекулы (CD86) экспрессирована в одном случае и (CD80) в 9 из 19. При этом только одна клеточная линия экспрессировала обе молекулы. Ко-стимул'ирующие молекулы очень важны для взаимодействия опухолевых и лимфоидных клеток, что приводит к увеличению иммуногенности [16, 122].

Все 19 исследованных клеточных линий экспрессировали на своей поверхности антиген CD54 (молекула адгезии ICAM-1, лиганд для LFA-1 и МАС-1). Положительная экспрессия CD54 считается отрицательным прогностическим фактором; проведенные эксперименты с anti-CD54 МКА замедляли рост опухоли [49, 177].

При использовании МКА IC0218 (HMW), положительная экспрессия HMW выявлена в 10 из 14 образцов клеточных линий (71,4%). Известно, что перевиваемые клеточные линии меланомы человека Вго и MS05 также не экспрессируют на своей поверхности HMW антиген [27]. Экспрессия маркера CD95 (FAS- антиген; опосредующий, апоптоз) была отрицательной во всех исследуемых случаях [55, 71]. Интересным фактом оказалась положительная- экспрессия- маркера стволовой гемопоэтической клетки/или эндотелиальной CD34 (в 8 случаях из 19). Клетки этих линий экспрессировали антиген гистосовместимости первого класса и в 6 из 9 случаев — второго. Доказать принадлежность этих клеток к стволовым в данной работе нам не удалось, однако многочисленные исследования подтверждают их существование [67].

Исследование экспрессии антигенов гистосовместимости первого и второго класса выявили в одном случае полное их отсутствие на протяжении всех пассажей, а в других - тенденцию к увеличению антигенов гистосовместимости второго класса. Наличие антигена гистосовместимости второго класса влияет на иммунологическую реакцию, которая может развиваться через взаимодействие комплекса HLA-DR с Т-клеточным рецептором, [134]. Снижение антигенов гистосовместимости первого класса и появление антигена второго класса, представляющего фенотип непрофессиональных антиген-презентирующих клеток [85], является характерным фактором для меланомных клеток. Злокачественная трансформация меланоцитов и опухолевая прогрессия часто ассоциируется с потерей антигена первого класса [90], 15% и 55% хирургически удаленной первичной опухоли и метастатической меланомы, соответственно, показало при иммуногистохимическом окрашивании отсутствие HLA I класса гистосовместимости. Потеря или снижение экспрессии антигена гистосовместимости первого класса может приводить к ускользанию меланомных клеток от иммунного ответа - узнавания или даже разрушения цитотоксическими Т-клетками, необходимости презентования антигенами первого класса ассоциированных антигенов [147].

Изучение HLA-фенотипа I класса гистосовместимости клеточных линий по аллелям, выявило неоднородность фенотипа по классам, что является важным, так как соответствующий рестракционный элемент, обуславливает экспрессию белка и определяющего иммуногенность клетки; способствуя выработке лимфоцитов. У пациентов с фенотипом НЬААЗ/11 и В7/4, получающих рестриктированную по указанным НЬА поливалентную аллогенную вакцину, отмечена более продолжительная выживаемость (Р < 029). Анализ экспрессии НЬА пациентов вне зависимости от НЬА вакцины показал, что наиболее благоприятным в отношении выживаемости является фенотип НЬА-А25 (Р = 006), тогда как фенотип НЬА- В35 оказывает неблагоприятное влияние на выживаемость (Р = 019) [94]. Таким образом, знание НЬА-фенотипа может играть важную роль для индивидуального подбора вакцины. (Клеточная линия^ по фенотипу аналогичная фенотипу клеткам хозяина).

Проведенный анализ раково-тестикулярных и дифференцировочных антигенов выявил неоднородную картину. Опухолеассоциированные антигены, узнаваемые цитотоксическими Т-лимфоцитами, играют важную» роль в специфической- противоопухолевой иммунотерапии [116]. Знание антигенов исследуемых клеточных линий, поможет комплементарно подбирать их для создания противоопухолевых вакцин [183].

Для создания противоопухолевых вакцин важным моментом является создание клеточного банка. Повседневные потребности клиники могут быть обеспечены только клеточным банком, содержащим стандартный, всесторонне обследованный клеточный материал, находящийся в условиях, способных обеспечить его длительное хранение без изменения свойств.

Полученные клеточные линии, учитывая их уникальность, хранятся в специализированной коллекции клеточных культур Института цитологии РАН в городе Санкт-Петербурге.

Двенадцать клеточных линий защищены патентами на изобретение, из них пять патентов вошли в 100 лучших изобретений России за 2009 год.

На основе двух клеточных линий разработаны две противоопухолевые генно-инженерные вакцины, на которые в настоящее время получено разрешение в Этическом комитете ФГУНЦ ЭСМП РОСЗДРАВНАДЗОРА на проведение второй фазы клинических испытаний.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Бурова, Ольга Семеновна, 2010 год

1. Анисимов В.В., Вагнер Р.И., Барчук A.C. Меланома кожи. // (4.1) СПб.: Наука. 1995. - 151 с.

2. Абелев Г. И. Иммунология опухолей человека. // В кн.: Канцерогенез. М.: Медицина. 2004. - С.474-482.

3. Барышников А.Ю., Кадагидзе З.Г., Махонова Л.А. и др. Иммунологический фенотип лейкозной клетки. // М.: Медицина. — 1989.-240с.

4. Барышников А.Ю. Противоопухолевые вакцины. (Материалы Всероссийской научно-практической конференции). Российский биотерапевтический журнал. — 2002. №2. — Т. 1. — С. 12-14.

5. Балдуева И.А. Противоопухолевые вакцины. // Практическая онкология. 2003. - Т. 4. № 3. - С. 157-166.

6. Гантиевская Ю.А., Селявко В.В. Дендритные клетки: роль в системе иммунитета. // Иммунопатология, аллергология, инфектология. — 2001. №4. — С.5-23

7. Гриневич Ю. А., Фильчаков Ф. В. Адаптивная иммунотерапия и ее влияние на эффективность лечения больных онкологического профиля. // Онкология. 2003. - Т.5. - №2. - С.90-95.

8. Ю.Гриневич Ю.А., Храновская H.H. Вакцины на основе антигенпрезентирующих дендритных клеток в иммунотерапии больных со злокачественными опухолями. // Онкология. — 2007. — Т.9.4. С.365-370.

9. Дейчман Г. И. Специфические трансплантационные опухолевые антигены. // В кн.: Канцерогенез. М.: Научный мир. 2000. - 420с.

10. Дейчман Г. И. Опухолевые антигены и противоопухолевый иммунитет (врожденный и приобретенный). // В кн.: Канцерогенез. М.: Медицина.2004. — С.448-473.

11. Кадагидзе 3. Г. Фенотип иммунокомпетентных клеток и его значение при биотерапии опухолей. // Сибирский онкологический журнал. — 2009. Приложение 2. - С.88-89.

12. Кешелава В.В. Противоопухолевые вакцины: • возможности и перспективы применения. // Вестник МЕДСИ. Сентябрь-ноябрь — 2009. -№5.-С. 16-23.

13. Колокольцева Т.Д., Шалунова Н.В., Петручук Е.М. К вопросу о контроле безопасности культур клеток, пригодных для заместительной терапии. // Биопрепараты. — 2006. Июнь. — С.8-12

14. Конюшко О.И., Хватов В.Б., Смирнов C.B., Бочарова B.C. Требования, предъявляемые к линиям диплоидных клеток, предназначенных для регенеративной медицины. // Трансплантология. — 2009. — С.31-34.

15. Коростелев С.А. Противоопухолевые вакцины. // Современная онкология. 2003. - Т. 5. - №.4. - С. 160-169.

16. Методические указания аттестации перевиваемых клеточных линий — субстратов производства и контроля медицинских иммунологических препаратов. // Руководящий документ. — РД 42-28-10-89.

17. Михайлова И.Н., Петенко H.H., Демидов JI.B. Вакцинотерапия меланомы дендритными клетками. // Российский биотерапевтический журнал. 2007. - №3. - С.8-18.

18. Моисеенко В.М. Возможности вакцинотерапии меланомы кожи. // Практическая онкология. 2001. - №4(8) декабрь. - С.58-64.

19. Москалева Е.Ю., Северин С. Е. Перспективы создания противоопухолевых вакцин с использованием дендритных клеток человека. //Иммунология. — 2002.-Т.23. — №1. -С.8-15.

20. Петров Р.В., Хаитов P.M., Манько В.М., Михайлова A.A. Контроль и регуляция иммунного ответа. //Л. : Медицина. 1981. - 311 с.

21. Тюряева И.И. Опухолевые антигены. // Цитология — 2008. Т.50. — №3.-С. 189-209.

22. Фигуркин К.М. Рак мочевого пузыря. // Из "Энциклопедия клинической онкологии": руководство для практикующих врачей. / Под общ. ред. М.И. Давыдова, Г.Л. Вышковского. М.: РЛС 2005,' 2004. - С.500-515.

23. Хаитов P.M. // Иммунология: учебник для студентов мед. вузов. М.: ГЭОТАР-Медиа. 2006. - 320с.

24. Хансон К.П., Моисеенко В.М: Биотерапия злокачественных новообразований. // Проблемы клинической медицины. — 2005. — №3. С.1-15.

25. Якубовская Р.И. Современные подходы к биотерапии рака. // Российский биотерапевтический журнал. — 2002. — №3. С.5-14.

26. Ярилин А.А. Основы иммунологии. // М.: Медицинская литература. -1999.-607с.

27. Andersen M.N., Schrama D., Thorstraten P., Becker J.C. Cytotoxic t cells. // a. J. Invest. Dermatology.-2006.-Vol. 126(1) P.32-41.

28. Aptsiauri N., Cabrera Т., Carcia-Lora A. et. al. MHC class I antigens and immune surveillance in transformed cells. // Int. Rev.Cytol. 2007. —1. Vol. 256.-P.139-189.

29. Armstrong A., Eaton D., Ewing J. Cellular immunotherapy for cancer. // BMJ. 2001. - Vol.323. - P.1289-1293.

30. Anichini A, Maccalli C, Mortarini R, et al. Melanoma cells and normal melanocytes share antigens recognized by HLA-A2 restricted cytotoxic T cell clones from melanoma patients. // JEM. 1993. - Vol.177- P.989-998.

31. Bale S.J., Dracopoli N.C. et al. Mapping the gene for hereditary cutaneus malignant melanoma dysplastic nevus to chromosome lp. // N.Engl .J.Med. -1989. - Vol.326. -P.1367-1372.

32. Balazs M, Adam Z, Treszl A, Begany A, Hunyadi J, Adany R. Chromosomal imbalances in primary and metastatic melanomas revealed bycomparative genomic hybridization. // Cytometry. 2001. 46(4) - P.222-232.

33. Barret A.W., Raja A.M. The immunohistochemical identification of human oral mucosal melanocytes. //Arch.Oral Biol. 1997:42(1). -P.77-81.

34. Barker C.F., Billingham R.E. Immunologically privileged sites.// Adv. Immunol. 1977.-Vol.25.-P. 1-54.

35. Barrow C., Browning J., MacGregor D., Davis I.D., Sturrock S., Jungbluth A.A., Cebon J. Tumor antigen expression in melanoma varies according to antigen and stage. // Clin Cancer Res. 2006. Feb. 1;12(3 Pt 1) . - P.764-771.

36. Beale AJ. Choice of cell substrate for biological products. //Adv Exp Biol Med.- 1979. Vol 118. P.83-97.

37. Beyer M., Schultze J.L. Regulatory T cells in cancer. // Blood. 2006. -Vol. 108. N. 3-P.804-811.

38. Borello I., Sotomayor E. Cancer vaccines for hematologic malignancies. // Cancer Control. 2002. March/April. - Vol.9. N.2. - P. 138-151

39. Brady M.S., Eckels D.D., Ree S.Y., Schultheiss K.E., Lee J.S. MHC class II mediated antigen presentaition by melanoma cells. // J.Immunother. — 2000. Vol.19. - P.387-397.

40. Boon T., Coulie P.G., Van den Eynde B.J., Van den Bruggen P. Human T-Cell Responses against Melanoma. // Annu.Rev.Immunol. 2006. Vol. 24. - P.175-208

41. Brooks K.J, Coleman E.J, Vietta E.S. The antitumor activity of an anti-CD54 antibody in SCID mice xenografted with human breast, prostate, nonsmall cell lung, and pancreatic tumor cell lines.- // Int.J.Cancer. 2008. — Vol. 123. N. 10 — P.2438-2445.

42. Bumol T.F., Reisfeld R.A. Unique glycoprotein-proyeoglycan comple defined by monoclonal antibody on human melanoma cells. // Proc Natl Acad'Sci USA. 1982.-Vol.79 - P.1245-1249.

43. Van der Bruggen P., Trversari C., Chomez P. et al. A gene encoding an antigen recognized by cytolytic T lymphocytes on a human melanoma.// Science. 1991,- Vol.254 - P.1643-1647.

44. Bouchard B., Fuller B.B., Vijayasaradhi S., Houghton A.N. Induction of pigmentation in mouse fibroblasts by expression of human tyrosinase c DNA.// J Exp Med. 1989. - Vol 169. - P.2029-2042.

45. Brady M.S., Eckels D.D., Ree S.Y., Schultheiss K.E., Lee J.S. MHC class II mediated antigen presentaition by melanoma cells. // J. Immunother. — 2000. — Vol.19.—P.387-397.

46. Bricharg V., Van Pel' A., Wolfel T., et al. The tyrosinase gene codes for antigen regnized by autologous cytolytic T lymphocytes on HLA-A2 melanomas. // J Exp Med. 1993. - Vol.178. - P.489-495.

47. Bullani R.R., Wehrli P., Viard Leveugle I., Rimoldi D., Cerottini J.C., Saurat J.H., Tscchopp J., French L.E. Frequent downregulation of Fas (CD95) expression and function in melanoma. // Melanoma.Res. — 2002. — Vol. 12. N. 3 -P.263-270.

48. Bystryn J., Oratz R., Henn M., et al. Preparation and characterization of polyvalent human melanoma antigen vaccine. // J Biol. Res. Med. 1986. -Vol.5.-P.211-224.

49. Bystryn J.C., Reynolds S.R. Melanoma vaccines: What we know so far. // Oncology (Williston Park). 2005. - Vol.19. N. 1 - P.97-108; discussion 108, 111-112, 115.

50. Caballero O.L., Chen Y.T. Cancer/testis (CT) antigens: potential targets for immunotherapy. // Cancer Sci. 2009. - Vol.100. N. 11. - P.2014-2021.

51. Cai G., Hafler D.A. Multispecific responses by T cells expanded by endogenous self-peptide/MHC complexes. // J.Immunol. 2007. - Vol.37.1. P.602-612.

52. Cancer Vaccines: Drug Pipeline Update 2008. (BioSeeker Group AB).

53. Caux C., Dezutter-Dambuyant C., Schmitt D., Banchereau J. GM-CSF and TNF-alpha cooperate in the generation of dendritic Langerhans cells. // Nature. 1992. - P.258-360.

54. Chen X., Chang C.H., Goldenberg D.M. Novel strategis for improved cancer vaccines. // Expert Rev Vaccines. — 2009. Vol.8. N.5 - P.567-576.

55. Darrow T.L., Slingluff C.L., Seigler H.F. The role of HLA class I antigens in recognition of melanoma cells by tumor-specific cytotoxic T lymphocytes: evidence for shared tumor antigens. // J Immunol. 1989. — Vol.142. - P.3329-3335.

56. Dedicated to William Coley. // Editorial/ Cancer Immunol Immunother. — 2003.-Vol 52.- P.1-38.

57. Dong Fang, Nguyen T.K, Kim Leishear K, Finko R. et al. A Tumorigenic Subpopulation with Stem Cell Properties in Melanomas. // Cancer Research. 2005. - Vol.65 (20) - P.9328-9337.

58. Elliott B., Dalgleish A. Melanoma vaccines. // Hosp Med. 2004. - Vol. 65. N.l 1. - P.668-673.

59. Espinoza-Delgado I. Cancer vaccines. // The Oncologist. 2002. 7(suppl 3): P.20-33.

60. Evans T.R.J., Kaye S.B. Vaccinetherapy for cancer-fact or fiction? // Q J Med. 1999. - Vol 92. - P.299-307.

61. Eggermont A.M., Schadendorf D. Melanoma and immunotherapy. // Hematol Oncol Clin North Am. 2009. Jun. 23(3): P.547-564. ix-x.

62. Van den Eynde B.J., Morel S. Differential processing of class-I-restricted epitopes by the standart proteasome and the immunoproteasome. // Curr/Opin. Immunol. -2001. Vol.13. N.2. - P. 147-153.

63. Van den Eynde B.,van den Bruggen P. T cell-defined tumor antigens. // Curr/ Opin Immunol. 1997. - Vol.9. N.5. - P.684-691.

64. Van Den Eynde B., Hainaut P., Herin M., et al. Presense on a human melanoma of multiple antigens recognized by autologous CTL. // Int J Cancer. 1989. - Vol. 44. -P.634-640.

65. Ferrone S., Marineóla F.M. Loss of HLA class I antigens by melanoma cells: molecular mechanisms, functional signicance and clinical relevance. // Immunol Today. 1995. - Vol.16. N.10. -P.508-522.

66. Fong L., Engleman E.G. Dendritic cells in cancer immunotherapy. // Ann. Rev. Immunol. -2000. Vol.18. -P.245-273.

67. Freeman S.M., McCune C., Robinson W. et al. The treatment of ovarian cancer with a gene modified cancer vaccine: A phase I study. // Hum Gene Ther. 1995. Vol. 6. - P.927-939.

68. Garrigues H.J., Lark M.W., Lara S. et al. The melanoma, proteoglycan: restricted expression on microspikes, a specific microdomain of the cell surface. // J Cell Biol. 1986. - Vol.103. - P. 1699-1710.

69. Gaygler B., Van der Brüggen P. et al. Human gene MAGE-3 codes for an antigen recognized on a melanoma by aytologous cytolytic T lymphcytes.// J Exp Med. 1994.-Vol.179. - P.921-930.

70. Giebel L.B., Strunk K.M., Spritz R.A. Organization and nucleotide sequences of the human tyrosinase gene and a truncated tyro sine-related segment. // Genomics. 1991. - Vol 9. - P.435-445.

71. Greenberg P. Adoptive T cell therapy of tumors: mechanisms operative in the recognition and elimination of tumor cells. // Adv. Immunol. 1991. -Vol.49.-P.281-355.

72. Greten T.F., Jaffee E.M. Cancer vaccines. // J Clin Oncol. 1999. - Vol. 17. N.3 - P.1047-1060.

73. Grizzi F., Chiriva-Internati M., Franceschini B., Hermonat P.L., Soda G., Lim S.H., Dioguardi N. Immunolocalization jf sperm protein 17 in human testis and ejaculated spermatozoa. // J. Histochem. Cytochem. —2003. — Vol. 51- P.1245-1248 .

74. Goodwin B.L., Hongkang Xi, Romeena Tejiram et all.Varying Functions of Specific Major Histocompatibility Class II Transactivator Promoter III and IV Elements in melanoma Cell Lines. // Cell Growth & Differentiation. -2001. June.-Vol.12. P.327-335.

75. Hanagiri T., Baren N., Neyns B. Analysis of one the rare melanoma patients with a spontaneous CTL response to a MAGE-A3 peptide presented by HLA-A1. // Cancer Immunol Immunother. 2006. - Vol 55(2). P. 178-184.

76. Hellstrom I., Garrigues H.J., Cabasco L. et al. Studies of a high molecular weight human melanoma-associated antigen. // J Immunol. 1983. - Vol. 130.- P.1467-1472.

77. Herin M., Lemoine C., Weynants P. et al. Production of stable cytolytic T-cell clones directed against autologous human'melanoma. // Int J Cancer. — 1987.-Vol 15: P.390-396.

78. Herper J.R., Reisfeld RA: Inhibtion of anchorege-independent growth of human melanoma cells by a monoclonal antibody to a chondroitin sulfate proteoglycan. // J Natl Cancer Inst. 1983. - Vol 71: P.259-263.

79. Hicklin D.J., Wang Z., Arienti F., Rivoltini L., Parmiane G., Ferrone S. beta2 -Microglobulin Mutations, HLA-Class I Antigen Loss, And Tunor Progression in melanoma // J.Clin.Invest. 1998. June. — Vol.101. N.12. P.2720-2729.

80. Horn S.S., Schwartzentruber D.J., Rosenberg S.A., Topalian S.L. Specific release of cytokines by lymphocytes infiltrating human melanomas in response to shared melanoma antigens. // J Immunother. — 1993. Vol. 13 — P. 18-30.

81. Houghton A.N., Gold J.S., Blachere N. Immuniti against cancer: lessons learned from melanoma. // Curr. Opin. Immunol. 2001. - Vol.13.1. P.134-140.

82. Hsueh E.C., Famatiga E., Gupta R.K., Morton D.L. Enhancement of complement-dependent cytoxicity by polyvalent melanoma cell vaccine (CancerVax): correlation with survival. //Ann. Surg. Oncol. 1998.1. Vol. 5. — P.595-602.

83. Hsuch E.C. Tumor cell-based vaccines for treatment of melanoma. // Bio Drugs.-2001.-Vol. 15(11) -P.713-720.

84. Hsueh E.C., Essner R., Foshag L.J., Ye W., Morton D.L. Active immunotherapy reinduction with a polyvalent allogeneic cell vaccine correlates with improved survival in recurrent metastatic melanoma. // Ann Surg Oncol. 2002. - Vol. 9(5) - P.486-492

85. Huang A., Golumbek P., Ahmadzadeh M., et al. Role of bone marrow derived cells in presenting MHC class I-restricted tumor antigens. // Science 1994. - Vol. 264: P.961-965.

86. Hurwitz A.A., Kwon E.D., varf Elsas A. Costimulatory wars: the tumor menace. // Curr. Opin. Immunol. 2000. - Vol. 12. - P.589-596.

87. Itoh K., Tilden AB., Balch C.m. Interleukin-2 activation of cytotoxic T-lymphocytes infiltrating into human metastatic melanomas. // Cancer Res.- 1986.-Vol. 46.- P.3011-3017.

88. Jager E., Ringhoffer M., Altmannsberger M. et al. Immunoselection in vivo: independent loss of MHC class I and melanocyte differentiation antigen expression in melastatic melanoma. // Int. J. Cancer. 1997. -Vol. 71(2).- P.142-147.

89. Jaffee E.M., Abrams R., Cameron J. et al. A phase I clinical trial of lethally irradiated allogeneic pancreatic tumor cells transfected with the

90. GM-CSF gene for the treatment of pancreatic adenocarcinoma. // Hum Gene Ther. 1998. - Vol. 9. - P. 1951-1971'.

91. Kageshita T., Ruriya N., Ono T., et al. Association of high molecular weight melanoma-associated antigen expression in primary acral lentiginous melanoma lesions with poor prognosis. // Cancer Res. 1993. -Vol. 53.-P.2830-2833.

92. Kawakami Y., Nishimura I., Pestifo NP. et al. T-cell recognition of human melanoma antigens. // J Immunother. 1993. - Vol. 14. - P.88-93.

93. Kawakami Y., Eliyahu S., Delgado C.H. et al. Identification of a human melanoma antigen recognized by tumor infiltrating lyniphocytes associated with in vivo tumor rejection. // Proc Natl Acad Sci USA. —'1994. -Vol. 91. P.6458-6462.

94. Kawakami Y., Rosenberg S.A., Ltze M.T. Interleukin-4 promotes the growth of tumor infiltrating lymphocytes cytotoxic for human autologous melanoma.//J Exp Med. 1988.- Vol.168. - P.2183-2191.

95. Kawakami Y., Rosenberg S.A. Immunobiology of human melanoma antigens MART-1 and gp 100 and theiruse for immuno-gene therapy. // Int. Rev. Immunol. -1997. Vol. 14(2-3). - P. 173-192.

96. Kawakami Y., Eliyahu S., Delgaldo C.H. et al. Cloning of the gene coding for a shared human melanoma antigen recognized by autologous T cells infiltrating into tumor. // Proc Natl Acad Sci USA. 1994. - Vol. 91.1. P.3515-3519.

97. Kawakami Y., Zakut R., Topalian S.L., Stotter H., Rosenberg S.A. Shared human melanoma antigens. Recognition by tumor infiltrating lymphocytes in HLA-A2.I transfected melanomas. // J Immunol. 1992. — Vol. 148.- P.638-643.

98. Kilgone N.E., Ford V.L., Margt C.D. et. al. Defining the parameters necessary for T cell recognition of ligands thet vary in potency. // Immunol Res. 2004. - Vol. 29. - P.29-40.

99. Kirkin A.F., Dzhandzhugazyan K., Zeuthen J. Melanoma -associated antigens recognized by cytotoxic T lymphocytes. // APMIS. 1998. — Vol. 106.- P.665-679.

100. Kirkin A.F., Dzhandzhugazyan K.N., Zeuthen J. Cancer /testis antigens: structural and immunobiological properties. // Cancer-Invest. — 2002. Vol. 20(2). - P.222-236.

101. Lai Y.H., Wang C. Delivery strategies of melanoma vaccines: An overview. // Expert Opin Drag Deliv. 2008. - Vol. 5(9). - P.979-1001.

102. Lapointe R., Royal R., Reeves M. et al. Retrovirally transduced human dendritic cells can generate T- cells recognizing multiple MHC class I and class II epitopes from the melanoma antigen glycoprotein 100. // J. Immunol.-2001.-Vol. 167,- P.4758-4764.

103. Letterio J.J., Roberts A.B. Regulation of immune response by TGFB. //Annu. Rev. Immunol.-1998.-Vol. 16. P. 137-161.

104. Livingston P.O., Wong G.Y.C., Adluri S. et al. Improved survival in stage III melanoma patients with GM2 antibodies: a randomized trial of adjuvant vaccination with GM2 ganglioside. // L. Clin. Oncol. 1994. -Vol. 12.- P.2012-2069.

105. Lotze M., Dallal R.M., Kirkwood J.M., Flickinger J.C. Cutaneous melanoma. Cancer: Principles & Practice of Oncology/ Eds. V.DeVita, S. Hellman, S.Rosenberg. Philadelphia: Lippincott Williams & Wilkins. 200. -P.2012-2069.

106. Maeurer M.J., Hurd S., Martin D. et al. Cytolytic T-cell define HLA-A2 restricted human cuutaneous melanoma peptide epitopes-correlation with T-cell receptor usage. // Cancer (philad.) — 1995. Vol. 2. - P. 162.

107. Marchand M., Weynants P., Rankin E. et al. Tumor regression responses in melanoma patients treated with a peptide encoded by gene MAGE-3. // Int. J. Cancer. 1995. - Vol. 65. - P.883.

108. Mitchell M.S. Perspective on allogeneic melanoma lysates in active specific immunotherapy. // Semin Oncol. 1998. - Vol. 25. - P.623-635.

109. Mitchel M.S., Kan-Mitchell J., Morrow P.R., Darrah D., Jones V.E., Mescher M.F. Phase I trial of large multivalent immunogen derived from melanoma lysates in patients with disseminated melanoma. // Clin Cancer Res. 2004. Jan. 1;10(1 Pt 1).- P.76-83.

110. Mukherji B., MacAlister T.J. Clonal analysis of cytotoxic T-cell response against human melanoma. // J Exp Ved. 1983. - Vol. 158:1. P.240-245.

111. Muul L.M., Spiess P.J., Director E.P., Rosenberg S.A. Identification of specific cytolytic immune responses against autologous tumor in humans bearing malignant melanoma. // J Immunol. — 1987. — Vol. 138. P.989-995.

112. Natali P.G., Imai-K., Wilson B.S. et al. Structural properties and tissue distribution of antigen recognized by the monoclonal antibody 653,40S to human melanoma cells. // J Natl Cancer Inst. 1981. - Vol. 67.1. P.591-601.

113. Natali P.G., Bigotti A., Nicotra M.R., et al. Analysis of the antigenic profile of uveal melanoma lesions with anti-cutaneous melanoma-associated antigen and anti-HLA monoclonal antibodies. // Cancer Res. 1989. — Vol. 49(5).- P. 1269-1274.

114. Nestle F.O., Alijagic S., Gillier M. et al. Vaccination of melanoma patients with peptide — or tumor lysate-pulsed dendritic cells. // Nat. Med. — 1998. Vol. 4. - P.328-332.

115. Ostrand-Rosmberg S., Pulaski B.A., Clements V. K. et al. Cell-basrd vaccines for thestimulation of immunity to metastatia cancer immunological. //Reviews. 1999. - Vol. 170. - P. 101-14.

116. Palese, P., Zavala, F., Muster, T., Nussenzweig, R.S., and Garcia-Sastre, A. Development of novel influenza virus vaccines and vectors. // J. Infect. Dis. 1997. - 176(Suppl. 1). - P.45-49.

117. Pardoll D.M. Cancer vaccines. // Nat. Med. 1998. - Vol. 4. -P.525-531.

118. Perez-Diez A., Joncker N.T., Choi K. et. al. CD4 cells can be more efficient at tumor rejiection then CD8 cells. // Blood. 2007. - Vol. 109. -P.5346-5354.

119. Pila L., Valenti R., Marrari A. et al. Vaccination: Role in metastatic melanoma. // Expert Rev Aticancer Ther. 2006. - Vol. 6(8). - P. 13051318.

120. Pilla L., Rivoltini L., Patuzzo R., Marrari A., Valdagni R., Parmiani G. Multipeptide vaccination in cancer patients. // Expert Opin Biol Ther. — 2009. Aug. 9(8).- P. 1043-1055.

121. Poehlein C.H., Rittinger D., Ma J., Hu H.M., Urba W.J., Fox B.A. Immunotherapy for melanoma: the good, the bad, and the future. // Curr Oncol Rep. -2005. Sep. 7(5). P.383-392.

122. Rass K., Diefenbacher H., Tilgen W. Experimental treatment of malignant melanoma and its rationale. // Hautarzt. — 2008. Vol. 59 (6). — P.475-483.

123. Rettig W.J., Real F.X., Spengler B.A. et al. Human melanoma proteogllycan: expression in controlled by intrinsic and extrinsic signals. // Science. 1986. -Vol. 231.- P. 1281-1284.

124. Restifo N.P. The new vaccines: building viruses that elicit antitumorimmunity. // Curr. Opin. Immunol. 1996. - Vol. 8. - P.658— 663.

125. Reynolds S.R., Celis E., Sette A. et al. HLA-independent heterogeneity of CD8+ T cell responses to MAGE-3, MelanA/MART-1, gp 100, tyrosinase, MCIR, and TRP-2 in vaccine-treated melanoma patients. // J. Immunol. 1998. - Vol. 161(12). - P.6970-6976.

126. Rimoldi D., Salvi S., Reed D., Coulie P., Jongeneel V.C., De Plaen E., Brasseur F., Rodriguez A.M., Boon T., Cerottini J.C. cDNA and protein characterization of human MAGE-10. // Int. J. Cancer. 1999. - Vol. 82. -P.901-907.

127. Rimoldi D., Romero P., Carrel S. The human melanoma antigen-encoding gene, MAGE-1, is expressed by other tumor cells of neuroectodermal origin such as glioblastomas and neuroblastomas. // Int J• Cancer. 1993. - Vol. 54. - P.527-528.

128. Rivoltini, L., Barrachini K.C., Viggiano V. et al. Quantitative correlation between HLA class I allele expression and recognition ofmelanoma cells by antigen- specific cytotoxic T-lymphocytes. // Cancer Res.- 1995.-Vol. 55.- P.3149-3157.

129. Robbins P.F., El-Gammil M., Kawakami Y., Stevens E., Yannelli J., Rosenberg SA. Recognition of tyrosinase by tumor infiltrating lymphocytes from a patient responding to immunotherapy. // Cancer Res. — 1994. — Vol. 54.- P.3124-3126.

130. Rosenberg S.A. In Cancer: Princeples and Practice of Oncology, ed. V.T. Devita, Hellman, S.A. Rosenberg. Philadelphia: Lippincott-Raven. 5th ed. 1997. - P.349-379.

131. Rubin J.T., Elwood L.J., Rosenberg S.A., Lotze M.T. Immunohistochemical correlates of response to recombinant interleukin-2 based immunotherapy in humans. // Cancer Res. — 1989. Vol. 49. — P.7086-7092.

132. Sabel M.S., Sondak V.K. Tumor vaccines: a role in preventing recurrence in melanoma? // Am J Clin Dermatol. — 2002. Vol. 3(9). — P.609-616.

133. Sato Y., Roman M., Tighe H. et al. Immunostimulatory DNA sequences necessary for effctive intradermal gene immunization. // Science. 1996. - Vol. 273. - P.352-354.

134. Scanlan M.J., Sompson A.J., Old L.J. The cancer/testis genes: review, standartization, and commentary. // Cancer Immunol. 2004. - Vol. 4. -P.1-15.

135. Schultz E., Diepgen T. Clinical and prognostic relevance of serum S-100 beta protein in malignant melanoma. // Br. J. Dermatol. — 1998. — Vol. 138.- P.137-141.

136. Shaffer L.G., Tommerup N. (eds) S. Karger. An International System for Human Cytogenetic Nomenclature. // Basel. — 2005. 130 pp.

137. Simpson A.J.G., Cballero O.L., Jungbluth A., Chen Y.-T., Old L.J. Cancer/testis antigens, gametogenesis and cancer. // Nature Rev. Cancer. — 2005.-Vol. 5.- P.615-625.

138. Stiter S., Monsurro V., Nielsen M.B. et al. Frequency of MART-1/MelanA and gpl00/Pmell7-specific T cells in tumor metastases and cutured tumor-infiltrating lymphocytes. // J.Immunother. 2002. - Vol. 25. - P.252-263.

139. Sondak K.K., Sabel M.S., Mule J.J. et al. Allogenic and autologous melanoma vaccines: Where have we been and where are we going? // Clin Cancer Res. -2006. 12(7Pt2). P.2337-2341.

140. Sobol R.E., Fakhrai H., Shawler D. et al: Interleukin-2 gene therapy in a patient with glioblastoma. // Gene Ther. 1995. - Vol. 2. - P. 164-167.

141. De Smet C., Lurquin C., Van der Bruggen P., De Plaen E., Brasser F., Boon T. Sequence and expression. patent of human MAGE-2 gene. // Immunoge.- 1994.-Vol. 39.- P.121-129.

142. Steinman R.M., Pack M., Inaba K., Dendritic cells in the T-cell areas of lymphoid organs.//Immunol. Rev. — 1997.-Vol. 156. P.25-37.

143. Srivastava P.K., Udono H. Heat shock protein-peptide complexes in cancer immunotherapy. // Curr. Opin. Immunol. 1994. Vol. 6. - P.728-732.

144. Tapparel C., Reymond A., Girardet C., Guillou L., Lyle R., Lamon C., Hutter P., Antonarakis S.E. The TPTE gene family: cellular expression, subcellular localization and alternative splising. // Gene. 2003. - Vol. 323. -P.189-199.

145. Topalian S.L., Solomon D., Rosenberg S.A. Tumor-specific cytolysis by lymphocytes infiltrating human melanomas. // J Immunol. — 1989. — Vol. 142.- P.3714-3725.

146. Urosevic V., Braun D., Willers J. et al. Expression of melanoma-associated antigens in melanoma cell cultures. // Exp. Dermatol. 2005. — Vol. 14.- P.491-497.

147. Yu Z., Restifo N.P. Cancer vaccines progress reveals new complexities. // J Clin Invest. 2002. - Vol. 110. - P.289-294.

148. Ward S., Casey D., Labarthe M.C., Whelan M., Dalgleish A., Pandha H., Todryk S. Onyvax Ltd., Immunotherapeutic potential of whole tumour cells. //Cancer Immunol Immunother. 2002. Sep. 51(7). - P.351-357. Epub. -2002. Jun 14.

149. Wilson B.S., Imai K., Natali P.G. et al. Distribution and molecular characterization of cell-surface and a cytoplasmic antigen detectable in human mtkfyjma cells with monoclonal antibodies. // Int J Cancer. 1981. -Vol. 28.- P.293-300.

150. Wolfel T., Van Pel A., Brichard V., et al. Two tirosinase non-apeptides recognized on HLA-A2 melanomas by autologous cytolytic T lymphocytes. // Eur. J. Immunol. 1994. - Vol. 24. - P.759-764.

151. Wolchoh J.D., Livingston P.O. Vaccines for melanoma: Teanslating basic immunology into new therapies. // Lancet Oncol. 2001. -Vol. 2(4).- P.205-211.

152. Xu H.P., Yuan L., Shan J., Feng H. Localization and expression of TSP50 protein in human and rodent testis. // Urology. 2004. 64. - P.826-832

153. Zarour H.M., Kirkwood J.M. Melanoma vaccines: Early progress and future promises. // Semin Catan Med Surg. 2003. - Vol. 22(1). - P.68-75.