Гидролиз и модификация липидов с применением липолитических ферментов дрожжей Candida rugosa и Yarrowia lipolytica тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.06, кандидат наук Чан Тхи Тху Хыонг

• Чан Тхи Тху Хыонг
• кандидат наук
• 2013

Оглавление диссертации кандидат наук Чан Тхи Тху Хыонг

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Общая характеристика липаз

1.1.1 Структура липаз и механизм действия липаз

1.1.2 Свойства липаз

1.1.3 Источники получения липаз

1.1.4 Факторы, влияющие на биосинтез липаз микроорганизмами

1.1.5 Иммобилизация липаз

1.1.6 Применение липаз

1.2 Ферментативные гидролиз и переэтерификация липидов

1.2.1 Ферментативный гидролиз липидов

1.2.2 Ферментативная переэтерификация липидов

ГЛАВА 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1 Материалы

2.1.1 Объект исследования

2.1.2 Ферментные препараты

2.1 .ЗСубстраты

2.1.4 Компоненты для приготовления питательной среды

2.1.5 Реактивы и растворители

2.2 Методы исследования

2.2.1 Гидролиз растительных масел и рыбьего жира ферментными препаратами липаз в системе вода — масло

2.2.2 Определение активности липаз (модифицированный метод Ота-Ямада)

2.2.3 Выращивание посевного материала Уаггом1а \ipolytica

2.2.4 Выращивание дрожжей Yarrowia Iipolytica на жидкой питательной среде

2.2.5 Изучение влияния источника углерода и липидного индуктора на липолитическую активность и рост культуры Yarrowia Iipolytica

2.2.6 Изучение влияния источника азота на липолитическую активность и рост культуры Yarrowia lipolytica

2.2.7 Изучение влияния ПАВ на липолитическую активность и рост культуры Yarrowia lipolytica

2.2.8 Осаждение липазы из культуральной жидкости дрожжей Yarrowia lipolytica

2.2.9 Иммобилизация ферментного препарата липазы Yarrowia lipolytica

2.2.10 Получение калиевых солей жирных кислот

2.2.11 Определение качественного и количественного состава высших жирных кислот методом газожидкостной хроматографии

2.2.12 Обработка полученных результатов

ГЛАВА 3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1 Ферментативный гидролиз касторового масла системе вода - масло без эмульгатора с использованием в качестве катализатора липазы из Candida rugosa

3.2 Ферментативный гидролиз оливкового масла в системе вода - масло без эмульгатора с использованием в качестве катализатора липазы из Candida rugosa

3.3 Ферментативный гидролиз рыбьего жира в системе вода - масло без эмульгатора с использованием в качестве катализатора липазы из Candida rugosa

3.4 Получение ферментного препарата с использованием продуцента Yarrowia (Candida) lipolytica Y-3153 (АТСС 34088)

3.4.1 Влияние источника углерода и индукторов на рост и липолитическую активность Yarrowia lipolytica

3.4.2 Влияние источника азота и стимулятора на рост и липолитическую

активность Yarrowia lipolytica

3.4.3 Выделение липаз из дрожжей Yarrowia lipolytica

3.4.4 Иммобилизация липаз из Yarrowia lipolytica

3.4.5 Проведение гидролиза иммобилизованным препаратом липазы Yarrowia lipolytica оливкового масла

3.4.6 Модификация рыбьего жира ферментным препаратом Yarrowia lipolytica и установление его жирно-кислотной специфичности

3.4.7 Технологические аспекты получения липолитического препарата на базе дрожжей Yarrowia lipolytica

ВЫВОДЫ

Список использованных источников

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Гидролиз и модификация липидов с применением липолитических ферментов дрожжей Candida rugosa и Yarrowia lipolytica»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность работы. Липазы - это гетерогенные катализаторы, которые работают на поверхности раздела фаз. Они играют важнейшую роль в жизнедеятельности всей биоты и находят применение в различных отраслях промышленности, прежде всего пищевой, особенно в масложировой отрасли, фармацевтической, химической, кожевенной, текстильной, производстве моющих средств и медицине.

Потребность в липазах испытывает сельское хозяйство, особенно высокопродуктивное животноводство для производства кормовых добавок. Находят применение липазы в области охраны окружающей среды, в частности, для очистки стоков мясной, масло-жировой промышленности, которые труднее всего подвергаются другим видам очистки.

Разумеется, различные области применения требуют наличия липолити-ческих ферментов с различными свойствами, прежде всего по селективности, по степени чистоты, устойчивости к различным факторам - температура, рН, способность сохранять ферментативную активность длительное время, спосоность к иммобилизации на различных матрицах и т.д. Таким образом, необходим широкий спектр липолитических ферментов. К сожалению, в России в промышленном масштабе практически не производятся липолитические ферменты, хотя потребность в них велика и приходится закупать дорогие зарубежные ферментные препараты, что сдерживает их широкое применение. Одной из причин такого положения является особенность свойств нативных липаз. Это гетерогенный катализатор, требующий подбора сложных сред, в которых наиболее эффективно он будет работать. Субстрат должен быть доступным для катализатора, для этого нужны эмульгаторы, часто органические растворители, причем те, которые бы не ингибировали фермент. Нативные липазы обычно обладают низкой термостабильностью, невысокими скоростями реакций в условиях, отличающихся от

оптимальных, что требует практически во всех случаях разработку методов иммобилизации липолитических ферментов.

Таким образом, поиск новых продуцентов липаз и создание на их основе липолитических ферментных препаратов, обладающих различными свойствами по специфичности, устойчивости в различных средах, пригодных для решения разнообразного круга задач является одной из актуальных проблем биотехнологии. Разработка технологии промышленного получения липолитических ферментных препаратов требует решения целого комплекса серьезных экспериментальных задач на всех уровнях от лаборатории до производства.

Другая важная проблема, которая существует в пищевой промышленности -это модификация жиров с целью придания им определенных физико-химических и биологических свойств: нужной консистенции, пластичности, твердости, определенных технологических свойств, прежде всего стабильности, повышение пищевой и биологической ценности. Достигается это обычно регулированием жирно-кислотного состава жиров. Существующие методы модификации жиров, физические и химические, имеют ряд ограничений и недостатков. Наиболее перспективным в этом отношении считается ферментативный катализ. Но для применения ферментативного катализа с целью модификации жиров нужен не только широкий ассортимент липолитических ферментов, но и знание их жирно-кислотной специфичности. Обе эти проблемы - расширение спектра липолитических ферментов и выявление жирно-кислотной специфи-чности известных и новых ферментных препаратов, являются важнейшими и актуальными проблемами в биотехнологии.

Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства образования и науки Российской Федерации в рамках федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2013 годы» по госконтракту № 01201252915 от 28.02.2012 г.

Цель и задачи исследования. Исследование ферментативного гидролиза липидов различного происхождения в системе вода — масло в отсутствии

химических эмульгаторов с использованием в качестве катализатора липазы из Candida rugosa (Type VII, производство Японии) и изучение условий проведения данного процесса.

Получение нового липолитического ферментного препарата на базе культуры дрожжей Yarrowia (Candida) lipolytica Y-3153 (АТСС 34088) и выявление его особенностей.

Поставленная цель достигалась решением следующих задач:

1) Выявление особенностей ферментативного гидролиза преимущественно монокислотных растительных масел (касторовое и оливковое) и рыбьего жира ферментным препаратом Candida rugosa в системах без эмульгаторов.

2) Установление жирно-кислотной специфичности ферментного препарата из Candida rugosa на примере гидролиза рыбьего жира и перспективы применения этого ферментного препарата для получения индивидуальных жирных кислот.

3) Разработка состава питательной среды для повышения липолитичес-кой активности дрожжей Yarrowia lipolytica с целью получения нового ферментного препарата - комплекса липаз, продуцируемых данным штаммом дрожжей.

4) Установление свойств липаз дрожжей Yarrowia lipolytica, возможности иммобилизации и способности к гидролизу и модификации жиров и выявление жирно-кислотной специфичности этого ферментного препарата.

Научная новизна. Впервые показано, что ферментный препарат из Candida rugosa может использоваться для гидролиза оливкового и касторового масел без применения эмульгатора, что облегчает последующее выделение жирных кислот (соответственно олеиновой и рицинолевой).

Впервые исследована жирно-кислотная специфичность ферментного препарата из Candida rugosa на примере гидролиза рыбьего жира и обнаружено, что фермент не способен гидролизовать ацильные остатки низкомолекулярных насыщенных жирных кислот до Спои, напротив, проявляет высокую специфичность при гидролизе ацильных остатков пентадециловой (С15 0) и бегеновой кислот

(С?2:о)? чт0 делает его перспективным для получения этих дефицитных высших жирных кислот.

Разработан состав питательной среды для культивирования продуцента липазы дрожжей Yarrowia lipolytica, позволяющий при снижении затрат на сырьевые компоненты среды повысить липолитическую активность культуры в 3,2 раза по сравнению с средой, рекомендованной по паспортным данным.

Подобраны оптимальные условия для получения нового иммобилизованного препарата липазы на базе дрожжей Yarrowia lipolytica и показана его жирно-кислотная специфичность при гидролизе рыбьего жира.

Практическая значимость. Полученные результаты могут быть использованы при получении олеиновой и рицинолевой кислот с использованием ферментативного гидролиза, протекающего при умеренных температурах, атмосферном давлении и в отсутствии эмульгатора, что обеспечивает простоту аппаратурного оформления процесса.

Полученный новый ферментный препарат на базе продуцента Yarrowia lipolytica может служить основой для дальнейшей пилотной разработки отечественного препарата липазы. Показана его пригодность для модификации жиров.

Достоверность полученных результатов. Достоверность отличий контрольных и экспериментальных результатов оценивали при помощи t-критерия Стьюдента.

Апробация работы. Результаты работы доложены на: XII Международной конференции молодых ученых «Пищевые технологии и биотехнологии» (Казань, 2012), Всероссийской молодежной научной школе «Биоматериалы и наноматериалы: Актуальные проблемы и вопросы безопасности» (Казань, 2012), VII Московском международном конгрессе «Биотехнология, состояние и перспективы развития» (Москва, 2013).

Публикации. По теме диссертационной работы имеется 9 публикаций, из них: 4 статьи в журналах, рекомендованных Высшей аттестационной комиссией Министерства образования и науки Российской Федерации и 5 тезисов.

Личный вклад автора. Автор проводила все экспериментальные работы по теме диссертации, принимала участие в обсуждении результатов работы, написании и оформлении статей.

Хроматографические анализы были проведены на ОАО «Казанский Масло-Экстракционный завод» совместно с Кузнецовым Б.А.

Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, результатов и их обсуждения (3 главы), выводов и библиографического указателя (152 наименований источников). Работа изложена на 134 страницах текста, включает 24 таблицы и 30 рисунков.

ГЛАВА 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Общая характеристика липаз

Липазы или, в соответствии с систематическим названием, триацилглицеро-лацилгидролазы (гидролазы эфиров глицерина) относятся по номенклатуре ферментов к третьему классу гидролаз первого подкласса и имеют систематический номер К.Ф ЗЛ.1.3. Особенность работы этих ферментов заключается в том, что сами ферменты растворимы в воде, а субстраты (жиры) в воде нерастворимы и для осуществления акта катализа требуют эмульгирования или диспергирования в воде. Для эмульгирования используются природные или синтетические эмульгаторы, при этом активность фермента может значительно изменяться в зависимости от природы эмульгатора.

Липолитические ферменты играют исключительно важную роль в обмене липидов всех живых организмов. Они способствуют переносу липидов от одного организма к другому. В организме они участвуют в процессах отложения и мобилизации жира, используемого в качестве энергетического резерва клетки; кроме того, включаясь в метаболизм внутриклеточных липидов, они принимают участие в функционировании биологических мембран. Липазы являются важными биокатализаторами из-за их отличных биохимических и физиологических свойств [1].

1.1.1 Структура липаз и механизм действия липаз

По типу укладки полипептидной цепи липазы относятся к белкам, построенным из нерегулярно чередующихся а-спиралей и (3-листов. З-О структура показывает основные схемы сворачивания липаз (семейство а и (3-структурированных гидролаз). Эта группа ферментов является одной из крупнейших групп структурно-связанных ферментов с различными каталитическими функциями [2-8]. Уста-

новлено большое число 3-D структур бактериальных и грибковых липаз, таких как панкреатическая липаза, липаза из гриба Geotrichum candidum, гриба Rhizo-mucor miehei [9-12].

С помощью программы BioEdit версия 7.0.5 было определено содержание различных типов аминокислот в первичной структуре липаз различного происхождения [13]. Таким образом, максимальное количество аминокислотных остатков у липаз микробного происхождения имеется в молекуле энзима, выделенного из Staphylococcus haemolyticus (711), а минимальное — из Serratia proteamacilans (255). Для липазы Staphylococcus hyicus (16,23%) и Pseudomonas aeryginosa (14,7%) характерно наибольшее количество положительно и отрицательно заряженных аминокислот, а для Aspergillus niger (5,37%) и Rhizopus stolonifer (7,41%) - наименьшее. Максимальное количество серосодержащих аминокислот наблюдалось у Rhizopus microsporus, среднее процентное содержание у представленных липаз колеблется в интервале 0,49-3,85% .

Молекулярная масса липаз изменяется в диапазоне от 19 кДа до 90 кДа. Их вторичная структура, как правило, состоит из нескольких (до восьми) параллельных ß листов (ßl-ß8), соединенных а спиралями (до шести) [8,11].

Увеличение мобильности фермента в процессе образования фермент-субстратного комплекса, достигается в результате способности четвертичной структуры липазы сохранятся за счет гидрофобных «сил сцепления», что доказано результами экспериментов по ИК-спектроскопии отдельных субъединиц липаз. Четвертичная структура фермента участвует в регуляции каталитической активности за счет взаимодействия субъединиц [14,15].

Каталитический центр липаз состоит из боковых цепей, содержащих три аминокислотную каталитическую триаду Ser-His-Asp/Glu, и идентичен с серино-вым протеазам. Особенностью этого активного центра является то, что он не находится на поверхности белка, вместо этого, он полностью закрыт структурой, похожей на крышку, состоящей из а-спирали, и не доступен субстрату. Есть гипотеза, что липазы подвергаются значительному конформационному изменению после адсорбции на поверхности раздела фаз масло-вода, открывающему субс-

трату доступ к активному центру. Другое важное конформационное изменение включает увеличение гидрофобной поверхности фермента, которое вовлечено в процесс опознавания липида. Топологическая локация, сложность и длина крышки различаются в зависимости от липазы [8,16,17].

Ферментативный гидролиз липидов и ферментативные реакции значительно отличаются друг от друга. Ферментативный гидролиз представляет собой гетерогенный процесс, так как подавляющее большинство липаз растворимо в воде, а субстратные молекулы - нерастворимы и объединены в малоподвижные крупные ассоциаты (мицеллы, эмульгированные жировые капли). Таким образом, взаимодействие фермента и субстрата должно протекать на поверхности раздела фаз. Выяснено, что скорость липолиза прямо пропорциональна степени диспергирования субстрата. Вероятно, это связано с явлением сорбции фермента на поверхности субстрата. Считается, ферментативный липолиз берет свое начало именно с этого процесса. Таким образом уравнение ферментативного липолиза имеет следующий вид [18]:

Е + Sэ <-> (£5 • 8э)адс <-> (££).« ■ 5э -> Е + Р + 5э

где Е - фермент; Бэ - эмульгированный субстрат; Б - единичная молекула субстрата; (Е8-8э)адс - фермент, адсорбированный на поверхности эмульгированного субстрата; (ЕБХ, - комплекс Михаэлиса; Р - продукт реакции.

Однако, эффективность адсорбции можно достичь путем внедрения фермента в поверхностный слой субстратной молекулы, и только после этого у фермента появляется возможность контакта активного центра с молекулой субстрата. Условно активный центр липаз делится на три участка, различающихся между собой функционально:

1) контактный, ответственный за узнавание поверхности субстратной фазы (мицеллы, эмульсии, монослоя и др.);

2) гидрофобный связывающий участок, осуществляющий извлечение одной молекулы субстрата из субстратной фазы в глобулу фермента;

3) участок, образованный группами, осуществляющими каталитический акт гидролиза сложно-эфирной связи [18].

В результате исследования бактериальных липаз выяснено, что у них имеется два связывающих места: широкий карман для спирта и узкий - для карбоновых кислот. Известно, что липаза является катализатором гидролиза триглицеридов, потому два углеводородных остатка направляются в широкий карман, а другая ацильная группа - в узкий и длинный карман. Например, липаза из Pseudomonas способна узнавать энантиомер вторичных спиртов за счет своей специфической структуры широкого кармана и показывать при этом высокую энантиоселектив-ность для вторичных спиртов, а липаза из Candida может показывает низкую энантиоспецифичность для спиртов из-за плоской структуры широкого связывающего кармана. В результате импринтинга липазы субстратами, происходит изменение структуры этого связывающего кармана, вследствие чего изменяется энантиоселективность [19-20].

Механизм катализа липазами включает ацилирование гидроксильной группы фермента с образованием интермедиата (ацилфермента) и его последующий гидролиз. Гидролазы с каталитической триадой Ser - His - Asp (Glu) являются, по-видимому, наиболее изученными ферментами. Механизм гидролиза липазами триглицеридов представляется на рисунке 1 [21].

Фермент при удалении липидного фрагмента может потерять активность, так как липаза является гетерогенным белком, обладающим небелковым компонентом липидной природы. Липидный фрагмент очень важен, так как благодаря ему фермент может функционировать в гетерогенной среде. Логично предположить, что этот фрагмент отвечает за формирование участка узнавания субстрата. Конструирование участка узнавания происходит за счет объединения белковой части фермента с небелковыми фрагментами или полипептидами у определенных липаз. В ряде случаев, что специфичность липолитических ферментов к физическому состоянию субстрата связана с их надмолекулярной структурой [18].

Asp

Н|5

/

step 1

f

"О*

I

..N

Ваг

.О

КГ" /

JL

R..QM

0

!'

1

active serine

R,

Азр

step 2

СГ'"

.-И

"O"'" ) \

V

N v.

- -is^' j H

See acyl-aciive serine intermediate.

"VI

/ R1

/

nucleophile

A

о

NLS

H,

H

H„

"NI i

H

R*

H.

-O OH

о

"OH hydrolysis

О

О

R1 OR^

acyl Iransler

О

О

о

'R,

active Siiriise

, „ R Г NHR,

ester aminolysis

I

R-i = alkyl. aryl. -N<RS)S R4 = ftlkyi aryl, - N =C{Rj,

Rf

O-OH peracid formation

Рисунок 1 - Механизм катализа липазой с участием серина

1.1.2 Свойства липаз

Липазы при действии на триацилглицериды проявляют различные виды специфичности, такие как стереоспецифичность, позиционную, глицеридную и жирнокислотную специфичность.

По позиционной специфичности липазы разделяют на две группы: позици-онно неспецифичные, освобождающие при гидролизе триглицеридов жирные

кислоты из всех трех позиций, и 1,3-специфичные. Приведем пример некоторых позиционно неспецифичных липаз - Oospora lactic, Geotrichum candidum, Humico-la lanuginose, Staphylococcus aureus. Некоторыми представителями 1,3-специфич-ных являются липазы грибов Aspergillus niger, Pseudomonas, Candida lipolytica, грибов рода Rhizopus, а также панкреатическая липаза. Липаза поджелудочной железы практически не действует на 2-моноглицериды из-за отсутствия эффекта притягивания электронов эфирными связями в 1,3-положении и из-за стеричес-кого несоответствия [22,23].

Многие липазы не обладают свойствами позиционной специфичности, различающей позиции 1 и 3 в триацилглицеридах. Из известных наук на данный момент липаз, только липаза Staphylococcus aureus гидролизует эфирные связи позиции 3 в 10 раз медленнее, чем позиции 1.

В результате длительного гидролиза глицеридов 1,3-специфичные липазы способны отщепить жирные кислоты из всех положений, поскольку 2-моноглицериды и 1,2-диглицериды как менее конформационно стабильные самопроизвольно изомеризуются в 1 -моноглицериды и 1,3-диглицериды. Липазы со специи-фичностью к позиции 2 встречаются довольно редко. Такая липаза найдена у Candida cylindracea [23, 24].

Жирнокислотная специфичность липаз выражается в предпочтении к жирным кислотам определенной длины цепи, а также в отношении строения жирно-кислотного остатка (кислоты имеющие разветвления в структуре или двойные связи, их количество и положение в цепи). В основном липазы легко отделяют жирные кислоты средней длины. В основном это наблюдается у липаз микроскопических грибов, за исключением пенициллов. К примеру, липаза Penicilium roqueforti предпочитает жирные кислоты с короткой цепочкой и практически не катализирует отщепление длинноцепочечных жирных кислот. Липазы Candida и Pseudomonas не ограничены в специфичности к длине цепи жирных кислот, а липаза Geotrichum candidum специфична по отношению к длинноцепочечным жирным кислотам. К тому же, липаза Geotrichum candidum гидролизует в тригли-церидах эфирную связь с элаидиновой, пертоселлиновой и вакценовой кислотам,

а также с короткой цепью или длинной цепью примерно в 10 раз медленнее, чем с олеиновой кислотой [22].

Стереоспецифичность выражается в способности к гидролизу сложно-эфирной связи в зависимости от конформации триацилглицерида и ацильных групп, входящих в него. Так, липаза Сео^1скит сапсИс1ит специфичная по отношению к длиноцепочным жирным кислотам, содержащим цис-двойные связи в со-9 - позиции, таким как олеиновая, линолевая, линоленовая кислоты. Специфичность липаз у отдельным жирным кислотам является основой для их применения в конкретных биотехнологических процессах [1].

Глицеридная специфичность характерна не для всех липаз. Фермент Рет'-сШит суЫоршт гидролизует моноглицериды и диглицериды и практически не действует на триглицериды [24].

Ряд липаз при липолизе природных масел и жиров различного происхождения не проявляет строгой специфичности и гидролизует их с одинаковой скоростью. Липаза «сейкен», полученная из культуры плесневого гриба ЛЫхорт гидролизует также свиное сало (лярд), китовый жир, масло соевое, кунжутное и хлопковое масло, масло семян рапса, причем все субстраты гидролизуются примерно в равной степени. Другие отдельные эфиры (этилацетат, амилацетат, метилмасля-ной кислоты) этот фермент не гидролизует [25].

Липазы различного происхождения (микробного, растительного и животного) отличаются прежде всего оптимумами рН действия. В зависимости от оптимальной величины рН, липазы делятся на кислые рН (4,0-6,0), нейтральные рН (6,5-7,2) и щелочные рН (7,5-9,0). Так, если клещевинная липаза имеет оптимум рН в кислой среде (4,7-5,0), то липазы поджелудочной железы, микроорганизмов и пшеничных зародышей действуют в слабощелочной среде, при рН около 8-9. Многие липазы очень чувствительны к малым концентрациям некоторых антибиотиков, которые ведут себя как конкурентные ингибиторы фермента, но степень ингибирования зависит от происхождения липазы [25].

Термостабильность липолитических ферментов зависит от источников из которых они были выделены. Основной диапазон температур, в котором липазы

имеют наибольшую стабильность, лежит в пределах от 30 °С до 40 °С, однако известны липазы, стабильные при 20 °С и 65 °С. Известно, что у липаз из микроорганизмов родов Geotrichum, Aspergillus, и Mucor наблюдается высокая термостабильность. Ряд липаз повышает активность при низких температурах — это явление необычное, но объяснимое, так как реакции могут протекать с большой скоростью благодаря различным фазовым переходам в твердое состояние участвующих в реакции компонентов. Степень очистки может влиять на стабильность фермента и некоторые его свойства. К примеру, для большинства липаз чем они чище, тем ниже их стабильность. [18,31].

Исключительной особенностью липазы является свойство поверхностей активации. Известно, что липазы ингибируются продуктами реакции - свободными жирными кислотами, и обнаруженная активация ферментов в присутствии ионов кальция. Также интерес вызывает и возможное положительное действие других катионов на процесс липолиза, например, хлористый натрий, другие двухвалентные соли, соли желчных кислот и кофакторы белков [22,26].

1.1.3 Источники получения липаз

Существуют три источника липолитических препаратов: животные ткани, семена некоторых растений и микроорганизмы. Источником животной липазы является поджелудочная железа. К тому же липаза содержится в заметных количествах в семенах многих растений: ржи, пшеницы, овса, сои, хлопчатника и особенно клещевины. Растительные липазы достаточно глубоко изучались, но не с целью получения их в виде препаратов, а с целью их влияния на хранение семян и процессы прорастания [18].

Помимо животного и растительного происхождения существуют липазы микробного происхождения. Экспериментальные исследования свидетельствуют о том, что микробные липазы являются ферментами с широкой специфичностью и большим разнообразием свойств. Изучение микробных липаз представляет

большой теоретический и практический интерес, так как они могут быть использованы при гидролизе разнообразных жировых субстратов [27].

Перспективным источником для получения липаз являются микроорганизмы, так как животное и растительное сырье не может удовлетворить растущую потребность в этих препаратах [18]. Существует ряд преимуществ при получении ферментов с использованием микроорганизмов. Микроорганизмы обладают высокой скоростью роста, могут развиваться на простых питательных средах; многие ферменты выделяются в культуральную жидкость, что значительно упрощает выделение активных белков и их химическую очистку. К тому же, с экономической точки зрения использование микроорганизмов в качестве источника липаз довольно выгодно. Так как получение микробных ферментов значительно дешевле, чем переработка растительного и животного сырья [28].

Липазы из разных источников различаются по ряду параметров позиционная, жирно-кислотная специфичность, стереоспецифичность, термостабильность и т.д.

Активные продуценты липаз принадлежат к различным группам микроорганизмов: это бактерии из родов Pseudomonas, Bacillus, актиномицеты Strept-omyces и Thermoactinomyces, дрожжи (в основном, представители рода Candida -Candida rugosa, Candida lipolytica, Candida antartica). Однако большинство бактерий синтезируют липазу, как правило, в небольшом количестве и внутрикле-точно, что затрудняет практическое использование их. В различных отраслях промышленности самое активное применение находят ферменты мицелиальных грибов Rhizopus, Aspergillus, Pénicillium, Rhizomucor, Mucor, Humicola, Geotrichum и дрожжи. В последнее время все чаще используются рекомбинантные штаммы, позволяющие получать высокий уровень продукции липаз с заданными свойствами [18,29].

Перспективным направлением является применение дрожжей рода Candida для получения ферментов, так как возможно использование не только ферментов, выделяющихся в культуральную жидкость, но и самих клеток дрожжей в качестве

источника микробного белка и витаминов. В результате этого технологический процесс в целом становится безотходным производством [30].

Диморфные аскомицетные дрожжи Yarrowia lipolytica являются перспективным объектом для получения промышленно ценной липазы. Кроме того, дрожжи Yarrowia lipolytica характеризуются большей устойчивостью к высоким концентрациям субстрата, чем грибы и большей толерантностью к ионам металлов, что позволяет использовать менее очищенные субстраты [31].

1.1.4 Факторы, влияющие на биосинтез липаз микроорганизмами

Состав питательной среды оказывает большое влияние на уровень биосинтеза липаз микроорганизмами. Для микробного биосинтеза липаз широко используют различные углеводсодержащие среды, такие как крахмал, декстрины или глюкозу [25]. Состав среды культивирования для разных продуцентов липаз различен. Однако имеются некоторые общие закономерности. Так в качестве источника углерода обычно используется глюкоза в концентрации 2-5 %. Синтез дрожжевой липазы ингибируется при повышении содержания глюкозы свыше 5% [27].

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Чан Тхи Тху Хыонг, 2013 год

Список использованных источников

1. Гамаюрова, B.C. Ферменты: лабораторный практикум / B.C. Гамаюрова, М. Е. Зиновьева. - СПб. : Проспект науки, 201 1. - 255 с. :ил.

2. Crystal structure of brefeldin A esterase, a bacterial homolog of the mammalian hormonesensitive lipase / Y. Wei [et al.] // Nat. Struct. Biol. - 1999. - V. 6. -P. 340-345.

3. Aspergillus niger protein EstA defines a new class of fungal esterases within the alpha/beta hydrolase fold superfamily of proteins / Y. Bourne [et al.] // Structure (Camb). - 2004. - V. 12. - P. 677-687.

4. The open conformation of a Pseudomonas lipase / J. D. Schräg [et al.] // Structure .- 1997,-V. 5. - P. 187-202.

' 5. Nardini, M. Alpha/beta hydrolase fold enzymes: the family keeps growing / M. Nardini, B. W. Dijkstra // Curr Opin Struct Biol. - 1999. - V. 9. - P.732-737.

6. Characterization of a novel intracellular endopeptidase of the alpha/beta hydrolase family from Streptomyces coelicolor A3(2) / I. Nagy [et al.] // Bacteriol. -2003.-V. 185. - P.496-503.

7. The alpha/beta hydrolase fold / D. L. Ollis [et al.] // Protein Eng. - 1992. -V. 5. - P.197-211.

8. Holmquist, M. Alpha/Beta-hydrolase fold enzymes: structures, functions and mechanisms / M. Holmquist // Curr.Protein Pept.Sci. - 2000. - V. 1. - P. 209-235.

9. Winkler, F. K. Structure of human pancreatic lipase/ F. K. Winkler, A. D'Arcy, W. Hunziker//Nature. - 1990.-V. 343.-P. 771-774.

10. Ser-His-Glu triad forms the catalytic site of the lipase from Geotrichum candidum / J. D. Schräg [et al.] //Nature. - 1991. - V. 351. - P. 761-764.

11. A serine protease triad forms the catalytic centre of a triacylglycerol lipase / L. Brady [et al.] // Nature. - 1990. - V. 343. - P. 767-770.

12. Low resolution crystal structure of lipase from Geotrichum candidum (ATCC34614) / Y. Hata [et al.] //Biochem. - 1979. -V. 86. - P. 1821-1827.

13. Беленова, А. С. Исследование закономерностей гидролиза триглицеридов свободной и иммобилизованной липазой : автореф. дис. ...канд. биол.наук: 03.01.02 / А. С. Беленова. - В., 2011. - 24 с.

14. Исследование четвертичной структуры липазы Rhizopus niveus / А. С. Беленова [и др.] // Сорбционные и хроматографические процессы. - 2008. - Т.8, вып. 2.-С. 246-251.

15. Analysis of the structure of Pseudomonas glumae lipase/ M. E. M. Noble [et al. ] // Protein Engineering. - 1994. - V. 7. - № 4. - P. 559-562.

16. Cygler, M. Structure as basis for understanding interfacial properties of lipases / M. Cygler, J. D. Schrag // Methods Enzymol. - 1997. - V. 284. - P. 3-27.

17. Bacterial lipases / K.E. Jaeger [et al.] // FEMS Microbiol. - 1994. - Rev. 15. - P. 29-63.

18. Грачева, И. M. Технология ферментных препаратов / И. М. Грачева. -М.: Агропромиздат, 1985. - 335 с.

19. Hult, К.Н. Kinetics, Molecular Modeling and synthetic applications with microbial lipases / K.H. Hult, M. Holmquist // Methods in Enzymology. - 1997. -V. 286.-P. 386-405.

20. Разработка методик и создание биохимических коллотдных систем для ветеринарно-биологических и зоотехнических направлений : отчет о НИР (промежуточ.) / Василевич Ф.И. - Москва: ФГОУ МГАВМиБ им.К.И.Скрябина, 2009.- 150 с.

21. Ashraf, G. Trends in lipase-catalyzed asymmetric access to enantiomerically pure/enriched compounds / G. Ashraf // Tetrahedron. - 2007. - V. 63. -P. 1721-1754.

22. Брокерхоф, X. Липолитические ферменты / X. Брокерхоф, Р. Дженсен. -М. : Мир, 1978.-396 с.

23. Давранов, К. Микробные липазы в биотенологии / К. Давранов // Прикладная биохимия и микробиология. - 1994. - Т. 30, вып 4-5. - С. 527-534.

24. Кислухина, О. Биотехнологические основы переработки растительного сырья / О. Кислухина, И. Кюдулас. - Каунас : Технология, 1997. - 183 с.

25. Коновалов, С. А. Биосинтез ферментов микроорганизмов / С. А. Коновалов. - М. : Пищевая промышленность, 1972. - 273 с.

26. Пути активации ферментативного гидролиза касторового масла / Т. Т. X Чан и др. // Вестник казанского технологического университета. - 2012. - Т. 15. - № 9. - С. 154-158.

27. Рубан, Е. J1. Микробные липиды и липазы / Е. Л. Рубан. - М. : Наука, 1977.-218 с.

28. Вецозола, А. О. Биосинтез липазы культурой Candida paralipolytica 739: дисс. канд. биол. наук : 03.00.07 / А. О. Вецозола. - Р., 1983. - 149с.

29. Синеокий, П. С. Разработка эффективных продуцентов липаз и новых технологий их использования / П. С. Сергей // В мире науки. - 2006. — № 7. -С. 1-7.

30. Глазунова, Л. М. Липазы микроорганизмов. Получение и применение ферментов, витаминов, аминокислот, премиксов: обзорная информация / Л. М. Глазунова, Ю. И. Гончарова, В. С. Минина. - М. : ОНТИТЭИмикробиопром, 1984.-Серия У.-35 с.

31. Lipase secretion and citric acid production in Yarrowia lipolytica yeast grown on animal and vegetable fat / S. V. Kamzolova [et al.] // Food Technol. Bio-technol. - 2005. - V. 43. -№2.-P. 113-122.

32. Лобырева, Л. В.Ферментативная активность микроорганизмов / Л. В. Лобырева//Изв. АН СССР, сер. Биол.-1974. - № 6. - С. 2169-2176.

33. Effect of vegetable oils in the secretion of lipase from Candida rugosa (DSM 2031) / B. S. Lakshmi, P. Kangueane, B. Abraham, G. Pennathur // Letters in Applied Microbiology. - 1999. - V. 29. - P. 66-72.

34. Effect of different carbon sources on lipase production by Candida rugosa / E. Dalmau, J. I. Montesion, M. Lotti, C. Casas // Enzyme microb. Technol. - 2000. -V. 26,- №4.-P. 657-663.

35. Zang, L. Y. Effective inducers for lipase production by Candida rugosa / L. Y. Zang, D. Z. Wei, W. Y. Tong // Ann. Microbiol. - 2003. - V. 53. - № 4. -P. 499-504.

36. Паканещикова, Н. В. Сравнительное изучение липолитической активности бактерий рода Serratia от состава питательной среды / Н. В. Паканещикова, Н. Н. Силищев, О. Н. Логинов // Башкирский химический журнал. - 2006. - № 4. — С. 31-34.

37. Орлова, Н. В. Влияние масел и жиров на образование окситетрациклина на среде с углеродами / Н. В Орлова // Антибиотики. - 1962. -№ 6. - С. 495-499.

38. Yoshida, F. Effect of lipid materials on the production of lipase by Torulopsis ernobii / F. Yoshida, H. Motai, E. Ychishima // Appl. Microbiol. - 1968. -V. 16. - № 6.-P. 845-847.

39. Звягинцева, И. С. Липазная активность Candida lipolytica / И. С. Звягинцева // Микробиология. - 1972. - № 1. - С. 249-256.

40. Ксадопуло, Г. Б. Влияние источников азота на синтез липазы грибами рода Geotrichum / Г. Б. Ксадопуло, Е. Л. Рубан // Микробиология .- 1974. - Т. 45. -№4.-С. 510-515.

41. Влияние источников азота на синтез дрожжевых липаз / И. А. Питрюк [и др.] // Микробиология. - 1974. - Т. 43. - № 6. - С. 198-205.

42. Рубан, Е. Л. Влияние условий культивирования на синтез липазы грибами Rhizopus delemar , Mucor lipolyticus / Е.Л. Рубан, Г.Б. Ксандопуло // Микробиология. - 1973. - Т. 42. - № 4. - С. 36-42.

43. Щелокова, С. С. Влияние различных источников азота на биосинтез липазы Oospora lactis / С. С. Щелокова, М-. Я. Табак, М. 3. Закиров // Прикладная биохимия и микробиология. - 1978. -Т 14, вып. 4 - С. 494-496.

44. Вецозола, А.О. Влияние условий культивирования на активность продуцентов / А. О. Вецозола, В. Т. Лука. - Рига: Зинатне, 1980. - С. 158-159.

45. Попова, Н. В. Влияние состава питательной среды на протеолитичес-кую активность Aspergillus terrícola : автореф. дис. .. .канд.наук: / Н. В. Попова . -М., 1968.-с.

46. Изучение механизмов адаптации дрожжей Yarrowia lipolytica к росту при щелочных условиях методами протеомики / М. А. Гусева [и др.] // Прикл. биох. микробиол. - 2010. - Т. 46. - № 3. - С. 336-341.

47. Ксандопуло, Г. Б. Влияние различных липидов на представителей рода Geotrichum / Г. Б. Ксандопуло // Микробиология. - 1974. - Т. 43. - № 6. -С. 160-165.

48. Kosugi, J. Continious hydrolysis of oil by immobilized lipase in a counter-current reactor / J. Kosugi, H. Tanaka, N. Tomizuka // Biotechnol Bioeng. - 1990. -V. 36,- №6.-P. 617-622.

49. Yang, H. A new kind of immobilized lipase in organic solvent and its structural model / H. Yang, S. Cao, Z. Ding et al. // Biochem Biophys Res Commun. -1994. - V. 200. - № 1. - P. 83-88.

50. Иммобилизация гидролитических ферментов на анионитах / Т. А. Ковалева, О. М. Кожокина, О. П. Багно, О. Д. Трофимова, А. С. Беленова // Сорб-ционные и хромографические процессы. - 2008. - Т. 8. - вып. 6. - С. 1035-1041.

51. Hsu, A. Immobilized lipase-catalyzed production of alkyl esters of restaurant grease as biodisel / A. Hsu, K. Jones, T. Foglia // Biotechnol Appl Biochem.

- 2002. - V. 36.-№3.-P. 181-186.

52. Liu, Y. Integration of purification with immobilization of Candida rugosa lipase for kinetic resolution of racemic ketoprofen / Y. Liu, J. Xu, H. Wu // Biotech-nol.

- 2004. - V. 110. - № 2. - P. 209-217.

53. Gomes, F. Immobilization of lipase on chitin and its use in nonconventional biocatalysis / F. Gomes, E. Pereira, H. de Castro // Biomacromolecules. - 2004. - V. 5. - № 1. - P. 17-23.

54. Soares, C. Studies on immobilized lipase in hydrophobic sol-gel / C. Soares, O. Dos Santos, H. De Castro // Appl Biochem Biotechnol. - 2004. - V. 113.-№ 1-3.-P. 307-320.

55. Silva, J. Evaluation of the catalytic activity of lipases immobilized on chrysotile for esterification / J. Silva, P. Jesus // An Acad Bras Cienc. - 2003. - V. 75. -№2.-P. 157-162.

56. Pereira, E. Kinetic studies of lipase from Candida rugosa: a comparative study between free and immobilized enzyme onto porous chitosan beads / E. Pereira, H. De Castro, F. De Moraes // Appl Biochem Biotechnol. - 2001. - V.91-93. - P. 739-752.

57. Адсорбция липазы на гидрофобном носителе / С. А. Шеламова [и др.] // Биотехнология. - 2007. - № 3. - С. 52-75.

58. Bovara, R. Modification of lipase from Pseudomonas sp. with poly (aerylyl-morpholine) and study of its catalytic properties in organic solvent / R. Bovara, G. Ottoline, G. Carrea//Biotechnol. Lett. - 1994.-V. 16.-№ 10.-P. 1069-1074.

59. Murray, M. Immobilization of lipase onto lipophilic polymer particles and application to oil hydrolysis / M. Murray, D. Rooney, M. Van Neikerk // Process Biochem. - 1997. - V. 32. - № 6. - P. 479-486.

60. Knezevic, Z. Immobilization of lipase on a hydrophobic zeolite type Y / Z. Knezevic , I. Mojovic, B. Adnadjevic // Journal of the Serbian chemical society. - 1998. - V. 63,-№4.-P. 257-264.

61. Microbial lipase production on a polymeric resin / P. Christen [et al.] // Biotechnology techniques. - 1995. - V. 9. - № 8. - P. 597-600.

62. Stability of hydrophobic lipase derivatives immobilized on to organic polymer beads / M. Basri [et al.] // Applied biochemistry and biotechnology. - 1994. -V. 48. - № 3. - P. 173-183.

63. Balcao, V.M. Bioreactors with immobilized lipase: state of the art / V. M. Balcao , A. L. Paiva, F. X. Malcata // Enzyme Microb. Technol. - 1996. - V. 18. - № 6. -P. 392-416.

64. Utilization of powdered pig bone as a support for immobilization of lipase / S. Negishi [et al.] // Journal of fermentation and bioengineering. - 1989. - V. 67. - № 5. -P. 350-355.

65. Хитозан как перспективный носитель для иммобилизации липазы / Т. А. Ковалева [и др.] // Биотехнология. - 2010. - № 4. - С. 59-64.

66. Soares, С. Intensification of lipase perfomance for long term operation by immobilization on controlled pore silica in presence of polyethylene glycol / C. Soares,

H. De Castro, M. Santana // Appl Biochem Biotechnol. - 2002. - V. 98. - № 1. -P. 863-874.

67. Hydrolysis of plant oils by means of lipase from Rhizopus nigricans / M. Rucka [et al.] // Bioprocess Eng. - 1991. - V. 7. - № 2. - P. 133-135.

68. Кока-Армас, X. Исследование некоторых каталитических свойств иммобилизованной липазы из Mucor griseocyanus / X. Кока-Армас, X. Л. Мартинес-Эрнандес, X. Дустет-Мендоса // Вестник. Моск. Уни-та. Сер.2. Химия. - 2006. - Т. 47. - № 2. - С. 103-108.

69. Penecreac'h, G. Activity of Pseudomonas cepacia lipase in organic media is greatly enhanced after immobilization on a polypropylene support / G. Penecreac'h, J. Baratti //Appl Microbiol Biotechnol. - 1997. - V. 47. - № 6. - P. 630-635.

70. Рид, Дж. Ферменты в пищевой промышленности / Дж. Рид. - М. : Пищевая промышленность, 1971.—315 с.

71. Лобырева, Л. Б. Липолитическая активность гриба Penicillium roqueforti / Л. Б. Лобырева, А. И. Марченкова // Прикладная биохимия и микробиология. - 1983. - Т. 19. - вып.1. - С. 78-82.

72. Rohit, S. Production, purification, characterization, and applications of lipases / S. Rohit, C. Yusuf, С. B. Uttam // Biotechnology Advances. - 2001. - V. 19. -P. 627-662.

73. Patent 1577933 UK . Fat process and composition / M. H. Colman, A. R. Macrae. - 1980.

74. Pabai, F. Interesterification of butter fat by partially purified extracellular lipases from Pseudomonas putida, Aspergillus niger and Rhizopus oryzae / F. Pabai, S. Kermasha, A. Morin // World J Microbiol Biotechnol . - 1995a. - V. 11. - P. 669-677.

75. Pabai, F. Lipase from Pseudomonas fragi CRDA 323: partial purification, characterization and interesterification of butter fat / F. Pabai, S. Kermasha, A. Morin // Appl Microbiol Biotechnol. - 1995b. - V. 43. - P. 42-51.

76. Undurraga, D. Cocoa butter equivalent through enzymic interesterification of palm oil midfraction / D. Undurraga, A. Markovits, S. Erazo // Process Biochem. -2001. -V. 36. - P. 933-939.

77. Цеперович, С. А. Ферменты (основы химии и технологии) / С. А. Цеперович. - Киев : Издательство «Техника», 1971. - 360 с.

78. Корчагина, JI. Н. Липолитические ферменты для медицинских целей / Л. Н. Корчагина, В. Ф. Рудюк, В. Т. Чербанова. - М. : ЦБНТИ. Минмедбиопром СССР, 1987.-26 с.

79. Gill, I. Polyunsaturated fatty acids: Part 1. Occurrence, biological activities and applications/ I. Gill, R. Valivety // Trends Biotechnol. - 1997a. - V. 15. -P. 401-409.

80. Belarbi, E. H. A process for high yield and scaleable recovery of high purity eicosapentaenoic acid esters from microalgae and fish oil / E. H. Belarbi, E. Molina, Y. Chisti // Enzyme Microb Technol. - 2000. - V. 26. - P. 516-529.

81. Аркадьева, 3. А. Промышленная микробиология / 3. А. Аркадьева, A. M. Безбородое, И. H. Блохина. - М. : Высш. шк., 1989. - 688 с.

82. Казанина, Г. А. Ферменты бактерий рода Pseudomonas / Г. А. Казанина, А. А. Селезнева, И. М. Терешин // Прикл. Биохимия и микробиология.

- 1981.-Т. 6. - № 7. - С. 875-881.

83. Выбор продуцента щелочной липазы / И. В. Штейн [и др.] // Тезисы докладов III всесоюз.конф. - М., 1986. - С. 26-27.

84. Калунянц, К.А. Производство ферментных препаратов в США// К. А. Калунянц, Т. Н. Макарова, Н. А. Ивановская. - М. : Микробиопром, 1974. - 400 с.

85. Claudia, S. D. Recombinate microbial lipases for biotechnological applications / S. D. Claudia // Bioorg. and Med. Chem. - 1999. - № 10. - P. 2123-2130.

86. Lipase Applications in Biodiesel Production.[Электронный ресурс] / Y. Sevil, T. Pinar, O. Didem // Biodiesel - Feedstocks, production and applications. -2013. - Режим доступа: http://dx.doi.org/10.5772/52662.

87. Fan, X. Enzymatic biodiesel production - the way of the future / X. Fan // Lipid Technology. - 2012. - V. 24. - №2.-P. 31-32.

88. Yahya, A. R. M. Ester synthesis in lipase catalyzed reactions / A. R. M. Yahya, W. A. Anderson, M. Moo-Young // Enzyme and Microbial Technology. - 1998.

- V. 23.-P. 438-450.

89. Enzymatic biodiesel synthesis - Key factors affecting efficiency of the process / M. S. Antczak [et al.] // Renewable Energy. - 2009. - V. 34. - P. 1185-1194.

90. Study on acyl migration in immobilized lipozyme TL catalyzed transesterifi-cation of soybean oil for biodiesel production / W. Du [et al.] // J Mol Catal B: Enzym. -2005. - V. 37.-P. 68-71.

91. Jaeger, К. E. Microbial lipases from versatile tools for biotechnology / K. E. Jaeger, Т. M. Reetz // Trends Biotechnol. - 1998. - V. 16. - P. 396-403.

92. Лещинская, И. Б. Микробная биотехнология / И. Б. Лещинская, Б. М. Куриненко, В. И. Вершинина. - Казань: Унипресс, ДАС. - 2000. - 368 с.

93. Постолов, Ю. М. Руководство по технологии получения и переработки растительных масел и жиров / Ю. М. Постолов, А. Н. Николавский. -Ленинград : Издательство ВНИИ жиров, 1975. - 544 с.

94. Патент RU 2246535 С2, МПК С11С1/06, С07С51/087. Способ получения жирных кислот / А. М. Иванов, И. А. Иванов; заявитель и патентообладатель Кур.гос.техн.уни-т. - № 2003108096/04 ; заявил. 24.03.03 ; опубл. 20.02.05.

95. Патент RU 2264444 С1, МПК С11С1/04, С11С1/10, С07С57/12, С07С57/02. Способ получения смеси высших ненасыщенных жирных кислот / А.

B. Губанов, Ю. М. Постолов, А. Н. Лисицын, Н. П. Климова, А. Б. Рафальсон, С. А. Губанов ; заявитель и патентообладатель Гос.науч.учр."Всеросс.науч.иссл.ин-т.жир"Росс.акад.сель.наук (ВНИИЖ). - № 2004108942/04 ; заявил. 23.03.04 ; опубл. 20.11.05.

96. Патент RU 2067611 С1, МПК С11С001/04, С07С057/02. Способ получе-ния смеси ненасыщенных высших жирных кислот / Ю. М. Постолов, Н. А. Тупкало, Н. Д. Белкина, Н. Ф. Лещенко, А. М. Рахматуллин, И. X. Сунгатул-лина,

C. Н. Шепель ; заявитель и патентообладатель Акц.общ. "НЭФИС" -Каз.химком.им.Вахитова. - № 94004174/04 ; заявил. 31.01.94 ; опубл. 10.10.96.

97. Патент RU 2166534 С2, С11С001/04. Способ получения жирных кислот / А. М. Иванов, С. А. Ефанов, Е. В. Грехнева ; заявитель и

патентообладатель Кур.гос.техн.ун-т. - № 99112458/04 ; заявил. 08.06.99; опубл. 10.05.01.

98. Гамаюрова, В. С. Ферментативные методы модификации растительных масел / В. С. Гамаюрова, М. Е. Зиновьева, К. J1. Шнайдер // Вестник КНИТУ. - 2012. - Т. 15.-№22.-С.106.

99. Multiple crystal forms of lipases from Geotrichum candidum / J. D. Schrag [et al.] // J. Mol. Biol. - 1991. - V. 220. - P. 541-543.

100. Rhizomucor miehei triglyceride lipase is synthesized as a precursor / E. Boel [el.al.] // Lipids. - 1988. - V. 23. - № 7. - P. 701-706.

101. Табак, M. Я. Влияние условий культивирования на биосинтез липаз Oospora lactis: дис. ...канд. биол. наук / М. Я. Табак. - Ташкент: Ин-т микробиологии АН УзССР, 1979. - 156 с.

102. Использование препарата липазы Oospora lactis для гидролиза растительных масел / К. Д. Давранов и др. // Прикладная биохимия и микробиология. -1985. - Т. 21. - № 2. - С. 199-202.

103. Production of a diacylglycerol-enriched palm olein using lipase-catalyzed partial hydrolysis: Optimization using response surface methodology / C. Ling-Zhi [et al.] //Food Chemistry Food Chemistry. -2007. - V. 105,- № 4. - P. 1614-1622.

104. Неклюдов, А. Д. Биохимическая переработка жиров и масел в новые липидные продукты с улучшенными биологическими и физико-химическими свойствами (обзор) / А. Д. Неклюдов, А. М. Иванкин // Прикладная биохимия и микробиология.-2002.-Т. 38. -№ 5.-С. 469-481.

105. Шнайдер, К. Л. Ферментативный гидролиз растительных масел с использованием неводных сред : дисс. ... канд. хим. наук: 02.00.15 / К. Л. Шнайдер. - К., 2009. - 136 с.

106. Fatty hydroxamic acid biosynthesis in aqueous medium in the presence of the lipase-acyl transferase from Candida parasilosis / L. Vaysse [и др.] // J Biotechnol. - 1997.-V. 53.-P. 41-46.

107. Chatterjee, Т. Study of lipase-catalyzed hydrolysis of some monoterpene esters / T. Chatterjee, B.K. Chatterjee, D. K. Bhattacharyya // Can J Microbiol . - 2001. - V. 47.-P. 397-403.

108. Pencreac'h, G. Hydrolysis of p-nitrophenyl palmitate in n-heptane by Pseudomonas cepacia lipase: a simple test for the determination of lipase activity in organic media / G. Pencreac'h, J. C. Baratti // Enzyme Microb Technol. - 1996. -V. 18.-P. 417-422.

109. Jaeger, К. E. Microbial lipases from versatile tools for biotechnology / K. E. Jaeger, Т. M. Reetz // Trends Biotechnol. - 1998. - V. 16. - P. 396-403.

110. Alteration of lipase chain length specificity in the hydrolysis of esters by random mutagenesis / D. J. H. Gaskin [et al.] // Biotechnol Bioeng . - 2001. - V. 73. -P. 433-441.

111. Lie, O. Digestive lipolytic enzymes in cold (Gadus morrhua): Fatty acid specificity / O. Lie, G. Lambertsen // Сотр. Biochem. Physiol B. - 1985. - V. 80. -№ 3. - P. 447-450.

112. Lie, O. Fatty acid specificity of Candida cylindracea lipase / O. Lie, G. Lambertsen // Fette, Seifen, Anstrichmittel. - 1986. - V. 88. -№ 9. - P. 365-367.

113. Патент RU 2151788 CI, МПК C11C3/02, C11C3/06, C07C69/52, С1237/64. Рафинирование масляных композий / X. Брейвик, Г. Г. Харальдссон ; заявитель и патентообладатель НОРСК ХЮДРО А.С. - № 96118495/04 ; заявл. 07.03. 95 ; опубл. 27.06. 00.

114. Зайцева, JI. В. Использование энзимой переэтерификации для модификации масел / J1. В. Зайцева, А. Ю. Юдин // Масложировая промышленность. -2011. - № 2.-С. 26-29.

115. Биохимический способ получения сложных эфиров жирных кислот / Е. В. Крюкова [и др.] // Прикладная биохимия и микробиология.- 1993. - Т. 29. -№ 3. - С. 370-373.

116. Патент RU 2058298 С1, МПК С07С67/03, С07С69/24, С07С69/52, С11СЗ/04. Способ получения сложных эфиров жирных кислот / В. Теодор ;

заявитель и патентообладатель Фог.унд.но.инд.гезел.мбх (AT) - № 5011430/04 ; заявл. 28.06.91 ; опубл. 20.04.96.

117. Патент RU 2078130 С1, МПК CI 1С003/10. Способ получения концентрата этиловых эфиров полиненасыщенных высших жирных кислот / Н. В. Серебрянников ; заявитель и патентообладатель Всеросс.науч.иссл.ин-т.рыб.хоз.океа.- № 94043254/13 ; заявл. 07.12.94; опубл. 27.04.97.

118. Патент RU 2127251 С1, МПК С07С67/03, С07С69/24, С07С69/52. Способ получения сложных эфиров жирных кислот / Г. Манфред, Ч. Герда ; заявитель и патентообладатель Хем.унд.фарм.фабр.фаль.лист.гмбх И.Л (DE).- № 94042226/04 ; заявл. 19.01.94 ; опубл. 10.03.99.

119. Microbial lipases as catalysts for the interesterification of oil and fats / A. R. Macrae [et al.] // Biotechnology for the Oils and Fats Industry, American Oil Chemist'Soc. Champaign. - 1985. - V. 3.-P. 189-198.

120. Interesterification of fats and oils / A. R. Macrae [et al.] // The Netherlands, Elsevier Science. - 1985. - P. 195-208.

121. Патент RU 2341557 CI, МПК C11B3/11, C11B3/10. Способ переэтери-фикации жира с высоким содержанием глицеридов / X. Б. Тен Бринк, М. Б. Диндер, Р. М. Дике, Г. Крамер, Л. Муис, Р.П Потман ; заявитель и патентообладатель ЮНИЛЕВЕР Н.В (NL).- № 2006102388/13 ; заявл.09.06.04 ; опубл. 20.12.08.

122. Ibrahim, N. A. Enzymatic interesterification of falm stearin and coconut oil by a dual lipase system / N. A. Ibrahim, Z. Guo, X. Xu // Am. Oil Chem. Soc. - 2008. -№ 85.-P. 37-45.

123. Скокан, Л. E. Об использовании жиров — заместителей масло-какао нелауриновой группы в производстве кондитерской глазури / Л. Е. Скокан, Л. И. Рысева, Н. В. Линовская // Кондитерское производство. - 2010. - № 4. - С. 12-13.

124. Шаяхметова, А. X. Окислительные превращения производных рици-нолевой кислоты : автореф. дис. ...канд. хим.наук: 02.00.03 / А. X. Шаяхметова. -У., 2007.-20с.

125. Майдина. Использование липаз из микроорганизмов для получения жирных кислот из масла сафлора : дисс. ...канд. хим.наук: 02.00.15 / Майдина. -М., 2008,- 143с.

126. Овчарова, J1. Р. Создание исходного материала для селекции сортов с высоким содержанием рицинолевой кислоты в масле семян клещевины : автореф. дисс. ...канд. сельск. наук: 06.01.05 / Л. Р. Овчарова. - К., 2008. - 24 с.

127. Патент RU 2135161 С1, МПК 7 А61К9/107, 7/48 , А61К7/48, А61К7/06, А61 КЗ 1/23. Композиция "Рициниол" для лечения и косметического ухода за слизистыми оболочками, кожей и волосами / О.Н. Марцинкевич; заявитель и патентообладатель.-№98117359/14 ; заявил. 22.09.1998; опубл. 27.08.1999.

128. Meenal, S. P. Enzymatic hydrolysis of castor oil: Process intensification studies / S. P. Meenal, K. R. Virendra, B. P. Aniruddha // India Biochemical Engineering Journal. -2006. - V. 31.-P. 31-41.

129. Virendra, K. R. Effect of various addivites on enzymatic hydrolysis of castor oil / K. R Virendra, B. P. Anirudha //Biochemical Engineering Journal. - 2009. - № 47. -P. 93-99.

130. Maximization of bioconversion of castor oil into ricinoleic acid by respons surface methodology / G. Debajyoti [et al] // Bioresource Technology. - 2009. - № 100. -P. 4067-4073.

131. Гамаюрова, В. С., Зиновьева М. Е.Ферментативный катализ в неводных средах // Бутлеровские сообщения. - 2011. - Т. 25. - № 7. - С. 87-95.

132. Гамаюрова, В. С. Активация и стабилизация ферментных препаратов неорганическими соединениями / В. С. Гамаюрова, К. Л. Васина, М. Е. Зиновьева // Вестник КГТУ. -2009. -№ 6. - С. 121-129.

133. Francisco, J. The role of calcium ions and bile salts on the pancreatic lipa-se-catalyzed hydrolysis of triglyceride emulsions stabilized with lecithin / J. Francisco, A. J. Stella, V. J. Stella // Pharmaceutical research. - 1989. - V. 6. - № 6. - P. 449-457.

134. Иммобилизация и стабилизация ферментных препаратов липаз. В.С Гамаюрова и др. // Вестник КГТУ. - 2007. - № 2. - С. 103-108.

135. Гамаюрова, В. С.Интенсификация процесса гидролиза целлюлозы ферментным препаратом DENYCEL 100 CG при добавлении некоторых органических соединений / В. С. Гамаюрова, М. Е. Зиновьева, М. А. Бурмасова // Вестник КГТУ. - 2009. - № 6. - С. 130-134.

136. Ландер, О. В. Исследование гидролиза растительных масел в биоэмульсиях / О. В. Ландер, Н. И. Петухова, В. В. Зорин // Башкирский химический жирнал. - 2009. - Т. 16,- №4. -С. 71-73.

137. Pretrealment of Chromobacterium viscosiun lipase with acetone increases its activity in sodium bis-(2-ethylhexyl) sulfosuccinate (AOT) reverse micelles / MMR Talukder [et al] // Journal of Chemical Technology & Biotechnology. - 2005. - V. 80. -№ 10.-P. 1166-1169.

138. Han, D. Lipase-catalyzed hydrolysis of milk fat in lecithin reverse micelles / D. Han, J. S. Rhee // Biotechnol. Bioeng. - 1986. - V. 28. - P. 1250-1255.

139. Трумина, Э. H. О механизмах действия полиненасыщенных жирных кислот на иммунную систему / Э. Н. Трумина, О. К. Мустафина, М. Н. Волгарев // Вопросы питания. - 2003. - № 3. - С. 35-40.

140. Петров, Б. Ф. Технология концентрата жирных кислот на основе низкосортного рыбного жира / Б. Ф. Петров // Вестник МГТУ. - 2010. - Т. 13. -№4/2.-С. 913-917.

141. Биферментная система липаза/липоксигенеза в обращенных мицеллах АОТ в октане / И. М. Павленко и др // Биоорганическая химия. -2002. - Т. 28. -№1. - С. 50-55.

142. Lipase-catalyzed hydrolysis of fish oil in an optimum emulsion system / H. G. B. [et al.] // Biotechnilogy and Bioprocess engineering. - 2007. - № 12. -P. 484-490.

143. Bhandari, K. Hydrolysis of tuna fish oil using Candida rugosa lipase for producing fatty acids containing DHA / K. Bhandari, S. P. Chaurasia, A. K. Dalai // International journal of applied and nature sciences. - 2013. - V. 2. - №3. - P. 1-12.

144. Purification of docosahexenoic acid by selective esterification of fatty acids from tuna oil with Rhizopus delemar lipase / Y. A Shimada [et al] / J. Am. Oil chem.soc. - 1997. - V. 74. - P. 97-101.

145. Upgrading of farmed salmon oil through lipase-catalyzed hydrolysis / D. Kahveci [et al] // The open biotechnol. - 2010. - V. 4. - P.47-55.

146. Денисова, Т. В. Влияние СВЧ-излучения на ферментативную активность и численность микроорганизмов почв юга России / Т. В. Денисова, С. И. Колесников // Почвоведение. - 2009. - № 4. - С. 479-483.

147. Рубан, Е. J1. Прикладная биохимия и микробиология. - 1980. - Т. 16, №4.-С. 490-501.

148. Паканещикова, Н. В., Влияние компонентов питательной среды на биосинтез липазы / Н. В. Паканещикова, Н. Н. Силищев, О. Н. Логинов // Башкирский химический журнал. - 2006. - № 2. - С. 16-19.

149. Гамаюрова, В. С. Изучение влияния источников азота на рост и биосинтез липазы дрожжами Saccharomycopis lipolytica 36 / В. С. Гамаюрова, К. Л. Шнайдер // Научная сессия КГТУ. - 2011. - С. 237.

150. Шеламова С.А., Некоторые каталитические свойства липазы Rhizopus oryzae 1403 / С.А. Шеламова, Ю.А. Тырсина // Вестник ОГУ. - 2009. - № 6. -С. 434-437.

151. Шеламова С.А. Индукция биосинтеза липаз микромицетом / С.А. Шеламова, Ю.А. Тырсин // Вестник ОГУ. - 2012. - № 1. -С. 172 -176.

152. Диксон М. К. Ферменты / М. К. Диксон, Э. Д. Уэбб. - М. Мир, 1982. -

184 с.