Растворимые формы мембранных белков клеток крови человека в норме и при неопластической альтерации гомеостаза тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.04, кандидат биологических наук Гостюжова, Екатерина Александровна

• Гостюжова, Екатерина Александровна
• кандидат биологических наук
• 2009

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Гостюжова, Екатерина Александровна

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Молекулярные основы опухолевой трансформации и современных подходов к лечению неоплазий на примере хронического миелолейкоза.

1.2. Дифференцировочные молекулы гемопоэтических клеток и их растворимые формы.

1.2.1. CD95 (Fas) протеин и его альтернативный сплайсинг.

1.2.2. Характеристика активационных молекул (CD25, CD38) и их растворимых форм.

1.2.3. Белки адгезии CD50, CD54, CD18 и их растворимые комплексы.

1.2.4. Молекулы главного комплекса гистосовместимости.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Материалы исследования.

2.2. Получение препаратов хромосом из клеток костного мозга и проведение цитогенетического исследования.

2.3. Используемые моноклональные антитела.

2.4. Иммуноферментные методы определения растворимых форм мембранных антигенов клеток иммунной системы.

2.5. Выделение РНК из клеток, постановка реакции обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции.

2.6. Методы статистического анализа.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Особенности кариотипа гемопоэтических клеток при хроническом миелолейкозе.

3.2. Сывороточный уровень растворимого CD95(Fas) протеина и спектр альтернативных форм мРНК Fas-антигена.

3.3. Сывороточный уровень растворимых форм активационных протеинов CD25 и CD38.

3.4. Сывороточное содержание растворимых молекул адгезии CD18, CD50, CD54 и их комплексов.

3.5. Сывороточное содержание растворимых форм молекул главного комплекса гистосовместимости (HLA-I, HLA-DR), СЭ8-антигена и растворимого комплекса (HLA-I-CD8).

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Растворимые формы мембранных белков клеток крови человека в норме и при неопластической альтерации гомеостаза»

Актуальность проблемы

Физиологические основы сохранения гомеостаза организма, в том числе и защита от неопластических процессов, базируются на эффективной и многосторонней работе молекулярных и клеточных механизмов иммунных реакций. В то же время, анализ данных по биологическим основам развития неоплазий свидетельствует: опухоль возникает в результате многоступенчатого процесса накопления генетических изменений.

В настоящее время растворимые формы мембранных белков клеток иммунной системы рассматриваются в качестве участников глобальной иммунологической сети, тесным образом связанной со всеми физиологическими системами организма. Каждая из растворимых дифференцировочных молекул или растворимых молекул гистосовместимости может быть представлена несколькими изоформами, образующимися за счет шеддинга с мембраны клетки или альтернативного сплайсинга матричной РНК. Они осуществляют множественные функции, модулируя иммунные реакции путем связывания с лигандами своих мембранных гомологов на поверхности клеток, и являются межклеточными белковыми коммуникаторами (Новиков В.В. и др., 2007; Mason D. et al., 2001).

Известно, что растворимые формы мембранных протеинов при онкологических заболеваниях участвуют в формировании механизмов ухода опухоли от иммунного надзора. Обнаружено изменение их сывороточного содержания при многих онкозаболеваниях, в том числе при раке молочной железы, раке тела матки, раке легкого и меланоме. Таким образом, растворимые формы мембранных белков, появляющиеся в биологических жидкостях, могут вызывать множественные эффекты, отражающие патогенетические механизмы, с одной стороны, и вносящие свой вклад в нарушение гомеостаза при различных неоплазиях, с другой стороны

Новиков B.B. и др., 2008). Особый интерес представляет исследование состояния пула растворимых форм мембранных белков при нарушениях в системе гемопоэза.

Основным молекулярным событием, ведущим к формированию лейкемического клона при опухолевых заболеваниях кроветворной системы, является нарушение функционирования нормальных генов в результате мутаций отдельных генов или хромосомных аберраций, зачастую с вовлечением протоокогенов (Westbrook T.F., 2005; Timothy J.L. et al., 2008). Для миелоидных опухолей наиболее характерными являются реципрокные транслокации, при которых происходит обмен генетическим материалом между различными хромосомами с образованием патологических хромосомных структур, самой известной из которых является "филадельфийская хромосома" (Ph-хромосома), или t(9;22), ведущая к образованию химерного гена BCR-ABL. Продукт этого гена (тирозинкиназа) ведет к, фосфорилированию множества протеинов, участвующих в процессе сигнальной трансдукции - передаче сигнала с рецепторов клеточной мембраны ядерному генетическому материалу. Активация различных сигнальных путей ведет к независимой от ростовых факторов пролиферации, нарушению адгезии клеток к стромальному окружению и устойчивости к апоптозу. Ph-хромосома обнаруживается при острых лимфобластных и миелоидных лейкозах с определенной частотой, но является перестройкой, специфичной для хронического миелолейкоза (XMJI) — в дебюте заболевания присутствует практически во всех метафазах у 95-98% больных.

Современная терапия ингибитором BCR-ABL тирозинкиназы (иматиниба мезилат, гливек) позволяет добиться значительного подавления опухолевого клона и восстановления нормального кроветворения, что приводит к увеличению выживаемости больных (Hughes Т.Р. et ah, 2003; Kantarjian Н. et ah, 2003). Однако часть пациентов остаются резистентными к лечению гливеком в качестве монотерапии. Насущным вопросом становится поиск путей прогнозирования устойчивости к ингибиторам тирозинкиназ на молекулярном и клеточном уровне.

Цель работы

Изучение сывороточного содержания растворимых форм мембранных белков клеток крови человека в норме и при альтерации гомеостаза неопластического генеза с изменением кариотипа опухолевых клеток.

Задачи

1. Исследовать особенности кариотипа гемопоэтических клеток больных хроническим миелолейкозом до терапии и на фоне терапии ингибитором тирозинкиназы.

2. Провести анализ уровня суммарной и олигомерной фракций растворимого CD95 (Fas) протеина в сыворотке крови и спектра альтернативных форм матричной РНК Fas белка при хроническом миелолейкозе.

3. Оценить уровень растворимых форм активационных молекул CD25 и CD38 в сыворотке крови в дебюте хронического миелолейкоза и при различном цитогенетическом ответе на проводимую терапию.

4. Изучить содержание в сыворотке крови растворимых белков адгезии CD50, CD54, CD18 и растворимых комплексов CD18-CD54, CD18-CD50 у пациентов с хроническим миелолейкозом.

5. Проанализировать сывороточное содержание растворимых форм молекул главного комплекса гистосовместимости (HLA-I, HLA-DR), CD8 протеина и растворимого комплекса HLA-I-CD8 при хроническом миелолейкозе.

6. Провести сравнительный анализ содержания исследуемых молекул при хроническом миелолейкозе и некоторых других неоплазиях кроветворной системы с поражением миелоидного и лимфоидного ростков кроветворения.

Научная новизна

На основе данных о содержании растворимых форм мембранных белков гемопоэтических клеток и результатов кариологического исследования при хроническом миелолейкозе впервые установлена взаимосвязь между уровнем цитогенетического ответа в процессе терапии ингибитором тирозинкиназы и структурно-функциональным состоянием пула растворимых форм мембранных белков клеток иммунной системы.

Впервые показано, что в дебюте хронического миелолейкоза и в случае минимального цитогенетического ответа и/или его отсутствия наблюдается наиболее высокое содержание исследуемых растворимых молекул: суммарной и олигомерной фракций sCD95, сывороточного содержания растворимых форм CD25 и CD38 протеинов, белка адгезии CD54, а также растворимых молекул HLAI класса.

Впервые обнаружено, что полный цитогенетический ответ на фоне терапии гливеком характеризуется нормализацией сывороточного содержания олигомерного белка CD38, суммарной фракции белка CD95, растворимых молекул HLA I класса, растворимого комплекса CD18-CD54, повышением уровня растворимого CD18, однако содержание суммарной фракции растворимого белка CD54 сохраняется повышенным.

Впервые продемонстрированы особенности спектра альтернативных форм матричной РНК Fas белка при хроническом миелолейкозе: в дебюте заболевания спектр форм мРНК отличался вариабельностью (от полного спектра до отсутствия альтернативных форм), при полном цитогенетическом ответе спектр форм мРНК Fas белка совпадал с донорским, в то время как при частичном ответе и отсутствии ответа отмечены изменения в спектре мРНК минорных альтернативных форм, а именно, в 50% образцов крови у больных выявлялась единственная минорная форма (FasExo3,4Del или FasExo3,4,6Del).

Впервые показано, что острый лимфобластный лейкоз сопровождается повышением сывороточного содержания не только суммарных, но и олигомерных фракций растворимых белков СЭ95 и СЭ38, а также суммарной фракции СБ50 протеина. При остром миелолейкозе впервые обнаружено повышение сывороточного уровня растворимого СЭ38 олигомера и растворимых ассоциатов НЬА-1-С08.

Научно-практическая значимость работы

Сведения о содержании растворимых форм мембранных белков гемопоэтических клеток могут быть использованы в изучении механизмов иммуносупрессии при неопластической альтерации гомеостаза с поражением системы кроветворения и природы резистентности опухолевых клеток к ингибиторам тирозинкиназ.

Полученные данные о повышении уровня суммарной фракции бСВ95, растворимых активационных молекул СТ)25 и СЭ38, С054 протеина адгезии, а также молекул НЬА I класса в сыворотке крови лиц с хроническим миелолейкозом в дебюте заболевания и при отсутствии ответа на терапию гливеком имеют прогностическую значимость и могут быть использованы для разработки новых подходов к оценке эффективности таргетной терапии хронического миелолейкоза ингибиторами тирозинкиназ.

Положения, выносимые на защиту

1. В дебюте хронического миелолейкоза наблюдается повышение сывороточного содержания суммарной фракции бСВ95 и бСВ38, белка адгезии С054, а также растворимых молекул НЬА I класса.

2. В случае большого цитогенетического ответа на фоне терапии гливеком отмечается возрастание уровня растворимой формы СО 18 белка, при частичной цитогенетической ремиссии имеет место повышение олигомерной фракции бСВ95 протеина.

3. Минимальный цитогенетический ответ или его отсутствие ассоциируется при лечении гливеком с наибольшим повышением содержания исследованных растворимых форм мембранных белков: суммарной и олигомерной фракций зС095, растворимых молекул СБ25 и СЭ38, СЭ54 протеина адгезии, а также молекул зНЬА-1; при этом отмечается снижение сывороточного уровня зС018.

4. За исключением растворимого комплекса НЬА-1-С08, острый лимфобластный лейкоз характеризуется более высоким сывороточным содержанием тестированных растворимых белков в сравнении с хроническим миелолейкозом и другими миелопролиферативными заболеваниями.

Апробация работы

Результаты работы представлены на Российской научно-практической конференции "Актуальные вопросы гематологии и трансфузиологии" (Санкт-Петербург, 2007), Всероссийской научно-практической конференции "Высокотехнологичные методы диагностики и лечения заболеваний сердца, крови и эндокринных органов" (Санкт-Петербург, 2008), Всероссийской научной конференция с международным участием «Нанотехнологии в диагностике опухолей» (Москва, 2009), 3-ей международной научной конференции "Актуальные проблемы спортивной морфологии и генетики человека" (Москва, 2009).

Апробация диссертации состоялась на расширенном заседании кафедры молекулярной биологии и иммунологии ННГУ им. Н.И. Лобачевского 25 июня 2009 года.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 4 работы в ведущих отечественных журналах, рекомендованных ВАК, и 6 статей и тезисов докладов региональных и всероссийских конференций.

Структура и объем диссертации

Диссертационная работа в объеме 150 листов состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований,

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Гостюжова, Екатерина Александровна

119 ВЫВОДЫ

1. При первичном хроническом миелолейкозе на фоне вариабельности спектра альтернативных форм матричной РНК CD95 протеина клеток крови обнаружено снижение сывороточного уровня растворимого комплекса CD 18-CD54 и повышение сывороточного содержания суммарной фракции растворимого CD95 протеина, олигомерной формы белка CD38, суммарной формы белка адгезии CD54, а также растворимых молекул HLA I класса.

2. Полный цитогенетический ответ на фоне терапии гливеком характеризуется спектром форм матричных РНК Fas белка клеток крови, соответствующим спектру здоровых доноров, нормализацией сывороточного содержания олигомерного белка CD38, суммарной фракции белка CD95, растворимых молекул HLA I класса, растворимого комплекса CD18-CD54, повышением уровня растворимого CD 18, а также сохранением изначально повышенного содержания суммарной фракции растворимого белка CD54.

3. Чем менее выражен цитогенетический ответ, тем ниже сывороточное содержание растворимого протеина CD 18 и выше уровень растворимых молекул HLA I класса, HLA-DR, растворимых комплексов HLA-I-CD8, растворимого рецептора интерлейкина-2, суммарного и олигомерного sCD95 протеина при сохранении у половины больных хроническим миелолейкозом с отсутствием цитогенетического ответа в клетках крови только одной из минорных форм матричной РНК CD95 протеина (FasExo3,4Del или FasExo3,4,6Del).

4. Независимо от цитогенетического ответа, сывороточное содержание суммарной фракции растворимого белка адгезии CD54 при терапии гливеком остается повышенным в сравнении с нормой, как и у первичных больных хроническим миелолейкозом.

5. Характер изменений сывороточного содержания тестированных представителей пула растворимых форм мембранных белков клеток иммунной системы для большинства из них сходен в дебюте хронического миелолейкоза с картиной изменений в их содержании у первичных больных РЬ-негативными миелопролиферативными заболеваниями, миелодиспластическим синдромом и острым миелолейкозом.

За исключением растворимых комплексов НЬА-1-С08, у больных острым лимфобластным лейкозом обнаружено более выраженное увеличение сывороточного уровня исследованных протеинов и их ассоциатов по сравнению с неоплазиями миелоидного происхождения.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Физиологические механизмы сохранения гомеостаза включают в себя как важную составную часть сохранение динамического равновесия между двумя такими фундаментальными процессами, как пролиферация и апоптоз. Гомеостаз иммунной системы складывается из множественного взаимодействия различных белковых ансамблей, что приводит к адекватному ответу на внешние и внутренние возмущающие агенты в виде продуктов генетически чужеродной информации. Адекватный и полноценный иммунный ответ является необходимой реакцией организма на возникновение и развитие неопластических процессов. В состав глобальной иммунологической сети входят антитела и антиидиотипические антитела, цитокины, рецепторы Т- и В-клеток, множество других мембранных белков, осуществляющих лиганд-рецепторное взаимодействие, а также их растворимые формы, которые образуются как путем шеддинга, так и за счет альтернативного сплайсинга мРНК. Опухолевый рост может вызвать гиперпродукцию не только растворимых опухолевых антигенов, но и растворимых форм мембранных антигенов иммунокомпетентных клеток, которые в состоянии блокировать различные фазы иммунного ответа и вызывать разбалансировку иммунного гомеостаза и индукцию иммуносупрессии, а последняя, как правило, приводит к активизации опухолевого процесса.

Механизмы возникновения опухолей кроветворной системы и реакция иммунной системы на развитие опухоли, наряду со своими особенностями, имеют и общие черты. Биологической основой лейкемической трансформации является мутация генетического материала клоногенной кроветворной клетки, причем мутация часто является результатом хромосомных аберраций с последующими событиями, приводящими к нарушениям пролиферации, дифференцировки и апоптоза клеток с накоплением патологического продукта (Ichikawa Н. et al., 2005). Наиболее известной перестройкой при опухолевых заболеваниях кроветворной системы является "филадельфийская хромосома" (Ph-хромосома), или t(9;22), ведущая к образованию химерного гена В CR-ABL. Современная терапия ингибитором BCR-ABL тирозинкиназы (иматиниба мезилат, гливек) позволяет достигнуть существенного подавления опухолевого клона, то есть полной или частичной цитогенетической ремиссии, и восстановления нормального кроветворения. В связи с этим XMJI может рассматриваться как принципиальный образец неоплазий, для которого известны молекулярные основы патогенеза. Кроме того, XMJI является одним из лучших примеров заболеваний, для которых разработана молекулярно направленная (таргетная) терапия. Характер изменения концентрации растворимых форм мембранных белков может нести прогностическую информацию при иммуноопосредованных заболеваниях разного генеза, в том числе онкологических. В связи с вышесказанным в работе эти показатели были выбраны в качестве критерия оценки альтерации гомеостаза при неоплазиях кроветворной системы различного происхождения.

Нами проведен анализ особенностей кариотипа опухолевых клеток при хроническом миелолейкозе в дебюте заболевания и на фоне терапии ингибитором тирозинкиназы. При кариологическом анализе до начала лечения стандартная транслокация t(9;22)(q34;qll) выявлена в 89% случаев хронического миелолейкоза. В остальных случаях имели место вариантные транслокации и комплексные аномалии кариотипа с вовлечением других хромосом, помимо 9 и 22. За все время наблюдения достижение большого цитогенетического ответа при лечении гливеком отмечено у 60% пациентов. Достоверно выше вероятность достижения большого цитогенетического ответа была в группе пациентов, получающих гливек в качестве первой линии терапии, по сравнению с теми, кто имел предлеченность в течение 6 месяцев и более (р<0,05). При этом для полного цитогенетического ответа зависимость была обратной. Среди лиц, получающих гливек в качестве первой линии терапии, чаще отмечалось достижение частичного цитогенетического ответа.

Мы проанализировали уровень цитогенетического ответа в зависимости от длительности терапии гливеком, поскольку время достижения большого или частичного ЦО является критерием оптимального, субоптимального или отсутствия ответа на терапию гливеком. С увеличением длительности проводимого лечения частота достижения полного или большого ЦО растет с 27% спустя 6 месяцев до 57% спустя 3 года и более.

На втором этапе работы у первичных больных XMJI и пациентов с разным цитогенетическим ответом на терапию ингибитором тирозинкиназы BCR-ABL (гливеком) исследовано сывороточное содержание растворимых форм ряда мембранных белков клеток иммунной системы.

В дебюте хронического миелолейкоза и в случае минимального цитогенетического ответа и/или его отсутствия наблюдается наиболее высокое содержание исследуемых растворимых молекул. При первичном XMJT имеет место повышение сывороточного содержания суммарной фракции растворимого CD95 протеина. При этом спектр форм мРНК Fas белка отличался гетерогенностью: от полного спектра до отсутствия альтернативных форм. Таким образом, повышение уровня суммарного, и в меньшей степени олигомерного растворимого CD95 протеина у больных первичным XMJI может приводить к подавлению цитотоксического звена Т-клеточного ответа, что вносит свой вклад в патогенез заболевания. У первичных пациентов с XMJI выявлено также повышение сывороточного содержания олигомерной формы белка CD38, суммарной формы белка адгезии С054, а также растворимых молекул НЬА I класса. Снижение отмечено лишь для уровня растворимого комплекса С018-СВ54.

Полный цитогенетический ответ на фоне терапии гливеком характеризуется нормализацией сывороточного содержания олигомерного белка С038, суммарной фракции белка С095, растворимых молекул НЬА I класса, растворимого комплекса СБ18-СВ54, повышением уровня растворимого СО 18, при этом содержание суммарной фракции растворимого белка СБ54 также сохраняется повышенным. Такой характер изменения содержания С095 протеина вероятно означает ограничение Раз-зависимой инициации апоптоза иммунокомпетентных клеток на фоне увеличения их проапоптотического потенциала по отношению к опухолевым клеткам, что приводит к повышению эффективности противоопухолевой терапии. Снижение повышенного уровня зНЬА-1 до нормальных значений в случае успешной терапии гливеком является, вероятно, звеном механизма нормализации апоптотических процессов, касающихся активированных Т-клеток. Это позволяет предположить возможность использования данного протеина для иммунологического мониторинга пациентов с ХМЛ.

При частичном цитогенетическом ответе отмечалось пониженное сывороточное содержание растворимого протеина СБ 18 и повышенный уровень растворимых молекул НЬА I класса, НЬА-ОК, растворимых комплексов НЬА-1-С08, растворимого рецептора интерлейкина-2, суммарного и олигомерного 8СБ95 протеина.

Минимальный цитогенетический ответ или его отсутствие ассоциируется при лечении гливеком с наибольшим повышением содержания исследованных растворимых форм мембранных белков: суммарной и олигомерной фракций зС095, растворимых молекул СБ25 и СОЭ8, С054 протеина адгезии, а также молекул зНЬА-1; при этом отмечается снижение сывороточного уровня зСВ18. При недостаточно успешном лечении гливеком, сопровождающемся минимальным цитогенетическим ответом либо его отсутствием, повышение уровня растворимого суммарного CD95 протеина более показательно, нежели олигомера, и может иметь прогностическую значимость.

Известно, что растворимый CD25 протеин является фактором супрессии, поскольку связывает в межклеточном пространстве интерлейкин-2, продуцируемый клетками (Новиков В.В. и др., 2008). В связи с этим повышение сывороточного уровня sCD25 у больных с отсутствием ЦО является закономерным отражением угнетения противоопухолевого иммунного ответа. Повышенный сход с мембраны sCD38 снижает плотность экспрессии этих молекул. В итоге меняется адгезионная способность клеток, реализующаяся при участии CD38 протеина. С другой стороны, изменение в крови содержания sCD38 может модулировать механизмы адгезионного взаимодействия клеток, связанные с участием данного протеина.

Высказывается предположение, что растворимые формы молекул семейства 1С AM могут блокировать связывание опухолевых клеток с мембранными формами их лигандов. Показано, что снижение экспрессии CD 18 антигена на лимфоцитах и нейтрофилах приводит к ослаблению цитотоксической функции этих клеток, так как уменьшается возможность формирования межклеточных контактов между иммунокомпетентными клетками и клетками опухоли, несущими на своей мембране лиганд CD54 антиген (Zhang J. et al., 2000; van Spriel et al., 2001). Таким образом, нарушение баланса между мембранными и растворимыми формами молекул адгезии может вносить свой вклад в опухолевую прогрессию.

Наряду с анализом сывороточного содержания растворимых молекул HLA I класса и растворимого белка CD8, был определен уровень растворимых комплексов, состоящих из данных молекул. Достоверное повышение содержания растворимого комплекса HLA-I-CD8 в 1,8 раза выявлено при отсутствии ЦО на получаемую терапию. Белки, входящие в состав растворимых ассоциатов, лишены способности обеспечивать модулирующие эффекты, свойственные свободным растворимым формам мембранных белков, поскольку их центры связывания взаимно блокированы. Таким образом может происходить ограничение программированной клеточной смерти CDS-положительных цитотоксических Т-лимфоцитов и обеспечение более эффективной работы противолейкемического клеточного иммунного ответа.

При полном цитогенетическом ответе спектр форм мРНК Fas белка совпадал с донорским, в то время как при частичном ответе и отсутствии ответа отмечены изменения в спектре мРНК минорных альтернативных форм, а именно, в 50% образцов крови у больных выявлялась единственная минорная форма (FasExo3,4Del или FasExo3,4,6Del). Вероятно, выявленные спектры форм мРНК Fas белка с одной стороны отражают особенности транскриптома мононуклеарных клеток крови при XMJI, а с другой, могут вносить вклад в модуляцию апоптотического сигнала, кодируя соответствующие белковые продукты.

Независимо от цитогенетического ответа, сывороточное содержание суммарной фракции растворимого белка адгезии CD54 при терапии гливеком остается повышенным в сравнении с нормой, как и у первичных больных хроническим миелолейкозом.

Характер изменений в сывороточном содержании тестированных представителей пула растворимых форм мембранных белков клеток иммунной системы для большинства из них сходен в дебюте хронического миелолейкоза с картиной изменений в их содержании у первичных больных Ph-негативными миелопролиферативными заболеваниями, миелодиспластическим синдромом и острым миелолейкозом. При остром миелолейкозе впервые обнаружено повышение сывороточного уровня растворимого CD38 олигомера и растворимых ассоциатов HLA-I-CD8. Однако структурно-функциональное состояние пула растворимых форм мембранных протеинов при острых лимфолейкозах и острых нелимфоидных лейкозах различалось.

За исключением растворимых комплексов HLA-I-CD8, у больных острым лимфобластным лейкозом обнаружено более выраженное увеличение сывороточного уровня исследованных протеинов и их ассоциатов по сравнению с неоплазиями миелоидного происхождения. Нами показано, что острый лимфобластный лейкоз сопровождается повышением сывороточного содержания не только суммарных, но и олигомерных фракций растворимых белков CD95 и CD38, а также суммарной фракции CD50 протеина. Ранее было показано повышение сывороточного уровня суммарного CD38 антигена при острых лимфолейкозах (Королева В.В. и др., 2000). В данной работе наряду с повышением сывороточного содержания суммарной фракции растворимого CD38 протеина обнаружено таюке увеличение содержания олигомерной фракции данного белка. Причем олигомерная фракция CD38 протеина увеличивалась намного более значительно в сравнении с суммарной, что свидетельствует о том, что при OJIJI sCD38 находится в сыворотке преимущественно в форме олигомера (димера). В противоположность характеру изменения уровня sCD38 при OJIJT зарегистрирован многократный подъем сывороточного содержания суммарной фракции sCD95 белка, что подтверждает литературные данные о его важной роли в патогенезе этого заболевания (Liu X. et al., 1999). Иной характер изменения суммарной и олигомерной фракций обнаружен при OJIJT для растворимого CD54 антигена. Сывороточное содержание sCD54 антигена в обеих фракциях равнозначно повышалось в 4 раза.

Многократное повышение сывороточного уровня выявлено также для растворимых молекул HLA I класса. Высокие концентрации sHLA-I в дебюте острого лимфолейкоза согласуются с имеющимися в литературе сведениями об увеличении уровня sHLA-I при гемобластозах (Новиков В.В., 1996). Повышенный уровень молекул sHLA-I способен вызывать гибель CD8-положительных цитотоксических Т-лимфоцитов, а также натуральных киллеров, что является важным фактором угнетения противолейкемического иммунного ответа, способным привести к прогрессированию заболевания.

Растворимые молекулы HLA I класса способны находиться в связанной с CD8 антигеном форме (Новиков В.В. и др., 2008). Оценка их уровня при острых лимфолейкозах показало, что на фоне четырехкратного повышения сывороточного уровня растворимых молекул HLA I класса, содержание растворимых комплексов HLAI-CD8 остается в норме. То есть, повышение содержания растворимых молекул HLA I класса при OJ1J1 происходит за счет их свободной, не связанной с лигандом формы, способной оказывать проапоптотический эффект.

На основании проведенного исследования можно заключить, что при хроническом миелолейкозе и других нарушениях гемопоэза неопластического характера изменяется структурно-функциональное состояние пула растворимых форм мембранных белков гемопоэтических клеток, что играет важную роль в формировании механизмов ухода лейкемического клона из-под контроля иммунной системы, взаимосвязано с цитогенетическим ответом на проводимую терапию ингибитором тирозинкиназы и может быть использовано в мониторинговых и прогностических целях.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Гостюжова, Екатерина Александровна, 2009 год

1. Абдулкадыров K.M., Бессмельцев С.С., Рукавицын O.A. Хронический миелолейкоз. — СПб: Специальная литература, 1998. — 464с.

2. Александров A.B., Джексон A.M., Румянцев А.Г. Анализ механизма модуляции межклеточных молекул адгезии ICAM // Иммунология. — 1997. -№ 1.-С. 35-42.

3. Алясова A.B., Варшавская Л.В., Новиков В.В. и др. Динамика растворимого CD50 антигена у больных раком молочной железы в процессе комплексного лечения // Клиническая и лабораторная диагностика. 2004. - № 3. - С. 42-43.

4. Бабаев A.A., Ежова Г.П., Добротина H.A. и др. Белки. Часть 2. Молекулы адгезии: Учебное пособие. — Н.Новгород: Изд-во ННГУ, 2004. 101 с.

5. Бабаев A.A., Кравченко Г.А., Ятманова Т.А. и др. Растворимые комплексы молеул адгезии в сыворотке крови человека // Вестник ННГУ, сер. Биология 2006. - №1 (11). - С. 128-132.

6. Боценовский В.А., Барышников А.Ю. Молекулы клеточной адгезии // Успехи современной биологии. 1994. - Т. 114 (6). - С. 741-750.

7. Варшавская Л.В., Алясова A.B., Кравченко Г.А. и др. Повышенное содержание растворимых CD50 и CD38 антигенов в сыворотке крови при солидных опухолях // Вестник ННГУ, сер. Биология. -2002.-№ 1 (4).-С. 183-188.

8. Волкова М.А. Хронический миелолейкоз //' Клиническая онкогематология: Рук-во для врачей / Под ред. М.А. Волковой. — 2-е изд. М.: "Медицина", 2007. - С. 552-582.

9. Голенков А.К., Митина Т.А., Новиков В.В. и др. Клиническое значение растворимых молекул адгезии (sCD50 ICAM3), апоптоза (sCD95) и sHLA класса I при лимфопролиферативных заболеваниях // Рос. биотер. журн. - 2002. - №1. - С. 60-64.

10. Ю.Домрачева Е.В., Захарова A.B., Асеева Е.А. Цитогенетика хронического миелолейкоза // Гематол. и трасфузиол. — 2005. — Т.50, №2. С.44-49.

11. П.Дейвис К. Анализ генома. Методы. М., 1990. - 289 с.

12. Евсегнеева И.В., Птицына Ю.С., Новиков Д.В. и др. Содержание суммарной и олигомерной фракций sCD95 антигена в сыворотке крови больных вирусными гепатитами В и С // Физиол. и патол. иммунн. сист. 2005. - Т. 9, № 3. - С. 12-15.

13. Королева В.В., Крыжанова М.А., Пугина С.А. и др. Уровень растворимого CD38 антигена в сыворотке крови онкогематологических больных. // Матер. V Всероссийского съезда онкологов «Высокие технологии в онкологии». — Казань, 2000. — Т.1.-С. 178-179.

14. Кравченко Г.А., Тагиров О.Т., Новиков В.В. Растворимый Fas (CD95) белок, ингибирующий апоптоз как прогностический биомаркер течения РМЖ // Вестник ННГУ, сер. Биол. 2001. - № 3. -С. 18-25.

15. Лебедев М.Ю., Крыжанова М.А., Кораблев С.Б. и др. Растворимый CD 38 антиген новый информативный показатель состояния иммунной системы при ожоговой болезни // Нижегородский мед. журнал. - 2000. - № 2. - С. 10-14.

16. Мартынкевич И.С., Мартыненко Л.С., Иванова М.П. и др. Дополнительные хромосомные аберрации у больных хроническим миелолейкозом // Гематол. и трансфузиол. 2007. - т.52, №2. - С. 28-35.

17. Новиков B.B. Растворимые формы дифференцировочных антигенов гемопоэтических клеток // Гематол. и трансфузиол. — 1996. — № 6. — С. 40-43.

18. Новиков В.В., Караулов A.B., Барышников А.Ю. Растворимые формы мембранных антигенов клеток иммунной системы // М.: Изд-во МИА, 2008.-243 с.

19. Новиков В.В., Караулов A.B., Барышников А.Ю. Растворимые формы мембранных антигенов клеток иммунной системы // Иммунология. 2007. - № 4. - С. 249-253.

20. Ольшанская Ю.В., Домрачева Е.В. Хромосомные перестройки при острых лейкозах: Справочное пособие. М.: МЕДпресс-информ, 2006.-112 с.

21. Петухов В.И. Роль Fas-опосредованного апоптоза в реализации противоопухолевого эффекта а-интерферона при хроническом миелолейкозе // Гематол. и трансфузиол. 2000. - №4. - С. 29-33.

22. Птицына Ю.С. Сывороточный уровень растворимых форм мембранных антигенов клеток иммунной системы при вирусных гепатитах В, С и G: Автореф. дисс. . канд. биол. наук. М., 2003. -24с.

23. Пяткин Е.К., Порошенко Г.Г. Хромосомные нарушения в костном мозге при хроническом миелолейкозе // Вестн. АМН СССР. — 1965. -№3.-С. 21-22.

24. Рукавицын O.A., Поп В.П. Хронические лейкозы. — М.: БИНОМ. Лаборатория знаний, 2004. 240 с.

25. Тагиров О.Т. Роль растворимых белков CD95 и HLA I класса в альтерации гомеостаза человека на примере неоплазий: Автореф. дисс. . канд. биол. наук. 2003. - 23с.

26. Туркина А.Г., Хорошко Н.Д., Дружкова Г.А. и др. Эффективность терапии иматиниба мезилатом (Гливеком) в хронической фазе миелолейкоза // Терапевтический архив. 2003. - Т.75, №8. - С.62-67.

27. Уткин О.В., Новиков В.В. Регуляция апоптоза с помощью альтернативного сплайсинга матричной РНК // Рос. биотер. журн. — 2007.-№2.-С. 13-20.

28. Флейшман Е.В. Хромосомные изменения при гемобластозах // Руководство по гематологии / Под ред. А.И. Воробьева. 3-е изд. -М., 2002.-T. 1.-С. 156-158.

29. Хаитов P.M., Алексеев Л.П. Физиологическая роль главного комплекса гистосовместимости человека. // Иммунология. — 2001. — № 3. С. 4-12.

30. Хорошко Н.Д., Мокеева P.A., Туркина А.Г. и др. Гиперэозинофильный вариант Ph-положительного хронического миелолейкоза // Тер.архив. 1998. - №7. - С.29-37.

31. Худякова Н.Е., Новиков В.В., Кравченко Г.А. и др. Уровень растворимых антигенов HLA I и II классов в сыворотке крови ВИЧ-инфицированных лиц. // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2004. - № 1. - С. 42-45.

32. Янченко О.С., Конторщикова К.Н., Новиков В.В. и др. Воздействие озонотерапии на популяционный состав лимфоцитов при раке тела матки и миоме матки // Рос. биотер. журн. — 2006. — №4. — С.4-7.

33. Alessio M., Roggero S., Funaro A. et al. CD38 molecule: structural and biochem-ical analysis on human T lymphocytes, thymocytes, and plasma cells.// J. Immunol. 1990. - Vol. 145. - P. 878-884.

34. Andrys C., Pozler O., Krejsek J. et al. Serum soluble adhesion molecules (sICAM-1, sVCAM-1 and sE-selectin) in healthy school aged children and adults // Acta Medica. 2000. - Vol. 43. - P. 103-106.

35. Angstreich G.R., Smith B.D., Jones R.J. Treatment options for chronic myeloid leukemia: imatinib versus interferon versus allogeneic transplant // Curr. Opin. Oncol. 2004. - Vol.16. - P. 95-99.

36. Aplin A.E., Howe A., Alahari S.K. et al. Signal transduction and signal modulation by cell adhesion receptors: the role of integrins, cadherins, immunoglobulin-cell adhesion molecules, and selectins // Pharm. Rev. -1998. Vol. 50 (2). - P. 197-263.

37. Arimilli S., Astafieva I., Mukku P.V. et al. Peptide binding inhibits aggregation of soluble MHC class II in solution. // IUBMB Life. 1999. - Vol. 48. - № 5. - P. 483-491.

38. Arnold P.Y., Mannie M.D. Vesicles bearing MHC class II molecules mediate transfer of antigen from antigen-presenting cells to CD4+ T cells. // Eur. J. Immunol. 1999. - Vol. 29. - № 4. - P. 1363-1373.

39. Axdorph U., Sjoberg J., Grimfors G. et al. Biological markers may add to prediction of outcome achieved by the International Prognostic Score in Hodgkin's disease. // Ann. Oncol. 2000. - Vol. 11. - № 11. - P. 14051411.

40. Baker M.A., Roncari D.A., Taub R.N. et al. Characterization of compounds shed from the surface of human leukemic myeloblasts in vitro // Blood. 1982. - Vol. 60, №2. - P. 412-419.

41. Ballantyne C.M., Kozak C.A., O'Brien W.E. et al. Assignment of the gene for intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) to proximal mouse chromosome 9 // Genomics. 1991. - № 9. - P. 547.

42. Barnes D.J., Melo J.V. Primitive, quiescent and difficult to kill: the role of non-proliferating stem cells in chronic myeloid leukemia // Cell Cycle. 2006. - Vol. 5, №24. - P. 2862-2866.

43. Begh B., Padoan M., Moss C.T. et al. Lack of association of HLA class I genes and TNF a-308 polymorphism in toluene diisocyanate-induced asthma.// Allergy. 2004. - №59. - P. 61-64.

44. Behrmann I., Walczak H., Krammer P.H. Structure of the human APO-1 gene // Europ. J. Immunol. 1994. - Vol. 24, №12. - P. 3057-3062.

45. Bjercke S., Gaudernack G. Dendritic cells and monocytes as accessory cells in T-cell responses in man. II. Function as antigen-presenting cells. // Scand. J. Immunol. 1985. - Vol. 21, № 5. - P. 501-508.

46. Blann A.D., Byrne G.J., Baildam A.D. Increased soluble intercellular adhesion molecule-1, breast cancer and the acute phase response // Blood Coagul. Fibrinolysis.-2002.-Vol. 13, №2.-P. 165-168.

47. Bleijs D.A., Geijtenbeek T.B., Figdor C.G. et al. DC-SIGN and LFA-1: a battle for ligand // TRENDS in Immunology. 2001. - Vol. 22. - № 8. -P. 457-463.

48. Brazma D, Grace C, Howard J. Genomic profile of chronic myelogenous leukemia: Imbalances associated with disease progression // Genes Chromosomes Cancer. 2007. - Vol. 46, №11. - P. 1039-1050.

49. Brieva J.A.,Villar L.M., Leoro G. et al. Soluble HLA class I antigen secretion by normal lymphocytes: relationship with cell activation and effect of interferon-gamma. // Clin. Exp. Immunol. 1990. - Vol. 82, № 2.-P. 390-395.

50. Bromley S.K., Buracky W. R., Johnsony K.G. et al. The immunological synapse//Rev. Immunol 2001.-Vol. 19.-P. 375-396.

51. Brown J.H., Jardetzky T.S., Gorga J.C. et al. Crystal structure of the human class-II histocompatibility antigen HLA-DR1. // Nature. 1994. -Vol. 364.-P. 215-221.

52. Buckle A.M., Hogg N. Human memory T cells express intercellular adhesion molecule-1 which can be increased by interleukin 1 and interferon-y // Eur. J. Immunol. 1990. - № 20. - P. 337-341.

53. Carbone E., Terrazzano G., Colonna M. et al. Natural killer clones recognize specific soluble HLA class I molecules. // Eur. J. Immunol. -1996. Vol. 26, № 3. - P. 683-689.

54. Cardama A.Q., Cortes J.E. Chronic Myeloid Leukemia: Diagnosis and Treatment // Mayo Clinic Proceedings. 2006. - Vol. 81, №7. - P. 973

55. Carrasco Y.R., Fleire S.J., Cameron T. et al. LFA-l/ICAM-1 interaction lowers the threshold of B cell activation by facilitating B cell adhesion and synapse formation // Immunity. 2004. - Vol. 20, № 5. - P. 589599.

56. Cascino I., Fiucci G., Papoff G. et al. Three functional soluble forms of the human apoptosis-inducing Fas molecule are produced by alternative splicing.//J.Immunol. 1995. - Vol. 154, №6. - P. 2706-2713.

57. Champagne B., Tremblay P., Cantin A. et al. Proteolytic cleavage of ICAM-1 by human neutrophil elastase 1 // J. Immunology. — 1998. — Vol. 161.-P. 6398-6405.

58. Charles A., Janeway Jr., Travers P. et. al. Immunobiology. London: Current Biology Ltd, 1994. -227p.

59. Cheng J., Zhou T., Liu C. et al. Protection from Fas-mediated apoptosis by a soluble form of the Fas molecule // Science. 1994. - Vol. 236. — P. 1759-1762.

60. Chomszynskii P., Sacchi N. Single step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyonate — phenol — chloroform extraction // Analyt. Biochem.- 1987. -Vol. 162.-P. 156-159.

61. Claus R., Hausmann S., Zavazava N. et al. In vitro effects of solubilized HLA-DR~role in immunoregulation? // Cell. Immunol. 1994. - Vol. 155, №2.-P. 476-485.

62. Cortes J.E., Talpaz M., Kantarjian H. Chronic myelogenous leukemia: a review // Am. J. Med. 1996. - Vol. 100, №5. - P. 555-570.

63. Cresswell P. Assembly, transport, and function of MHC class II molecules. // Annu. Rev. Immunol. 1994. - Vol. 12. - P. 259-293.

64. Deaglio S., Mehta K., Malavasi F. Human CD38: a (Revolutionary story of enzymes and receptors. // Leukemia Research. — 2001. — Vol. 25. — P. 1-12.

65. Debatin K.-M., Goldman C.K., Bamford R. et al. Monoclonal antibody mediated apoptosis in adult T cell leukemia// Lancet. 1990. - Vol. 335. -P.447.

66. Deininger M.W., Goldman J.M., Lydon N. et al. The tyrosine kinase inhibitor CGP57148B selectively inhibits the growth of BCR-ABL-positive cells // Blood. 1997. - Vol. 90, №9. - P. 3691-3698.

67. Deutsch E., Jarrousse S., Buet D. et al. Down-regulation of BRCA1 in BCR-ABL-expressing hematopoietic cells // Blood. 2003. - Vol. 101, №11. -P.4583-4588.

68. DeVito-Haynes L.D., Jankowska-Gan E., Heisey D.M. et al. Soluble HLA class I in epithelial lining fluid of lung transplants: associations with graft outcome // Hum. Immunol. 1997. - Vol. 52, №2. - P. 95108.

69. Diamond M.S., Staunton D.E., Marlin S.D. et al. Binding of the integrin Mac-1 (CD1 lb/CD 18) to the third immunoglobulin-like domain of ICAM-1 (CD54) and its regulation by glycosylation // Cell. 1991. - № 65.-P. 961.

70. Diederik A.B., Binnerts M.E., van Vliet S.J. et al. Low-affinity LFA-l/ICAM-3 interactions augment LFA-l/ICAM-1-mediated T cell adhesion and signaling by redistribution of LFA-1 // J. Cell Science. -2000.-№ 113.-P. 391-400.

71. Ditschkovski M., Kreuzfelder E., Rebmann V. et al. HLA-DR expression and soluble HLA-DR levels in septic patients after trauma.// Ann. Surg. — 1999. Vol. 229, № 2. - P. 246-254.

72. Dorsey J.F., Cunnick J.M., Lanehart R. et al. Interleukin-3 protects Bcr-Abl-transformed hematopoietic progenitor cells from apoptosis induced by Bcr-Abl tyrosine kinase inhibitors // Leukemia. 2002. - Vol. 16, №9. -P. 1589-1595.

73. Drbal K., Angelisova P., Hilgert I. et al. Aproteolytically truncated form of free CD 18, the common chain of leukocyte integrins, as a novel marker of activated myeloid cells // Blood. 2001. - № 98. — P. 15611566.

74. Drucker B.J., Tamura S., Buchdunger E. et al. Effects of selective inhibitor of the Abl tyrosine kinase on the growth of Bcr-Abl positive cells // Nat Med. 1996. - №2. - P.561.

75. Druker B., Okuda K., Matulonis U. et al. Tyrosine phosphorylation of rasGAP and associated proteins in chronic myelogenous leukemia cell lines //Blood. 1992. - Vol. 79, №9. - P. 2215-2220.

76. Fioretos T, Nilsson PG, Aman P. et al. Clinical impact of breakpoint position within M-bcr in chronic myeloid leukemia // Leukemia. 1993 Aug;7(8): 1225-31.

77. Fukuda Y., Nakano I., Katano Y. et al. Serum levels of soluble intercellular adhesion molecule-1 and soluble vascular cell adhesion molecule-1 in asymptomatic carriers of hepatitis C virus // J. Int. Med. Res. 1998. - Vol. 26 (6). - P. 313-318.

78. Funaro A, De Monte LB, Dianzani U, Forni M, Malavasi F. // Human CD38 is associated to distinct molecules which mediate transmembrane signaling in different lineages. Eur J Immunol 1993;23:2407-11.

79. Furuya Y., Fuse H., Masai M. Serum soluble Fas level for detection and staging of prostate cancer // Anticancer Res. 2001. - Vol. 21, № 5. - P. 3595-3598.

80. Gambacorti-Passerini C, Barni R, le Coutre P. Role of alphal acid glycoprotein in the in vivo resistance of human BCR-ABL(+) leukemic cells to the abl inhibitor STI571 // J Natl Cancer Inst. 2000 Oct 18;92(20): 1626-7.

81. Ghio M., Contini P., Mazzei C. et al. Soluble HLA class I, HLA class II, and Fas Ligand in blood components: a possible key to explain theimmunomodulatory effects of allogeneic blood transfusions. // Blood. — 1999. Vol. 93. - № 5. - P. 1770-1777.

82. Gho Y.S., Kleinman H.K., Sosne G. Angiogenic activity of human soluble intercellular adhesion molecule-1 // Cancer Res. 1999. Vol. 59 (2)07 P. 5128-5132.

83. Giacomelli R., Passacantando A., Parzanese I. et al. Serum levels of soluble CD30 are increased in ulcerative colitis (UC) but not in Cronhus disease (CD) // Clin. Exp. Immunol. 1998. - Vol. Ill (3). - P. 532535.

84. Glynn P., Coakley R., Kilgallen I., O'Neill S. Neutrophil CDllb and soluble ICAM-1 and E-selectin in community acquired pneumonia // Eur. Respir.L 19997 Vol. 13 (6)7 P. 1380-1385.

85. Goldman JM, Melo JV. Targeting the BCR-ABL tyrosine kinase in chronic myeloid leukemia // N Engl J Med. 2001 Apr 5;344(14):1084-6.

86. Gordon MY, Goldman JM. Cellular and molecular mechanisms in chronic myeloid leukaemia: biology and treatment // Br J Haematol. 1996 Oct;95(l): 10-20.

87. Grakoui A., Bromley S.K., Sumen C. et al. The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation // Science. -1999. Vol. 285. - P. 221-227.

88. Griffiths C.E., Boffa M.J., Gallatin W.M., Martin S. Elevated levels of circulating intercellular adhesion molecule-3 (cICAM-3) in psoriasis // Acta Derm. Venereol. 1996. - Vol. 76 (1). - P. 2-5.

89. Grimaldi, J.C., Balasubramanian, S., Kabra, N.H., Shanafelt, A., Bazan, J.F., Zurawski, G. & Howard, M.C. (1995) CD38-mediated ribosylation of proteins. J. Immunol. 155, 811-817.

90. Grungreiff K., Reinhold D., Ansorge S. Serum concentrations of sIL-2R, IL-6, TGF-betal, neopterin, and zinc in chronic hepatitis C patientstreated with interferon-alpha. // Cytokine. 1999. - Vol. 11. - № 12. - P. 1076-1080.

91. Hagemeijer A, Bartram CR, Smit EM. Is the chromosomal region 9q34 always involved in variants of the Phi translocation? // Cancer Genet Cytogenet. 1984 Sep;13(l):l-16.

92. Hagihara ML, Hosoi K., Kagawa T. et al. Serum soluble HLA-DR antigens in autoimmune hepatitis. // Autoimmunity. 1999. - Vol. 31. -№2.-P. 85-93.

93. Hahn E.A. The quality of life of patients with chronic phase chronic myeloid leukemia in the IRIS study of interferon-alpha plus ara-c vs imatinib (STI571, Glivec) // Hematology J. 2002. - Vol.3 (suppl. 1). -P. 300.

94. Hara T, Tsurumi H, Takemura M. Serum-soluble fas level determines clinical symptoms and outcome of patients with aggressive non-Hodgkin's lymphoma // Am J Hematol. 2000

95. Harris ES, Mclntyre TM, Prescott SM, Zimmerman GA. The leukocyte integrins // J Biol Chem 2000; 275:23409-23412.

96. Hausmann S., Claus R., Buchwald S. et al. Quantitation of soluble HLA-DR antigens in human serum and other body fluids // Beitr. Infusionsther Transfusionsmed. 1994. - Vol. 32. - P. 281-287.

97. Hayflick J.S., Stine J., Fox R. et al. Functional mapping of the cytoplasmic region of intercellular adhesion molecule-3 reveals important roles for serine residues // J. Biol. Chem. — 1997. — Vol. 272 (35).-P. 22207-22214.

98. Hehlman R. Interferon-alpha in chronic myeloid leukemia // Fortsch. Med. 1997. Vol. 115. №9. P.30-34.

99. Heisterkamp N, Groffen J, Stephenson JR. The human v-abl cellular homologue // J Mol Appl Genet. 1983;2(l):57-68.

100. Hicks J.A., Dewald G.W. Incidence and types of variant Ph-chromosomes in 378 patients with Ph-chromosome // Karyogram. -1985.-Vol. 11.-P. 105.

101. Hillebrand K., Moritz T., Westhoff U., Niederle N., Grosse-Wilde H. Soluble HLA class I and beta-2-microglobulin plasma concentrations during interferon treatment of chronic myelogenous leukemia. Vox Sang 1994; 67(3):310-314

102. Hogg N., Henderson R., Leitinger B., McDowall A., Porter J., Stanley P. Mechanisms contributing to theactivity of integrins on leukocytes // Immunological Reviews 2002 Vol 186 P. 164-171.

103. Horiike N., Onji M., Kumamoto I., Masumoto T. Soluble intercellular adhesion molecule-1 in serum in chronic hepatitis B and C // J. Gastroenterol. 1994. - Vol. 29 (4). - P. 455-459.

104. Hosoi K., Hagihara M., Kagawa T. et al. The serum soluble HLA-DR antigens as a predictive marker of the response to interferon-alpha treatment in patients with chronic hepatitis C. // Tokai. J. Exp. Clin. Med. 2000. - Vol. 25. - № 3. - P. 117-124.

105. Hughes TP, Kaeda J, Branford S. et al. Frequency of major molecular responses to imatinib or interferon alfa plus cytarabine in newly diagnosed chronic myeloid leukemia // N Engl J Med. 2003 Oct 9;349(15): 1423-32.

106. ISCN: International System Human Cytogenetic Nomenclature (2005). Eds. Lisa G. Shaffer, Niels Tommarup. 2005.

107. Itoh N., Nagata S.A. Novel protein domain required for apoptosis. Mutational analysis of human Fas antigen // Biol. Chem. 1993. - Vol. 268 (15).-P. 10932-10937.

108. Itoh N., Yonehara S., Ishii A. et al.The polypeptide encoded by the cDNA for human cell surface antigen Fas can mediatal poptosis//Cell.~ 1991.- V. 66.-P. 233-243.

109. Iwai K., Miyawaki T., Takizawa T. et al. Differential expression of bcl-2 and susceptibility to anti-Fas-mediated cell death in peripheral blood lymphocytes, monocytes, and neutrophils // Blood. 1994. - Vol. 84.-P. 1201-1208.

110. Janossy G, Roberts M, Greaves MF. Target cell in chronic myeloid leukaemia and its relationship to acute lymphoid leukaemia // Lancet. 1976 Nov 13 ;2(7994): 1058-61.

111. Jodo S., Kobayashi S., Nakajima Y. et al. Elevated serum levels of soluble Fas/APO-1 (CD95) in patients with hepatocellular carcinoma // Clin. Exp. Immunol.- 1998.-Vol. 112, №2.-P. 166-171.

112. Jorgensen HG, Holyoake TL. Characterization of cancer stem cells in chronic myeloid leukaemia // Biochem Soc Trans. 2007 Nov;35(Pt 5): 1347-51.

113. Jun C.D., Carman C.V., Redick S.D. et al. Ultrastructure and function of dimeric, soluble intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) // J. Biol. Chem. 2001.-Vol. 276. -P. 29019-29027.

114. Kamitani T., Nguyen H.P., Yeh T.H. Activation-induced Aggregation and Processing of the Human Fas Antigen // J. Biol. Chem. 1997. - Vol. 272 - P. 22307-22314.

115. Kantarjian H, Sawyers C, Hochhaus A. et al. Hematologic and cytogenetic responses to imatinib mesylate in chronic myelogenous leukemia // N Engl J Med. 2002 Feb 28;346(9):645-52.

116. Kantarjian H., O'Brien S., Anderlini P. et al. Treatment of chronic myelogenous leukemia: current status and investigational options // Blood. 1996. Vol. 87. №8. P.3069-3081.

117. Kantarjian HM, Deisseroth A, Kurzrock R. et al. Chronic myelogenous leukemia: a concise update // Blood. 1993 Aug l;82(3):691-703.

118. Kawatani T, Endo A, Tajima F. Clinical significance of serum soluble interleukin-2 receptor in chronic myeloproliferative disorders // Int J Hematol. 1997 Feb;65(2): 123-8

119. Kessel J.M., Hayflick J., Weyrich A.S. et al. Coengagement of ICAM-3 and Fc receptors induces chemokine secretion and spreading by myeloid leukocytes 1 // J. Immunology. 1998. - № 160. - P. 55795587.

120. Kiersnowska-Rogowska B, Izycka A, Jablonska E, Rogowski F, Parfiericzyk A. Effect of LFA-1 expression on neutrophils and serum level of soluble ICAM-1 in patients with chronic myelogenous leukemia // Przegl Lek. 2003;60(11):719-20.

121. Kilinc M., Saatci-Cekirge I., Karabudak R. Serial analysis of soluble intercellular adhesion molecule-1 level in relapsing-remitting multiple sclerosis patients during IFN-betalb treatment // J. Interferon Cytokine Res. 2003. - Vol. 23. - P. 127-133.

122. King P.D., Sandberg E.T., Selvakumar A. et al. Novel isoforms of murine intercellular adhesion molecule-1 generated by alternative RNAsplicing // J. Immunol? \995~ Vol. 154? P. 6080.

123. Krueger A., Fas S.C., Baumann S., Krammer P.H. The role of CD95 in the regulation of peripheral T-cell apoptosis// Immunological Reviews 2003 Vol. 193: 58-69.

124. Kuang X., Ma K., Duan T. The significance of postburn changes in plasma levels of ICAM-1, IL-10 and TNFalpha during early postburn stage in burn patients // Zhonghua Shao Shang Za Zhi. 2002. Vol. 18 (5)? P. 302304.

125. Kuijpers T.W., Roos D. Leukocyte extravasation: mechanisms and consequenses // Behring. Inst. Mitt. 1993. - № 92. - P. 107-137.

126. Lechner H., Amort M., Steger M.M. et al. Regulation of CD95 (APO-1) expression and the induction of apoptosis in human T cells: changes in old age. // Int. Arch. Allergy. 1996. - Vol. 110. - P. 238-243.

127. Levacher M., Hulstaer F., Tallet S. et al. The significance of activation markers on CD8 lymphocytes in human immunodeficiency syndrom: staining and prognostic value // Clin. Exp. Immunol. 1992. - № 90. - P. 376.

128. Liu J.H., Wei S., Lamy T. et al. Blockade of Fas-dependent apoptosis by soluble Fas in LGL leukemia // Hematol.-2002.-Vol. 100.-P. 1449-1453.

129. Liu X., Qi Z., Luo L., Zhang X. Measurement of soluble Fas in patients with hematological malignancy. // Hunan Yi Ke Da Xue Xue Bao.-1999.-Vol. 24.-P. 171-173.

130. Lugo TG, Pendergast AM, Muller AJ, Witte ON. Tyrosine kinase activity and transformation potency of bcr-abl oncogene products // Science. 1990 Mar 2;247(4946): 1079-82.

131. Lund F, Solvason N, Grimaldi JC, Parkhouse RM, Howard M. Murine CD38: an immunoregulatory ectoenzyme // Immunol Today. 1995 Oct;16(10):469-73.

132. Mason D., Andre P., Bensussan A. et al. CD Antigens 2001 // Internal. Immunol.-2001.-V. 13, №9.-P. 1095-1098).

133. Mastroianni C.M., Lichtner M. Changes in circulating levels of soluble cell adhesion molecules following highly active antiretroviral treatment of HIV-1-infected patients // Clin. Immunol." 2000." Vol. 95 (3)7 P. 212-217.

134. McDonald J.C., Adamashvili I., Hayes J.M. Soluble HLA class II concentrations in normal individuals and transplant recipients. Comparison with soluble HLA class I concentrations. // Transplantation. 1994.-Vol. 58. -№ 11.-P. 1268-1272.

135. Melo JV, Chuah C. Resistance to imatinib mesylate in chronic myeloid leukaemia // Cancer Lett. 2007 May 8;249(2):121-32.

136. Miles E.A., Thies F., Wallace F.A. et al. Influence of age and dietary fish oil on plasma soluble adhesion molecule concentrations // Clin. Sci. (Lond).- 2001. -Vol. 100.-P. 91-100.

137. Minguela A., Torho A., Marhn L. et al. Implication of soluble and membrane HLA class I and serum IL-10 in liver graft acceptance. // Hum. Immunol. 1999. - Vol. 60. - № 6. - P.500-509.

138. Miyawaki T., Uehara T., Nibu R. TsuujiT., Yachie A., Yonehara S. Taniguchi N1. Differential axpression of apoptosis-related Fas antigen on lymphocyte subpopulations in human peripheral bloodVJ.Immunol.-1992.-Vol. 149.- P. 3753 3758.

139. Mizutani Y., Yoshida O., Bonavida B. Prognostic significance of soluble Fas in the serum of patients with bladder cancer // J. Urol. — 1998.-Vol. 160, №2. -P. 571-576.

140. Moffatt O.D., Devitt A., Bell E.D. et al. Macrophage recognition of ICAM-3 on apoptotic leukocytes // J. Immunol. 1999. - № 162. - P. 6800-6810.

141. Morgan C.L., Price C.P., Cohen S.B. et al. Soluble CD8 stabilizes the HLA class I molecule by promoting beta2M exchange: analysis in real time // Hum. Immunol. 1999. - Vol. 60. - №5. - P. 442-449.

142. Motoi T, Uchiyama T, Hori T. Elevated serum-soluble interleukin-2 receptor (Tac antigen) levels in chronic myelogenous leukemia patients with blastic crisis // Blood. 1989 Aug 15;74(3): 1052-7.

143. Munker R, Midis G, Owen-Schaub L, Andreff M. Soluble FAS (CD95) is not elevated in the serum of patients with myeloid leukemias, myeloproliferative and myelodysplasia syndromes // Leukemia. 1996 Sep; 10(9): 1531-3

144. Murakami T, Ohyashiki K, Ohyashiki JH. et al. Cytogenetic and immunogenotypic alterations of blast crisis cells in chronic myelogenous leukemia independently linked to immunophenotypic expression // Cancer Genet Cytogenet. 1994 Jan;72(l):48-54.

145. Nakata B., Chung K.H., Kato Y. Serum soluble interleukin-2 receptor level as a prognostic indicator in gastric cancer. // Br. J. Cancer. 1998. - Vol. 77. - № 11. - P. 1820-1824.

146. Nano R., Capelli E., Facoetti A., Gerzeli G. Evaluation of serum levels of cytokines and intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) in astrocytic tumours. // Cell. Mol. Biol. (Noisy-le-grand). 2003. - Vol. 49. -№4.-P. 525-528.

147. Nardi V, Azam M, Daley GQ. Mechanisms and implications of imatinib resistance mutations in BCR-ABL // Curr Opin Hematol. 2004 Jan;l l(l):35-43.

148. Nocito M., Montalban C., Gonzalez-Porque P. et al. Increased soluble serum HLA class I antigens in patients with lymphoma. // Hum. Immunol. 1997.-Vol. 58. -№2.-P. 106-111.

149. No well P.C., Hungerford D.A. Chromosome studies in human leukemia. II. Chronic granulocytic leukemia // J Natl Cancer Inst. 1961 Nov;27:1013-35.

150. Nowinski G.P., Van Dyke D.L., Tilley B. et al. The frequencyof aneuploidy in cultered lymphocytes is correlated with age and gender, but not reproductive history // Am. J. Hum. Genet. 1990. - Vol.44. -P. 169-179

151. Orditura M., De Vita F., Roscigno A. et al. Soluble interleukin-2 receptor and soluble CD8 antigen levels in serum from patients with solid tumors. // Int. J. Mol. Med. 1998. - Vol. 2. - № 1. - P. 75-79.

152. Ott V., Seidl C., Westhoff U. et al. Soluble HLA class I and class II antigens in patients with multiple sclerosis. // Tissue Antigens. 1998. -Vol. 51.-№3.-P. 301-304

153. Owen-Schaub L. Soluble Fas and cancer // Clin. Cancer. 2001. -Vol. 7.-P. 1108-1109.

154. Owen-Schaub L.B., Yonehara S., Crump W.L. et al. DNA fragmentation and cell death is selectively triggered in activated humanlymphocytes by Fas antigen engagement // Cell Immunol. — 1992. — Vol. 140.-P. 197-205.

155. Papoff G., Cascino I., Eramo A. et al. An N-terminal domain shared by Fas/Apo-1 (CD95) soluble variants prevents cell death in vitro // J. Immunol. 1996.-Vol. 156.-P. 4622-4630.

156. Papoff G., Hausler P., Eramo A. et al. Identification and characterization of a ligand-independent oligomerization domain in the extracellular region of the CD95 death receptor // J. Biol. Chem. 1999. - Vol. 274, № 53. - P. 38241-38250.

157. Park C.W., Yun S.N., Yang C.W. et al. Serum and urine soluble HLA class I antigen concentrations are increased in patients with hemorrhagic fever with renal syndrome. // Korean J. Intern. Med. 1997. - Vol. 12. -№ l.-P. 52-57.

158. Pfister M. Ogilvie A., Christina P. da Silva, Andreas Grahnert, Andreas H. Guse and Sunna Hauschildt//Eur. J. Biochem. 268, 56015608 (2001).

159. Pickl WF, Majdic O, Fae I, Reuschel R, Holter W, Knapp W. The soluble pool of beta 2-microglobulin free HLA class I alpha-chains. Qualitative and quantitative characterization // J Immunol. 1993 Sep 1; 151 (5):2613-22.

160. Pierre R.V., Hoalgland H.C. Age-associated aneuploidy: loss of Y chromosome from human bone marrow cells with aging // Cancer. -1972. Vol. 30. -P.541-548.

161. Plaeger S, Bass HZ, Nishanian P et al. The prognostic significance in HIV infection of immune activation represented by cell surface antigen and plasma activation marker changes // Clin Immunol- 1999-Feb;90(2)-P.238-46.

162. Proussakova O.V., Rabaya N.A., Moshnikova A.B. et al. Oligomerization of Soluble Fas Antigen Induces Its Cytotoxicity // J. Biol. Chem. 2003. - Vol. 278, № 38. - P. 36236-36241.

163. Puil L, Liu J, Gish G. et al. Bcr-Abl oncoproteins bind directly to activators of the Ras signalling pathway // EMBO J. 1994 Feb 15;13(4):764-73.

164. Puppo F., Ghio M., Contini P. et al. Immunoregulatory role of soluble HLA molecules: a new skin for an old subject? // Arch. Immunol. Ther. Exp. (Warsz). 1998. - Vol. 46. - № 3. - P. 157-160.

165. Puppo F., Scudeletti M., Indiveri F., Ferrone S. Serum HLA class I antigens:markers and modulators of an immune response?// Immunology Today,1995, V.18, № 3, P.124-127.

166. Ramaschi G, Torti M, Festetics ET, Sinigaglia F, Malavasi F, Balduini C. Expression of cyclic ADP-ribose-synthesizing CD38 molecule on human platelet membrane. //Blood 1996;87:2308-13.

167. Raposo G., Nijman H.W., Stoorvogel W. et al. B lymphocytes secrete antigen-presenting vesicles. // J. Exp. Med. — 1996. — Vol. 183. № 3. -P. 1161-1172.

168. Rebmann V., Dornmair K., Grosse-Wilde H. Biochemical analysis of plasma-soluble invariant chains and their complex formation with soluble HLA-DR // Tissue Antigens. 1997. - Vol. 49. - № 5. - P. 438-442.

169. Reilly P.L., Woska J.R., Jeanfavre D.D. et al. The native structure of intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) is a dimer // J Immunol. 19957 № 155? P. 529.

170. Reinherz EL, Kung PC, Goldstein G, Levey RH, Schlossman SF. Discrete stages of human intrathymic differentiation: analysis of normal thymocytes and leukemic lymphoblasts of T-cell lineage.// Proc Natl Acad Sci USA 1980;77:1588-92

171. Rhynes V.K., McDonald J.C., Gelder F.B. et. al. Soluble HLA class I in the serum of transplant recipients. // Ann. Surg. — 1993. — Vol. 217. -№ 5. P. 485-489.

172. Ricci-Vitiani L., Conticello C., Zeuner A., De Maria R. CD95/CD95L interactions and their role in autoimmunity //Apoptosis 2000; 5: 419-424.

173. Rokita E., Menzel E.J. Characteristics of CD 14 shedding from human monocytes. Evidence for the competition of soluble CD 14 (sCD14) with CD 14 receptors for lipopolysaccharide (LPS) binding // APMIS. 1997. -Vol. 105 (7).-P. 510-518.

174. Rowley J.D. A new consistent chromosomal abnormality in chronic myelogenous leukaemia identified by quinacrine fluorescence and Giemsa staining (letter) //Nature. 1973 Jun l;243(5405):290-3.

175. Rubin L.A., Nelson D.L. The soluble interleukin-2 receptor: biology, function, and clinical application. // Ann. Intern. Med. — 1990. — Vol. 113. -№ 8.-P 619-627.

176. Rudert F., Moloney S., Lindridge E. et al. Transcription factors regulating CD95/fas gene expression // Cancer Detect, and Prevent. — 2000. Vol. 24. - P. 3373-3474.

177. Sacco R., Leuci D., Tortorella C. et al. Transforming growth factor betal and soluble Fas serum levels in hepatocellular carcinoma // Cytokine-2000.-Vol. 12, №6.-P. 811-814.

178. Sack U, Burkhardt U, Borte M, Schadlich H, Berg K, Emmrich F. Age-dependent levels of select immunological mediators in sera of healthy childrenClin Diagn Lab Immunol. 1998 Jan;5(l):28-32)

179. Salgia R, Sattler M, Pisick E. et al. p210BCR/ABL induces formation of complexes containing focal adhesion proteins and the protooncogene product pl20c-Cbl // Exp Hematol. 1996 Feb;24(2):310-3.

180. Santoso S., Kiefel V., Volz H., Mueller-Eckhardt C. Quantitation of soluble HLA class I antigen in human albumin and immunoglobulin preparations for intravenous use by solid-phase immunoassay. // Vox Sang. 1992. - Vol. - 62. - № 1. - P. 29-33.

181. Sattler M, Mohi MG, Pride YB. Critical role for Gab2 in transformation by BCR/ABL // Cancer Cell. 2002 Jun;l(5):479-92.

182. Seidl C., Lee J.S. Expression of alternatively spliced HLA class II transcripts in lymphoid and nonlymphoid tissues. // Immunogenetics. 1992.-Vol. 35.-P. 385-390.

183. Seidl C., Lee J.S. Expression of alternatively spliced HLA class II transcripts in lymphoid and nonlymphoid tissues. // Immunogenetics. 1992.-Vol. 35.-P. 385-390.

184. Seth R., Raymond F. D., Makgoba M. W. Circulating ICAM-1 isoforms: diagnostic prospects for inflammatory and immune disorder // Lancet 19917 № L P. 83.

185. Shimura T, Tsutsumi S, Hosouchi Y. et al. Clinical significance of soluble form of HLA class I molecule in Japanese patients with pancreatic cancer //Hum Immunol. 2001 Jun;62(6):615-9.

186. Sipsas N.V., Sfikakis P.P., Touloumi G. et al. Elevated serum levels of soluble immune activation markers are associated with increased risk for death in HAART-naive HIV-1-infected patients // AIDS Patient Care STDS.-2003.-Vol. 17.-P. 147-153.

187. Skubitz K.M., Khalil A., Campbell K.D. et al. CD50 (ICAM-3) is phosphorylated on tyrosine and is associated with tyrosyne kinase activity in human neutrophils // J. Immunol. 1995. - № 154. - P. 28882895.

188. Srivastava M.D., Srivastava A., Srivastava B.I. Soluble interleukin-2 receptor, soluble CD8 and soluble intercellular adhesion molecule-1 levels in hematologic malignancies. // Leuk. Lymphoma. 1994. - Vol. 12.-P. 241-251

189. States DJ, Walseth TF, Lee HC. Similarities in amino acid sequences of Aplysia ADP-ribosyl cyclase and human lymphocyte antigen CD38. //Trends Biochem Sci 1992;17:495.

190. Stevenson F.K., George A.J., Walters M.T., Hamblin T.J. Analysis of soluble HLA class II antigenic material in patients with immunologicaldiseases using monoclonal antibodies. // J. Immunol. Methods. 1986. -Vol. 86.-№2.-P. 187-190.

191. Stewart M., Hogg N. Regulation of leukocyte integrin function: affinity vs. avidity// J Cell Biochem 1996; 61:554-561.223. van de Stolpe A, van der Saag PT. Intercellular adhesion molecule-1 // J Mol Med. 1996 Jan;74(l): 13-33.

192. Symons J.A., Wood N.C., Di Giovine F.S., Duff G.W. Soluble IL-2 receptor in rheumatoid arthritis. Correlation with disease activity, IL-1 and IL-2 inhibition // J. Immunol. 1988. - Vol. 141. - P. 2612-2618.

193. Tabayoyong WB, Zavazava N. Soluble HLA revisited // Leuk Res. 2007 Feb;31(2):121-5.

194. Tan S.-M., Hyland R.H., Al-Shamkhani A. et al. Law Effect of integrin b2 subunit truncations on LFA-1 (CDlla/CD18) and Mac-1 (CD1 lb/CD 18) // J. Immunology. 2000. - Vol. 165. - P. 2574-2581.

195. Timothy J. L., Elaine R. M., Li D. et al. DNA sequencing of a cytogenetically normal acute myeloid leukaemia genome // Nature 456, 66-72 (6 November 2008)

196. Tsujisaki M., Imai K., Hirata H. et al. Detection of circulating intercellular adhesion molecule-1 antigen in malignant diseases // Clin. Exp. Immunol 199L Vol. 85 (1)7 P. 3-8.

197. Turowski G., Gociski I., Gieracka D. et al. Soluble class HLA antigens in serum of patients with brain tumors. // Pol. Merkuriusz. Lek. 1996.-Vol. 1. - № 6. - P. 410-411.

198. Vuoristo M.S., Laine S., Huhtala H. et al. Serum adhesion molecules and interleukin-2 receptor as markers of tumour load and prognosis in advanced cutaneous melanoma. // Eur. J. Cancer. 2001. — Vol. 37. - № 13.-P. 1629-1634.

199. Wakao D., Murohashi I., Tominaga K. et al. Serum thymidine kinase and soluble interleukin-2 receptor predict recurrence of malignant lymphoma. // Ann. Hematol. 2002. - Vol. 81. - № 3. - P. 140-146.

200. Walczak H., Krammer P.H. The CD95 (APO-l/Fas) and the TRAIL (APO-2L) apoptosis systems // Exp. Cell Res. 2000. - Vol. 256 (1). -P. 58-66.

201. Westbrook TF, Martin ES, Schlabach MR et al. A genetic screen for candidate tumor suppressors identifies REST // Cell. 2005 Jun 17;121(6):813-5.

202. Wiktor A., Rybicki B.A., Piao Z.S. et al. Clinical significance of Y chromosome loss in hematologic disease // Genes Chromosomes Cancer. 2000 Jan;27(l):ll-6

203. Woska J.R., Morelock M.M. Durham D.J. et al. Molecular comparison of soluble intercellular adhesion molecule (sICAM)-l and sICAM-3 binding to Lymphocyte Function-associated Antigen-1 // J. Biol. Chem. 1998. - Vol. 273 (8). - P. 4725-4733.

204. Yoshino T., Kondo E., Cao L. et al. Inverse expression of bcl-2 protein and Fas antigen in lymphoblasts in peripheral lymph nodes andactivated peripheral blood T and B lymphocytes // Blood. 1994. - Vol. 83.-P. 1856-1861.

205. Zavazava N., Kronke M. Soluble HLA class I molecules induce apoptosis in alloreactive cytotoxic T lymphocytes. // Nature Med. — 1996. -Vol. 2.-P. 1005-1007.

206. Zavazava N. Soluble HLA class I molecules: biological significance and clinical implications. // Mol. Med. Today. 1998. - Vol. 4. - № 3. -P. 116-121. 190.

207. Zhang J., Wu X., Huang J. Clinical study on the expression level of lymphocyte function-related antigen of breast cancer patients // Zhongguo Zhong Xi Yi Jie He Za Zhi. 2000. - Vol. 20 (2). - P. 110112.

208. Zhang L.J., Shin E.S., Yu Z.X. Molecular genetic evidence of Y chromosome loss in male patients with hematological disorders // Chin Med J (Engl). 2007 Nov 20;120(22):2002-5.

209. Zipp F., Otzelberger K., Dichgans J. et al. Serum CD95 of relapsing remitting multiple sclerosis patients protects from CD95-mediated apoptosis // J. Neuroimmunol. 1998. - Vol. 86, № 2. - P. 151-154.

210. Zorn U., Dallmann I., Grosse J. et al. Soluble interleukin 2 receptors abrogate IL-2 induced activation of peripheral mononuclear cells // Cytokine. 1994. - Vol. 6. - P. 358-364.