Разработка технологии дрожжевой липазы для применения в пищевой промышленности тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 05.18.07, кандидат наук Гаскарова, Елена Фидаевна

• Гаскарова, Елена Фидаевна
• кандидат наук
• 2015

Оглавление диссертации кандидат наук Гаскарова, Елена Фидаевна

Оглавление

Оглавление

Введение

Глава 1 Обзор литературы

1.1 Липаза и ее изоформы

1.2 Механизм действия фермента

1.3 Источники получения липаз

1.4 Характеристика дрожжевых липаз

1.4.1 Синтез липаз дрожжами Candida rugosa

1.4.2 Липазы дрожжей Candida antarctica

1.4.3 Липазы дрожжей Candida lypolytica и Candida cylindracea

1.4.4 Липазы дрожжей Geotrichum candidum

1.4.5 Липазы дрожжей рода Trichosporon

1.4.6 Иные дрожжевые продуценты липазы

1.5 Условия увеличения биосинтеза липазы дрожжами

1.5.1 Разработка питательных сред для продуцентов липаз

1.5.2 Иммобилизация липаз

1.5.3 Биокаталитическая инженерия

1.5.4 Белковая инженерия

1.6 Применение ферментных препаратов липазы

1.7 Функциональные свойства некоторых жирных кислот, получаемых при липолизе растительных масел

Заключение

Глава 2 Материалы и методы

2.1 Приборы, расходные материалы и лабораторная посуда, используемые в работе

2.2 Химические реактивы

2.3 Питательные среды, используемые в работе

2.4 Биологические объекты, использованные в работе

2.5 Источники выделения микроорганизмов, обладающих липазной активностью

2.6 Использованные методы

2.6.1 Скрининг микроорганизмов - продуцентов липаз, выделенных из природных мест обитания

2.6.2 Исследование культуральных и физиолого-биохимических свойств продуцентов липолитических ферментов

2.6.3 Изучение морфологии клеток

2.6.4 Исследование культуральных признаков

2.6.5 Физиолого-биохимические свойства микроорганизмов

2.6.6 Изучение филогенетических особенностей дрожжевой культуры

2.6.7 Определение величины рН растворов

2.6.8 Определение содержания сухих веществ

2.6.9 Определение массовой доли золы

2.6.10 Определение массовой доли жира

2.6.11 Определение массовой доли белка по методу Лоури

2.6.12 Определение количества клеток микроорганизмов высевом на плотные питательные среды (метод Коха)

2.6.13 Определение количества мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов (КМАФАнМ), дрожжей и плесневых грибов

2.6.14 Выращивание культур микроорганизмов

2.6.14.1 Выращивание культуры дрожжей поверхностным способом на плотных питательных средах

2.6.14.2 Выращивание культуры дрожжей в условиях глубинной ферментации

2.6.15 Проведение УФ-индуцированного мутагенеза

2.6.16 Методы определения ферментативных активностей

2.6.16.1 Методы определения липазной активности ферментов

2.6.16.1.1 Качественное определение наличия липазной активности у штаммов-продуцентов, выращенных на тест-среде

2.6.16.1.2 Титриметрический метод определения липазной активности с применением субстрата оливкового масла (модифицированный метод Ота, Ямада)

2.6.16.1.3 Метод дезинтеграции клеток для определения внутриклеточной активности липазы

2.6.16.2 Метод определения протеолитической активности ферментов

2.6.16.3 Метод определения амилолитической активности ферментов

2.6.16.4 Метод определения каталазной активности ферментов

2.6.17 Осаждение ферментов из культуральной жидкости органическими растворителями

2.6.18 Метод стабилизации и активации ферментного препарата неорганическими соединениями

2.6.19 Определение молекулярной массы белковых фракций ферментного препарата липазы М10-10 Г20х методом гель-фильтрации

2.6.20 Методы определения физико-химических параметров действия липазы

2.6.20.1 Определение оптимума рН действия липазы

2.6.20.2 Определение температурного оптимума липазы

2.6.21 Модификация растительных масел ферментным препаратом липаза М10-10 Г20х

2.6.21.1 Гидролиз растительных масел липазой М10-10 Г20х

2.6.21.2 Определение кислотного числа

2.6.21.3 Получение натриевых солей жирных кислот

2.6.21.4 Определение состава жирных кислот методом газо-жидкостной хроматографии

2.6.22. Математические методы планирования экспериментов

2.6.22.1 Метод последовательных смещений

2.6.22.2 Метод полного факторного эксперимента (ПФЭ)

2.6.23 Методика изготовления сдобных хлебобулочных изделий с введением в рецептуру модифицированного липазой М10-10 Г20х маргарина

2.6.24 Методика изготовления соуса «Майонез» с введением в рецептуру модифицированных липазой М10-10 Г20х липидных компонентов

2.6.25 Определение влажности мякиша хлебобулочных изделий

2.6.26 Определение пористости хлебобулочных изделий

2.6.27 Определение кислотности готовой продукции

2.6.28 Определение стойкости эмульсии майонеза

2.6.29 Определение БПК|10ЛН в сточных водах предприятия

2.6.30 Определение ХПК в сточных водах предприятия

Глава 3 Результаты и обсуждения

3.1 Скрининг микроорганизмов-продуцентов липаз

3.2 Исследование фенотипических признаков и идентификация дрожжевого изолята М10

3.2.1 Морфология клеток дрожжевого изолята

3.2.2 Культуральные признаки изолята М10

3.2.3 Физиолого-биохимические признаки изолята М10

3.2.4 Идентификация штамма М10 до вида с помощью анализа 18S рРНК

3.3 Изучение путей повышения активности липазы С. parapsilosis MIO

3.3.1 Определение наиболее эффективного состава питательной среды для биосинтеза липазы С. parapsilosis MIO

3.3.1.1 Влияние источников углерода в составе питательной среды на биосинтез липазы штаммом С. parapsilosis MIO

3.3.1.2 Влияние источников азота на рост и липазную активность C.parapsilosis MIO

3.3.1.3 Влияние источников фосфорного питания на липазную активность в культуральной жидкости штамма-продуцента С. parapsilosis MIO

3.3.1.4 Влияние микроэлементов на липазную активность штамма C.parapsilosis MIO

3.3.1.5 Влияние концентрации СаСОз в составе питательной среды на липазную активность дрожжей С. parapsilosis MIO

3.3.1.6 Влияние ТВИН-80 в составе питательной среды на JIA дрожжей C.parapsilosis MIO

3.3.2 Проведение оптимизации состава питательной среды с использованием математических методов планирования экспериментов

3.3.3 Проведение индуцированного мутагенеза с помощью УФ-облучения с целью увеличения биосинтетической способности у дрожжей С. parapsilosis MIO

3.3.4 Влияние количества и возраста посевного материала на уровень липазной активности культуры С. рагарзИоз'ьБ М10-10, выращенной в условиях глубинной ферментации

3.3.5 Влияние условий культивирования С. рагар8ИоБ1з М10-10 на уровень накопления липазной активности в культуральной жидкости

3.3.5.1 Изучение динамики уровня липазной активности в культуральной жидкости дрожжей С. рагарзИоБ15 М10-10

3.3.5.2 Влияние температуры культивирования и рН питательной среды на липазную активность культуры С. рагарз'йоь'м М10-10

3.4 Определение наличия эндофермента в биомассе штамма Срагартг/ау/^ М10-10

3.5 Осаждение липазы С. рагарБИоБЬБ М10-10 из фильтрата культуральной жидкости

3.5.1 Влияние соотношения осадитель:культуральная жидкость и значения рН на выход сухого ферментного препарата С. рагарБИоБ^Б М10-10

3.5.2 Влияние концентрации осаждающего агента и эффективного гидромодуля на выход ферментного препарата липазы

3.6 Стабилизация и активация ферментного препарата

3.7 Исследование температурного и рН - оптимума действия ферментного препарата

3.8 Очистка липазы С. рагарБИоБ1Б М10-10

3.9 Характеристика препарата липазы М10-10 Г20х

3.9.1 Сравнительная характеристика препаратов с липолитическим действием

3.9.2 Изучение биохимического состава ферментного препарата липаза М10-10 Г20х

3.9.3 Изучение фракционного состава белковой части препарата липаза Ml0-10 Г20х методом колоночной гель-хроматографии

3.9.4 Исследование термостабильности и рН-стабильности ферментного препарата липазы М10-10 Г20х

3.10 Исследование ферментативной трансформации растительных масел препаратом липазы Ml 0-10 Г20х

3.10.1 Подбор эффективных условий гидролиза растительных масел

3.10.2 Исследование глубины ферментолиза растительных масел ферментным препаратом липазы Ml 0-10 Г20х

3.10.3 Оценка жирнокислотного состава липидных продуктов

3.11 Апробация полученного ферментного препарата липаза Ml0-10 Г20х

3.11.1 Введение в рецептуру сдобных хлебобулочных изделий модифицированного ферментом липаза Ml0-10 Г20х маргарина

3.11.2 Введение в рецептуру соуса «Майонез» модифицированных ферментом липаза Ml 0-10 Г20х липидных продуктов на основе растительных масел

3.11.3 Очистка сточных вод с применением ферментного препарата липаза Ml 0-10 Г20х на локальных очистных сооружениях рыбоперерабатывающего предприятия

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ:

Заключение

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Приложение А

Приложение Б

Приложение В

Приложение Г

Приложение Д

Приложение Е

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Разработка технологии дрожжевой липазы для применения в пищевой промышленности»

Введение

Актуальность темы. Производство ферментных препаратов занимает одно из ведущих направлений в развитии биотехнологии во всем мире. Их применение в промышленности позволяет интенсифицировать множество технологических процессов, увеличить объем выпускаемой продукции, повысить ее качество и снизить себестоимость, а так же сэкономить дефицитное сырье.

В современной пищевой промышленности существует важная проблема — это модификация жиров с целью придания им определенных биологических и физико-химических свойств: нужной пластичности, твердости, консистенции, повышения пищевой ценности. Достичь этого можно с помощью регулирования жирнокислотного состава жиров и масел. Наиболее перспективным методом в этом отношении считается ферментативная трансформация растительных масел.

Известные в отечественной и зарубежной практике микробные липолитические ферментные препараты являются, как правило, грибного и бактериального происхождения, оптимум действия липаз которых чаще всего находится в нейтральной и щелочной областях рН. В этой связи возникла необходимость поиска нового высокоактивного дрожжевого штамма-продуцента липаз, проявляющего свою активность в кислой области значений рН, пригодного для использования в пищевой промышленности.

Цель и задачи исследования. Цель диссертационной работы состояла в поиске нового активного дрожжевого продуцента липазы, разработке условий его культивирования для биосинтеза фермента, получении очищенного ферментного препарата липазы и его апробации в пищевой промышленности. Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

- скрининг микроорганизмов-продуцентов липаз, выделенных из природных мест обитания, с целью отбора штаммов, обладающих наибольшей липазной активностью;

- отбор штаммов-продуцентов липазы дрожжевого происхождения по совокупности их морфологических и культуральных признаков;

- идентификация выбранного штамма-продуцента липазы на основании изучения совокупности его морфологических, культуральных, физиолого-биохимических характеристик, а также на основе анализа участка ДНК, кодирующего часть 18S рРНК;

- разработка эффективного режима глубинного культивирования штамма-продуцента и оптимизация состава питательной среды;

- проведение индуцированного мутагенеза штамма-продуцента с целью получения дрожжевого мутанта, обладающего повышенной липазной активностью;

- разработка биотехнологии ферментного препарата липазы на основе нового перспективного штамма дрожжей;

- изучение состава ферментного препарата липазы и условий его использования в пищевой промышленности;

- установление жирнокислотной специфичности полученного ферментного препарата на примере гидролиза растительных масел, применяемых в пищевой промышленности.

Научная новизна работы. В результате проведенного направленного скрининга микроорганизмов отобран новый штамм дрожжей, продуцирующий липазу. На основании изучения совокупности морфологических, культуральных, физиолого-биохимических и филогенетических характеристик штамм идентифицирован как Candida parapsilosis MIO.

В результате проведенного индуцированного мутагенеза получен мутант С.parapsilosis M10-10, обладающий липазной активностью на 15% выше по сравнению с родительским штаммом.

На основе лабораторных исследований и полученных зависимостей накопления новым штаммом С. parapsilosis М10-10 липазной активности и выхода липазы от условий культивирования этого штамма, параметров выделения и очистки ферментного препарата, дано научное обоснование разработаной биотехнологии препарата дрожжевой липазы.

Впервые проведена оптимизация условий гидролиза растительных масел с применением липазы М10-10 Г20х в отсутствии эмульгатора, исследованы состав, условия действия и жирнокислотная специфичность полученного ферментного препарата.

Практическая значимость работы. Проведенные лабораторные исследования явились основой для разработки технологии дрожжевой липазы, пригодной для применения в пищевой промышленности. С использованием математических методов планирования экспериментов были оптимизированы основные значимые параметры процессов в технологии ферментного препарата липазы.

На основе наиболее продуктивного штамма С. parapsilosis Ml 0-10, полученного в результате скрининга микроорганизмов-продуцентов липаз, разработан проект Лабораторного технологического регламента по производству ферментного препарата липаза Ml0-10 Г20х, на основе которого проведена наработка липазы Ml0-10 Г20х штамма С. parapsilosis Ml0-10 с активность 30600 ед/г (оптимум действия препарата: рН 5,5; t=37°C) в условиях опытного производства ОАО «Биохиммаш». Результаты подтверждены актом о наработке (утверждены заместителем генерального директора по науке ОАО «Биохиммаш» 20.03.2014 г.). Составлен проект Технических условий на ферментный препарат липаза Ml0-10 Г20х штамма С. parapsilosis М10-10.

Проведенный расчет экономической эффективности разработанной технологии липазы Ml0-10 Г20х показал, что оптовая цена ферментного препарата находится ниже уровня мировых рыночных цен и составляет 14909,63 руб/кг.

Штамм дрожжей С. parapsilosis М10 депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов под номером ВКПМ Y-4055.

Подана заявка №2014138579 от 24.09.2014 на выдачу патента РФ «Штамм дрожжей Candida parapsilosis MIO - продуцент липазы».

В производственных условиях ООО «Компания Трасса» и ООО «Золотой голос» осуществлено изготовление сдобных хлебобулочных изделий и майонеза с

заменой в рецептуре растительных масел и маргарина на липидные продукты на их основе, модифицированные с помощью липазы М10-10 Г20х. Применение модифицированных липидных продуктов не оказало негативного влияния на форму, консистенцию, вкус и аромат продукции, при этом положительно сказалось на структуре изделия и его пищевой ценности. В производственных условиях ООО «Русский рыбный мир» осуществлены испытания по очистке сточных вод на локальных очистных сооружениях рыбоперерабатывающего предприятия с применением липазы М10-10 Г20х. Применение фермента оказало положительное действие на качество очистки стоков. Введение модифицированного узла реагентной обработки в схему очистки сточных вод предприятия позволило снизить содержание жировых загрязнений на 86,8%, БПКполн на 69,5%, ХПК на 61,3%). Результаты проведенной работы подтверждаются актом (приложение В).

Методология и методы исследований. Исследования выполнены по стандартным методикам с использованием современных микробиологических, биохимических и физико-химических методов исследования.

Основные положения, выносимые на защиту:

- разработанная схема скрининга микроорганизмов-продуцентов липазы;

- новый штамм дрожжей С. parapsilosis М10-10, обладающий липазной активностью;

- оптимизированный состав питательной среды и условия глубинного культивирования штамма С. parapsilosis М10-10 на основании анализа его физиолого-биохимических особенностей;

- обоснованные эффективные параметры выделения и очистки препарата липазы;

- биохимический состав ферментного препарата и условия его использования в пищевой промышленности;

- эффективные условия гидролиза растительных масел с использованием нового ферментного препарата липазы.

Степень достоверности результатов. Все измерения проводились не менее чем в трех повторностях. Результаты экспериментальных исследований обработаны с помощью Microsoft Office Excel 2007. В диссертационной работе представлены средние результаты с достоверностью 95%.

Апробация работы. Основные положения работы докладывались на Российских и международных конференциях и симпозиумах: Международной конференции «Биология — наука XXI века» (Москва, 2012 г.); Международной научно-практической конференции «Биотехнология и качество жизни» в рамках конгресса «Биотехнология - состояние и перспективы развития» (Москва, 2014 г.); VII Международном научно-практическом симпозиуме «Перспективные ферментные препараты и биотехнологические процессы в технологиях продуктов питания и кормов» (Москва, 2014 г.), Международной научно-практической конференции «Биотехнология и качество жизни» в рамках конгресса «Биотехнология - состояние и перспективы развития» (Москва, 2015 г.);

На международной научно-практической конференции «Биотехнология и качество жизни» в рамках конкурса молодых ученых на лучшую научно-исследовательскую работу результаты разработок отмечены дипломом и медалью.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 работ, в том числе 3 статьи в ведущих рецензируемых научных журналах, определенных Высшей аттестационной комиссией Министерства образования и науки РФ.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, выводов, библиографического списка, включающего 196 источников (в том числе 132 зарубежных), и 6 приложений. Работа изложена на 215 страницах машинописного текста, включает 23 таблицы и 21 рисунок.

Глава 1 Обзор литературы

1.1 Липаза и ее изоформы

Ферментные препараты отличаются от ферментов тем, что кроме активного белка они содержат различные балластные вещества. Кроме того, подавляющее количество ферментных препаратов являются комплексными, содержащими кроме основного еще значительное количество сопутствующих ферментов. Однако в комплексных препаратах один фермент может преобладать над другим. При определении его названия учитывают только основной фермент.

Термин «липолитические ферменты» относится к липазам и гидролазам эфиров карбоновых кислот, и первые отличаются от вторых тем, что способны расщеплять нерастворимые эфиры. Липазы работают преимущественно в эмульгированных субстратах с длинноцепочечными жирными кислотами, в то время как гидролазы эфиров карбоновых кислот работают в растворимых эфирах с короткоцепочечными жирными кислотами [Sommer и др., 1997].

Липаза (КФ 3.1.1.3) - фермент, принадлежащий к классу гидролаз, по номенклатуре ферментов имеет название триацилглицероацилгидролаза. Однако этот фермент имеет еще и несколько тривиальных названий: стеапсин, трибутираза, липаза триглицеридов [Грачева и др., 2000]. Биохимические и молекулярные характеристики липаз, выделенных из различных источников, имеют большую неоднородность по своей специфичности, аминокислотной последовательности и каталитическим свойствам. На основе ингибирования их ферментативной активности путем химической модификации, липазы первоначально были классифицированы как сериновые гидролазы. Серии находящийся в активном центре представляет собой закрытый хорошо сохраненный домен, и это единственная общая черта между липазами [Antonian, 1988].

Липазы катализируют широкий спектр реакций, в том числе реакции гидролиза, синтеза эфиров, трансэтерификации (алкоголиз, ацидолиз,

интерэтерификация и аминолиз)[1Чт1 и др., 2001; Shintre и др., 2002; Nagayama и др., 2002]:

1. Гидролизэфиров:

R - COO - R] + Н20 —> R - СООН + R, - ОН

2. Синтез эфиров:

R-COOH + HO-R, ->R-COO-R, + Н20

3. Трансэтерификация:

3.1. Ацидолиз

R - COO - R, + R2 - СООН R2 - COO - Rj + R - СООН

3.2. Алкоголиз

R - COO - R, + НО - R2 -> R - COO - R2 + HO - Rj

3.3. Интерэтерификация:

R - COO - R, + R2 - COO - R3 —» R - COO - R3 + R2 - COO - R,

3.4. Аминолиз:

R - COO - Ri + H2N - R2 R - CO - NH - R2 + HO - R, Они входят в число наиболее важных биокатализаторов, осуществляющих нестандартные реакции в водной и безводной средах. Липолитические ферменты гидролизуют сложноэфирные связи в триацилглицеридах (ТАГ) с высвобождением жирных кислот (СЖК) [Sheldon, 1993; Saxena и др., 1999]. В средах с низким содержанием воды липазы катализируют реакции этерификации, переэтерификации и реакции энантиоселективного гидролиза [Kui и др., 2003; Piao и др., 2003; Raku и др., 2003].

Многие липазы очень чувствительны к действию антибиотиков, которые ведут себя как конкурентные ингибиторы фермента, но степень ингибирования зависит от происхождения липазы. Для любого фермента существует оптимальное значение рН и температуры, при котором они проявляют максимальную активность. Так, например, рН - оптимум действия для липаз варьирует в достаточно широких пределах от 4,0 до 9,0. В зависимости от оптимального рН для действия липаз они делятся на кислые (4-6), нейтральные (6,5-7,2) и щелочные (7,5—9). Оптимум температур для большинства липаз колеблется в интервале 37 - 43°С. Некоторые из

представителей термоустойчивы и действуют при достаточно высоких температурах 55 - 70°С. Более того, некоторые представители липаз устойчивы и активны при 20°С.

Липазы, как правило, являются гликопротеинами и имеют относительно небольшую молекулярную массу - 20-65 кДа [Грачева и др., 2000]. Они имеют чрезвычайно разнообразные хемо-, регио- и энантиоселективные изоформы, имеющие разные молекулярные массы и оптимальные параметры действия. Так, например, Veeraragavan К. и Gibbs В. на анионообменной колонке выделили две липазы из Candida rugosa (С. cylindrcea L.1754) — LIP 1 и LIP 2. Молекулярные массы обоих белков составлял 58 кДа [Veeraragavan, Gibbs, 1989]. В том же году Shaw и Chang указали на наличие трех различных форм липаз А, В и С продуцентом которых являлся штамм дрожжей С. rugosa. При этом молекулярные массы липаз А, В и С находится в пределах ~ 362, ~ 200 и ~ 143 кД соответственно [Shaw, Chang, 1989]. Результаты SDS-PAGE показывают, что липазы А и С состоят из субъединиц одной и той же молекулярной массы, т.е. 62 кД. Вполне возможно, что липазы А, В и С являются гексамерами, тримерами и димерами одной субъединицы.

Пять лет спустя Chang с соавторами изучали влияние условий культивирования на производство липаз из С. rugosa (АТСС 14830), и предположили, что условия культивирования не только влияют на производство липазы, но так же изменяют модель формирования различных ее изоформ. Они продемонстрировали зависимость биосинтеза фермента от внесения ТВИНа 20 и 80 в состав питательной среды при культивировании штамма С. rugosa. В результате культура продуцировала разные формы липазы, которые, в свою очередь, проявляли разную субстратную специфичность и термостабильность [Chang и др., 1994]. Эти результаты демонстрируют, что специфичность и термостабильность липолитических препаратов могут предопределяться составом питательной среды.

Перспективы практического применения липаз делают целесообразным исследование таких ее свойств, как субстратная специфичность, оптимальные

условия действия, стабильность при изменении кислотности среды и температуры.

Дрожжевые липазы в большинстве своем являются внеклеточными гликопротеинами, хотя имеется несколько публикаций, например по штамму дрожжей Yarrowia lipolytica, согласно которым у данного вида дрожжей два из трех изоферментов имеют связь с клеткой и по своей природе являются внутриклеточными [Sugiura и др., 1976; Ota и др., 1982; Pignede и др., 2000].

1.2 Механизм действия фермента

Исследования структуры липаз предоставили данные для понимания их гидролитической активности, межфазной активации и стереоселективности [Kazlauskas и др., 1998].

Липаза — фермент, катализирующий реакцию гидролитического расщепления триацилглицерола до диацилглицерола и остатка отщепляемой жирной кислоты. Далее идет отщепление следующих остатков жирных кислот до образования глицерина. При этом скорость отщепления кислотного остатка от триацилглицерола к моноацилглицеролу уменьшается [Грачева и др., 2000].

Липазы различного происхождения могут проявлять сродство к определенным кислотным остаткам и обладать различной субстратной специфичностью. Они могут проявлять специфичность как к остаткам жирных кислот, так к спиртовым фрагментам своих субстратов. Согласно позиционной специфичности субстратов микробные липазы делят на две группы: позиционно-неспецифичные и позиционно-специфичные [Безбородое и др., 2008].

Ферменты первой группы не обладают позиционной специфичностью и высвобождают жирные кислоты из всех трех положений глицерина. Они катализируют полный гидролиз триацилглицеринов до жирных кислот и глицерина, где диацилглицерины и моноацилглицерины являются всего лишь промежуточными продуктами реакции. Характерными для позиционно-неспецифичных липаз является появление глицерина в реакционной смеси уже

на начальном этапе гидролиза, в то время как при гидролизе позиционно-специфичными липазами глицерин начинает появляться только после достижения 20-50% -ой глубины расщепления триглицеридов [Мееров и др., 1978]. К этой группе ферментов относятся липазы, продуцируемые штаммами Galactomices geotrichium, Candida cilindracea, Pseudomonas fragy, Geotrichum candidum и т. д. Когда в качестве катализаторов реакции используются липазы этого типа, продукты реакции содержат произвольное распределение остатков жирных кислот в триацилглицеринах и имеют тот же самый состав, что и продукты, получаемые в результате химической переэтерификации [Грачева и др., 2000].

Вторая группа липаз освобождает жирные кислоты позиционно-специфически. Специфичность действия липаз связана с 1 и 3 положением ацилглицеринов, в результате чего, последние гидролизуются с образованием жирных кислот 1,2(2,3)-диацилглицеринов и 2-моноацилглицеринов. Основными продуктами, образующимися в результате липолиза в этом случае, являются 2-моноглицериды и свободные жирные кислоты. Хроматографический анализ фракций показал, что в реакционной смеси накапливаются, как правило, 1,2- и 2,3-диглицериды, а 1,3-диглицериды не обнаружены, что указывает на неспособность данных липаз атаковать эфирную связь в положении 2 [Зубенко и др., 1979; Грачева и др., 2000]

Большая часть известных липаз микроорганизмов не обладает специфичностью относительно остатка жирной кислоты, входящего в структуру триглицерида. Однако имеются существенные различия в скорости гидролиза этих субстратов. Так, некоторые липазы быстрее гидролизуют сложные эфиры, образованные глицерином и жирными кислотами с короткой углеродной цепочкой, в то время как другие лучше гидролизуют эфиры, содержащие остатки длинноцепочечных жирных кислот.

Ряд липаз при липолизе природных масел и жиров различного происхождения не проявляет строгой специфичности и гидролизует их с одинаковой скоростью. Так, при проведении липолиза оливкового, подсолнечного, кунжутового, хлопкового и соево-бобового масел, а также свиного жира (лярд), жира моржа и

масла семян рапса с помощью липазы из гриба рода Rhizopus степень активности и глубина гидролиза были почти на одном уровне.

Липазы обладают уникальной особенностью действовать на водной и неводной поверхности раздела фаз [Verger, 1997; Schmidt, 1998]. Принцип межфазной активности липазы заключается в ограничении каталитической активности взаимодействия между липидами и водой. Активация фермента происходит в результате изменения его конформации - при связывании с субстратом, полипептидный участок, сдвигаясь в сторону, открывает доступ молекулам субстрата к активному центру.

Способность липаз функционировать на поверхности раздела фаз липид-вода подразумевает, что фермент взаимодействует с полярными и неполярными молекулами. Следует отметить, что взаимодействие с неполярными молекулами (например, мицеллами) может вызвать структуральные изменения в ферменте, вследствие чего развивается каталитическая активность [Derewenda, 1994]. Наряду с вышесказанным известно, что скорость липолиза зависит от степени диспергирования субстрата - чем она выше, тем быстрее идет липолиз. Это связано с увеличением поверхности контакта фермента и субстрата.

Субстратами для действия липаз являются липиды - сложная смесь органических веществ, которая подразделяется на две большие группы: сложные и простые. К простым липидам относятся липиды, не содержащие азота, фосфора и серы. Это воски, диольные липиды, ацилглицерины (глицериды), алкильные липиды, нейтральные плазмалогены, гликолипиды. К сложным липидам следует отнести сульфолипиды, инозипол, глицеро-фосфолипиды, фосфорсодержащие плазмалогены, сфинголипиды, состоящие из сфингомиелинов и гликосфингомиелинов [Леонтьев, Игнатовец, 2013].

Акт ферментативного липолиза можно записать следующим образом (1):

^ + <-> (sS ■ S3)adc <-> (eS)m S3 г + Pj + S3 (1)

Где s - фермент;

S3 - эмульгированный субстрат;

S - единичная молекула субстрата;

(е8 • 8э)адс — фермент, адсорбированный на поверхности эмульгированного

субстрата;

(£Б)т - комплекс Михаэлиса;

Pj - продукты реакции [Грачева и др., 2000].

1.3 Источники получения липаз

Липолитические ферментные препараты могут быть получены из трех источников: тканей животных, семян некоторых растений и микроорганизмов [ЕПЬо1, Огег, 2000; Кагштига и др.,2001].

Наиболее важным источником липаз животного происхождения являются поджелудочные железы крупного рогатого скота, овец, свиней и поросят. Самыми известными признаны панкреатические липазы свиного происхождения. Их недостаток в том, что они не могут быть использованы при обработке вегетарианской или кошерной пищи. Экстракт поджелудочной железы свиней содержит трипсин, который содержит горькие на вкус аминокислоты. Они также могут содержать остатки вирусов животных, гормоны и т.д.[УакЫи, Коиг, 2006]. Обычно панкреатическая липаза используется только для медицинских целей [Грачева и др., 2000].

В заметных количествах липаза содержится в семенах многих растений: ржи, пшеницы, овса, сои, хлопчатника и особенно клещевины. Растительные липазы не используются в коммерческих целях, и изучались достаточно глубоко, не с позиции получения их в виде препаратов, а с позиции их влияния на хранение семян и процессы прорастания.

Наиболее перспективным источником липаз являются микроорганизмы. Животное и растительное сырье не может удовлетворить растущую потребность в этих препаратах, а микроорганизмы являются неисчерпаемым источником. Микробы - это основной источник огромного количества ферментов, производимых промышленным способом по причинам, упомянутым выше.

Липазы синтезируются очень многими микроорганизмами. Бактерии, как правило, накапливают внутриклеточную липазу, а актиномицеты, грибы и дрожжи - преимущественно внеклеточную [Грачева и др., 2000]. Однако место локализации липазы, образуемой микроорганизмами, так же может зависеть от физиологического состояния культуры, от условий культивирования, состава питательной среды.

Среди бактерий найдены активные продуценты липаз, относящиеся к родам Pseudomonas, Bacillus, Acinetobacter, Propionibacterium, Chromobacterium, Alcaligenes. Для промышленного использования чаще всего рекомендуются микроскопические грибы. Высокая липазная активность отмечается у грибов родов: Geotrichum, Aspergillus, Mucor, Rhizopus, Pénicillium, и Oospora.

Обширные обзоры были написаны по бактериальным липазам [Arpigny, Jaeger, 1999; Jaeger и др.,1999].

Дрожжи же используются в пищевой и других отраслях промышленности начиная с древности. Они заняли свое место давно и считаются чем-то естественным. Также считается, что с дрожжами просто работать и их легко культивировать, по сравнению с бактериями. Самые известные: Candida rugosa, С. antarctica, Yarrowia lipolytica (Geotrichum candidum) [Kademi и др., 2003].

1.4 Характеристика дрожжевых липаз

1.4.1 Синтез липаз дрожжами Candida rugosa

Candida rugosa является наиболее часто используемым микроорганизмом для синтеза липаз [Benjamin, Pandey, 1998; Akoh и др., 2004], но несмотря на это дрожжевые липазы не получили заслуженного внимания, а поэтому информация о них разрознена.

Липазы, синтезируемые С. rugosa, быстро стали одними из наиболее часто используемых в промышленности ферментами. Причина их использования в

различных процессах - высокая ферментативная активность, как при гидролизе, так и в синтезе [Redondo и др., 1995].

Veeragavan и Gibbs при изучении липазы из С. rugosa/cylindracea выделили две ее изоформы, обладающие стереоселективностью, и обозначили их I и II. У обоих белков молекулярный вес оказался 58 кДа, а изоэлектрические точки липаз А и В составили ~ 5,8 и ~ 5,6 соответственно [Veeraragavan, Gibbs, 1989; Hernaiz и др., 1997]. В том же году Shaw и Chang указали на наличие трех различных изоформ липазы А, В и С в коммерческом препарате. Все три формы демонстрировали значительные липолитические активности [Shaw, Chang, 1989].

Shaw и Chang предположили, что липазы А и С соответствуют липазам I и И, предложанными исследователями Veeragavan и Gibbs, а липаза В не была ими обнаружена, так как была превращена в липазу I обработкой сырого препарата этанолом.

Chang, Chou и Shaw изучали влияние условий культивирования на производство липаз штаммом С. rugosa (АТСС 14830). Эта группа исследователей предположила, что условия культивирования не только влияют на производство липазы, но также изменяют модель формирования различных форм липаз. Оказалось, что в зависимости от наличия ТВИН-20 и ТВИН-80 в составе питательной среды, С. rugosa начинала продуцировать разные формы липазы, которые показывали разную субстратную специфичность и термостабильность. Эти результаты показали, что специфичность и термостабильность липолитических препаратов может быть смоделирована составом питательной среды [Chang и др., 1994]. В то же время Lotti с соавторами в университете Милана (Италия) также проводили оценку роста клеток С. rugosa/cylindracea на различных питательных средах [Lotti и др., 2001].

Benjamin и Pandey выделили и охарактеризовали три различные формы липазы из С. Rugosa (DM - 2031). Очищенные изоформы внеклеточной липазы (lipA, lipB, and LipC) имели молекулярные массы 64, 62 и 60 кДа. Все три формы имеют температурный оптимум в пределах 35-40°С и оптимум pH 7-8. Ионы

серебра и ртути сильно подавляли липолитическую активность, а внесение ионов Са2+ и Mg2+ приводили к ее увеличению [Benjamin и др., 2001].

Lopez, Pernas и др изучали реакционную способность очищенных изоферментов С. rugosa (LIP1, LIP2 и LIP3) в водной и органической средах. LIP1 и LIP3 обладали схожей стабильностью, в то время как LIP2 был менее стабилен. Наибольшие различия между ними были выявлены в отношении гидролиза триглицеридов. Предпочтительным субстратом для LIP3, LIP1 и LIP2 были короткие, средние и длинные ацильные цепи триглицеридов, соответственно [Lopez и др., 2004].

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Гаскарова, Елена Фидаевна, 2015 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Адлер Ю.П. Планирование эксперимента при поиске оптимальных условий// Ю.П. Адлер, Е.В. Маркова, Ю.В. Грановский - М.: Наука, 1976. -с. 280.

2. Арутюнян Н.С. Рафинация масел и жиров: Теоретические основы, практика, технология, оборудование // Н.С. Арутюнян, Е.П. Корнена, Е.А. Нестерова. - СПб. ГИОРД, 2004. - с. 288

3. Бабьева И.П. Методы выделения и идентификации дрожжей// И.П. Бабьева, В.И. Голубев. -М.: Пищевая промышленность, 1979. - с.6-61.

4. Бабьева И.П. Биология дрожжей // И.П. Бабьева, И.Ю. Чернов. - М.: Товарищество научных изданий КМК, 2004. - с. 221

5. Безбородов A.M. Ферментативные процессы в биотехнологии.// В.О. Попов, H.A. Загустина. — М.: Наука, 2008 - с.335

6. Беззубов Л.П. Химия жиров// Л.П. Беззубов. - Учебник для техникумов пищевой промышленности. 3-е изд.перераб. и доп. — М., 1975. - с.279.

7. Березов Т.Т. Биологическая химия: учебник // Т.Т. Березов, Б.Ф. Коровкин; под ред. акад. АМН СССР С.С. Дебова. - 2-е изд., перераб. и доп. - М.: Медицина, 1990.-е. 528.

8. Бирюков В.В. Оптимизация периодических процессов микробиологического синтеза// В.В. Бирюков, В.М. Кантере. — М.: Наука, 1985.-е. 296.

9. Брокерхоф X. Липолитические ферменты// X. Брокерхоф, Р. Дженсен. - М.: Мир., 1978. - с.355.

10. Бутова С.Н. Методические указания к выполнению лабораторных работ по курсу «Химия жиров»// С.Н. Бутова, С.Ю. Солдатова, В.И. Дергаусов, Н.Т. Елошвили. - М.: МГУПП., 2009. - с.38.

11. Бутова С.Н. Методические указания к выполнению лабораторных работ по курсу «Технология рафинации»// С.Н. Бутова, Н.Т. Елошвили, С.Ю.

Солдатова, Ю.С. Скляренко, Е.А. Кудряшова, К.А. Лыско. - М.: МГУПГТ, 2010. -с.40.

12. Величко А.К. Методы лабораторного определения общей перекись разрушающей активности ферментов растений// А.К. Величко, В.Б. Соловьев, М.Т. Генгин. - Пенза: Известия 111 11У им. В.Г. Белинского, 2009. -№14(18)-с. 44-48.

13. Вержбицкий В.М. Основы численных методов: учебник для вузов// В.М. Вержбицкий - М.: Высшая школа, 2002. - с. 848.

14. Гайдадин А.Н. Применение средств ЭВМ при обработке активного эксперимента // А.Н. Гайдадин, С.А. Ефремова - Волгоград: Волг. ГТУ, 2008.-с. 16.

15. ГОСТ 10444.15-94 Продукты пищевые. Методы определения количества мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов. -Введ. 1996.01.01. — М.: Издательство стандартов , 2010. - с. 7.

16. ГОСТ 13496.15-97 Корма, комбикорма, комбикормовое сырье. Методы определения содержания сырого жира.- Введ. 1999-01-01. — М.: Издательство стандартов, 2011. - с.12.

17. ГОСТ 13979.6-69 Жмыхи, шроты и горчичный порошок. Метод определения золы. — Введ. 1970-01-01. — М.: Издательство стандартов, 2002. -4 с.

18. ГОСТ 20264.2-88 Препараты ферментные. Методы определения протеолитической активности. - Введ. 1989-01-01. - М.: ИПК Издательство стандартов, 2005. - с. 15.

19. ГОСТ 21094-75 Хлеб и хлебобулочные изделия. Метод определения влажности. - Введ. 1976-07-01. — М.: Издательство стандартов, 1986. — с. 4.

20. ГОСТ 28805-90 Продукты пищевые. Методы выявления и определения количества осмотолерантных дрожжей и плесневых грибов. — Введ. 1993.01.01. -М.: Издательство стандартов , 2010. - с. 4.

21. ГОСТ Р 52110-2003 Масла растительные. Методы определения кислотного числа. - Введ. 2003-07-07. - М.: Стандартинформ, 2008. - с.8.

22. ГОСТ 53595-2009 Майонезы и соусы майонезные. Правила приемки и методы испытания. - Введ. 2011-01-01. -М.: Стандартинформ, 2011. - с.35.

23. ГОСТ 54330-2011 Ферментные препараты для пищевой промышленности. Методы определения амилолитической активности. - Введ. 2013-01-01. -М.: Стандартинформ, 2012. - с.20.

24. ГОСТ 5669-96 Хлебобулочные изделия. Метод определения пористости. -Введ. 1997-08-01. - М.: ИПК Издательство стандартов, 2001. - с.2.

25. ГОСТ 5670-96 Хлебобулочные изделия. Методы определения кислотности. - Введ. 1997-08-01. - М.: ИПК Издательство стандартов, 1997. - с. 5.

26. Грачев Ю.П. Математические методы планирования эксперимента // Ю.П. Грачев, Ю.М. Плаксин - М.: ДеЛи принт, 2005. - с. 296.

27. Грачева И.М. Лабораторный практикум по технологии ферментных препаратов: учебное пособие для вузов / И.М. Грачева, Ю.П. Грачев, М.С. Мосичев. — М.: Легкая и пищевая промышленность, 1982. — с. 240.

28. Грачева И.М. Технология ферментных препаратов // И.М. Грачева, А.Ю. Кривова. - 3-е изд., перераб. и доп. -М.: «Элевар», 2000. - с.512.

29. Гринберг Г. Модифицированные жиры // Г. Гринберг, Г. Щепаньская; пер. с польск. Ерошевой H.H.; Под ред. Венгеровой Н.В. и др. - М.: Пищевая промышленность, 1973. - с. 105.

30. Дарбре А. Практическая химия белка / А. Дарбре. - М.: Мир, 1989 - с.623.

31. Демидович Б.П. Основы вычислительной математики // Б.П. Демидович, И.А. Марон - 5-е изд. - СПб.: Лань, 2006. - с. 664.

32. Джей Дж. М. Современная пищевая микробиология // Дж. М. Джей, М. Дж. Лесснер, Д.А. Гольден; пер. 7-ого англ. изд. - М.: БИНОМ. Лаборатория знаний, 2012. - 886.

33. Зубенко Т.Ф. Влияние температуры культивирования на термостабильность липолитических ферментов гриба Rhizopus microsporus// Т.Ф. Зубенко, М.З. Закиров, К.Д. Давранов. - М.: Прикладная биохимия и микробиология, 1979. - т. 15, с. 832-838.

34. Иванова JI.A. Методические рекомендации к проведению лабораторных работ по технологии белковых препаратов, аминокислот и липидов//Л.А. Иванова, Л.И. Войно. - М.: Издательский комплекс МГУПП, 1985. - с.42.

35. Иванова Л.А. Методические рекомендации к проведению лабораторных работ по дисциплине «Технология биоконверсии растительного сырья» // Л.А. Иванова, Л.И. Войно, Е.Г. Борисенко, И.С. Иванова. - М.: МГУПП, 2002. - с.65.

36. Иванова Л.А. Методические указания к выполнению лабораторных работ по курсу «Теоретические основы биотехнологии» Раздел 2. Биохимические основы синтеза биологически активных веществ. Часть 1. Белки // Л.А. Иванова, Ю.А. Тырсин, И.М. Грачева, С.Н. Бутова, И.А. Типисева, В.В. Матреничева. - М.: МГУПП, 2002. - с.4-44.

37. Ипатова Л.Г. Жировые продукты для здорового питания. // Л,Г. Ипатова, A.A. Кочеткова, А.П. Нечаев, В.А. Тутельян. — М.: ДелиПринт, - 2009, - с. 396.

38. Коновалов С.А. Селекция микроорганизмов - продуцентов ферментов // С.А. Коновалов, В.Б. Котов. - М., 1970. - с.57-69.

39. Косцова Т.Е. Исследовать и разработать малоотходные процессы рафинации масел и жиров с применением 1 -гидроксиэтилидендифосфоновой кислоты // Т.Е. Косцова. - Дис. на соискание ученой степени канд. Техн. наук. - М.: МФ ВНИИЖ, 2004. -с.184.

40. Кривова А.Ю. Технология микробных ферментных препаратов, осуществляющих трансформацию липидов // А.Ю. Кривова. — Дисс. на соискание ученой степени доктора технических наук. - М.: МГАПП, 1995. -с.572.

41. Леонтьев В.Н. Химия биологически активных веществ // В.Н. Леоньтьев, О.С. Игнатовец. - Электронный курс лекций для студентов специальности 148 02 01 «Биотехнология», 2013. - с.99-100.

42. Ливинская С.А. Методические указания к выполнению лабораторных работ по дисциплине «Пищевые эмульсии масложировой промышленности» // С.А. Ливинская. - М.:МГУПП, Технология жиров, 2007. - с.34.

43. Максимова И.А. Руководство к практическим занятиям по биологии дрожжей // И.А. Максимова, И.Ю. Чернов. - Тула: Гриф и К.,2006. - с.92.

44. Мееров Г.И. О специфичности заменителей панкреатической липазы и методах ее определения // Г.И. Мееров, К.Т. Михальская, Г.В. Савинов. -Москва: Химико-фармацевтический журнал, 1978. - т. 12, № 6, с.42-45.

45. Нетрусов А.И. Практикум по микробиологии: учебное пособие для студентов высших учебных заведений // А.И. Нетрусов, М.А. Егорова, Л.М. Захарчук. -М.: Издательский центр "Академия", 2005. - с.608.

46. Нечаев А. П. Пищевая химия: учебник для вузов // А.П. Нечаев, С.Е. Траубенберг, A.A. Кочеткова и др.; под ред. А. П. Нечаева. - Изд. 5-е, испр. и доп. - СПб:ГИОРД, 2012. - 672с.

47. Нечаев А.П. Растительные масла функционального назначения // А.П. Нечаев, A.A. Кочеткова // Масложировая промышленность. — М., 2005 - №3 - с.20-21.

48. Нечаев А.П. Пищевые микроингредиенты в технологиях масложировых продуктов // А.П. Нечаев // Пищевые ингредиенты в создании современных продуктов питания // Под ред. В.А. Тутельяна, А.П. Нечаева. - М.: ДеЛи плюс, 2014. - с.348 - 363

49. Оттавей П. Берри. Обогащение пищевых продуктов и биологически активные добавки // Оттавей П. Берри. - СПб: Профессия, - 2010, - с. 312.

50. Паронян В.Х. Технология жиров и жирозаменителей.// В.Х. Паронян. - М.: ДелиПринт, 2006, - с.760.

51. ПНД Ф 14.1:2:3:4.123-97 Количественный химический анализ вод. Методика выполнения измерений биохимической потребности в кислороде после n-дней инкубации (БПКполн.)

52. ПНД Ф 14.1:2.100-97. Количественный химический анализ вод. Методика выполнения измерений химического потребления кислорода в пробах природных и очищенных сточных вод титриметрическим методом.

53. Полыгалина Г.В. Определение активности ферментов // Г.В. Полыгалина, B.C. Чередниченко, J1.B. Римарева. -М.: ДеЛи, 2003. - 372 с.

54. СанПиН 2.3.2.1078-01 "2.3.2. Гигиенические требования безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов. - Введ. 2001-11-14. — М.: ФГУП «ИнтерСЭН», 2002. - с. 168.

55. Семенова П.А. Аспекты применения водо- и жирорастворимых витаминов в технологиях обогащенных пищевых продуктов // Пищевые ингредиенты в создании современных продуктов питания // П.А. Семенова, К.Д. Горшунова, А.П. Нечаев // под ред. В.А. Тутельяна, А.П. Нечаева. — М.: ДеЛи плюс, 2014. - с. 196-224.

56. Скорюкин А.Н. Технология получения и применения купажированных жировых продуктов с оптимальным жирнокислотным составом ПНЖК: дис. канд. техн.наук - М., 2004, - с. 79.

57. Степанов А.Е. Физиологически активные липиды. // А.Е. Степанов, Ю.М. Краснопольский, В.И. Швец-М.: Наука, 1991, - с. 136.

58. Тутельян В.А. Пищевые ингредиенты в создании современных продуктов питания // В.А. Тутельян, А.П. Нечаев. - М.: ДеЛи плюс, 2014. - с.483

59. Тырсин Ю.А. Методические указания к выполнению лабораторных работ по курсу «Специальная биохимия» // Ю.А. Тырсин, Л.А. Иванова, АЛО. Кривова. -М.: МГАПП, 1993. - с.33-45.

60. Чан Тхи Тху Хыонг. Гидролиз и модификация липидов с применением липолитических ферментов дрожжей Candida rugosa и Yarrowia lipolytica // Чан Тхи Тху Хыонг. - Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук. - Казань, 2013. - с. 19.

61. Шатнюк Л.Н. Ингредиенты в технологиях продуктов здорового питания // Пищевые ингредиенты в создании современных продуктов питания // Л.Н.

Шатнюк, Г.А. Михеева, Т.Э. Некрасова // под ред. В.А. Тутельяна, А.П. Нечаева. - М.: ДеЛи плюс, 2014. - с. 196-224.

62. Шендеров Б.А. Функциональное питание и его роль в профилактике метаболического синдрома// Б.А. Шендеров - М.: Дели Принт, 2008, - с. 319.

63. Шнайдер К. Л. Ферментативный гидролиз растительных масел с использованием неводных сред // К.Л. Шнайдер. - Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук. — Казань, 2009.-с. 18.

64. Яровенко В.Л. Технология спирта // В.Л. Яровенко, В.А. Маринченко, В.А. Смирнов. - М.:Колос-Пресс, 2002. - с.365.

65. Aebi Н. Catalase in vitro// Н. Aebi. - Methods in enzymology. - 1984. - №105, p. 121-126.

66. Akoh C.C. Protein engeneering and applications of Candida rugosa lipase isoforms// C.C. Akoh, G. Lee, J.F. Shaw. - Lipids, 2004. - 39(6), p. 513-526.

67. Antonian E. Recent advances in the purification characterisation and structure determination of lipases// E. Antonian. - 1988. - vol.23, no.12, p. 1101-1106.

68. Arpigny J. L. Bacterial lipolytic enzymes: Classification and properties // J.L. Arpigny, K.E. Jaeger. - Biochemical Journal, October 1999. - vol. 343, no.l, p. 177-183.

69. Batenburg A.M. Enzymes and enzymatic detergent composition // A.M. Batenburg, M.R. Egmond, L.G.J. Frenken, C.T. Virrips. - European patent 0407225A1 - 1991.

70. Benjamin S. Candida rugosa lipases: Molecular biology and versatility in biotechnology // S. Benjamin, Pandey. - Yeast, September 1998. - vol. 14, no. 12, p. 1069-1087.

71. Benjamin S. Isolation and characterization of three distinct forms of lipases from Candida rugosa produced in solid state fermentation // S. Benjamin, Pandey, Ashok. - Brazilian Archives of Biology and Technology, June 2001. - vol. 44, no. 2, p. 213-221.

72. Bertolini M.C. Polymorphism in the lipase genes of Geotrichum candidum strains // M.C. Bertolini, L. Laramee, D.Y. Thomas, M. Cygler, J.D. Schrag, T. Vernet. -European Journal Biochemistry, 1994. - 219, p. 119-125.

73. Boer E. An extracellular lipase from the dimorphic yeast Arxula adeninivorans: molecular cloning of the ALIP1 gene and characterization of the purified recombinant enzyme // E. Boer, H.P. Mock, R. Bode, G. Gellisseu, G. Kunze. -Yeast, 2005 . - 22(7), p. 523-535.

74. Cao L. Lipase-catalyzed solid phase synthesis of sugar esters IV: selectivity of lipases towards primary and secondary hydroxyl groups in carbohydrates// L. Cao, U.T. Bornscheuer, R.D. Schmid. - Biocatalysis and Biotransformation, vol. 16, 1999,-p. 249-257.

75. Castillo B. On the activity loss of hydrolases in organic solvents. I Rapid loss of activity of a variety of enzymes and formulations in a range of organic solvents// B. Castillo, Y. Pacheco, W. Alazzam, K. Griebenow, M. Devi, A. Ferrer, G. Barletta. - Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 2005. - 35, p. 147-153.

76. Castillo E. Lipase-catalyzed synthesis of xylitol monoesters: solvent engeneering approach// E. Castillo, F. Pezzotti, A. Navarro, A.J. Lopez-munguia. - Journal of Biotechnology 2003. - 102, p.251-259.

77. Chang C.R. Multiple forms and functions of Candida rugosa lipase // C.R. Chang, J.S. Chou, F.J. Shaw. - Biotechnology and Applied Biochemistry, 1994. - vol. 19, p. 93-97.

78. Chang S.W. Biocatalysis for the prodaction of carbohydrate esters// S.W. Chang, J.F. Shaw. - New Biotechnology, 2009, - vol. 26, p. 109-116.

79. Chen J. Lipase production by hydrocarbons by Trichosporon fermentansWU-C12 in presence of surfactants. // J. Chen, S. Shimura, K. Kirimura, S. Usami. -Bioscience, Biotechnology and Biochemistry, 1994. - vol. 58, p. 773-775.

80. Chen J. Lipase production by Trichosporon fermentans WU-C12, a newly isolated yeast // J. Chen, T. Ishii, S. Shimura, K. Kirimura, S. Usami. - Journal of Fermentation and Bioengineering, 1992. - vol. 73, p. 412-414.

81. Ciafardini G. Lipolytic activity of Williopsis californica and Saccharomyces cerevisiae in extra virgin olive oil// G. Ciafardini, B.A. Zullo, G. Cioccia, A. Iride. - International journal of food microbiology, 2006b. - 107(1), p. 27-32.

82. Corzo G. Production and characteristics of the lipase from Yarrowia lipolytica 681// G. Corzo, S. Revah. - Bioresource technology, 1999.-70, p. 173-180.

83. Costas M. Lipolytic activity in submerged cultures of Issatchenkia orientalis// M. Costas, F.J. Deive, M.A. Longo. - Process biochem, 2004. - 39, p. 2109-2114.

84. Cox D.L. Effects of molecular oxygen, oxidation-reduction potential, and antioxidants upon in vitro replication of Treponema pallidum sub sp. pallidum// D.L. Cox, B. Riley, P. Chang, S. Sayahtaheri. - Applied and environmental microbiology, 1990. - vol. 56 №10, p. 3063-3072.

85. Cygler M. Structure and conformational flexibility of Candida rugosa lipase// M. Cygler, J.D. Schräg. - Biochim. Biophys. Acta. - 1999. - 1441(2-3), p. 205-214.

86. D'annibale A. Olive-mill wastewaters: a promising substrate for microbial lipase production// A. D'annibale, G.G. Sermanni, F. Federici, M. Petruccioli. -Bioresource technology, 2006. - 97(15), p. 1828-1833.

87. De Maria P.D. Rational strategy for the production of new crude lipases from Candida rugosa// P.D. De Maria, J.M. Sanchez-Montero, A.R. Alcantara, F. Valero, J.V. Sinisterra. - Biotechnology Letters, 2005. - 27(7), p. 499-503.

88. Derewenda Z. Structure and functions of lipases // Z. Derewenda. - Advances in Protein Chemistry, 1994. - Vol. 45. - P. 1-52.

89. Dharmsthiti S. Purification and characterization of lipase from a raw-milk yeast (Trichosporon asteroides) // S. Dharmsthiti, P. Ammaranond. - Biotechnology and Applied Biochemistry, October 1997. - vol. 26, no. 2, p. 111-116.

90. Du W. Study of acylmigration in immobilized lipozyme TL catalyzed transesterification of soybean oil for biodiesel prodaction// W. Du, Y. Xu, D. Liu, J. Zeng. - Journal of molecular catalysis b: enzymatic, 2004. - 30, p. 125-129.

91. Elibol M. Influence of oxygen transfer on lipase production by Rizopus arrhizus // M. Elibol, D. Ozer. - Processes Biochemistry, 2000. - 36, p.325-329.

92. Fadiloglu S. Effects of carbon and nitrogen sources on lipase production by Candida rugosa // S. Fadiloglu, O. Erkmen, J. Turkish. - Engineering environmental science, 2002. - 26, p. 249 - 254.

93. Fernandez L. High-level expression and characterization of Galactomyces geotrichum (BT107) lipase I in Pichia pastoris// L. Fernandez, I. Perez-Victoria, A. Zafra, P.L. Benitez, J.C. Morales, J. Velasco, J.L. Adrio. - Protein expr. Purification, 2009. - 49(2), p. 256-264.

94. Ferrer P. Production of native and recombinant lipases by Candida rugosa// P. Ferrer, J.L. Montesinos, F. Valero, C. Sola. - Applied Biochemistry, 2001. -95(3), p. 221-255.

95. Fickers P. Overproduction of lipase by Yarrowia lipolytica mutants// P. Fickers, J. M. Nicaud, J. Destain, P. Thonart. - Applied microbiology and biotechnology, 2003. -63(2), p.136-142.

96. Fickers P. Carbon and nitrogen sources modulate lipaseproduction in the yeast Yarrowia lipolytica// P. Fickers, J.M. Nicaud, J. Destain, P. Thonart. - Applied Microbiology and Biotechnology, 2004. - 96(4), p. 742-749.

97. Fickers P. Involvement of hexokinase Hxkl in glucose catabolite repression of LIP2 encoding extracellular lipase in the yeast Yarrowia lipolytica// P. Fickers, J.M. Nicaud, J. Destain, P. Thonart. - Current microbiology, 2005. - 50(3), p. 133-137.

98. Fickers P. Selection of new over-producing derivatives for the improvement of extracellular lipase production by the non-conventional yeast Yarrowia lipolytica// P. Fickers, F. Fudalej, J.M. Nicaud, J. Destain, P. Thonart. - Journal of biotechnology, 2005. - 115(4), p. 379-386.

99. Fickers P. Production and down-stream processing of an extracellular lipase from the yeast Yarrowia lipolytica// P. Fickers, M. Ongena, J. Destain, F. Weekers, P. Thonart. - Enzyme and microbial technology, 2006. - 38, p.756-759.

100. Francoise E. Use of lipases to discriminate against Fatty acids of industrial interest I E // E. Francoise, M. Trani, G. Andre. - II Int. News Fats Oils and Relat. Mater, 1991.-2, №4, p. 357.

101. Fujino S. Purification and characterization of phospholipase B from Candida utilis// S. Fujino, D. Akiyama, S. Akaboshi, T. Fujita, Y. Watanabe, Y. Tamai. -Biotechnology Biochem, 2006. - 70(2), p. 377-386.

102. Gandhi N. Applications of Lipase // N. Gandhi. - Journal of the American Oil Chemists' Society, June 1997. - vol. 74, no. 6, p. 621-634.

103. Gellissen G. New yeast expression platforms based on methylotrophic Hansenula polymorpha and Pichia pastoris and on dimorphic Arxula adeninivorans and Yarrowia lipolytica// G. Gellissen, G. Kunze, C. Gaillardin, J.M. Cregg, E. Berardi, M. Veenhuis, I. Van der Klei. - Fems yeast research, 2005. - 5(11), p.1079-1096.

104. Goyens P. L. L. Conversion of a-linolenic acid in humans is influenced by the absolute amounts of a-linolenic acid and linoleic acid in the diet and not by their ratio // P. L. L. Goyens, M. E. Spilker, P. L. Zock, M. B. Katan, R. P. Mensink. -American Journal of Clinical Nutrition. - 2006, - vol. 84, no. 1, pp. 44-53.

105. Goswami A. Enzymatic resolution of sec-butylamine// A. Goswami, Z. Guo, W.L. Parker, R.N. Patel. - Tetrahedron: asymmetry, 2005. - 16, p.1715-1719.

106. Hernaiz M.J. Hydrolysis of (R,S) 2 aryl propionic esters by pure lipase B from Candida cylindracea // M.J. Hernaiz, M.J.M Sanchez, J.V. Sinisterra. - Journal of Molecular Catalysis A: Chemical, 1997. - vol. 19, p. 303-306.

107. Holmquist M. Insights into the molecular basis for fatty acyl specificities of lipases from Geotrichum candidum and Candida rugosa// M. Holmquist. - Chem. Phys. Lipids, 1998. - 93(1-2), p. 57-66.

108. Hsu A. F. Biotechnolology // A. F. Hsu, K. Jones, T.A. Foglia, W. N. Marmer. -Applied Biochemistry, 2008. - 36, p.181-186.

109. Jacobsen T. Separation and characterization of 61- and 57-kDa lipases from Geotrichum candidum ATCC 66592 // T. Jacobsen, O.M. Poulsen. - Canadian Journal of Microbiology, January 1992. - vol. 38, no. 1, p.75-80.

110. Jacobsen T. Comparison of lipases from different strains of the fungus Geotrichum candidum// T. Jacobsen, O.M. Poulsen. - Biochemistry, Biophysics. Acta Lipids and Lipid Metabolism, 1995. - 1257, p.96-102.

111. Jaeger K.E. Bacterial biocatalysts: Molecular biology three-dimensional structures and biotechnological applications of lipases // K.E. Jaeger, B.W. Dijkstra, M.T. Reetz. - Annual Review Microbiology, October 1999 - vol.53, p. 315-351.

112. Jandrositz A. The lipid droplet enzyme Tgllp hydrolyzes both steryl esters and triglycerides in the yeast, Saccharomyces cerevisiae // A. Jandrositz, J. Petschnigg, S.D. Kohlwein, R. Leber. - Biochim. Biophys. Acta< 2005. -1735(1), p.50-58.

113. Jyoti Vakhlu. Yeast lipases: enzyme purification, biochemical properties and gene cloning // Jyoti Vakhlu, Avneet Kour. - Electronic Journal of Biotechnology ISSN: 0717-3458, 2006. - Vol.9 No.l.

114. Kademi A. Production of heterologous microbial lipases by yeasts// A. Kademi, B. Lee, A. Houde. - Indian Journal of Biotechnology, July 2003. - vol.2, no. 3, p. 346-355.

115. Kakugawa K. Purification and characterization of a lipase from the glycolipid-producing yeast Kurtzmanomyces sp. I-11 // K. Kakugawa, M. Shobayashi, O. Suzuki, T. Miyakawa. - Bioscience, Biotechnology and Biochemistry, May 2002. - vol. 66, no. 5, p. 978-985.

116. Kamimura, E.S. Studies on lipase-affinity adsorption using response-surface analysis // E.S. Kamimura, O. Medieta, M.I. Rodrigues, F. Maugeri. -Biotechnol. Appl. Biochem, 2001. - 33, p.153-159.

117. Kamini N.R. Production, purification and characterization of an extracellular lipase from the yeast, Cryptococcus sp. S-2 // N.R. Kamini, T. Fujii, T. Kurosu, H. Iefuji. - Process biochem, 2000. - 36, p. 317-324.

118. Karboune S. Lipase-catalyzed biosynthesis of cinnamoylated lipids in a selected organic solvent medium// S. Karboune, M. Safari, B. Lue, F.K. Yeboah, S. Kermasha. - Journal Biotechnology, 2005. - p. 167.

119. Kayirhan F. Increase in the enzymatic hydrolysis rate of triacetin using polyethylene particles packed in a column reactor// F. Kayirhan, S.S. Celebi. -Biochemical engineering journal, 1998. - 1, p. 153-158.

120. Kazlauskas R.J. Biotransformations by lipases // R.J. Kazlauskas, U.T. Bornscheuer, H.J. Rehm, G. Reed, A. Pahler, P. Stadler, D.R. Kelly. -Weinheim. Falta num paginas. Biotechnology, 1998. - vol.8

121. Kim B.S. Bioprocess // B.S. Kim, C.T. Hou. - Biosyst. Engenering, 2009. - 29(1), p. 59-64.

122. Kontkanen H. Characterisation of sterylesterase activities in commercial lipase preparations // H. Kontkanen, M. Tenkanen, R. Fagerstrom, T. Reinikainen. -Journal of Biotechnology, February 2004. - vol. 108, no. 1, p. 51-59.

123. Kui T. Lipase-catalysed modification of lard to produce human milk fat substitutes// X. Xu, C. He, L. Li. - Food Cap Chem, 2003.- 80, p.473^81.

124. Kwak. S.M. Efficacy of Omega-3 fatty acid supplements (eicosapentaenoic acid and docosahexaenoic acid) in the secondary prevention of cardiovascular disease: a meta-analysis of randomized, double-blind, placebo-controlled trials // S. M. Kwak, S. K. Myung, Y. J. Lee, H. G. Seo. - Archives of Internal Medicine, 2012. -vol. 172, no. 9, pp. 686-694.

125. Lakshmi B.S. Effect of vegetable oils in the secretion of lipase from Candida rugosa// B.S. Lakshmi, P. Kangueane, B. Abraham, G. Pennathur. - Letters in applied microbiology, 1999. - 29, p. 66-70.

126. Lanciotti R. Use of Yarrowia lipolytica strains for the treatment of olive mill wastewater// R. Lanciotti, A. Gianotti, D. Baldi, R. Angisani, G. Suzzi, D. Mastrocola, M.E. Guerzoni. - Bioresource technology, 2005. - 96, p. 317-322.

127. Larios A. Synthesis of flavor and fragrance esters using Candida antarctica lipase// A. Larios, H.S. Garcia, R.M. Oliart, G. Valerio-alfaro. - Applied microbiology and biotechnology, 2004. - 65(4), p. 373-376.

128. Lee S.B. Effect of water activity on enzyme hydration and enzyme reaction rate in organic solvents// S.B. Lee, K.J. Kim. - Journal of fermentation and Bioengineering, 1995. - vol. 79, p. 473-478.

129. Lopez N. Reactivity of pure Candida rugosa lipase isoenzymes (Lipl, Lip2 and Lip3) in aqueous and organic media. Influence of the isoenzymatic profile on the lipase performance in organic media // N. Lopez, M.A. Pernas, L.M. Pastrana, A.

Sanchez, F. Valero, M.L. Rua. - Biotechnology Progress, January 2004. - vol. 20, no.l, p. 65-73.

130. Lotti M. Cloning and analysis of Candida cylindracealipase sequence // M. Lotti, R. Grandosi, F. Fusetti, S. Longhi, S. Brocca, A. Tramontana, L. Alberghina. -Gene, February 1993. - vol. 124, no. 1, p. 45-55.

131. Lotti M. Physiological control on the expression and secretion of Candida rugosa lipase// M. Lotti, S. Monticelli, J.L. Montesinos, S. Brocca, F. Valero, J. Lafuente. - Chemistry and physics of lipids, 1998. - 93, p. 143-148.

132. Lotti M. High lipase production by Candida rugosa is associated with G1 cells // M. Lotti, S.Brocca, D. Porro. - A flow cytometry study. Biotechnology Letters, 2001. - vol. 23, no. 21, p. 1803-1808

133. Lowry O.H. Protein measurement with the Folin reagent // O.H. Lowry, N.J. Rosebrough, A.L. Farr, R.J. Randall. - Journal of Biological Chemistry, 1951. -Vol. 193., p. 317-325.

134. Lux Lock L. Tecnológica - lipases produced by yeasts: powerful biocatalysts for industrial purposes// L. Lux Lock, V. Corbellini, P. Valente. - Santa Cruz do Sul, 2007. - v. 11, n. 1 e2, p. 18-25.

135. Macédo G.A. Partial purificationand characterization of an extracellular lipase from a newly isolated strain of Geotrichum sp // G.A. Macédo, Y.K. Park, G.M. Pastore. - Journal Brazilian Social Microbiology, 1997. - 28, p. 90-95.

136. Magnusson A.O. Creating space for large secondary alcohols by rational redesign of Candida antarctica lipase B// A.O. Magnusson, J.C. Rotticcimulder, A. Santagostino, K. Hult. - Chembiochem, 2005. - 6(6), p.1051-1056.

137. Mahadik N. D. Production of acidic lipase by Aspergillus niger in solid state fermentation// N.D. Mahadik, U.S. Puntambekar, K.B. Bastawde, J.M. Khire, D.V. Gokhale. - Process biochemistry, 2002. - 38, p.715-721.

138. Manca C. Infection and immunity // C. Manca, S. Paul, E.B. Clifton. - 1999. -vol.67 JVbl, p. 74-79.

139. María P.D. Biotechnological applications of Candida antarctica lipase A: State-of-the-art// P.D. María, C. Carbonioerlemans, B. Tuin, G. Bargeman, A. Meer, R. Gemert. - Journal of molecular catalysis b: enzymatic, 2005. - 37, p.36-46.

140. McCabe R.W. Synthesis of novel polyurethane polyesters using the enzyme Candida antarctica lipase B// // R.W. McCabe, A. Taylor. - Chem. Commun. (camb), 2002. - 7(9), p. 934-935.

141. Medina A.R. Lipase-catalyzed esterification of glycerol and polyunsaturated fatty acids from fish and microalgae oils// A.R. Medina, L.E. Cerdán, A.G. Giménez, B.C. Páez, M.J. González, E.M. Grima. - Journal Biotechnology , 1999. - 70, p. 379-391.

142. Nagayama K. Fatty acid esterification catalyzed by Candida rugosa lipase in lecithin microemulsion-based organogels// K. Nagayama, N. Yamasaki, M. Imai. - Biochemistry Engineering Journal, 2002. - 12, p. 231-236.

143. Nandi S. Production of medium chain glycerides from coconut and palm kernel fatty acid distillates by lipase-catalyzed reactions// S. Nandi, Y. Gangopadhya, S. Ghosh. - . Enzyme microbal technology, 2005. — 36, p. 725-728.

144. Nini L. Lipase catalysed hydrolysis of short-chain substrates in solution and in emulsion: a kinetic study// L. Nini, L. Sarda, L. Coumeau, E. Boitard, J. Dubes,

H. Chahinian. - Biochim.Biphys. Acta Molecular and Cell Biology, 2001. - 1534, p. 34-44.

145. Novotny C. Dimorphic growth and lipase production in lipolytic yeasts// C. Novotny, L. Dolezalova, J. Lieblova. - Folia Microbiologica, 1994. - vol. 39, no.

I, p. 71-73.

146. Oishi H. Purification and characterization of phospholipase B from Kluyveromyces lactisand cloning of phospholipase B gene// H. Oishi, T. Morimoto, Y. Watanabe, Y. Tamai. - Bioscience, Biotechnology and Biochemistry, January 1999. - vol. 63, no. 1, p. 83-90.

147. Ota Y. Lipase from Candida paralipolytica: Part 1 Anionic surfactant as the essential activator in the systems emulsified by polyvinyl alcohol // Y. Ota, K. Yamada. - Agricultural and Biological Chemistry, 1966. - vol.30, p.351-358.

148. Ota Y. Purification and some properties of cell-bound lipase from Saccharomycopsis lipolytica // Y. Ota, K. Gomi, S. Kato, T. Sugiura, Y. Minoda. - Agricultural and Biological Chemistry, 1982. - vol. 46, p.2885-2893.

149. Ota Y. Nutritional factors causing mycelial development of Saccharomycopsis lipolytica // Y. Ota, S. Oikawa, Y. Morimoto, Y. Minoda. - Agricultural and Biological Chemistry, 1984. - vol. 48, p. 1933-1940.

150. Ottoson J. Substrate entropy in enzyme enantioselectivity: an experimental and molecular modeling study of a lipase// J. Ottoson, L. Fransson, J.W. King, K. Hult. - Biochim. Biophys. Acta, 2002. - 1594, p. 325-334.

151. Pandey A. The realm of microbial lipases in biotechnology// A. Pandey, S. Benjamin, C.R. Soccol, P. Nigam, N. Krieger, V. Soccol. - Biotechnology and Applied Biochemistry, April 1999. - vol. 29, no. 2, p. 119-131.

152. Panzavolta F. Acetylenic polymers as new immobilization matrices for lipolytic enzymes// F. Panzavolta, S. Soro, R.D. Amato, C. Palocci, E. Cernia, M.V. Russo. - Journal of molecular catalysis b: enzymatic, 2005. - 32, p.67-76.

153. Passicos E. Regioselective acylation of flavonoids catalyzed by immobilized Candida antarctica lipase under reduced pressure// E. Passicos, X. Santarelli, D. Coulon. - Biotechnology letters, 2004. - 26(13), p. 1073-1076.

154. Pereira E.B. Esterification activity and stability of Candida rugosa lipase immobilized into chitosan// E.B. Pereira, H.F. De Castro, F.F. De Moraes, G.M. Zanin. - Applied biochemistry and biotechnology, 2002. - 98-100, p.977-986.

155. Pierce G.E. Unique microbial lipases with activity at temperatures and pH's suitable for use in detergent // G.E. Pierce, C.B. Wick, D.T. Palmer. - European Patent No. 0385401 - 1990.

156. Pignede G. Characterization of an extracellular lipase encoded by Lip2 in Yarrowia lipolytica // G. Pignede, H. Wang, F. Fudalej, C. Gaillardin, M. Seman, J.M. Nicaud. - Journal of Bacteriology May 2000a. - vol. 182, no. 10, p.2802-2810.

157. Qian Z. Improving the catalytic activity of Candida antarctica lipase B by circular permutation// Z. Qian, S.J. Lutz. - Am. Chem. Soc., 2005. - 127(39), p. 1346613467.

158. Reetz M.T. Efficient immobilization of lipases by entrapment in hydrophobic solgel materials// M.T. Reetz, A. Zonta, J. Simpelkamp. - Biotechnology bioengenering, 1996.-49, p.527-534.

159. Raku T. Enzymatic synthesis of threalose esters having lipophilicity// T. Raku, M. Kitagawa, H. Shimakawa, Y. Tokiwa. - Journal of Biotechnology, 2003. -100, p.203-208.

160. Rendondo O. Comparative kinetic study of lipases A and B from Candida rugosain the hydrolysis of lipid P-nitrophenyl esters in mixed micells with tritón X-100// O. Rendondo, A. Herrero, J.F. Bello, M.G. Roig, M.V. Calvo, F.J. Plou, F.J. Burguillo. - Biochimica et Biophysica. Acta (BBA). General Subjects, January 1995. - vol. 1243, no. 1, p. 15-24.

161. Razanka T. Odd-numbered very-long-chain fatty acids from microbial, animal and plant kingdoms // T. Razanka, K. Sigler. - Progress in Lipid research, 2009. -vol. 48, p. 206-238.

162. Romero M.D. Enzymatic synthesis of isoamyl acetate with immobilized Candida antarctica lipase in n-hexane// M.D. Romero, L. Calvo, C. Alba, A. Daneshfar, H.S. Ghaziaskar. - Enzyme and microbial technology, 2005. - 37, p. 42-48.

163. Salis A. Wax esters synthesis from heavy fraction of sheep milk fat and cetyl alcohol by immobilised lipases. // A. Salis, V. Solinas, M.J. Monduzzi. - Journal of molecular catalysis b: enzymatic, 2003. - 21, p.167-174.

164. Samukawa T. Pretreatment of immobilized Candida antarctica lipase for biodiesel fuel production from plant oil// T. Samukawa, M. Kaieda, T. Matsumoto, K. Ban, A. Kondo, Y. Shimada, H. Noda, H. J. Fukuda. - Journal of Bioscience and Bioengineering, 2000. - 90(2), p. 180-183.

165. Sánchez A. Characterisation of the lipase and esterase multiple forms in a enzyme preparation from Candida rugosa pilot plant scale fed-batc fermentation// A.

Sánchez, P. Ferrer, A. Serrano, M. Pernas, F. Valero, M.L. Rúa, C. Casas, C. Sold. - Enzyme and Microbial Technology, 1999. - 25, p.214-223.

166. Saxena R.K. Microbial lipases: potential biocatalysts for the future industry// R.K. Saxena, P.K. Gosh, R. Gupta, W.S. Davidson, S. Bradoo, R. Gulati. -Current Science, July 1999. - vol. 77, no. 1, p. 101-115.

167. Schmidt R.D. Lipases: Interfacial enzymes with attractive applications// R. Schmidt, R. Verger. - AngewandteChemie (International ed. in English), 1998. -vol. 37, no. 12, p. 1608-1633.

168. Schmitt J. Blocking the tunnel: engineering of Candida rugosa lipase mutants with short chain length specificity// J. Schmitt, S. Brocca, R.D. Schmid, J. Pleiss. -Protein engineering, 2002. - 15(7), p.595-601.

169. Shaw J. Characterization of three distinct forms of lipolytic enzyme in a commercial Candida lipase prepration// J. Shaw, C. Chang. - Biotechnology Letters, November 1989. - vol. 11, no. 11, p. 779-784.

170. Sheldon R. Chirotechnology-industrial synthesis of optically-active compounds// R. Sheldon. - New York: Marcel Dekker Ltd., 1993. - p. 448. ISBN 0824791436

171. Shimada Y. cDNA cloning and characterization of Geotrichum candidum lipase II// Y. Shimada, A. Sugihara, Y. Tominaga, T. Iizumi. - Journal of Biochemistry, May 1990. - vol. 107, no. 5, p.703-707.

172. Shimada, Y. Regiospecific Analysis by Ethanolysis of Oil with Immobilized Candida antarctica Lipase// Y. Shimada, J. Ogawa, Y. Watanabe, T. Nagao, A. Kawashima, T. Kkobayashi, S. Shimizu. - Lipids, 2003. - 38(12), p.1281-1286.

173. Shintre M. Lipolase catalyzed synthesis of benzyl esters of fatty acids// M. Shintre, R. Ghadge, S. Sawant. - Biochem. Engineering, 2002. - J. 12, p. 131141.

174. Siddiqui K.S. Improved thermal stability and activity in the cold-adapted lipase B from Candida antarctica following chemical modification with oxidized polysaccharides// K.S. Siddiqui, R. Cavicchioli. - Extremophiles, 2005. - 9(6). p. 471-476.

175. Sidebottom C.M. Geotrichum candidum produces sevelar lipases with markedly different substrate specificities// C.M. Sidebottom, E. Charton, P.P. Dunn, G. Mycock, C. Davies, J. Suttton, A.R, Macre, A.R. Slabas. - European Journal of Biochemistry, 1991. - vol. 202, p. 485-491.

176. Sommer P. Genetic and biochemical characterization of a new extracellular lipase from Streptomyces cinnamomeus// P. Sommer, C. Bormann, F. Gotz. - Applied and environmental microbiology, 1997. - 9, p. 3553-3560.

177. Soo E.L. Optimization of enzyme-catalysed synthesis of amino acid-based surfarctans from palm oil fractions// E.L. Soo, A.B. Salleh, M. Basri, R.N. Rahman, K.J. Kamaruddin. - Bioscince Bioenginering, 2003. - 95(4), p. 361-367.

178. Suen W.C. Improved activity and thermostability of Candida antarctica lipase B by DNA family shuffling// W.C. Suen, N. Zhang, L. Xiao, V. Madison, A. Zaks. -Protein engenering, Des. Sel., 2004. - 17(2), p. 133-140.

179. Sugiura T. Partial characterisation of cell-bound lipase of Candida paralipolytica// T. Sugiura, Y. Ota, Y. Minoda. - Agricultural and Biological Chemistry, 1976. - vol. 40, p. 2479-2480.

180. Torossian K. Purification and characterization of acid resistant triacylglycerol lipase from Aspergillus niger// K. Torossian, A.W. Bell. - Biotechnology and Applied Biochemistry, 1991. - vol. 13, p.205-211.

181. Trubiano G. Ethyl oleate synthesis using Candida Rugosa lipase in a solvent-free system. Role of hydrophobic interactions// G. Trubiano, D. Borio, M.L. Ferreira. - Biomacromolecules, 2004. - 5(5), p. 1832-1840.

182. Tsai S.W. Implication of substrate-assisted catalysis on improving lipase activity or enantios-electivity in organic solvents// S.W. Tsai, C.C. Chen, H.S. Yang, T.L. Chen. - Biochim. Biophys. Acta., 2006. - 1764(8), p. 1424-1428.

183. Tsujisaka Y. Purification, crystallization and some properties of lipase from Geotrichum candidum link // Y. Tsujisaka, Iwaim, Y. Tominasa. - Agricultural and Biological Chemistry, 1973. - vol. 37, p. 1457-1464.

184. Uppenberg J. Crystilization and preliminary X-ray studies of lipase B from Candida Antarctica // J. Uppenberg, S. Patkar, T. Bergfors, T. Jones. - Journal of Molecular Biology January 1994. - vol. 235, no. 2, p. 790-792.

185. Vakhlu J. Yeast lipases: enzyme purification, biochemical properties and gene cloning // J. Vakhlu, A. Kour. - Electronic Journal of Biotechnology ISSN: 07173458., 2006. - Vol.9 No.l, p. 69-85.

186. Vecchia R. D. Aplicares sintéticas de lipases imobilizadas em polímeros// R.D. Vecchia, M.G. Nascimento, V. Soldi. - Química nova, 2004. - Vol. 27, no. 4, p.623-630.

187. Veeraragavan K. Detection and partial purification of two lipases from Candida rugosa// K. Veeraragavan, B. Gibbs. - Biotechnology Letters, 1989. - vol. 11, p. 345-348.

188. Verger R. Interfacial activation of lipases: facts and artefacts// R. Verger. -Trends in Biotechnology, 1997. - vol. 15, no. 1, p. 32-38.

189. Verma N. Microbial Lipases: Industrial Applications and Properties// N. Verma, S. Thakur, A.K. Bhatt. - International Research Journal of Biological Sciences, 2012 - ISSN 2278-3202, Vol. 1(8), 88-92.

190. Watanabe Y. Conversion of degummed soybean oil to biodiesel fuel with immobilized Candida antarctica lipase// Y. Watanabe, Y. Shimada, A. Sugihara, Y.J. Tominaga. - Molecular Catal. B. Enzymology, 2002. - 17, p. 151-155.

191. Won K. Optimization of lipase entrapment in Ca-alginate gel beads// K. Won, S. Kim, K.J. Kim, H.W. Park, S.J. Moon. - Process Biochemistry, 2005. - 40, p.2149-2154.

192. Xu H. Immobilization of Candida cylindracea lipase on methyl acrylate-divinyl benzene copolymer and its derivatives// H. Xu, M. Li, B. He. - Enzyme and Microbial Technology, 1995. - 17, p. 194-199.

193. Xu Y. Study on the kinetics of enzymatic interesterification of triglycerides for biodiesel production with methyl acetate as the acyl acceptor// Y. Xu, W. Du, D.J. Liu. - Molecular Catal. B Enzymology, 2005. - 32, p. 241-245.

194. Yadav R. Purification and characterization of a regiospecific lipase from Aspergillus terreus // R. Yadav, R. Saxena, R. Gupta, W. Davidson. -Biotechnology and Applied Biochemistry, December 1998. - vol. 28, no. 3, p. 243-249.

195. Yan Y. Lipase-catalyzed solid-phase synthesis of sugar fatty acid esters: Removal of byproducts by azeotropic distillation// Y. Yan, U.T. Bornscheuer, L. Cao, R.D. Schmid. - Enzyme microbiol technology, 1999. - 25, p.725-728.

196. Yu H. W. Effect of salts on activity, stability and enantioselectivity of Candida rugosa lipase in isooctane // H.W. Yu, H. Chen, Y.Y. Yang, C.B. Ching. -Journal of molecular catalysis b: enzymatic, 2005. - 35, p.28-32.